JP2006343156A - 遺伝子検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブが固定化された電極と、一本鎖に変性された遺伝子サンプルとを反応させ、該電極に固定化された核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、電気化学的に活性であり、且つ前記二本鎖核酸に特異的に結合される挿入剤を、前記二本鎖核酸形成工程にて得た前記二本鎖核酸に添加する挿入剤添加工程と、前記二本鎖核酸に未結合の挿入剤を、前記挿入剤と同種の電荷を有する試薬を含む洗浄液で除去する洗浄工程と、前記二本鎖核酸に結合された挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含む。
【選択図】図1
Description
さらに、従来の低減方法では、核酸プローブに悪影響を与えてしまうため、検出信号が減少して、逆に検出感度を低下させてしまうという問題もある。
これにより、一本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異吸着した挿入剤を効果的に除去することができ、この結果、検出対象である遺伝子サンプルを高感度に検出できる。
これにより、挿入剤の非特異的吸着の要因となる前記一本鎖の核酸プローブや前記電極の静電力を排除できるとともに、該挿入剤の一本鎖の核酸プローブや電極への静電的な非特異吸着を抑制することができるため、洗浄工程における挿入剤の除去がより容易となる。
これにより、前記挿入剤からの電気化学的な信号を妨げることなく、洗浄工程で二本鎖核酸と未結合の挿入剤を除去できる。
これにより、前記一本鎖の核酸プローブや前記電極表面への前記挿入剤の非特異吸着を効果的に抑制でき、洗浄工程における挿入剤の除去がより容易となる。
これにより、前記電極の静電力を排除できるとともに、前記挿入剤の一本鎖の核酸プローブや電極への静電的な非特異吸着を抑制することができるため、洗浄工程における挿入剤の除去がより容易となる。
これにより、前記挿入剤からの電気化学的な信号を妨げることなく、洗浄工程で二本鎖核酸と未結合の挿入剤を除去できる。
これにより、二本鎖核酸に特異的に結合した挿入剤由来の電気化学的な信号を測定して、検出対象である遺伝子サンプルを検出することができる。
これにより、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるので、その発光を測定することで、検出対象である遺伝子サンプルを検出することができる。
これにより、前記検出対象である遺伝子サンプルの存在を的確に確認できる。
以下に、実施の形態1における遺伝子検出方法について説明する。
まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作成する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。
この核酸プローブは、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸あるいは化学合成で得られた一本鎖の核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
そしてこの後、生成した核酸プローブを電極表面に固定する。
本実施の形態1にかかる挿入剤は、電気化学的に活性で、且つ前記二本鎖核酸に特異的に結合される特徴を持つ物質である。従って、本実施の形態1では、前記二本鎖核酸に特異的に結合された挿入剤由来の電気化学的な信号を測定することにより、二本鎖核酸の存在、すなわち遺伝子サンプルの存在を高感度に検出することができる。
非特異吸着抑制剤は、挿入剤と同種の電荷を有する試薬であり、前記挿入剤と同様、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極に対して、静電的な非特異吸着が生じる物質である。従って、前記二本鎖核酸形成工程後の、核酸プローブと遺伝子サンプルの反応系に、前記非特異吸着抑制剤を添加すると、前記非特異吸着抑制剤は、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極に対して静電的に吸着するため、挿入剤の非特異吸着の要因である、前記一本鎖の核酸プローブや前記電極の静電力を排除することができる。
前記非特異吸着抑制剤としては、挿入剤が正に荷電する物質が多いことから、カチオン性の試薬が挙げられる。
(1)金電極表面への核酸プローブの固定化
ガラス基板上にスパッタ装置(アルバック製SH−350)によりチタン10nmを下地に金200nmを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで、金電極を準備した。電極表面をピラニア溶液(過酸化水素:濃硫酸=1:3)で1分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。
遺伝子サンプルには、前記核酸プローブと相補的な5’−末端からATGATAGTGGGAAAATTATT GCATATCTGG ATCCAGGGGGの配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド(タカラバイオ製)を使用した。そして、該遺伝子サンプルを、10mMのPBS、及び2XSSCを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、20μMに調整した。
非特異吸着抑制剤として、0.1Mのテトラエチルアミンの溶液を調製した。この調整した溶液を、二本鎖核酸が形成された金電極x、及び二本鎖核酸が形成されていない金電極yのそれぞれに3μL滴下し、10分間室温で放置した。
挿入剤には、下記の化1に示すソラレン修飾ルテニウム錯体を使用した。
まず、公知の方法(Biochemistry,1977,vol.16,No.6)により合成した4’−クロロメチル−4,5,8−トリメチルソラレン(0.5g、1.81mmol)を、水酸化ナトリウム溶解ジメチルホルムアミド(乾燥)に溶かし、160℃で撹拌しながら1,4−ジアミノブタン(0.32g、3.63mmol)を滴下し12時間反応させた。溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Aを得た(収率40%)。
1H‐NMR(300MHz、DMSOd−6)
σ:
1.4〜1.8 (6H,m)
2.4〜2.6 (12H,m)
2.74 (2H,t)
3.8〜3.1 (6H,m)
4.31 (2H,s)
6.32 (1H,s)
7.38 (2H,d)
7.54 (7H,m)
