KR101076578B1 - 2입자 착물을 이용한 생물학적 분자의 검출을 위한 방법 및조성물 - Google Patents

2입자 착물을 이용한 생물학적 분자의 검출을 위한 방법 및조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전기발광 화학발광을 이용한 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 전기발광 화학발광 모이어티를 가두거나 또는 함유하는 1개 이상의 고체 지지체를 함유하는 조성물을 제공한다.
자기 비드, 폴리스티렌 비드, 분석대상물, 핵산, 단백질

Description

2입자 착물을 이용한 생물학적 분자의 검출을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE DETECTION OF BIOLOGICAL MOLECULES USING A TWO PARTICLE COMPLEX}
본 발명은 개괄적으로 시료 내 해당 분석대상물을 검출하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 해당 분석대상물은 인간 또는 기타 생물을 괴롭히는 질병 또는 질환과 관계되어 있을 수 있다. 해당 분석대상물에는 독소, 화학적 또는 생물학적 무기, 및 환경 오염물질이 포함될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 특별하게도 제1운반체 및 제2운반체, 시료 내에 함유된 해당 분석대상물, 제1운반체를 통해 갇힌 또는 함유된 전기발광 화학발광(electrogenerated chemiluminescent)(ECL)) 모이어티, 및 제1운반체 및 제2운반체 중 적어도 하나에 결합되는 1 이상의 해당 분석대상물에 대한 특이적 결합 파트너를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 이러한 조성물을 이용하여 시료 내에 해당 분석대상물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
화학적, 화학생물학적, 및 생물학적 물질과 같은 분석대상물을 검출 및 정량하는 신속하고도 매우 특이적인 방법에 대한 계속적이고 광범위한 요구가 있다. 구체적으로, 소량의 의약품, 대사산물, 생물학적 마커(marker), 미생물, 바이러스 및 기타 병원체를 검출하는 방법이 요구된다. 이러한 물질의 존재는 종종 다수의 생물학적 시스템을 특징짓는 고도의 특이성을 나타내는 결합(binding) 방법에 의해 종종 측정될 수 있다. 시료 내 존재하는 해당 분자의 검출을 위해 결합에 의존하는 공지된 방법에는 핵산 하이브리드화 기법, 및 항원-항체 결합과 같은 단백질-리간드 상호작용이 포함된다. 이러한 방법에 있어서, 진단적 가치가 있는 착물의 존재는 전형적으로 이 착물을 구성하는 1 이상의 물질에 결합된 관찰가능한 표지의 존재/활성 또는 부존재/불활성에 의해 나타난다.
복수의 성분으로 구성된 시료 내에 존재하는 해당 특이적 분자를 검출하기 위한 임의의 시스템에 대하여 민감성 및 선택성은 모두 바람직한 속성이다. 해당 생물학적 분자의 검출을 위한 DNA 하이브리드화 및 기타 생물검정(bioassay)에 있어서, 민감성은 임상적 진단(문헌 [Liron and Fisher Eds. Novel Approaches in Biosensors and Rapid Diagnostic Assays, Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, 2000; Kenton et al. 1992, clin. Chem. 38:873; Chistodoulides et al. 2002, Anal. Chem. 74:3030]), 법화학(forensic chemistry)(문헌 [Heller, 2002, Annu. Rev . Biomed . Eng. 4:219; Nelson et al. 1996, J. Forensic Sci . 41:557]), 환경 조사(문헌 [Lucarelli et al. 2002, Talanta 56:949; Min et al. 2002, Anal . Biochem. 303:186]), 의약 연구(문헌 [Heller, 2002, Annu. Rev . Biomed . Eng . 4:129; Pollice et al. 1985, Clin . Lab . Med. 5:463]), 및 생물학적 무기 검출(문헌 [Smith, 2002, Anal . Chem . 74:462A; Miao and Bard, 2003, Anal . Chem . 75:5825)에 있어서 중요하다. 따라서 해당 분자의 민감하고 선택적인 검출을 제공 하는 어떠한 시스템이라도 이러한 분야에서 광범위한 용도를 갖게 될 것이다.
전기화학발광(ECL) 방법은, 이의 높은 민감성, 광범위한 동적 범위, 및 선택성 때문에 결합 연구에 있어서 광범위하게 이용되어왔다(미국 특허 제6,316,607호; Bard, A.J. Ed. Electrogenerated Chemiluminescence, Marcel Dekker New York, 2004). 예를 들어, 다양한 기법이 DNA의 검출에 이용가능한데, 여기서 단일가닥 표적 DNA(t-ssDNA)에 부착된 전기화학적 표지, 형광 표지, 및 ECL 활성 표지는 분석 과정에 있어서 측정가능한 신호를 발생시킨다(Liron and Fisher Eds. Novel Approaches in Biosensors and Rapid Diagnostic Assays, Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, 2000; Yang and Ngo Eds. Biosensors and Their applications, Kluwer Academic/Plenum Publishers:New York, 2000; Cunningham, Introduction to Bioanalytical Sensors , J. Wiley & Sons, Inc.:New York, 1998). 측정된 신호의 강도가 일반적으로 t-ssDNA의 양에 비례하고, 전형적으로, 단지 하나 또는 소수의 표지가 하나의 t-ssDNA에 부착될 수 있기 때문에, 이들 방법의 민감성은 종종 제한적이다. 높은 민감성을 달성할 수 있게 하기 위해, 하나의 DNA가 더 많은 수의 표지로 표지될 수 있게하는 다양한 접근법이 개발되어왔다(Wang and Merkoci, 2003, Langmiur 19:989; Zhao et al. 2003, J. Am , Chem . Soc. 125:11474). 이러한 방법들은 펨토몰(fmol) 범위 내에서의 정량에 요구되는 민감성을 제공하지 못한다. 이들은 낮은 비-특이적 결합을 제공하지 않으며, 상보적인 하이브리드화 및 2 염기쌍 미스매치(mismatch) 또는 복수의 측정 사이에서 구별하는 것이 가능하지 않다.
따라서, 높은 선택성 및 낮은 비-특이적 결합을 제공하는 높은 민감성의 검출 시스템(예컨대 fmol 범위에서)에 대한 요구가 존재한다. 이 시스템은 실질적으로 임의의 해당 분자를 검출하는데 이용할 수 있도록 광범위한 이용성을 가져야만 하는데, 단 적어도 하나의 다른 분자(예컨대, 특이적 결합 파트너)와 결합 또는 상호작용을 할 수 있어야 한다. 해당 분자가 핵산, 예컨대 DNA일 경우, 시스템은 하기 각각의 방법 사이에서 구별될 수 있어야만 한다: 상보적인 하이브리드화, 2개 이상의 염기쌍 미스매치 하이브리드화, 및 비-상보적 DNA 하이브리드화.
이상적으로는, 검출 시스템은 ECL 표지의 비-특이적 결합을 제거하는 단순한 처리방법 및 ECL 표지의 높은 안정성을 제공하여, 이로써 신호의 손실 없이 다중의 측정을 수행할 가능성을 부여할 것이다. 적어도, 이러한 각각의 요구가 게시되는 발명의 특정 구체예에 의해 충족된다.
발명의 개요
특정 구체예에서, 본 발명은 신속, 민감 및 선택적인, 시료 내에 해당 분석 대상물을 검출하는 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 시료 내에 함유된 소량(예, 1 fmol)의 해당 분석대상물을 정확하게 검출(예, 잘못된 양성 신호의 발생이 적도록)하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 바람직한 민감성은 제1운반체 내에 갇힌 또는 함유된 복수의 ECL 분자를 제공함으로써 적어도 부분적으로는 달성된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법을 제공한다:
(a) 하기의 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
(여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고;
B는 A를 함유하는 제1운반체이고, B는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며;
C는 해당 분석대상물을 함유할 수도 있는 시료이고;
D는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 제2운반체이며;
k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이다);
(b) A, B, D 및 해당 분석대상물을 함유하는 착물을 조성물의 다른 성분과 분리시키는 단계;
(c) ECL 모이어티를 전기화학적 에너지에 노출시켜 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 모이어티를 유도하는 단계; 및
(d) 방출된 전자기적 방사선을 검출하고, 이로써 해당 분석대상물의 존재를 검출하는 단계,
단, B와 D가 모두 해당 분석대상물에 결합되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시료 내 생물학적 분자의 검출 방법을 제공한다:
(a) 하기의 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
(여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고;
B는 A를 내포 또는 함유한 제1 고체 지지체이고, B는 해당 생물학적 분자에 결합되거나, 또는 해당 생물학적 분자의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며;
C는 해당 생물학적 분자를 함유할 수도 있는 시료이고;
D는 해당 생물학적 분자에 결합되거나, 또는 해당 생물학적 분자의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 제2 고체 지지체이며;
k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이다);
(b) A, B, D, 및 해당 생물학적 분자를 함유하는 착물을 조성물의 다른 성분과 분리시키는 단계;
(c) ECL 모이어티를 전기화학적 에너지에 직접적으로 노출시켜 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 모이어티를 유도하는 단계; 및
(d) 방출된 전자기적 방사선을 검출하고, 이로써 해당 생물학적 분자의 존재를 검출하는 단계,
단, B와 D가 모두 해당 생물학적 분자에 결합되는 것은 아니다.
본 발명의 어떤 구체예에서는, 해당 생물학적 분자가 단백질일 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 해당 생물학적 분자가 핵산일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 성분을 함유하는, 시료 내 해당 분석대상물의 검출에 유용한 조성물을 제공한다:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고; B는 A를 함유하는 제1운반체이고, B는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며; C는 해당 분석대상물을 함유할 수도 있는 시료이고; D는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 제2운반체이며; k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이고, 단, B와 D가 모두 해당 분석대상물에 결합되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 성분을 함유하는, 시료 내 생물학적 분자의 검출에 유용한 조성물을 제공한다:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고; B는 A를 함유하는 제1 고체 지지체이고, B는 해당 생물학적 분자에 결합되거나, 또는 해당 생물학적 분자의 특이적 결합 파트너에 결합되며; C는 해당 생물학적 분자를 함유할 수도 있는 시료이고; D는 해당 생물학적 분자에 직접적으로 결합되거나, 또는 해당 생물학적 분자의 제2 특이적 결합 파트너에 결합될 수 있는 제2 고체 지지체이며; k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이다.
본 발명의 어떤 구체예에서는, 해당 생물학적 분자가 단백질일 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 해당 생물학적 분자가 핵산일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시료 내 해당 핵산분자의 검출 방법을 제공한다:
(a) 하기의 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
(여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고;
B는 A를 함유한, 유기 용매에 용해되는 비드(bead), 예컨대 폴리스티렌 비드이고, B는 해당 핵산분자에 결합되거나, 또는 해당 핵산분자의 특이적 결합 파트너에 결합되며;
C는 해당 핵산분자를 함유할 수도 있는 시료이고;
D는 해당 핵산분자에 결합되거나, 또는 해당 핵산분자의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 자기 비드(magnetic bead)이며;
k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이다);
(b) A, B, D, 및 해당 핵산분자를 함유하는 착물을 조성물의 다른 성분과 분리시키는 단계;
(c) B를 유기 용매에 용해하는 단계;
(d) ECL 모이어티를 전기화학적 에너지에 직접적으로 노출시켜 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 모이어티를 유도하는 단계; 및
(e) 방출된 전자기적 방사선을 검출하고, 이로써 해당 핵산분자의 존재를 검출하는 단계,
단, B와 D가 모두 해당 핵산분자에 결합되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 이 해당 핵산분자는 데옥시리보핵산(DNA)이다. 어떤 구체예에서는, 해당 핵산분자가 리보핵산(RNA)이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 성분을 함유하는, 시료 내 해당 핵산분자를 검출하는데 유용한 조성물을 제공한다:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2 모이어티이고; B는 A를 함유한 폴리스티렌 비드이고, B는 해당 핵산분자에 결합되거나, 또는 해당 핵산분자의 결합 파트너에 결합되며; C는 해당 핵산분자를 함유할 수도 있는 시료이고; D는 해당 핵산분자에 결합되거나, 또는 해당 핵산분자의 특이적 결합 파트너에 결합되는 자기 비드이며; k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수인데, 단 B와 D가 모두 해당 핵산분자에 결합되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 성분을 함유하는, 시료 내 해당 핵산분자의 검출을 위한 조성물을 제공한다:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고; B는 A를 함유한 폴리스티렌 비드이고, B는 해당 핵산분자에 결합되거나, 또는 해당 핵산분자의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며; C는 해당 핵산분자를 함유할 수도 있는 시료이고; D는 해당 핵산분자에 결합되거나, 또는 해당 핵산분자의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 자기 비드이며; k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수인데, 단, B와 D가 모두 해당 핵산분자에 결합되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 시료 내 해당 단백질의 검출 방법을 제공한다:
(a) 하기의 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
(여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고;
B는 A를 함유한 폴리스티렌 비드이고, B는 해당 단백질에 결합되거나, 또는 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며;
C는 해당 단백질을 함유할 수도 있는 시료이고;
D는 해당 단백질에 결합되거나, 또는 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 특이적 결합 파트너에 결합될 수 있는 자기 비드이며;
k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이다);
(b) A, B, D, 및 해당 단백질 분자를 함유하는 착물을 조성물의 다른 성분과 분리시키는 단계;
(c) ECL 모이어티를 전기화학적 에너지에 직접적으로 노출시켜 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 모이어티를 유도하는 단계; 및
(d) 방출된 전자기적 방사선을 검출하고, 이로써 해당 단백질의 존재를 검출하는 단계,
단, B와 D가 모두 해당 단백질에 결합되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 해당 단백질의 제1 결합 파트너 및/또는 제2 결합 파트너는 항체 또는 특이적 결합 단백질일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 성분을 함유한, 시료 내 해당 단백질의 검출을 위한 조성물을 제공한다:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고; B는 A를 함유한 폴리스티렌 비드이고, B는 해당 단백질에 결합되거나, 또는 해당 단백질의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며; C는 해당 단백질을 함유할 수도 있는 시료이고; D는 해당 단백질에 결합되거나, 또는 해당 단백질 분자에 특이적으로 결합하는 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 자화성 비드(magnetizable bead)이며; k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수인데, 단, B와 D가 모두 해당 단백질에 결합되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 해당 단백질 분자의 제1 결합 파트너 및/또는 제2 결합 파트너는 항체 또는 특이적 결합 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한 해당 분석대상물을 검출하기 위한 경쟁적 결합 분석의 수행 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법을 제공한다:
(a) 하기의 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
(여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고;
B는 A를 함유하는 제1운반체이고, B는 해당 분석대상물의 유사체(analog)에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며;
C는 해당 분석대상물을 함유할 수도 있는 시료이고;
D는 해당 분석대상물의 유사체에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 제2운반체이며;
k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이다);
(b) A, B, D 및 해당 분석대상물을 함유하는 착물을 조성물의 다른 성분과 분리시키는 단계;
(c) 착물 내 ECL 모이어티를 전기화학적 에너지에 직접적으로 노출시켜 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 모이어티를 유도하는 단계; 및
(d) 방출된 전자기적 방사선을 검출하고, 이로써 해당 분석대상물의 존재를 검출하는 단계,
단, B와 D가 모두 해당 분석대상물의 유사체에 결합되는 것은 아니며; 나아가, 만약 B가 해당 분석대상물의 유사체에 결합되면, D는 해당 분석대상물의 결합 파트너에 결합되고, 만약 B가 해당 분석대상물의 결합 파트너에 결합되면, D는 해당 분석대상물의 유사체에 결합된다.
관련 구체예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시료 내 해당 핵산분자의 검출 방법을 제공한다:
(a) 하기의 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
(여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고;
B는 A를 함유한 폴리스티렌 비드이고, B는 해당 핵산분자의 유사체에 결합되거나 또는 해당 핵산분자의 특이적 결합 파트너에 결합되며;
C는 해당 핵산분자를 함유할 수도 있는 시료이고;
D는 해당 핵산분자의 유사체에 결합되거나 또는 해당 핵산분자의 특이적 결합 파트너에 결합되는 자기 비드이며;
k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이다);
(b) A, B, D, 및 해당 핵산분자를 함유하는 착물을 조성물의 다른 성분과 분리시키는 단계;
(c) B를 유기 용매에 용해시키는 단계;
(d) ECL 모이어티를 전기화학적 에너지에 모이어티를 직접적으로 노출시켜 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 모이어티를 유도하는 단계; 및
(e) 방출된 전자기적 방사선을 검출하고, 이로써 해당 분석대상물의 존재를 검출하는 단계,
단, B 및 D 중 하나만이 해당 핵산의 유사체에 결합되며; 나아가 만약 B가 해당 핵산분자의 유사체에 결합되면, D는 해당 핵산분자의 결합 파트너에 결합되고, 만약 B가 해당 핵산분자의 결합 파트너에 결합되면, D는 해당 핵산분자의 유사체에 결합된다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시료 내 해당 단백질의 검출 방법을 제공한다:
(a) 하기의 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
(여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고;
B는 A를 함유한 폴리스티렌 비드이고, B는 해당 단백질의 유사체에 결합되거나, 또는 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 특이적 결합 파트너에 결합되며;
C는 해당 단백질을 함유할 수도 있는 시료이고;
D는 해당 단백질의 유사체에 결합되거나, 또는 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 자기 비드이며;
k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이다);
(b) A, B, D, 및 해당 단백질을 함유하는 착물을 조성물의 다른 성분과 분리시키는 단계;
(c) ECL 모이어티를 전기화학적 에너지에 직접적으로 노출시켜 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 모이어티를 유도하는 단계; 및
(d) 방출된 전자기적 방사선을 검출하고, 이로써 해당 단백질의 존재를 검출하는 단계,
단, B 및 D 중 하나만이 해당 단백질의 유사체에 결합되며, 나아가 만약 B가 해당 단백질의 유사체에 결합되면, D는 해당 단백질의 특이적 결합 파트너에 결합되고, 만약 B가 해당 단백질의 특이적 결합 파트너에 결합되면, D는 해당 단백질의 유사체에 결합된다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 해당 분석대상물의 검출을 위해 경쟁적 결합 분석을 수행하기 위한 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 하기의 성분을 함유하는, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 조성물을 제공한다:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고; B는 A를 함유하는 제1운반체이고, B는 해당 분석대상물에 결합되거나, 또는 해당 분석대상물의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며; C는 해당 분석대상물을 함유할 수도 있는 시료이고; D는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제2 특이적 결합 파트너에 결합될 수 있는 제2운반체이며; k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수인데, 단, B 및 D 중 하나만이 해당 분석대상물의 유사체에 결합되는 것은 아니며, 나아가, 만약 B가 해당 분석대상물의 유사체에 결합되면, D는 해당 단백질의 결합 파트너에 결합되고, 만약 B가 해당 단백질의 결합 파트너에 결합되면, D는 해당 단백질의 유사체에 결합된다.
이 조성물의 특정 구체예에서는, 해당 분석대상물이 핵산이다. 이 조성물의 어떤 구체예에서는, 해당 분석대상물이 단백질이다.
관련 구체예에서, 본 발명은 하기의 성분을 함유하는, 시료 내 해당 핵산분자의 검출을 위한 조성물을 제공한다:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고; B는 A를 함유하는 폴리스티렌 비드이고, B는 해당 핵산분자의 유사체에 결합되거나 또는 해당 핵산분자의 특이적 결합 파트너에 결합되며; C는 해당 핵산분자를 함유할 수도 있는 시료이고; D는 해당 핵산분자의 유사체에 결합되거나 또는 해당 핵산분자의 특이적 결합 파트너에 결합되는 자기 비드이며; k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수인데, 단, B 및 D 중 하나만이 해당 핵산분자의 유사체에 결합되며; 나아가 만약 B가 해당 핵산분자의 유사체에 결합되면, D는 해당 핵산분자의 결합 파트너에 결합되고, 만약 B가 해당 핵산분자의 결합 파트너에 결합되면, D는 해당 핵산분자의 유사체에 결합된다.
특정 구체예에서는, 해당 핵산분자가 데옥시리보핵산(DNA)이다. 특정 구체예에서는, 해당 핵산분자가 리보핵산(RNA)이다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 하기의 성분을 함유하는, 시료 내 해당 단백질의 검출을 위한 조성물을 제공한다:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고; B는 A를 함유하는 폴리스티렌 비드이고, B는 해당 단백질의 유사체에 결합되거나, 또는 해당 단백질의 특이적 결합 파트너에 결합되며; C는 해당 단백질을 함유할 수도 있는 시료이고; D는 해당 단백질의 유사체에 결합되거나, 또는 해당 단백질의 특이적 결합 파트너에 결합되는 자기 비드이며; k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수인데, 단, B 및 D 중 하나만이 해당 단백질의 유사체에 결합되고, 나아가 만약 B가 해당 단백질의 유사체에 결합되면, D는 해당 단백질의 특이적 결합 파트너에 결합되고, 만약 B가 해당 단백질의 특이적 결합 파트너에 결합되면, D는 해당 단백질의 유사체에 결합된다.
추가적인 구체예는 본 발명의 특정 방법의 수행 및 특정 조성물의 형성에 유용한 키트(kit)를 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티; 해당 분석대상물의 유사체에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되는, ECL 모이어티를 함유하는 제1운반체; 및 해당 분석대상물의 유사체에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 제2운반체를 함유하는, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 키트를 제공한다.
당업자는 상기 기술한 방법, 조성물 및 키트가 포함되는 구체예 중 어느 것도 1개 이상의 ECL 모이어티를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것인데, 단 각 ECL 모이어티는 상이한 파장의 빛을 방출한다. 2개 이상의 ECL 모이어티를 함유하는 조성물, 방법, 및 키트가, 예컨대 시료 내에 1개 이상의 분석대상물을 검출하기 위해 이용될 수 있다.
당업자는 상기 기술한 방법, 조성물 및 키트가 포함되는 구체예 중 어느 것도 1개 이상의 ECL 모이어티를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것인데, 단 각 ECL 모이어티는 상이한 파장의 빛을 방출한다. 예컨대, 1개 이상의 분석대상물이 검출 될 수 있을 경우에는, 1개 이상의 ECL 모이어티가 유용하다.
본 발명의 추가적인 목적 및 유리한 효과는 하기의 설명에서 부분적으로 설명될 것이며, 부분적으로는 이 설명으로부터 자명하게 될 것이거나, 본 발명의 실시에 의해 알게될 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 유리한 효과는 첨부된 청구의 범위에서 특별히 지적하는 요소 및 이들의 조합을 수단으로 하여 실현 및 달성될 것이다.
전술한 개괄적 설명 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시적 및 설명적일 뿐이고, 청구한 바와 같은 본 발명의 제한은 아니다.
도 1은 해당 분석대상물이, ECL 표지를 함유한 제1운반체로서 또한 제공되는 폴리스티렌 비드에 결합된 DNA 분자인, 본 발명의 특정 구체예의 개략적인 다이어그램을 나타낸다. 또한 제2비드도 나타냈는데, 이는 자성이고, 폴리스티렌 비드에 결합된 DNA 분자에 상보적인 DNA 분자에 결합된 제2운반체로서 기능한다. 이 두 개의 DNA 분자는 결합하여 착물을 형성한다. 이 착물에 대한 자기장의 적용은 해당 분석대상물(예, DNA)의 분리 수단을 제공하고, ECL 표지의 검출은 해당 분석대상물의 검출 수단을 제공한다.
도 2는 직경이 10㎛인 카르복실레이트 폴리스티렌 비드의 형광 이미지를 나타낸다. 도 2(a)는 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2를 가둔 후의 비드를 나타내고, 도 2(b)는 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2가 적재된 비드의 표면 상에 아비딘(avidin)을 공유결합한 후의 비드를 나타낸다. 이용된 노출 시간은 30초였다. 표본은 λex 490nm에서 여기했다.
도 3은 프로브(probe) DNA-자기 비드 공액(DNA-MB), 및 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2를 함유하는 아비딘-코팅 폴리스티렌 비드에 공액된 상보적인 DNA(DNA-Ru(II)⊂PSB/아비딘으로 표현됨) 사이의 DNA 하이브리드화 후에 수득된 주사전자현미경(SEM) 이미지이다. 두 DNA 분자에 대하여 이용된 농도는 5μM이었고, PSB 및 MB의 크기는 각각 10㎛ 및 1.0㎛였다.
도 4는 스캔속도(scan rate)를 50mV/s로 하여 2.2mm 직경의 Pt 전극에서, 0.10M (TBA)BF4 전해액-0.10M 트리프로필아민(TPrA) 공반응물을 함유하는 아세토니트릴(MeCN) 내에 0.10μM Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2로부터 수득된 (a) 환식전류(CV) 및 (b) ECL 반응을 나타낸다. 비교 목적으로, TPrA의 부존재 하에서 0.10M (TBA)BF4를 함유한 MeCN 내에 1.0mM Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2의 CV를 (c)로 표현했다. (c)에서의 실험 조건은 (a) 및 (b)에서의 실험 조건과 같았으나, CV 전류는 10배로 했다.
도 5는 ECL 강도에 대한 (a) TPrA 및 (b) TPrA-트리플루오로아세트산(TFAA)의 농도 효과를 나타낸다. 모든 시료는 MeCN 내 0.10μM Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2 및 0.10M(TBA)BF4를 함유했다. 작동중인 전극은 직경이 2.2mm인 Pt 전극이었다. 스캔속도는 50mV/s이었다.
도 6은 TPrA-MeCN 시스템을 위한 ECL 배경의 제거를 나타낸다. (a)에서는 0.10M TPrA 및 0.10M (TBA)BF4-MeCN을 이용했다. (b)에서는, (a)에서와 같은 조건을 이용하되, 0.055M TFAA를 첨가했다. (c)에서는 (b)에서와 같은 조건을 이용하되 1.0%(v/v) H2O를 첨가했다. (d)에서는, 0.10M(TBA)BF4-MeCN을 이용했다. 도 6(e)는 (a) - (d)에서 표현한 상대적 ECL 강도를 나타낸다.
도 7은 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2의 농도의 함수로서 ECL 강도 (a) 및 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2가 적재된 10㎛ 직경의 폴리스티렌 비드의 수의 함수로서 ECL 강도 (b)를 나타낸다.
도 8은 DNA 하이브리드화의 ECL 검출을 나타낸다. 도 8(a)는 프로브 DNA-MB(1.0㎛) 및 표적 DNA-Ru(II)⊂PSB/아비딘(10㎛) 사이의 DNA 하이브리드화가 MB/PSB의 비율이 29일 때 일어났다는 것을 나타낸다. 도 8(b)는 프로브 DNA-MB(2.8㎛) 및 표적 DNA-Ru(II)⊂PSB/아비딘(10㎛) 사이의 DNA 하이브리드화가 MB/PSB의 비율이 4일 때 일어났다는 것을 나타낸다.
도 9는 10㎛직경의 비오티닐화된 PSB와 반응한, 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된 (a) 2.8㎛ 및 (b) 1.0㎛ 직경의 MB를 이용한 포아송(Poisson) 분포를 나타낸다. "결합 PSB%"는 반응 매체에서 MB-PSB 공액을 자기적으로 분리한 후 상청액에서 발견된 PSB의 수로부터 계산했다.
도 10은 플루오레세인 비오틴 적정 실험예서 수득된, 비오티닐화 23-mer-ss DNA(p-ss DNA)에 대한 (a) Ru(bpy)3 2+를 가두고 있는 10㎛ 직경의 스트렙타비딘-코팅 폴리스티렌 비드의 결합력, (b) 1.0㎛ 직경의 스트렙타비딘-코팅 자기 비드의 결합력, 및 (c) 2.8㎛ 직경의 스트렙타비딘-코팅 자기 비드의 결합력을 나타낸다.
도 11은 DPA(a) 및 RUB(b)의 분자구조를 나타낸다.
도 12는 방향족 탄화수소를 폴리스티렌 비드에 적재하는 절차에 있어서, 각 단계들을 표현한 흐름도이다.
도 13은 (a) DPA 적재 PSB; (b) RUB 적재 PSB; 및 (c) 단독 PSB 형광 이미지를 나타낸다.
도 14는 (a) MeCN에 용해된 DPA 적재 PSB 및 (b) 공반응물로서 TPrA를 사용한 0.25mM DPA 아세토니트릴 용액의 CV 및 ECL 거동(behavior)을 나타낸다.
도 15는 (a) MeCN에 용해된 RUB 적재 PSB 및 (b) 공반응물로서 TPrA를 이용한 35μM RUB 아세토니트릴 용액의 CV 및 ECL 거동을 나타낸다.
도 16은 ECL 신호와 C 반응성 단백질(CRP) 농도 사이의 상관관계를 나타낸다.
구체예의 설명
A. 정의
본원에서 사용하는 "항체"라는 용어는 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 또는 이들의 일부분을 의미하며, 그의 공급원, 생산 방법 또는 기타 특성과는 상관 없이 항원-결합 부위를 함유하는 임의의 폴리펩티드(polypeptide)를 포함하는 개념이다. 이 용어에는, 예컨대, 다클론성(polyclonal) 항체, 단클론성(monoclonal) 항체, 단특이성(monospecific) 항체, 다특이성(polyspecific) 항체, 인간화된 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 하이브리드 항체, 돌연변이 항체, 및 CDR-이식 항체가 포함된다. 항체의 부분에는 항원, 예컨대, Fab, F(ab')2, Fv, scFv를 결합시길 수 있는 임의의 절편이 포함될 수 있다.
본원에서 사용하는 "해당 분석대상물"이라는 용어는 시료 내에서 발견되는 바이러스의 세포 또는 세포질 성분이 포함되는, 임의의 분자, 또는 분자의 응집물을 의미한다. 또한 시료 내에서 발견되는 임의의 분자의 절편이 포함된다. 해당 분석대상물은 유기 화합물, 유기금속 화합물 또는 무기 화합물일 수 있다. 해당 분석대상물은 핵산(예, DNA, RNA, 플라스미드, 벡터, 또는 올리고뉴클레오티드), 단백질(예, 항체, 항원, 수용체, 수용체 리간드, 또는 펩티드), 리포단백질, 당단백질, 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 지질, 지방산, 비타민, 아미노산, 약제 화합물(예, 진정제, 바르비투르산염, 마취제, 알콜, 3고리 항울제, 벤조디아제핀, 항-바이러스제, 항-진균류 행생제, 스테로이드, 강심 배당체, 또는 전술한 것 중 임의의 대사산물), 호르몬, 성장인자, 효소, 조효소, 아포효소, 합텐(hapten), 레치틴(lechtin), 기질, 세포 대사산물, 세포질 성분 또는 세포기관(예, 멤브레인, 세포벽, 리보솜, 염색체, 미토콘드리아, 또는 세포골격 성분)일 수 있다. 이 정의에는 또한 독소, 살충제, 제초제, 및 환경 오염물질이 포함될 수 있다. 이 정의에는 추가적으로 본 정의에서 설명한 예들 중 임의의 것을 1 이상 함유하는 착물이 포함된다.