7.77 (4H,m)
8.16 (4H,t)
8.70 (2H,d)
8.88 (4H,d)
この調整した溶液を、非特異吸着抑制剤を滴下後の二本鎖核酸が形成された金電極x、及び二本鎖核酸が形成されていない金電極yのそれぞれに7μL添加し、30分間4℃の冷蔵庫内で暗反応を行った。
30分後、前記金電極x,yのそれぞれに、UVクロスリンカー(UVP製UVPCL1000L型)を用いて、波長365nm、5mW/cm2の紫外線を10分間照射し、ソラレンと二本鎖核酸とを共有結合させた。
前記UV照射による、二本鎖核酸と挿入剤とを共有結合させた後、洗浄液として、カチオン性界面活性剤であるカチオーゲンTML(第一工業化学製)を5%に調整した50mLの水溶液を作成し、その溶液中に前記金電極x,yそれぞれを浸漬させ、5分間揺動した。その後、洗浄液に浸漬させたまま3分間流水でリンスした後、風乾させ、未反応のRu錯体を取り除いた。
以上の工程の後、前記二本鎖核酸が形成された電極x、及び二本鎖核酸が形成されていない電極yのそれぞれに、0.1MのPBS、及び0.1Mのトリエチルアミンを混合した電解液を滴下した。
Claims (11)
- 検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法において、
前記検体試料中の検出すべき遺伝子を、一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定する固定化工程と、
前記一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記電極に固定化された核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、
前記二本鎖核酸形成工程で得た前記二本鎖核酸に、電気化学的に活性であり、且つ前記二本鎖核酸に特異的に結合される挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、
前記二本鎖核酸と未結合の挿入剤を、前記挿入剤と同種の電荷を有する試薬を含む洗浄液で除去する洗浄工程と、
前記洗浄工程後の、前記二本鎖核酸に結合された挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含む、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項1に記載の遺伝子検出方法において、
前記洗浄液に含まれる前記挿入剤と同種の電荷を有する試薬は、カチオン性の試薬である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項2に記載の遺伝子検出方法において、
前記カチオン性の試薬は、カチオン性界面活性剤、第4級アミン、あるいは酸のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項1に記載の遺伝子検出方法において、
前記挿入剤添加工程は、前記二本鎖核酸形成工程で得た前記二本鎖核酸に、前記挿入剤と該挿入剤と同種の電荷を有する試薬とを添加する、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項4に記載の遺伝子検出方法において、
前記挿入剤と同種の電荷を有する試薬は、カチオン性の試薬である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項5に記載の遺伝子検出方法において、
前記カチオン性の試薬は、第4級アミン、あるいは酸のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項1に記載の遺伝子検出方法において、
前記挿入剤は、酸化還元性を有する化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項7に記載の遺伝子検出方法において、
前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項8に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気化学発光を示す化合物は、金属錯体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項9に記載の遺伝子検出方法において、
前記金属錯体の中心金属は、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。 - 請求項1に記載の遺伝子検出方法において、
前記検出工程は、前記電極に対して電圧を印加し、前記二本鎖核酸に結合させた挿入剤による電気化学発光量を測定する、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2005167507A JP2006343156A (ja) | 2005-06-07 | 2005-06-07 | 遺伝子検出方法 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011520123A (ja) * | 2008-05-08 | 2011-07-14 | ボード・オブ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・テキサス・システム | 起電性化学発光で使用する発光ナノ構造化材料 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03233851A (ja) * | 1990-02-07 | 1991-10-17 | Hitachi Ltd | 真空用放電灯 |
-
2005
- 2005-06-07 JP JP2005167507A patent/JP2006343156A/ja active Pending
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JPH03233851A (ja) * | 1990-02-07 | 1991-10-17 | Hitachi Ltd | 真空用放電灯 |
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JP2011520123A (ja) * | 2008-05-08 | 2011-07-14 | ボード・オブ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・テキサス・システム | 起電性化学発光で使用する発光ナノ構造化材料 |
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