본원에서 사용하는 "해당 분석대상물의 유사체"라는 용어는 특이적 결합 파트너에 결합하기 위해 해당 분석대상물과 경쟁하는 물질이다. 해당 분석대상물의 유사체는 특이적 결합 파트너에 결합하기 위해 시료 내에 존재하는 해당 분석대상물과 경쟁하도록 첨가되는 공지된 양의 해당 분석대상물 자체일 수 있다.
본원에서 사용하는 "운반체"라는 용어는, 물질을 캡슐화하는 1 이상의 고체 또는 액체를 의미한다. 운반체는 유기 또는 무기 화합물을 함유할 수 있으며, 하기의 목적 중 적어도 하나를 위해 이용될 수 있다: 시료를 제시, 특이적 결합 파트너를 제시, 또는 ECL 모이어티를 함유 또는 가둠. 운반체는 뒤에 보다 자세히 설명된다.
본원에서 사용하는 "함유하는" 또는 "함유된"이라는 용어는 운반체의 내부와 ECL 모이어티 사이의 비-특이적 회합(association)을 의미하는데, 이는 ECL 모이어티와 운반체가 서로 물리적으로 접촉하는 상태에 있지만, 필수적으로 부착되어 있는 것은 아니다. 본 발명의 특정 구체예에서, 운반체 내에 함유된 ECL 모이어티는 운반체에 결합될 수 있다. 특정 구체예에서, 운반체 내에 함유된 모이어티는 운반체에 결합되지 않는다. 함유한/함유된이라는 용어는 "내포된/내포한", 및 "갇힌/가두는"이라는 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용하는 "하이브리드화"라는 용어는 하나의 뉴클레오티드 서열과 제2의 뉴클레오티드 서열이 적절한 조건 하에서 듀플렉스(duplex)를 형성하는 것을 의미한다. 어떤 구체예에서, 적절한 조건은 엄격한 조건일 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며 다른 환경에서는 상이하게 될 것이다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드 한다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.] 및 문헌[Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assocaites and Wiley Interscience, N.Y]을 참조하라). 일반적으로, 엄격한 조건은 지정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열적 용융점(Tm)보다 낮은 약 5℃가 되도록 선택된다. 이 Tm은 표적 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 하이브리드하는 시점의 온도(지정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서)이다. 전형적으로 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 나트륨 이온 약 1.0M 미만, 전형적으로는 나트륨 이온 농도(또는 기타 염)가 약 0.05 내지 1.0M이고, 온도는 짧은 프로브(예, 10 내지 50 뉴클레오티드)에 대하여는 적어도 약 30℃ 및 긴 프로브(예, 50뉴클레오티드보다 긴)에 대하여는 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드(formamide)와 같은 불안정화제를 첨가하여 달성될 수 있다. 용액의 포름아미드 농도가 1%씩 증가하면 DNA 듀플렉스의 Tm은 약 0.7℃만큼 낮아진다.
하이브리드화는 100% 상보적인, 즉 이중나선 핵산의 두 가닥 사이에 미스매치가 존재하지 않는 경우의 폴리뉴클레오티드 사이에서 일어날 수 있다. 하이브리드화는 또한 이중나선 핵산의 두 가닥 사이에 미스매치가 존재할 경우에도 일어날 수 있다. 본원에서 사용하는 상보적인 하이브리드화는 이중나선 핵산의 두 개의 하이브리드화된 가닥 사이에 1개 이하의 미스매치가 존재하는 핵산의 두 가닥 사이에서의 하이브리드화를 언급하는 것이다.
본원에서 사용하는 "결합된"이라는 용어는 두 모이어티 사이의 직접적인 공 유결합, 두 모이어티 사이에 직접적인 비공유결합, 및 1 이상이 추가적인 모이어티에 의해 중개되는 두 모이어티 사이의 간접적인 공유 결합을 포함한다. 예를 들어, 두 모이어티 사이의 직접적인 공유결합에는 두 아미노산 사이의 아미드 결합이 포함될 수 있고, 두 모이어티 사이의 직접적인 비공유결합에는 금속과 염기 사이의 염을 형성하기 위한 이온 상호작용, 또는 두 물 분자 사이의 수소결합이 포함될 수 있다. 1개 이상의 추가적인 모이어티에 의해 중개된 두 모이어티 사이의 간접적인 결합에는 Ig 퓨전 단백질과 같은 퓨전 단백질 및 TNF 수용체와 같은 수용체가 포함될 수 있는데, Ig 및 TNF 수용체 사이의 결합은 링커, 예컨대 Ig 또는 TNF 수용체에서 기원한 것이 아닌 짧은 아미노산 서열에 의해 중개된다.
"결합된"이란 용어는 당해 분석대상물에 의해 중개되는 결합을 포함하는 개념은 아니다.
본원에서 사용하는 "자화성"이란 용어는 물질의 물성을 언급하는 것인데, 여기서 이 물질의 침투성은 자유 공간의 침투성과 차이가 있다. 이 용어는 상자성 및 초상자성의 개념을 포함한다.
본원에서 사용하는 "핵산"이란 용어는 단일가닥 또는 이중가닥의 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보튜클레오티드로 구성된 중합체를 말한다. 전형적으로 단일가닥의 핵산은 100보다 많은 염기를 함유할 것이고, 이중가닥은 100보다 많은 염기쌍을 함유한다. "핵산"이라는 용어는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드뿐만 아니라, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 보유한 천연 뉴클레오티드의 유사체(analogue)도 포함되는 핵산을 아우르는 개념이다. 핵산이라는 용어에는 또한 cDNA 또는 유전자로 암호화된 mRNA도 포함된다. 핵산은 예컨대 수소결합을 통한 상보적인 염기 짝짓기에 의하여 그의 보체에 하이브리드할 수 있을 것이다.
본원에서 사용하는 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 길이가 전형적으로 100 염기 이하인 단일가닥 핵산을 말한다. 물론, 상보적인 올리고뉴클레오티드도 어닐링되어 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드에는 천연(즉, A, G, C, T, 또는 U) 또는 변형된 염기가 포함될 수 있다. 이외에도, 올리고뉴클레오티드 내 염기는 가닥 소로간의 염기 짝지음을 저해하지 않는 한, 포스포디에스테르 결합 이외의 결합에 의해 연결될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드는 성분요소인 염기가 포스포디에스테르 결합보다는 펩티드 결합으로 연결된 펩티드-핵산일 수 있다.(예컨대, 문헌[Nielson, 2001, Current Opinion in Biotechnology 12:16] 참조). 당업자에게는 올리고뉴클레오티드가 프로브 서열과의 완벽한 상보성이 결여된 서열과 하이브리드될 수 있고, 본원에 기술된 방법이 완벽하게 상보적인 결합 및 보다 덜 상보적인 결합을 구별하는데 이용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 선택적으로 이 올리고뉴클레오티드가 방사성동위원소, 발색단, 루미포어(lumiphore), 색소원, 또는 ECL 모이어티로 직접 표지될 수 있거나, 또는 스트렙타비딘 또는 아비딘 착물이 나중에 결합할 수 있는, 예컨대 비오틴으로 직접 표지될 수 있다.
본원에서 사용하는, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 2 뉴클레오티드 이상 내지 100 뉴클레오티드 미만을 함유한 중합체를 의미한다.
본원에서 사용하는, "시료"라는 용어는 생물계에서 유도 또는 생물계에서 비 롯된 임의의 표본을 의미한다. 생물계에는 생태계(예, 물, 공기 또는 토양 표본) 또는, 유기체(예, 식물, 동물, 균류, 박테리아, 기타 진핵생물 또는 원핵생물), 또는 바이러스 또는 프리온(prion)이 포함된다. 이 시료는 해당 분석대상물을 함유할 수 있다. 시료라는 용어에는 또한 분리된, 예컨대 정제된 해당 분석대상물이 포함될 수 있다.
본원에서 사용하는 "특이적 결합 파트너(specific binding partner)"라는 용어는 생리적인 조건 하에서 제2분자와 비교적으로 안정한 착물을 형성할 수 있는 제1분자를 의미한다. 일반적으로, 특이적 결합은 비교적 높은 친화fur 및 비교적 낮은 수용 완화력을 특징으로 한다. 비특이적 결합은 통상 높은 수용 능력을 완화함과 함께 낮은 친화력을 보유한다. 전형적으로, 결합은 친화력 상수 Ka가 약 106M-1보다 높은 경우 또는 108M-1보다 높은 경우에 특이적이라고 여겨진다. 보다 높은 친화력 상수는 더 큰 친화력 및 이에 따라서 더 큰 특이성을 나타낸다. 항체는 전형적으로 106M-1 내지 109M-1 범위 또는 이보다 높은 친화력 상수를 가진 항원과 결합한다. 원한다면, 비특이적 결합은, 결합 조건을 다양화하여 특이적 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않고 감소시킬 수 있다. 그러한 조건은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자는 일상적인 기법을 이용하여 적절한 조건을 선택할 수 있다. 예를 들면, 이 조건은 분자 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합에 허용된 시간, 비연관 분자의 농도(예, 혈청 알부민, 우유 카제인) 등으로 정의될 수 있다.
특이적 결합 파트너의 예에는 상보적인 핵산 서열(예, 서로 하이브리드하는 두 DNA 서열; 서로 하이브리드하는 두 RNA 서열; 또는 서로 하이브리드 하는 DNA 및 RNA 서열), 항체와 항원, 수용체와 리간드(예, TNF와 TNFr-I, CD142와 Vlla 인자, B7-2와 CD28, HIV-1rhk CD4, ATR/TEM8 또는 CMG와 탄저균 독소의 방어 항원의 모이어티), 효소와 기질, 또는 분자와 결합 단백질(예, 비타민 B12와 내재성인자, 폴레이트와 폴레이트 결합 단백질)이 포함된다. 특이적 결합 파트너는 또한 특이적 결합파트너를 자연적으로 발생시키는 유사체일 수 있다. 유사체의 예에는 아지도티미딘(AZT), HIV 역전사효소와 결합하는 뉴클레오티드의 유사체, 퓨로마이신(puromycin), 아미노아실-tRNA의 터미널 아미노아실아데노신 부분의 아닐로그, 및 메토트렉세이트(methotrexate), 테트라하이드로폴레이트의 유사체가 포함된다. 기타 유사체는 해당 분석대상물의 유도체일 수 있다.
B. 전기발광 화학발광 물질
특정 구체예에서, 본 발명은 ECL을 이용한 시료 내에 해당 분석대상물을 검출을 제공한다. 이 ECL 모이어티는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 공반응물의 존재 하에 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있다. 어떤 구체예에서, 이 ECL 모이어티는 금속-함유 유기화합물을 함유할 수 있는데, 여기서 이 금속은 예컨대, 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 플레티넘, 팔라듐, 몰리브덴, 및 테크네튬에서 선택될 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 금속은 루테늄 또는 오스뮴일 수 있다. 이 금속은 또한 예컨대, 세륨, 디스프로슘, 에르븀, 유로퓸, 가돌리늄, 홀뮴, 란타늄, 루테튬, 네오디뮴, 프라세오디뮴, 프로메튬, 테르븀, 툴륨, 및 이테르븀이 포함되나 이에 한정되지는 않는 희토류 금속에서 선택될 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 금속은 세륨, 유로퓸, 테르븀, 또는 이테르븀이다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 금속-함유 ECL 모이어티는 하기의 화학식을 가지는데,
M(P)m(L1)n(L2)o(L3)p(L4)q(L5)r(L6)s
상기 식에서 M은 금속이고; P는 M의 폴리덴테이트 리간드이고; L1, L2, L3, L4, L5 및 L6는 M의 리간드인데, 이들 각각은 서로 동일한, 또는 다른 리간드일 수 있으며; m은 1보다 크거나 같은 정수이고; n, o, p, q, r 및 s 각각은 0보다 크거나 같은 정수이며; P, L1, L2, L3, L4, L5 및 L6는 ECL 모이어티가 전자기적 방사선을 방출하도록 유도될 수 있고 M의 리간드에 의해 제공되는 M에 대한 결합의 총 수가 M의 배위수와 같도록 되는 조성 및 수이다.
본 발명의 어떤 구체예에서, M은 루테늄이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, M은 오스뮴이다.
본 발명의 특정 구체예에서, ECL 모이어티는 M의 한 폴리덴테이트 리간드를 갖는다. 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 1개 이상의 폴리덴테이트 리간드를 갖는 다. M의 1개 이상의 폴리덴테이트 리간드를 함유한 구체예에서, 폴리덴테이트 리간드는 동일 또는 상이할 수 있다. 폴리덴테이트 리간드에는 방향족 및 지방족 리간드가 포함된다. 적절한 방향족 폴리덴테이트 리간드에는 방향족 헤테로고리 리간드가 포함되고, 이는 질소를 함유할 수 있는데, 예컨대, 비피리딜, 비피라질, 터피라질, 1,10 페난트롤린, 및 포르피린 등이 있다.
적절한 폴리덴테이트 리간드는 치환되지 않을 수 있거나, 또는 당업계에 공지된 다수의 치환체 중 임의의 것으로 치환될 수 있다. 적절한 치환체에는 예컨대, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, 카르복실레이트, 카르복살데히드(carboxaldehyde), 카르복사미드(carboxamide), 시아노, 아미노, 하이드록시, 이미노, 하이드록시카르보닐, 아미노카르보닐, 아미딘, 구아니디늄, 우레이드, 말레이미드 황-함유 그룹, 인 함유 그룹, 및 N-하이드록시석신이미드의 카르복실레이트 에스테르가 포함된다.
추가적으로, L1, L2, L3, L4, L5 및 L6 중 적어도 하나는 폴리덴테이트 방향족 헤테로고리 리간드일 수 있다. 더욱이, 이러한 폴리덴테이트 방향족 헤테로고리 리간드 중 적어도 하나는 질소를 할 수 있다. 적절한 폴리덴테이트 리간드에는 비피리딜, 비피라질, 터피리딜, 1,10 페난트롤린, 포르피린, 치환된 비피리딜, 치환된 비피라질, 치환된 터피리딜, 치환된 1,10 페난트롤린 또는 치환된 포르피린이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 치환된 폴리덴테이트 리간드는 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, 카르복실레이트, 카르복 살데히드, 카르복사미드, 시아노, 아미노, 하이드록시, 이미노, 하이드록시카르보닐, 아미노아르보닐(aminoarbonyl), 아미딘, 구아니디늄, 우레이드, 말레이미드 황-함유 그룹, 인함유 그룹 또는 N-하이드록시석신이미드의 카르복실레이트 에스테르로 치환될 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 2개의 두자리(bidentate) 리간드를 함유할 수 있는데, 이들 각각은 비피리딜, 비피라질, 터피리딜, 1,10 페난트롤린, 치환된 비피리딜, 치환된 비피라질, 치환된 터피리딜, 치환된 1,10 페난트롤린을 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, ECL 모이어티는 3개의 두자리 리간드를 함유할 수 있는데, 이들 가각은 비피리딜, 비피라질, 터리리딜, 1,10 페난트롤린, 치환된 비피리딜, 치환된 비피라질, 치환된 터피리딜 또는 치환된 1,10 페난트롤린일 수 있다. 이 ECL 모이어티는 루테늄을 함유할 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 루테늄, 2개의 두자리 비피리딜 리간드, 및 1개의 치환된 두자리 비피리딜 리간드를 함유할 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 포르피린 또는 치환된 포르피린과 같은 네자리 리간드를 함유할 수 있다.
이 ECL 모이어티는 1개 이상의 한자리 리간드를 가질 수 있는데, 다양한 한자리 리간드가 당업계에 공지되어 있다. 적절한 한자리 리간드에는, 예를 들어, 일산화탄소, 시안화물, 이소시안화물, 할로겐화물, 및 지방족, 방향족 및 헤테로고리 포스핀, 아민, 스티빈 및 아르신이 포함된다.
이러한 ECL 모이어티의 특정 구체예는 비스(2,2'-비피리딜)루테늄(II) 및 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄(II)을 함유할 수 있다.
추가적인 화학적 표지, 예컨대 방사성 동위원소, 형광 성분, 또는 추가적 발광 루테늄- 또는 오스뮴-함유 중심이 부착된 M의 1개 이상의 리간드도 본 발명의 범주 내에 속한다.
본 발명의 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄(II) 테르라키스(펜타플루오로페닐)보레이트이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 비스[(4,4'-카르보메톡시)-2,2'-비피리딘]2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)프로필]-1,3-디옥솔란 루테늄(II)이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 비스(2,2'-비피리딘)[4-(부탄-1-알)-4'-메틸-2,2'-비피리딘]루테늄(II)이다. 본 발명의 추가적인 구체예에서, ECL 모이어티는 비스(2,2'-비피리딘)[4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)부티르산]루테늄(II)이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 비스(2,2'-비피리딘)[시스-비스(1,2-디페닐포스피노)에틸렌]{2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)프로필]-1,3-디옥솔란}오스뮴(II)이다. 본 발명의 또 다른 추가 구체예에서, ECL 모이어티는 비스(2,2'비피리딘)[4-4'-메틸-2,2'-비피리딘)-부틸아민]루테늄(II)이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, ECL 모이어티는 비스(2,2'-비피리딘)[1-브로모-4(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)부탄]루테늄(II)이다. 본 발명의 또 다른 추가 구체예에서, ECL 모이어티는 비스(2,2'-비피리딘)말레이미도헥사온산, 4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-부틸아미드 루테늄(II)이다.
본 발명의 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 금속을 함유하지 않고, 예를 들어 루브렌(rubrene) 또는 9,10-디페닐안트라센일 수 있다.
어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 운반체에 함유 또는 내포될 수 있다. 운반체 내에 내포된 또는 운반체에 흡수된 ECL 분자의 수는 ECL 분자의 크기 및 운반체의 크기에 좌우될 것이다. 운반체는 1×102 - 1×1020, 1×102 - 1×1015, 1×104 - 1×1012, 1×102 - 1×1010, 1×106 - 1×1010, 1×106 - 1×109개의 ECL 분자를 함유할 수 있다. 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 운반체에 함유 또는 내포될 수 있고, 운반체의 표면에, 예컨대 공유결합 또는 비공유 상호작용에 의해 결합될 수 있다.
본원에서 사용하는 "ECL 공반응물"이란 용어는 그 자체에 의해 또는 그것의 전기화학적 환원 산화 생성물(들)을 통하여 일련의 ECL 반응에 있어서 역할을 수행하는 화학적 화합물을 의미한다.
종종 ECL 공반응물은 보다 단순한 ECL 방출 수단의 이용(예컨대, 2단계 산화-환원 사이클의 절반만 이용) 및/또는 개선된 ECL 강도를 허용할 수 있을 것이다. 어떤 구체예에서는, 공반응물이 전기화학적 산화/환원 반응 시, 직접적으로 강한 산화 또는 환원 종을 용액 내에 산출하거나 추가 반응 시에 강한 산화 또는 환원 종을 용액 내에 산출하는 화학적 화합물일 수 있다. 공반응물은 비가역적으로 전기-환원되어 산화성 SO4·-이온을 형성하는 퍼옥소디설페이트(즉, S2O8 2 -, 퍼설페이트)일 수 있다. 공반응물은 또한 비가역적으로 전기-산화되어 환원적 CO2·- 이온을 형 성하는 옥살레이트(즉, C2O4 2 -)일 수 있다. 환원제로서 작용할 수 있는 일군의 공반응물은 아민 또는 아민기를 함유하는 화합물인데, 이에는 예를 들어 트리-n-프로필아민(즉, N(CH2CH2CH2)3, TPrA)이 포함된다. 어떤 구체예에서는, 3차 아민이 2차 아민보다 더 양호한 공반응물일 수 있다. 어떤 구체예에서는, 2차 아민이 1차 아민보다 더 양호한 공반응물일 수 있다.
공반응물에는 린코마이신; 클린다마이신-2-포스페이트; 에리트로마이신; 1-메틸피롤리돈; 디페니돌; 아트로핀; 트라조돈; 하이드로플루메티아지드; 하이드로클로로티아지드; 클린다마이신; 테트라사이클린; 스트렙토마이신; 겐타마이신; 레세르핀; 트리메틸아민; 트리-n-부틸포스핀; 피페리딘; N,N-디메틸아닐린; 페니르아민(pheniramine); 브로모페니르아민; 클로로페니르아민; 디페닐하이드라민(diphenylhydramine); 2-디메틸아미노피리딘; 피릴아민; 2-벤질아미노피리딘; 류신(leucine); 발린; 글루탐산; 페닐알라닌; 알라닌; 아르기닌; 히스티딘; 시스테인; 트립토판; 티로신; 하이드록시프롤린; 아스파라긴; 메티오닌; 트레오닌; 세린; 사이클로티아지드; 트리클로르메티아지드; 1,3-디아미노프로판; 피페라진, 클로로티아지드; 하이드라지노탈라진; 바르비투르산; 퍼설페이트; 페니실린; 1-페페리디닐 에탄올; 1,4-디아미노부탄; 1,5-디아미노펜탄; 1,6-디아미노헥산; 에틸렌디아민; 벤젠설폰아미드; 테트라메틸설폰; 에틸아민; 디-에틸아민; 트리-에틸아민; 트리-이소-프로필아민; 디-n-프로필아민; 디-이소-프로필아민; 디-n-부틸아민; 트리-n-부틸아민; 트리-이소-부틸아민; 비-이소-부틸아민; s-부틸아민; t-부틸아민; 디- n-펜틸아민; 트리-n-펜틸아민; n-헥실아민; 하이드라진 설페이트; 글루코스; n-메틸아세트아미드; 포스포노아세트산; 및/또는 이들의 염이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
공반응물에는 또한 N-에틸모르폴린; 스파르테인; 트리-n-부틸아민; 피페라진-1,4-비스(2-에탄설폰산)(PIPES); 트리에탄올아민; 디하이드로니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드; 1,4-디아조비사이클로(2.2.2)옥탄; 에틸렌디아민 테트라아세트산; 옥살산; 1-에틸피페리딘; 디-n-프로필아민; N,N,N',N'-테트라프로필-1,3-디아미노프로판; DABAM-4, 폴리프로필렌이민 테트라아민 덴드리머; DAB-AM-8, 폴리프로필렌이민 옥타아민 덴드리머; DAB-AM-16, 폴리프로필렌이민 헥사데카아민 덴드리머; DAB-AM-32, 폴리프로필렌이민 도트리아콘타아민(dotriacontaamine) 덴드리머; DAB-AM-64, 폴리프로필렌이민 테트라헥사콘타아민 덴드리머; 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산; 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판설폰산; 글리실-글리신; 2-모르폴리노에탄설폰산; 2,2-비스(하이드록시메틸)-2,2',2''-니트릴로트리에탄올; N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산; N,N-비스(2-하이드록시에틸)타우린; N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산); N,N-비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산; 4-(N-포르폴리노)부탄설폰산; 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-(2-하이드록시프로판설폰산) 하이드레이트; 피페라진-1,4-비스(2-하이드록시프로판설폰산) 디하이드레이트; 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-프로판설폰산; N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신; N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산); 및/또는 이들의 염이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 ECL 측정은 아세토니트릴과 같은 유기 용매 내에서, 부분적으로 수성인 계, 또는 수성인 계 내에서 이루어질 수 있다. ECL 모이어티의 전기화학적 환원을 위한 적절한 전극은, 예컨대 Pt 전극 또는 Pt와 Ir의 합금으로 구성된 전극일 수 있다.
C. 운반체
특정 구체예에서, 본 발명은 해당 분석대상물의 검출에 이용될 수 있는 제1운반체 및 제2운반체를 제공한다. 제1운반체 및 제2운반체는 시료의 제시, 특이적 결합 파트너의 제시, ECL 모이어티의 함유 또는 가둠, 및 해당 분석대상물과 특이적 결합 파트너 사이에 형성된 착물을 조성물의 다른 성분과 분리하는 수단을 제공하는 것을 포함한 몇몇 기능 중 적어도 하나를 제공할 수 있다.
제1운반체 또는 제2운반체 중 하나는 ECL 모이어티를 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, ECL 모이어티는 운반체 네에 함유될 수 있다. ECL 모이어티는 운반체 내에 함유되어 있고, 본 발명은 예컨대 용매의 성질과 같은 특정 조건을 변화시켜, 운반체로부터 ECL 모이어티의 신속한 방출을 제공한다. 특정 구체예에서, 예컨대 운반체가 플라스틱과 같은 물질로 구성된 고체 지지체일 경우, ECL 모이어티는 운반체에 혼합되지 않는다. 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 운반체의 표면에 공유적으로 결합될 수 있고, 운반체 내에 함유될 수 있다. 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 운반체 내에 포함될 수 있고, 운반체의 표면에 흡수될 수 있다. 제1운반체는 선택적으로 해당 분석대상물을 함유하는 시료로 구성될 수 있다. 특정 구체예에서는, 시료가 제1운반체의 표면에 결합될 수 있는데, 이로써 시료가 특이적 결 합 파트너와 결합할 수 있게 한다. 그러나, 특정 구체예에서는, 시료가 제1운반체 또는 제2운반체에 결합될 수 없다. 이러한 구체예에서는, 시료가 용매 내에 존재할 수 있다.
특정 구체예에서, 제1운반체 또는 제2운반체 중 하나는 해당 분석대상물의 특이적 결합 파트너를 함유할 수 있다. 이 특이적 결합 파트너는 제1운반체의 표면에 결합될 수 있고, 이로써 제1운반체가 해당 분석대상물의 결합에 대해 접근하기 쉽도록 만든다.
제2운반체를 함유하는 본 발명의 구체에에서, 이 제2운반체는 해당 분석대상물의 특이적 결합 파트너를 함유할 수 있다. 이 특이적 결합 파트너는 제2운반체의 표면에 결합될 수 있고, 이로써 제2운반체가 해당 분석 대상물에 대한 결합에 대해 접근하기 쉽도록 만든다. 이 제2운반체는 해당 분석대상물과 특이적 결합 파트너 사이에 형성된 착물을 분리하는 수단을 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 제2운반체는 해당 분석대상물과 특이적 결합 파트너 사이에 형성된 착물을 조성물 내 다른 성분과 분리하는 수단을 제공할 수 있다. 예를 들어, 제2운반체는 해당 분석대상물과 특이적 결합 파트너 사이에 형성된 착물이 조성물 내 다른 성분과 자석을 이용하여 분리되도록 자화될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 착물을 조성물의 다른 성분과 분리시키는데 이용된 자석은, 예컨대 미국 특허 제5,935,779호 및 제6,325,973호에 기술된 바와 같은 시스템에 전기화학적 에너지를 주입하는데 이용될 수 있는 전극에 인접하여 위치할 수 있다.
특정 구체예에서, 제1운반체 및 제2운반체 중 적어도 하나는 고체 지지체일 수 있다. 어떤 구체예에서는, 제1운반체 및 제2운반체 모두가 고체 지지체이다. 이 고체 지지체는 입자, 즉 적어도 한쪽의 치수가 1000㎛보다 큰 길이를 가진 중합체, 나노입자, 즉 적어도 한쪽의 치수가 1-1000nm 범위의 길이를 가진 중합체, 또는 마이크로입자, 즉 1000nm보다 큰 길이를 가졌으나 적어도 한쪽의 치수에 있어서 1000㎛ 이하의 길이를 가진 중합체를 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 이 고체 지지체는 불규칙적 또는 규칙적 형상, 예컨대 구형, 정육면체형, 원뿔형이 포함되는 3차원 형태를 가질 수 있다.
이 고체 지지체는 비드, 겔 또는 멤브레인을 함유할 수 있다. 멤브레인은, 예컨대 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리비닐리덴 플로라이드(PVDF) 또는 카르복실레이티드 폴리비닐리덴(미국 특허 제6,037,124호)를 함유할 수 있다. 이 멤브레인은 폴리비닐 벤질 디메틸 하이드록시에틸 암모늄 클로라이드, 폴리비닐 벤질 벤조일 아미노에틸 디메틸 암모늄 클로라이드, 폴리비닐 벤질 트리부틸 암모늄 클로라이드, 폴리비닐 벤질 트리헥실 암모늄 클로라이드와 폴리비닐 벤질 트리부틸 암모늄 클로라이드의 공중합체, 폴리비닐 벤질 벤질 디메틸 암모늄 클로라이드와 폴리비닐 아미노에틸 디메틸 암모늄 클로라이드의 공중합체 및 폴리비닐 벤질 페닐 우레이도에틸 디메틸 암모늄 클로라이드와 폴리비닐 벤질 벤질 디메틸 암모늄 클로라이드의 공중합체(미국 특허 제5,335,596호)로 코팅될 수 있다. 이 고체 지지체는 해당 분석 대상물 및/또는 시료의 특이적 결합 파트너와 결합될 수 있는 임의의 물질(예, 폴리스티렌, 세파로스, 세파덱스) 및/또는 ECL 모이어티를 함유 또는 가둘 수 있는 임의의 물질을 함유할 수 있다. 고체 지지체는 폴리아크릴릭, 비닐 중합체, 아크릴 레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아실로니트릴, 및 폴리올레핀과 같은 임의의 합성 유기 중합체를 함유할 수 있다. 고체 지지체는 또한 카르보하이드레이트 중합체, 예컨대 아가로스, 셀룰로스, 히알루론산(hyaluronic acid), 키틴, 아실 겔란, 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸 녹말, 카르복시메틸 키틴, 폴리(락티드-코-에틸렌 글리콜)을 함유할 수 있다. 고체 지지체는 실리카, 지르코니아, 예컨대, 탄소 클래드 지르코니아(미국 특허 제5,182,016호), 티타니아, 세리아, 알루미나, 망간, 마그네시아(즉, 산화마그네슘), 산화칼슘, 조절 다공성 유리(controlled pore glass(CPG))와 같은 무기 산화물을 함유할 수 있다. 고체 지지체는 또한 덱스트란-아크릴아미드가 포함되나 이에 한정되지 않는 상기 언급한 지지체 중 몇몇의 혼합물을 함유할 수 있다. 고체 지지체는 특이적 결합 파트너 및/또는 해당 분석대상물과의 비특이적 상호작용을 최소화하도록 제조될 수 있다.
제1운반체 또는 제2운반체 중 적어도 하나가 고체 지지체인 특정 구체예에서, 고체 지지체는 수용액 환경에서는 불용성이나, 유기 환경, 예컨대 아세토니트릴, 에테르, 클로로포름, 벤젠 내에서는 용해성일 수 있다. ECL 모이어티가 그러한 고체 지지체에 갇혀 있거나, 기타 다른 방법으로 연합되어 있는 구체예에 대해서는, 고체 지지체를 유기 환경에 위치시킴에 의해 ECL 모이어티가 방출될 수 있고, 이로써 ECL 모이어티의 검출을 촉진한다. 유기 환경에는 70 - 100%, 80 - 100%, 90 - 99%, 99 - 99.99% 유기용매(부피/부피)인 용매가 포함될 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에서는, 제1운반체 또는 제2운반체 중 적어도 하나가 30℃ - 60℃ 범위의 융해점을 갖는 겔, 예컨대 저온 융해성 아가로스이다. 이러한 구체예에서, ECL 모이어티를 함유한 운반체의 융해점 이상에서 착물을 가열하면 ECL 모이어티가 방출될 것이고, 이로써 검출이 촉진된다.
특정 구체에에서, 고체 지지체는 비드, 예컨대 폴리스테렌 비드이다. 제1운반체 및 제2운반체 모두가 비드인 구체예에서는, 제1운반체가 그 내부에 함유한 또는 가두고 있는 ECL 모이어티를 가질 수 있고, 제2운반체는 자화성 비드일 수 있다. ECL-함유 비드 및 자화성 비드는 모두 0.1㎛-100㎛, 0.5㎛-50㎛, 1㎛-20㎛, 또는 0.5㎛-10㎛ 범위의 직경을 보유할 수 있다. 어떤 구체예에서는, 제1운반체는 직경이 10㎛일 수 있고, 제2운반체는 직경이 1㎛일 수 있다. 어떤 고체예에서는, 제1운반체는 직경이 10㎛일 수 있고, 제2운반체는 직경이 2.8㎛일 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 운반체 중 적어도 하나는 액체를 함유할 수 있다. 이 액체는 1개 이상의 양친매성 분자를 함유할 수 있다. 양친매성 분자는 극성 및 비극성 부분을 모두 가지고, 수용액 환경 내에서 미셀(micelle)과 같은 응집물을 형성할 수 있는 분자이다. 따라서, 미셀은 팔미테이트 또는 올레이트와 같은 임의의 지방산 이온으로 구성될 수 있다. 미셀은 1 이상의 비-이온성 세정제, 예컨대 트리톤 X-100, 또는 옥틸-β-D-글루코시드를 함유할 수 있다. 미셀은 1 이상의 이온성 세정제, 예컨대 소듐 도데실 설페이트, 데옥시콜레이트(deoxycholate), 리솔레시틴(lysolecithin)을 함유할 수 있다. 어떤 구체예에서, 미셀은 이온성 세정제 및 비이온성 세정제를 모두 함유할 수 있다.
따라서 특정 구체예에서, 제1운반체 및 제2운반체 중 적어도 하나는 미셀일 수 있다. 이 미셀은 시료에 결합되어 해당 분석대상물이 미셀의 표면에 노출되게 할 수 있고, 이로써 특이적 결합 파트너가 해당 분석대상물과 접촉하게 한다. ECL 모이어티는 미셀의 내부에 함유될 수 있다. 따라서, 예컨대 교반 또는 초음파, 또는 산화 또는 환원을 통한 미셀의 붕괴는 ECL의 방출 수단을 제공할 것이고, 해당 분석대상물의 검출을 촉진할 것이다.
특정 구체예에서, 운반체는 리포솜일 수 있다. 리포솜은 인지질이 수화될 때 형성되는 현미경적 구형 운반체이다. 낮은 전단 조건 하에 물에서 혼합될 경우, 인지질은 자체적으로 시트로 배열하고, 분자는 "머리"는 위쪽으로 "꼬리"는 아래쪽으로 되는 배향으로 나란히 배열된다. 이후, 이러한 시트는 꼬리-대-꼬리로 결합되어 수성 중심을 가진 인지질 구 내에 2층 멤브레인을 형성한다. 리포솜은 균일한 크기, 예컨대 직경이 200nm일 수 있다. 리포솜은 계면활성제 또는 기타 유화제를 사용하지 않고도 함께 사용될 수 있도록, 수용성 및 불수용성 물질일 수 있다. 수용성 물질은 인지질이 수화되어 물에 용해되고, 이 경우 이러한 물질 유래의 리포솜은 수성 중심에 갇혀있다. 리포솜 벽은 인지질 멤브레인인데, 오일과 같은 지방 용해성 물질을 보유한다. 리포솜은 안정화된 천연의 인지질 혼합물, 합성 동일-사슬 인지질, 글리코리피드-함유 리포솜, 양극성 지방산, 메틸/메틸렌 x-결합, 리포프로틴-고팅, 또는 카보하이드레이트-코팅으로 구성될 수 있다. 시료는 리포솜의 표면에 제시되어 특이적 결합 파트너 또는 시료의 결합을 촉진시킬 수 있다. 리포솜은 그 내부(즉 수성 중심 또는 주변을 감싸고 있는 지질 내에) ECL 모이어티를 함유할 수 있는데, 이는 예컨대 미국 특허 제6,706,861호를 참조하길 바란다.
D. 시료 또는 특이적 결합 파트너를 운반체에 결합하는 방법
해당 분석 대상물 또는 특이적 결합 파트너를 함유하는 시료는 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 운반체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 가교결합 시약이 단백질 및 핵산에 이용될 수 있다(문헌[Lund et al. 1988, Nucleic Acids Res. 16:10861]). 유사하게, 광반응 가교결합 시약이 핵산 및 단백질 모두에 대하여 이용되어 왔다(문헌[Penchovsky et al. 2000, Nucleic Acids Res. 28(22):98; Harrison et al. 1989, Biochemistry 28:6023). 적절한 수단의 선택은 시료의 성질 및 운반체의 성질에 좌우될 것이다. 예를 들어, 결합은 공유결합, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 반데르발스 상호작용, 또는 수소결합과 같은 비-공유 상호작용에 의할 수 있다. 당업자는 시료를 운반체에 결합하는 방법을 잘 선택할 것이다.
특정 구체예에서는, 리간드가 리간드 상의 특정 작용기(예, 1차 아민, 설프하이드릴(sulfhydryl), 카르복시산, 알데히드)와 운반체 상의 반응기 사이의 공유적인 화학 결합을 형성함에 의해 운반체에 직접적으로 고정화 또는 "결합"된다.
기타 결합 방법도 또한 가능한데, 이에는 결합체로서 아비딘 또는 스트렙타비딘과 함께 비오틴을 이용하는 것이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 결합제로서 비오틴/아비딘, 스테렙타비딘의 이용 방법은 당업계에 공지되어 있다(문헌[Wilch and Bayer, Eds. Methods in Enzymology vol . 184 Academic press, San Die해 1990] 참조). 특정 구체예에서는, N-하이드록시석신이미드(NHS)가 비오틴의 NHS 에스테르를 형성하기 위해 이용될 수 있다. 비오틴 잔기는 리신(lysine) 잔기 상의 1차 아민, 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기 상의 카르복실 모이어티, 또는 시스테인 잔기 상의 설프하이드릴 모이어티가 포함되나, 이에 한정되지는 않는 다양한 작용기와 결합될 수 있다. 아비딘은 시아노겐 브로마이드(CNBr)로 운반체를 활성화시킨 후에 리신 상의 아미노기를 통해 운반체에 공유적으로 결합될 수 있다.
특정 구체예에서는, 시료 또는 결합 파트너가 단순하게 운반체의 표면에 흡수될 수 있다. 예를 들어, 항체는 폴리스티렌 마이크로스피어의 표면에 흡수될 수 있다. 운반체의 표면에 단백질을 흡수시키는 것이 바람직한 구체예에서, 최대로 표면을 덮기 위해서는(단일층까지), 용액의 pH가 단백질의 등전점으로 또는 이보다 약간 염기성이 되도록 조절될 수 있다. 묽은 마이크로스피어 현탁액(약 1% 고형물)을 이용하는 것은 단일 마이크로스피어의 코팅을 확실하게 한다. 약 0.1mg/ml의 최종 단백질 농도가 통상 단백질의 단일층을 달성하기에 충분하지만, 그 양의 약 3배 내지 약 10배를 추가하는 것이 양호한 화학양론 및 결합에 대한 양호한 원동력을 확실하게 한다.
운반체의 표면은 시료의 공유결합 또는 특이적 결합 파트너를 촉진하도록 변형될 수 있다. 표면-변형 중합체성 마이크로스피어는 종종 스티렌을 소량(약 5% 미만)의 기능성 단량체, 예컨대 아크릴산과 공중합화 하여 제조되는데, 이는 -COOH기로 덮힌 마이크로스피어를 산출한다. 기타 단량체가 상이한 표면 화학을 가진 마이크로스피어를 제조하기 위해 이용될 수 있는데, 이는 예컨대 미국 특허 제5,599,889호를 참조하길 바란다.
실리카 마이크로스피어의 표면상에 본래의 실라놀기는 수용액 또는 용매-기 반의 실란 결합제와 반응하여 다양한 표면 작용기를 가진 예비활성화된 실리카 마이크로스피어를 산출할 수 있다. 작용기의 예에는 클로로메틸기, 카르복실기, 및 아미노기가 포함된다. DNA 및 RNA는 무질서유발제(chaotopic agent)의 존재 하에 실리카 상에 흡수될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 5'-아미노 말단을 통해 표면-변형 실리카에 공유적으로 결합될 수 있다. 지질은 문헌[Boom et al., 1990, J. Clin. Microbiol., 28:495)에 기술된 바와 같이, 지방산 사슬 상의 카르복실기 및 실리카 상의 프로필아민 표면기를 통하여 결합될 수 있다.
해당 분석대상물 또는 특이적 결합 파트너가 미셀 내부로 병합될 수 있는데, 이는 예컨대 문헌[Savic et al., 2003, Science 300:615; Maysinger et al., 2001, Biochim. biophys . Acta . 1539(3):205]를 참조하길 바란다. 단백질의 세정제 미셀로의 용해성화 및 복원이 예컨대, 6M 구아니딘 염산(Gdn·HCl) 내에 단백질 용액을 과량의 리폴딩 완충액(예, 3% 디헥사노일 포스파티딜클로린 20mM Tris·HCl/5mM EDTA/0.6M L-아르기닌, pH 8.5) 내부로 천천히 희석하여 수행될 수 있다. 잔류하는 Gdn-HCl을, 예컨대 투석에 의해 제거한 후, 용액은 한외여과를 포함한 다양한 기법에 의해 농축될 수 있다. 예컨대 문헌[Fernandez et al. 2001, Proc . Natl . Acad . Sci USA 98:2358]을 참조하길 바란다.
해당 분석대상물, 또는 특이적 결합 파트너가 리포솜에 병합될 수 있다. 단백질을 리포솜에 병합하는 다양한 방법이 공지되어 있다(예컨대 문헌[Rigaud., et al., "Liposomes as Tools for the Reconstitution of Biological Systems," p. 71-88, in Liposomes as Tools in Basic Research and Industry, ed. Philippot, J. R. and Schuber, CRC Press, Boca Raton, Fla.(1995)를 참조하길 바란다). 그 예로서, 초음파세척기(sonicator) 또는 프렌치 프레스와 같은 기계적인 수단이 과량의 완충액 내에 인지질 필름을 팽윤 및 건조하여 유니라멜라(unilamella) 소포를 생산하는데 이용될 수 있다(문헌[Lelkes et al., 1985, J. Biol . Chem . 260:1796). 선택적으로, 단백질은 낮은 농도의 콜레이트 또는 리솔레시틴에 의해 촉진된 예비형성 리포솜 내로 동시적으로 병합될 수 있다(문헌[Wrigglesworth et al., 1987, Biochem J. 246(3):737). 단백질은 또한 인지질 및 세정제의 존재 하에 공동-용해되어 미셀을 형성할 수 있고, 이어서 순차적인 세정제의 제거가 수행된다. 대형의 리포솜은 역상 증발법(revers-pahse evaporation)에 의해 제조될 수 있고, 다양한 양의 세정제, 즉 Triton X-100, 옥틸 글루코시드, 또는 소듐 콜레이트로 처리될 수 있다. 용해성화 방법의 각 단계에서는, 단백질이 첨가될 수 있다. 이후, 단백질-인지질 세정제 혼합물은 SM2 바이오-비드(Bio-Beads) 처리를 거쳐 세정제를 제거할 수 있다(문헌 [Rigaud et al., 1988, Biochemistry 27(8):2677). 멤브레인 단백질은 용액 내 멤브레인 단백질을 제공하고; 예비형성된 리포솜의 용액을 제공하고; 이 혼합물을 배양하여 리포솜 내부로 병합될 수 있다. 예비형성된 리포솜의 용액을 제공하는 단계 이전에, 리포솜은 인지질과 적어도 1개 형태의 불포화 지방산의 용액의 혼합물을 화합시켜 형성된다(미국 특허 제6,706,861호). 당업자는 운반체에 시료를 결합하는 많은 추가적인 방법이 있다는 것을 인지하게 될 것이다.
E. ECL 모이어티를 운반체로 적재하는 방법
특정 구체예에서, ECL 모이어티는 운반체의 표면에 결합될 수 있다. 시료를 운반체에 결합하는 것과 관계하여 상기 설명된 방법은 ECL 모이어티를 운반체에 결합하는데 유사하게 이용될 수 있다. 운반체가 고체 지지체, 예컨대 비드일 경우에, ECL 모이어티는 운반체의 표면에, 예컨대 공유 결합, 비-공유 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 반데르발스 상호작용, 또는 수소결합을 통해 결합될 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 유기 용매에는 용해성이나, 수성 용매에는 불용성이다. 이 ECL 모이어티는 유기 용매에 용해될 수 있고, 이후 복수의 운반체 입자, 예컨대 폴리스티렌과 같은 소수성 물질로 구성된 비드와 혼합될 수 있다. 이 ECL 모이어티를 함유하는 유기 용매는 운반체의 공극에 침투하고, 유기 용매를 증발할 시에, ECL 모이어티는 운반체의 내부에 갇히거나 내포된다. 비드가 수성 용매에서 용매화될 경우, ECL 모이어티 대부분 또는 모두는 운반체 내에 내포된 채 잔류한다. 특정 구체예에서는, 운반체가 폴리스테린 비드이다. 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 ECL 모이어티를 함유하는 용액 내에서 겔을 형성하여 겔에 병합될 수 있다. 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티는 ECL 모이어티를 함유하는 용액 내에 미셀을 형성하여 미셀 내부로 병합될 수 있다. 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 ECL 모이어티를 함유하는 용액 내에 리포솜을 형성하여 리포솜 내부로 병합될 수 있다.
어떤 구체에에서는, ECL 모이어티가 주변의 매체로의 실질적인 손실 없이 운반체의 내부에 갇히게 될 수 있다. 주변 액체상에 대한 ECL 모이어티의 손실은 제조 및 사용 중에는 원하지 않은 것일 수도 있다. ECL 모이어티를 가두는 운반체의 능력은 기본적으로 분배계수라고 하는 중요한 물리적 상수에 의해 설명될 수 있다. 이 분배계수는 K = C 운반체/ C 액체인데, 여기서 C 운반체는 운반체에 흡수된 모이어티의 농도이고, C 액체는 흡수되지 않은 모이어티의 농도이다.
2상(운반체 및 액체)의 시스템에 있어서, 1보다 큰 분배 계수를 갖는 모이어티는 운반체상에 대한 선호를 나타낸다. 높은 값의 분배계수는 운반체상에 대한 강한 선호를 나타낸다. 이와는 반대로, 분배계수가 1 미만인 모이어티는 액체상을 선호할 것이다. 운반체 내부에 높은 수준의 ECL 모이어티를 초기에 가진 낮은 분배계수의 시스템은 주변 액체상에 대해 모이어티를 손실하게 될 것이다.
어떤 구체예에서는, 운반체와 수성 용매 사이의 분배계수가 약 2보다 크다. 어떤 구체예에서는, 운반체와 수성 용매 사이의 분배계수가 약 10보다 크다. 어떤 구체예에서는, 운반체와 수성 용매사이의 분배계수가 약 100보다 크다. 높은 분배계수에 도달하기 위한 몇몇 화학적 및 물리적 고안이 존재한다. (1) 모이어티는 쿨롱 인력에 의해 운반체에 붙잡혀 있을 수 있다. 그러한 경우에, ECL 모이어티는 합계 양전하를 가질 수 있고, 운반체는 합계 음전하를 가질 수 있다. (2) 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티의 용해도가 운반체 상에서 훨씬 높을 수 있다. 예를 들어, ECL 모이어티는 물에 불용성이고, 친유성 폴리스티렌 운반체에는 용해성이다. (3) 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 운반체에 갇히게될 수 있는데, 왜냐하면 운반체의 미시적인 공극이 모이어티의 직경보다 작기 때문이다. (4) 어떤 구체예에서는, 모이어티가 공유결합을 통해 운반체에 결합될 수 있다.
F. 해당 분석대상물의 검출 방법.
본 발명은 시료 내에 함유된 해당 분석대상물을 검출하는 다양한 방법을 제공한다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 해당 분석대상물이 운반체, 예컨대 제1운반체에 결합될 수 있다. 해당 분석대상물은 운반체의 표면에 존재할 수 있고, 이로써 특이적 결합 파트너가 분석대상물에 접근하는 것을 촉진한다. 어떤 구체예에서는, 해당 분석대상물이 어떤 운반체에도 결합될 수 없다. 어떤 구체예에서는, 해당 분석대상물이 용액 내에 존재한다.
본 발명의 방법은 해당 분석대상물에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 특이적 결합 파트너를 제공한다. 어떤 구체예에서는, 1개 이상의 특이적 결합 파트너가 운반체에 결합될 수 있다. 이러한 구체예에서는, 시료가 제2운반체에 결합될 수 있다.
어떤 구체예에서는, 1개 이상의 특이적 결합 파트너가 해당 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 단백질일 수 있다. 이 결합 파트너는 운반체에 결합될 수 있다. 이러한 구체예에서 시료는 제2운반체에 결합될 수 있다.
어떤 구체예에서, 1개 이상의 특이적 결합 파트너는 해당 분석대상물에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산일 수 있다. 이 결합 파트너는 운반체에 결합될 수 있다. 이러한 구체예에서, 시료는 제2운반체에 결합될 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 두 개의 특이적 결합 파트너, 즉 제1 특이적 결합 파트너 및 제2 특이적 결합 파트너를 제공하는데, 이들 모두는 해당 분석대상물 에 특이적으로 결합한다. 이 두 개의 특이적 결합 파트너는 모두 운반체에 결합될 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서는, 제1 특이적 결합 파트너가 제1운반체에 결합될 수 있고, 제2 특이적 결합 파트너가 제2 운반체에 결합될 수 있다. 이러한 구체예에서는, 시료가 어떤 운반체에도 결합하지 않을 수 있다. 또한, 동일한 특이적 결합 파트너가 제1운반체 및 제2운반체 모두에 결합될 수 있다고도 여겨진다. 어떤 구체예에서는, 해당 분석대상물에 특이적으로 결합하는 다클론성 항체가 제1운반체 및 제2운반체에 결합될 수 있을 것이다. 어떤 구체예에서는, 해당 분석대상물이 단클론성 항체에 의해 인식되는 에피토프(epitope)의 다중 복제물을 함유할 수 있거나, 분석대상물이 핵산일 경우에, 핵산은 제1운반체 및 제2운반체 모두에 결합되어 있는 프로브에 의해 인식되는 서열의 다중 반복을 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 특이적 결합 파트너 중 적어도 하나는 항체일 수 있다. 양 특이적 결합 파트너가 또한 항체일 수도 있다고 여겨진다. 본 발명은 또한 하나의 특이적 결합 파트너가 항체일 수 있고, 제2 특이적 결합 파트너가 특이적 결합 단백질일 수 있는 구체예를 포함한다.
어떤 구체예에서는, 적어도 하나의 특이적 결합 파트너가 시료 내 해당 분자와 하이브리드하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 항체와 함께, 양 특이적 결합 파트너는 시료 내 해당 분자와 하이브리드 하는 올리고뉴클레오티드 또는 기타 핵산일 수 있다고 여겨진다.
ECL 모이어티는 예를 들어, 방출 및 흡수 분광법, 예컨대 자외선 흡수, 적외선 흡수, 및 형광물질 방출; 원자 흡수, 전기화학적 방법, 예컨대 음극 벗김 전압 전류법(anodic stripping voltametry); 뉴트론 활성화 및 화학적 방법을 포함하여 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 검출될 수 있다. 특정 구체예에서는, 광발광, 화학발광 및 전기화학발광 방법이 이용된다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, ECL 모이어티가 전자기적 방사선을 방출하도록 유도시키고, 방출된 방사선을 검출하여 화학적 모이어티의 존재가 측정될 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 시약 혼합물을 전자기적, 화학적 또는 전기화학적 에너지에 노출시켜 전자기적 방사선을 방출하도록 ECL 모이어티가 유도될 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서는, 시약 혼합물을 화학적 또는 전기화학적 에너지에 노출시켜 전자기적 방사선을 방출하도록 ECL 모이어티가 유도될 수 있다. 특정 구체예에서는, ECL 모이어티의 검출을 보조하기 위해 공반응물, 예컨대 TPrA가 첨가된다.
발광 기법을 이용하면 매우 낮은 농도에서 Ru(bpy)3 2+가 측정될 수 있다. 산화적 환원 방법을 이용하여, 5×10-8M의 농도에서 Ru(bpy)3 2+를 측정하는 것이 가능하다. 포화된 염화제1수은 기준 전극과 대비하여 0 내지 +1.4V에서 5 내지 10초 간격으로 진동하는 전위와 함께 포스페이트 완충액 pH 5.0 내 소듐 옥살레이트(1mM)가 이용될 수 있다. CH3CN:H2O(1:1 v/v) 내에 18mM Na2S2O8 및 0.1M 테트라-n-부틸 암모늄 테트라플루오로보레이트를 이용하면, 10-13M 만큼 낮은 농도의 Ru(bpy)3 2+를 검출할 수 있다(예컨대 미국 특허 제6,140,138호; 제5,731,089; 제5,714,089호를 참조하길 바란다).
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는, 해당 분석대상물을 검출하기 위한 분석법에 있어서 ECL 모이어티를 이용하는 방법을 제공한다:
(a) 하기의 화학식을 갖는 착물을 형성하는 단계:
(A)k, (B)u, (C), (D)x
(상기 식에서, 특정 구체예에서는, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고; B는 A와 연합한 제1운반체이고(해당 분석대상물의 특이적 결합 파트너에 결합되어 있는), C는 해당 분석대상물을 함유할 수도 있는 시료이고, B는 해당 분석대상물의 결합 파트너를 통하여 해당 분석대상물과 결합되어 있고; D는 해당 분석대상물과 직접적으로 결합될 수 있거나, 해당 분석대상물의 제2 특이적 결합 파트너를 통하여 해당 분석대상물과 결합될 수 있는 제2운반체이며; k, u, 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이다);
(b) (a)단계에서 형성된 착물을 조성물 내 다른 성분과 분리하는 단계;
(c) 전기화학적 에너지에 모이어티를 직접적으로 노출시켜 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하는 ECL 모이어티를 유도하는 단계; 및
(d) 방출된 전자기적 방사능을 검출하고, 이로써 해당 분석대상물의 존재를 검출하는 단계.
특정 구체예에서는, 본 발명의 방법이 경쟁적 결합 분석법, 예컨대, 경쟁적 억제 분석법(예컨대, 문헌[Janeway et al. Immunobiology, Garland Publishing, New York 2001]을 참조 바람)일 수 있다. 이러한 분석법의 어떤 구체예에서는, 공지된 양의 해당 분석대상물 또는 해당 분석대상물의 유사체가 모이어티를 함유하지 않은 운반체, 예를 들어 자기 비드에 결합될 수 있다("결합된"이라는 용어는 공유 결합 및 비공유 결합을 모두 포함하는 것임). 해당 분석대상물에 대한 결합 파트너가 ECL 모이어티를 함유하는 제2운반체, 예컨대 폴리스티렌 비드에 결합될 수 있다. 첨가된 해당 분석대상물의 부존재 하에서는, 착물이 제1운반체에 결합한 해당 분석대상물과 제2운반체에 결합한 해당 분석대상물에 대한 결합 파트너 사이에서, 제2운반체에 대한 제1운반체의 결합을 효과적으로 형성할 것이다. 이러한 착물과 연합한 ECL 모이어티의 양은 당업계에 공지된 기법에 의해 측정될 수 있다. 이후, 시료 내 해당 분석대상물의 존재는 제2운반체와 결합한 결합 파트너에 결합하기 위해 운반체와 결합한 해당 분자와 경쟁하여 형성된 착물의 양을 감소시키는 능력으로써 검출될 수 있다. 특정 구체예에서는, 시료 내 해당 분석대상물의 양은 공지된 양의 해당 분자를 함유하는 시료를 이용한 표준 곡선과 비교함으로써 정량할 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 해당 분석대상물을 검출하기 위한 샌드위치-형의 결합 분석법을 제공한다. 이러한 분석법의 어떤 구체예에서는, 해당 분석대상물의 제1 결합 파트너가 제1운반체, 예컨대 자기 비드와 결합될 수 있다. 해당 분석대상물의 제2 결합 파트너는 ECL 모이어티를 함유할 수 있는 제2운반체, 예컨대 폴리스티렌 비드와 결합될 수 있다. 해당 분석대상물을 함유하는 시료의 존재 하에서는, 제1운반체 및 제2운반체 모두를 함유한 착물이 형성될 수 있다. 이러한 착물과 연합한 ECL 모이어티의 양은 시료 내 해당 생물학적 물질의 양에 비례하는데, 이는 당업계에 공지된 기법에 의해 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 시료 내 해당 분석대상물의 양은 공지된 양의 해당 분자를 함유하는 시료를 이용한 표준 곡선과 비교함으로써 정량할 수 있다.
어떤 구체에에서, 본 발명은 시료 내 해당 분석대상물을 검출하는 직접적인 결합 방법을 제공한다. 이러한 방법의 어떤 구체예에서, 시료 내 분자는 제1운반체, 예컨대 자기 비드에 결합될 수 있다. 해당 분석대상물의 결합 파트너는 ECL 모이어티를 함유할 수 있는 제2운반체, 예컨대 폴리스티렌 비드에 결합될 수 있다. 시료가 해당 분석대상물을 함유한다면, 제1운반체 및 제2운반체 모두를 함유한 착물이 형성될 수 있다. 이러한 착물과 연합한 ECL 모이어티의 양은 시료 내 해당 생물학적 분자의 양에 비례하는데, 당업계에 공지된 기법에 의해 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 시료 내 해당 분석대상물의 양은 공지된 양의 해당분자를 함유한 시료를 이용한 표준 곡선과 비교함으로써 정량할 수 있다.
이러한 형태의 결합 분석법에서의 다양한 변형이 당업자에게는 공지되어 있으며, 본 발명의 방법과는 양립할 수 있다.
존재하는 ECL 모이어티의 양을 정량하는 다수의 방법이 존재한다. 시스템 내부로 입력하는 에너지의 속도는 ECL 모이어티의 측정값을 제공할 수 있다. 예를 들어, 적절한 측정방법에는 ECL 모이어티가 전기화학적으로 여기되었을 때 전류의 측정, ECL 모이어티가 화학적으로 여기되었을 때 환원 또는 산화 속도의 효율, 또는 광발광 기법에 있어서의 전자기적 에너지 흡수의 측정이 포함된다. ECL 모이어티는 또한 방출된 전자기적 방사선을 측정함으로써 검출될 수 있다. 이러한 측정방법 모두는 연속식, 속도-기반 측정, 또는 장기간 신호를 축적하는 누적 방법 중 하나로서 이루어질 수 있다. 속도-기반 측정방법은 입사광의 강도에 대하여 비례적인 크기의 전류를 생산하는 광전자증배관(photomultiplier tube), 광다이오드, 또는 광트랜지스터를 이용하여 이루어질 수 있다. 누적 방법은 속도-기반 데이터의 통합 또는 누적 데이터를 직접 제공하기 위한 사진용 필름의 이용을 수반할 수 있다.
본 발명은 또한 해당 분석대상물, 1개 이상의 운반체, 및 ECL 모이어티를 함유하는 착물의 분리를 제공할 수 있다. 어떤 구체예에서는, 예컨대 1개 이상의 운반체가 자기 비드일 경우에, 자기장이 착물을 분리하기 위해 이용될 수 있다. 어떤 구체예에서는, 착물의 분리는 침전에 의해, 예컨대 착물의 질량이 개별적 구성성분의 질량보다 클 경우에 중력에 의한 침전에 의해 달성될 수 있다. 어떤 구체예에서는, 조성물의 다른 성분과 착물을 분리하기 위해 필터가 이용될 수 있다. 예를 들어, 이 필터는 착물을 보유하기에 충분히 작은 공극을 가지나, 착화되지 않은 물질이 통과할 수 있도록 충분히 클 수 있다. 어떤 구체예에서는, 크기배제 컬럼이 착물을 분리하기 위해 이용될 수 있다. 조성물의 다른 성분과 착물을 구별하는 기타 물성에는, 예컨대 소수성 또는 다른 결합 파트너에 대한 친화성이 이용될 수 있다.
D. 질병 및 질환
특정 구체예에서, 해당 분석대상물은 질병 또는 질환에 관계된 마커(marker)일 수 있다. 따라서, 본 발명은 질병 또는 질환과 관계된 마커를 검출하고, 이로써 질병 또는 질환을 보유한 환자를 진단하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서는, 본 발명은 질병 또는 질환과 관계된 마커의 존재 또는 양을 모니터함에 의해 질병 또는 질환의 진행양상을 모니터하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 질병 또는 질환과 관계된 마커의 존재 또는 양을 모니터하여 질병 또는 질환을 다루는데 이용한 치료법의 효율성을 모니터하는 방법을 제공한다.
이 질병 또는 질환에는 감염원, 예컨대 박테리아, 균류, 기생충, 바이러스, 또는 프리온에 의해 유발된 감염성 질병이 포함될 수 있다. 박테리아 병원체의 예에는 탄저균(B. anthracis), 대장균(E. coli ), 폐렴구균(S. pneumoniae), 화농성연쇄상구균(S. pyognes ), 우연쇄상구균(S. bovis ), 용혈성연쇄상구균(S. agalactiae), 황색포도상구균(S. aureus), 스트렙토코코스 에르데미디스(S. epdermidis), 뇌수막염균(N. meningitidis), 결핵균(M. tuberculosis)이 포함된다. 바이러스 감염의 예에는, 천연두, 급성호흡기증후군(SARS), 인간 면역-결핍 바이러스(HIV), 엡스테인-바 바이러스(EBV), B형 간염, C형 간염, 리노바이러스, 인플루엔자, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 홍역, 폴리오, 단순 포진 바이러스-1(HSV-1) 및 단순 포진 바이러스-2(HSV-2)가 포함된다. 기생충의 예에는 열대열원충(Plasmodium falciparum), 삼일열원충(P. vivax), 사일열원충(P. malaria), 톡소포자충(ToxoPlasma gondii), 샤가스병원충(Trypanosoma cruzi), 및 람블편모충(Giardia lamblia)이 포함된다.
질병은 암 또는 자가-면역 질병일 수 있다. 해당 분석대상물이 될 수 있는 다양한 암과 관계된 마커에는 흑색종의 돌연변이 사이클론-의존 키나아제 4; 흑색종의 p17 단백질; 흑색종의 gp 100; 흑색종의 흑색종 관련 항원-1(MART-1)(Melan- A)(PCT 공개공보 WO94/21126); 흑색종의 p15 단백질; 흑색종의 티로시나제(tyrosinase)(PCT 공개공보 WO94/11459); 흑색종의 흑색종 관련 항원(MAGE) 1, 2 및 3, 갑상선 수질암; 비소세포 폐암(small cell lung cancer), 결장 및/또는 기관지의 편평세포 암(PCT/US92/04354); 흑색종 연관 항원-Xp (MAGE-Xp) (미국특허 제5,587,289호); 방광의 B 흑색종 항원(BAGE), 흑색종, 유방, 및 편평세포 암종(미국특허 제5,571,711호 및 PCT 공개공보 WO95/00159); G 항원(GAGE) (미국특허 제5,610,013호 및 PCT 공개공보 WO95/03422); 신종양 항원(RAGE) 족(미국특허 제5,939,526호); 흑색종에서 선호적으로 발현되는 항원(preferentially expressed antigen in melanoma)(PRAME)(이전의 DAGE; PCT 공개공보 WO96/10577); 흑색종 편재 돌연변이 단백질(melanoma ubiquitous mutated protein)(MUM-1/LB-33B)(미국특허 제5,589,334호); 신경아세포종 증폭 단백질(neuroblastoma amplified protein)(NAG)(미국특허 제5,821,122호); FB5 (엔도시아린(endosialin)) (미국특허 제6,217,868호); PSMA (프로스테이트-특이적 멤브레인 항원(prostate-specific membrane antigen)) (미국특허 제5,935,818호); 흑색종의 gp75; 흑색종의 태아항원(oncofetal antigen); 카르보하이드레이트/지질, 예컨대 유방의 점액, 췌장, 및 난소암; GM2 및 GD2 흑색종의 강글리오사이드(gangliosides); 암종의 돌연변이 p53과 같은 암유전자; 결장암의 돌연변이 라스(mutant ras); 적백혈병 바이러스성 암유전자 상동기관(erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (HER2/neu)) 유방 암종의 원형암유전자(proto-oncogene of breast carcinoma); 및 단백질 자궁경부 및 식도의 편평상피 세포암의 인간 유두종바이러스 단백질과 같은 바이러스성 산물이 포함된다. 자가면역성 질병에 관련된 마커에는 전신성홍반성루푸스(systemic lupus erythematosus)와 관계된 염색질에 특이적으로 결합하는 항체, 인간백혈구항원(HLA) 대립유전자 DR2 (다발성 경화증과 관련), DR3 (그레이브즈병(Graves disease)과 관련) 또는 류머티즘성 관절염과 관계된 DR4가 포함된다(문헌[Janeway et al. Immunobiology, Garland Publishing, New York 2001])
H. 키트
특정 구체예에서, 본 발명은 시료 내 해당 분석대상물을 검출하는 키트를 제공한다. 이 키트는 1개 이상의 ECL 모이어티를 함유하는 제1운반체, 제2운반체, 제1 및 제2운반체 중 적어도 하나에 결합한 해당 분석대상물의 특이적 결합 파트너 1개 이상, 1개 이상의 용기, 및 선택적으로 사용설명서를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 이 키트는 2개 이상의 ECL 모이어티를 포함할 수 있다.
화학물질 및 원료: 알드리치(Aldrich)(위스콘신주, 밀워키 소재)에서 입수한, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄(II) 디클로라이드 헥사하이드레이트(Ru(bpy)3Cl2 ·6H2O), 트리플루오로아세트산(TFAA, 99%), 실버 테트라플루오로보레이트(AgBF4, 98%), 및 트리-n-프로필아민(TPrA, 99+%); 보울더 사이언티픽 컴패니(Boulder Scientific Co.)(콜로라도주, 미드 소재)에서 입수한 리튬 테트라키스(펜타플루오로페닐)보레이트(Li[(B(C6F5)4)]·nEt20, n = 2-3); 플루카(Fluka)(위스콘신주, 밀워키 소재)에서 입수한 테트라부틸암모늄 테트라플루오로보레이트((TBA)BF4, 전기화학 적 등급); 라이프 테크놀로지(Life Technologies)(메릴랜드주, 록빌 소재)에서 입수한 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스(Tris), 초순도); 시그마(Sigma)(미주리주, 세인트 루이스 소재)에서 입수한 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDAC, 시그마울트라(SigmaUltra)), N-하이드록시석신이미드(NHS), 플루오레세인 비오틴(90%), 1-메틸이미다졸, 및 DNA 하이브리드화 버퍼(PerfectHybTM plus); EM(뉴저지주 깁스타운 소재)에서 입수한 수산화나트륨(GR), 염산(GR), 염화나트륨(GR), 에틸에테르(무수물), 아세토니트릴(HPLC), 테트라하이드로퓨란(THF, GR), 및 에틸렌디니트릴로테트라아세트산(EDTA); 피어스(Pierce)(일리노이주, 록포드 소재)에서 입수한 아비딘(NeutrAvidin), D-비오틴(ImmunoPure(r)), 및 비오틴-PEO-LC-아민; 및 피셔(Fisher)(뉴저지주 페어론 소재)에서 입수한 메탄올(분광분석 등급)을 다른 언급이 없는 한 추가적인 정제 없이 이용했다. 카르복실레이트 폴리스티렌 마이크로스피어/비드(PSB, 직경 10㎛, 2.6% (w/w) 수성현탁액, 6.5×104 비드/μL) 및 초상자성 폴리스티렌 비드로 코팅된 스트렙타비딘(자기 비드 또는 MB라고 칭함, (a) 직경 1.0㎛, ∼9.5×l06 비드/μL를 보유한 수성현탁액 10mg/mL; (b) 직경 2.8㎛, ∼6.5×105비드/μL를 보유한 수성현탁액 10mg/mL)을 폴리사이언스 인크(PolySciences Inc.)(펜실베니아주 와링톤 소재) 및 다이날 바이오텍 인크(Dynal Biotech Inc.)(뉴욕주, 레이트 석세스 소재)에서 각각 구입했다. 탄저균(바실러스 안타시스(Ba813))에서 유래한 합성 23-mer 단일가 닥 DNA (ssDNA) 올리고뉴클레오티드를 퀴아젠 오퍼론(Qiagen Operon)(캘리포니아주 알라메다 소재)에서 입수했고, 이는 하기의 서열을 보유했다: (a) 프로브, 5'-[비오틴-TEG]-AACGA TAGCT CCTAC ATTTG GAG-3' (p-ss-DNA, M.W. = 7617 g/mol; SEQ ID NO: 1); (b) 표적 또는 상보체, 5'-[비오틴-TEG]-CTCCA AATGT AGGAG CTATC GTT-3'(t-ssDNA, M.W. = 7608 g/mol; SEQ ID NO: 2); (c) 비-상보체, 5'-[비오틴-TEG]- TTAAC ACCTT AGCGA CGGCT AGT-3' (nc-ssDNA, M.W. = 7593 g/mol; SEQ ID NO: 3); 및 (d) 2-염기쌍 미스매치 올리고머 서열, 5'-[비오틴-TEG]-CTCCA AACGT AGGAG TTATC GTT-3'(2-bp-m-ssDNA; SEQ ID NO: 4), 여기서 비오틴-TEG는 트리에틸렌 글리콜을 기초로 한 16-원 혼합 극성 스페이서(spacer)를 함유했고, 비오티닐화된 DNA와 아비딘/스트렙타비딘 상호작용에 한정된 표면 사이의 입체 장애를 감소시키기 위해 이용했다. 달리 언급하지 않는 한, 모든 용액은 18 MΩ-cm의 탈이온 Milli-Q 물(매사츄세츠주 베드포드 소재 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.))로 새롭게 제조했다.
ECL 및 전기화학적 측정. 3-전극 전지 시스템을 이용했는데, 직경이 2.2mm인 Pt 디스크, 직경이 2.0mm인 Au 또는 직경이 3.0mm인 유리질탄소(glassy carbon) 디스크를 작업전극(working electrode)으로서, Pt 와이어는 대항전극으로서, 그리고 Ag/Ag+(MeCN 내 10mM AgBF4 및 50mM TBABF4)는 기준전극으로서 이용했다. 각각의 실험 전에 모든 전극을 주의깊게 세척했다. 이 세척 단계는: 크롬산 용액에 작업전극을 침지시키는 단계, 0.05㎛ 알루미나 슬러리(일리노이주 레이크 블러프 소재 부엘 러 리미티드(Buehler Ltd.))로 가는 단계, 풍부한 양의 물로 세척하는 단계, MeCN으로 헹구는 단계, 및 다공성 바이코어(Vycor) 팁 및 유리관을 기준전극으로 대체하는 단계를 포함한다. 일회용 5mL 유리 바이알(vial)을 전기화학 전지로 이용했다. ECL 신호가 오염된 시스템의 Ru(bpy)32+에서 발생될 가능성을 배제하기 위하여, 필요할 때면 언제나 새로운 유리용기 및 전극을 이용했다. 전기화학 전지 아래에 설치된 광전자증배관(PMT, Hamamatsu R4220p, 일본)과 결합한 홈빌트 정전위기(potentiostat)로 환식 전압전류그림(CV)과 함께 ECL 강도를 동시에 측정했다. 고-전압 공급기(뉴욕주 힉스빌 소재 버탄 하이 볼티지 고포레이션(Bertan High Voltage Corp., Series 225)로 PMT에는 -750V의 전압을 공급했다.
다른 언급이 없는 한, 모든 측정은 온도 20±2℃에서 수행했다.
실시예 1: ECL 표지를 함유한 Ru ( bpy ) 3 2+ 의 합성
본 연구에서는, ECL 표지로서 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄(II) 테트라키스(펜타플루오로페닐)보레이트(Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2)을 이용했는데, 왜냐하면, 하기의 단락에서 보는 바와 같이, 이러한 착물dl 적절한 유기 용액을 이용하여 폴리스티렌 비드에 효과적으로 적재될 수 있고, 수용액에서 일련의 변형 비드 중에 비드 내부에 잘 갇혀있을 수 있기 때문이다. 다시 말하면, Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2 는 유기 용매에서는 충분히 용해되지만 수용액에서는 완전히 불용성이다. Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2를 ECL 표지로서 선택한 또 다른 이유는 착물의 Ru(bpy)3 2+ 모이어티가 매우 높은 ECL 효율성을 보유한다는 사실이다. Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2은 물에서 Ru(bpy)3Cl2와 Li[B(C6F5)4]·nEt2O (n = 2-3) 사이의 복분해 반응에 의해 제조했다. 이 침전물을 물로 세척했고, 아세토니트릴/물 용액으로부터 재결정화했으며, 진공에서 건조시켰다.
실시예 2: 공반응물로서 TPrA 를 이용한 MeCN 내에서 Ru ( bpy ) 3 2+ 의 전기화학적 거동 및 ECL 거동
스캔속도 50mV/s에서 MeCN 함유 0.10M (TBA)BF4 전해질-0.10M TPrA 공반응물 내에 0.10μM Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2의 Pt 전극에서의 환식 전압전류 및 ECL 응답을 도 4에 나타냈다. TPrA는 약 Ag/Ag+에 대하여 대략 0.5V 전위에서 산화되기 시작했으며, Ag/Ag+에 대하여 대략 0.75V에서 최대 산화 피이크를 나타냈다(도 4a). 이 전극이 Ag/Ag+에 대해 1.1V보다 양(positive)의 전위에 대해 스캔될 경우, Ru(bpy)3 2+가 Ru(bpy)3+로 산화되고(도 4c), ECL이 생성된다(도 4b). 전위가 증가함에 따라 ECL 강도도 계속적으로 증가했고, 결국 약 700mV 반파장 너비 및 Ag/Ag+에 대하여 약 1.6V에서의 피이크 전위를 가진 광범위한 피이크가 형성되었다. 역방향 스캔 상에 서는, 큰 ECL 강도 및 유사한 피이크 위치를 관찰하였다. Ru(bpy)3 2+의 산화 전위가 TPrA의 존재 하에서는, ECL 피이크 전위가 TPrA의 부존재 하에서의 Ru(bpy)3 2+의 산화 전위와 비교하여 보다 양의 값이기 때문에, 약간 양의 방향으로 이동할 수 있다는 것은 주의하길 바란다. 예상한 바대로, Ru(bpy)3 2+ 착물의 반대이온으로의 변화, 예컨대 B(C6F5)4 -에서 CIO4 -로의 변화는 ECL의 거동을 변화시키지 않았다. 수용액의 경우와는 반대로, TPrA·+와 Ru(bpy)3 +(Ru(bpy)3 2+와 TPrA·의 반응에 의해 형성)의 반응시 여기상태의 Ru(bpy)3 2+*의 형성에 기인한 TPrA 산화의 전위 영역에서 선행-파장(pre-wave)이 나타났고, μM 수준의 Ru(bpy)3 2+를 이용했을 경우에는(Miao, Choi and Bard, 2002, J. Am. Chem. Soc. 124:14478) 주목할만한 상응하는 ECL 신호가 MeCN 내에서 발견되지 않았다. 이는 제시된 실험 조건 하에서는, MeCN 내 TPrA·+의 수명이 본래의 수용액에서 보다 더 짧거나, 또는 TPrA·+가 Ru(bpy)3 +를 Ru(bpy)32+*로 산화시키기에 에너지적으로 강력하지 않다는 것을 시사한다. 이와는 별개로, 우리는 공반응물로서 TPrA를 이용한 수용액에서 전개된 ECL 메커니즘이 MeCN에서도 효력을 발생한다는 결론에 다다랐다.
TPrA 농도의 함수로서 ECL 강도를 도 5a에 나타냈으며, 여기서 가장 높은 ECL 강도 영역은 TPrA 농도 30mM와 상응했다. 수용액 내에서 ECL-pH 의존 연구를 기초로 했을 때, (Leland et al. 1990, J. Electrochem. Soc. 137:3127), Ru(bpy)3 2+/TPrA/MeCN 용액에 트르플루오로아세트산(TFAA)을 첨가함으로써, 용액의 산도가 변화했고, 예상되었던 바와 같이 ECL 강도가 변화했다(도 5b). 100mM TPrA와 55 mM TFAA의 조합은 가장 큰 ECL 반응을 제공했다.
ECL 강도 및 안정성도 또한 이용된 전극 물질에 영향을 받았다. Pt 및 Au 전극은 유사한 반응을 나타냈는데; ECL이 수회의 전위 사이클에 걸쳐 안정했고, Au 전극에 비하여 Pt 전극에서 약간 적은 광전류(photocurrent) 밀도를 발견했다. 그러나 GC 전극에서는, 최초의 전위 사이클의 정방향 스캔에서만 빛이 생성되었다. GC 전극을 연마한 후에는, 빛이 다시 발생했으며, 이는 전극 표면이 어떤 종류의 막에 의해 차단되었었음을 암시하는 것이었다. 상대적인 ECL 강도는, 스캔속도 50mV/s에서 Ag/Ag+에 대한 0 내지 3.0V 사이의 최초 전위 사이클 동안에 0.10 μM Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2-0.10 M TPrA-0.055 M TFAA-0.10 M (TBA)BF4 를 함유한 MeCN 용액에서 수득하였고, Au, Pt 및 GC 전극은 100:93:61의 비율이었다.
흥미롭게도, Ru(bpy)3 2+의 부존재 하에서도, 0.10M (TBA)BF4와 함께 아세토니트릴 용액 내 TPrA도 또한 ECL 신호를 생성할 수 있었다(도 6a). 증류에 의한 TPrA 및 MeCN의 정제, 전해질을 (TBA)BF4에서 (TBA)CIO4로 바꾸거나 또는 새로 개봉된 전 기화학적 등급의 전해질을 이용하는 것, 새 유리용기 및 전극을 이용하는 것, 및 Pt 대항전극을 블랙 플라스틱의 층으로 코팅된 또는 코팅되지 않은 유리관으로 커버하는 것은 결과를 바꾸지는 않았다. ECL은 Ag/Ag+에 대하여 2.1V의 피이크 전위값을 가졌는데, 이는 0.1μM Ru(bpy)3 2+의 존재 하에 수득한 것에 비하여 500mV 이동한 값이다(도 4b). 도 5a에서 이전에 나타낸 바와 같이, TPrA 부존재 하에서는, 0.10M (TBA)BF4를 보유한 MeCN 용액 내 Ru(bpy)3 2+는 양전위에 대한 스캔만으로는 동일한 강도 규모 상에서 관찰가능한 ECL 반응을 나타내지 않았다. 따라서 도 6a에 나타낸 ECL 신호는 TPrA에서 유래한 것임에 틀림없고, 이는 아마도 TPrA· 자유라디칼과 관계된 전하-이동반응 역광방출(charge-transfer reaction inverse photoemission (CTRIP))에 기인한 것일 것이다(Murakoshi et al. 1992, J. Phys . Chem. 96:4593; Uosaki et al. 1991 , J. Phys . Chem . 95:779; Uosaki et al. 1990, Chem . Lett . 7; 1159; Mclntyre et al. 1987, J. Electroanal . Chem . Interfac. Electrochem . 228:293; Mclntyre et al. 1986, Phys Rev Lett. 56:651 ; Mclntyre et al. 1985, J. Electroanal . Chem . Interfac . Electrochem 196:199; Murakoshi et al. 1993, Conden Mar Mater. Phys. 47:2278; Ouyang and Bard 1988, J. Phys. Chem. 92:5201 ; Ouyang and Bard 1987, J. Phys. Chem. 91 :4058). 도 4b에서 수득한 적분 강도의 약 12% 정도인, 도 6a에서 수득한 적분 ECL 강도가 중 요한데, 왜냐하면 TPrA의 부존재 하에서, 0.10 M (TBA)BF4/MeCN 용액에서 측정된 잔여 광전류가 상당히 낮기 때문이다(도 6d). TPrA-연관 ECL 신호 배경은 TFAA를 이 용액에 첨가함으로써 극적으로 억제하였고(도 6b), "불필요한" 신호의 추가적인 제거는 0.10M TPrA-0.055M TFAA-0.10M (TBA)BF4 MeCN 용액에 1%(v/v) H2O를 첨가하여 달성했다(도 6c). 도 6e는 도 6a 내지 6d에서 수득한 상대적 ECL 강도를 나타낸다.
실시예 3: 폴리스티렌 비드 내부에 ECL 표지의 적재
Eppendorf 5415D 원심분리기(뉴욕주 웨스트베리 소재 브링크만 인스트루먼츠, 인크.(Brinkmann Instruments, Inc.))를 이용하여 10krpm으로 5분간 적당한 부피(0.10-1.0mL)의 2.6%(w/w) 폴리스티렌 비드 현탁액으로부터 직경이 10㎛인 카르복실레이트 폴리스티렌 비드를 분리하고, 이후 물 1mL로 1회 세척했다.
이 비드를 60℃에서 1시간 동안 진공 하에서 건조시키고, 이어서 ECL 표지 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2-포화(0.7 mM) 5% THF-95% MeOH (v/v) 용액 1.5mL를, PSB를 함유하는 2mL 마이크로원심분리용 튜브에 첨가했다. 20rpm으로 20분간 이 혼합물을 Dynal 시료 혼합기(Dynal Biotech Inc.)로 교반시켰고, 이어서 원심분리했으며, 50% MeOH-50% H2O (v/v)로 2회 세척했다. Ru(II)⊂PSB로 지정한, 수득된 ECL 표지-함유 황색 폴리스티렌 비드를 진공 하에서 60℃에 1시간 동안 추가적으로 건조했다. 상기 처리의 과정 동안에, 우선 폴리스티렌 비드는 ECL 표지 함유 5% THF-95% MeOH 유기 용액에서 팽윤되고, 불수용성 ECL 표지가 중합체 매트릭스에 확산되도록 하는데, 이 때, 진공 증발에 의해 비드에서 유기 용매를 제거할 경우 ECL 표지가 갇히게 되는 것이다. 폴리스티렌 비드로 ECL 표지의 효과적인 적재는 Nikon Eclipse TE 300 도립 현미경(뉴욕주 멜빌 소재 니콘 인스트루먼츠 인크.(Nikon Instruments Inc.))과 결합한 Magnafire-Model S99806 Olympus America CCD 카메라 (뉴욕주 멜빌 소재 올림푸스 아메리카(Olympus America))로 찍은 형광 이미지(도 2a)를 통해 시각적으로 확인할 수 있었다. MeCN에 용해된 Ru(II)⊂PSB 및 공반응물로서 TPrA를 이용하는 표준 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2 용액에서 수득한 ECL 데이터를 기초로 하여, 비드 당 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2분자 7.5×109개의 전형적인 적재량을 측정했다.
실시예 4: Ru(II)⊂PSB의 표면 상에 아비딘의 고정화
0.10M EDAC 및 0.10M NHS를 함유하는 0.10M 1-메틸-이미다졸 완충액(pH7)에 새롭게 제조한 25μM 아비딘 1.5mL에 비드를 침지하고, 이 혼합물을 ∼40rpm으로 1시간 동안 회전킴에 의한, Ru(II)⊂PSB-CO-NH-아비딘의 형성을 통해 Ru(II)⊂PSB의 표면에 아비딘 층을 공유적으로 부착시켰다. Ru(II)⊂PSB/아비딘으로서 지정한, 새롭게 형성된 아비딘-코팅 Ru(II)⊂PSB를 5-10krpm으로 5분간 반응용액에서 원심분리하고, 1mL의 "1X B&W 완충액"(1X 완충 & 세척 용액, 5mM Tris-HCI (pH 7.5) + 0.5mM EDTA + 1.0M NaCl)으로 3회 세척했다. 이 최종 Ru(II)⊂ PSB/아비딘 산물을 개시 PSB 현탁액과 동일한 부피(0.10-1.0mL)를 보유한 1X B&W 완충용액에 재-부유시켰으며, 이용할 때까지 ∼4℃에서 유지시켰다. 대략적으로, 이로써 6.5×104 Ru(II)⊂PSB/아비딘 비드/μL를 측정할 수 있었는데, 단 Ru(II)⊂PSB/아비딘의 제조 동안에 비드의 손실은 없는 것으로 가정했다. 도 2b는 비드가 형광 비오틴과 반응한 후에 Ru(II)⊂PSB/아비딘의 밝은 녹색 이미지를 나타내는데, 이는 Ru(II)⊂PSB의 표면에 양질의 아비딘 층이 형성되었다는 것을 시사하는 것이었다. 대조적으로, "있는 그대로"의 Ru(II)⊂PSB에 비특이적으로 흡수된 형광 비오틴은 매우 약한 형광 이미지만을 나타냈다. 비오티닐화된 23-mer ssDNA(p-ssDNA)에 대한 Ru(II)⊂PSB/아비딘의 결합 용량은 형광 비오틴 적정 실험을 기초로 할 때, 0.565 nmol(p-ssDNA)/mgPSB 또는 1.4×108 p-ssDNA 분자/비드의 값을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 10 및 아래 표 1 참조).
실시예 5: MB 및 Ru ( II )⊂ PSB / 아비딘 비드 표면에 ssDNA 의 부착
프로브 DNA - MB 공액 . 직경이 1.0㎛ 또는 2.8㎛ 중 하나인, 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드(MB)를 프로브 DNA 운반체로서 이용했다. 프로브 DNA-MB 공액을 형성하기 위해서, 1.0㎛ MB 5.0μL, 또는 2.8㎛ MB 10.0μL를 우선 2mL짜리 마이크로원심분리용 튜브에 이동시켰고, 이후 자석(Dynal MPC(r)-S)으로 본래의 현탁액에서 분리했으며, 이어서 "2X B&W 완충액" (완충 & 세척 용액: 10mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.0mM EDTA, 2.0M NaCl) 200μL로 1회 세척했고, 1X B&W 완충액 200μL로 2회 세척한 후 이 비드를 2.5μM 비오티닐화된 p-ssDNA 100μL에 침지하고, 40rpm으로 온화하게 회전시키면서 30 내지 60분간 배양했다. 형성된 프로브 DNA-MB 공액을 순차적으로 분리하고 1X B&W 완충액 200μL로 3회 세척했으며, 이전 튜브의 벽에 프로브 DNA의 흡수 가능성을 피하기 위해 새로운 2mL짜리 마이크로원심분리용 튜브에 옮겼고, 하이브리드화 완충액 20μL에 재부유시켰다. 이러한 방법으로 생성된 공액은 1.0㎛ 및 2.8㎛ 직경의 MB에 대하여 각각, 포화된 프로브 DNA 커버리지 약 2.53 및 1.11nmol (p-ssDNA)/mg(비드), 또는 1.6×106 및 1.0×107개의 p-ssDNA 분자/비드를 갖는다(도 10 및 표 1 참조).
Figure 112007006193819-pct00001
표적 DNA - Ru ( II )⊂ PSB / 아비딘 공액 . 적당한 농도의 비오티닐화된 t-ssDNA(1.0×10-8 내지 1.0×10-15M), 또는 비-상보적-ssDNA(nc-ssDNA) 1.0×10-9M 및 2염기쌍의 미스매치-ssDNA(2-bp-m-ssDNA)를 1X B&W 완충액 내 ∼6.5×104 비드/μL의 Ru(II)⊂PSB/아비딘 25μL에 첨가했고, 회전속도 20rpm에서 온화하게 혼합하면서 1시간 동안 배양했으며, 1X B&W 완충액 200μL로 2회 세척했고, 3k-5k-10krpm으로 5분간 원심분리했으며, 하이브리드화 완충액 50μL에서 재부유시켰다.
실시예 6: DNA 하이브리드화 및 ECL 검출
새롭게 제조된 표적 DNA-Ru(II)⊂PSB/아비딘 공액(실시예 5)을 이전에 형성된 프로브 DNA-MB 공액(실시예 5)을 함유하고 있는 2mL용량의 원심분리용 튜브에 옮겼다. 적당한 부피의 하이브리드화 완충액을 이 튜브에 첨가하여 총 하이브리드화 용액 부피 200μL를 제조했다. 1시간 동안 20rpm으로 온화하게 혼합한 후, 프로브 DNA-MB↔표적 DNA-Ru(II)⊂PSB/아비딘 응집물(aggregate)을 자유 비결합 Ru(II)⊂PSB/아비딘 비드를 함유하는 "용액"에서 자기적으로 분리시켰고, 1X B&W 완충액 200μL로 온화하게 3회 세척했으며, 튜브의 벽에 자유 Ru(II)⊂PSB/아비딘 비드의 가능한 흡수를 최소화하기 위해 새로운 원심분리용 튜브에 주의를 기울여 옮겼다. DNA 하이브리드화 응집물과 함께 벽면 상의 자유 Ru(II)⊂PSB/아비딘 비드도 또한 MeCN에 용해될 수 있기 때문에, 이러한 종류의 비특이적 흡수는 상당히 높은 수준의 배경 ECL을 생성할 수 있다. 이 응집물을 최종적으로 물 200μL로 세척했고, 차후 ECL 측정을 위하여 0.10M TPrA-0.055M TFAA-0.10M (TBA)BF4 MeCN 용액 0.50 mL에 용해시켰다. DNA 하이브리드 후에 프로브 DNA-MB↔표적 DNA-Ru(II)PSB/아비딘 응집물을 도 3에 나타낸 SEM 이미지를 통해 명백하게 확인할 수 있었는데, 여기서 프로브 DNA 및 상보적인 DNA 모두는 농도가 5μM이었고, MB/PSB의 초기 비율은 29였으며, MB 및 PSB의 크기는 각각 1.0㎛ 및 10㎛였다.
ECL 강도와 0.10nM 내지 1.0μM 범위의 Ru(bPy)3[B(C6F5)2 농도 사이의 직선 관계는 1% 물을 첨가한 0.10M TPrA-0.055M TFAA-0.10M (TBA)BF4 MeCN에서 발견했다(도 7a). 동일한 실험 조건 하에서는, ECL 강도와 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2로 적재된 다수의 10㎛ 직경의 폴리스티렌 비드 사이의 양호한 상관관계도 또한 관찰했다(도 7b). 이 비드를 전해질 용액 0.50mL에 용해하여 폴리스티렌이 ECL 신호를 생성 또는 ECL 신호에 영향을 미치지 않는다는 것을 증명했다. 도 7b와 도7a를 비교함으로써, 20 Ru(bpy)3 2+가 적재된 비드에서 발생된 빛의 강도가 0.5nM Ru(bpy)3 2+와 동등하다는 것이 명백했다. 따라서 비드의 적재 용량은 비드 당 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2 분자 7.5×109개인 것으로 측정했다. 이 결과는 "벌크 비드" ECL 측정을 기초로 하여 수득한 데이터와도 모순되지 않았다.
DNA 하이브리드화의 ECL 검출을 위해 두 세트의 실험을 고안했다. 제1세트에서는, MB 대 PSB 비드의 비율을 29가 되게 10㎛직경의 MB를 이용했다. 이 경우에는, 도 8a서 나타낸 바와 같이, ECL 강도가 10pM 내지 10nM 범위에 걸친 표적 DNA 농도에 비례했으며, 2개의 염기가 미스매치된 2-bp-m-ssDNA 및 비상보적 nc-ssDNA가 상보적인 DNA 하이브리드화와 즉시 구별될 수 있었다. 새롭게 형성된 MB-PSB 공액 및 마이크로원심분리용 튜브가 이미 충분한 물을 함유하고 있었으므로, 도 7에 나타낸 실시예와는 달리 전해질 용액에 물을 첨가하지 않았다는 것을 주의하길 바란다. 도 8에 나타낸 ECL 강도에 대하여 배경을 삭제하지 않았다는 것도 또한 주의하길 바란다. MB 대 PSB의 비율을 감소시키고, 이에 따라 Ru(bpy)3 2+ 대 t-ssDNA의 증폭 인자를 증가시킴으로써, 훨씬 낮은 농도에서 표적 DNA의 DNA 하이브리드화가 검출될 수 있었을 것이다. 하기에 증명되는 바와 같이, 통계적으로, 10㎛ 직경의 PSB 하나가 2.8㎛ 직경의 MB 하나로 떼어질 수 있다. 그 결과, DNA 하이브리드화에 관계된 ECL 신호가 매우 낮은 표적 DNA 농도에서도 일어나고, 이로써 2.8㎛ MB 및 10㎛ PSB가 낮은 비율로 존재할 경우에도 검출될 수 있다. 도 8b는 2.8㎛ MB/10㎛PSB의 비율이 4인, 그러한 실시예의 결과를 나타낸다. t-ssDNA는 1.0fmol만큼의 농도에서 검출될 수 있다. 이러한 조건 하에서도, 수득된 ECL 강도가, 각 종이 1.0nM로 이용될 경우 2-bp-m-ssDNA 및 nc-ssDNA의 DNA 하이브리드화에서 수득된 ECL의 강도보다 컷고, 이에 의해 구별했다.
실시예 7: 비오틴-PEO-LC-아민을 카르복실레이트 폴리스티렌 비드에 결합 및 포아송 분산 시험( Poisson Distribution Test )
비오틴-PEO-LC-아민(M.W. = 418.6 g/mol)은 비오틴과 아비딘 상호작용의 입체 장애를 줄이는데 이용되는 22.9Å의 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 기반 스페이서 아암(arm)을 보유한 수용성 가교제(cross-linker)이다(2003-2004 Applications Handbook & Catalog; Pierce Biotechnology, Inc. 2003). 비오틴-PEO-LC-아민 분자는 0.10M 1-메틸-이미다졸 완충액(pH 7) 내 0.10M EDAC-0.10M NHS의 존재 하에 가교제의 1차 아민기 비드의 카르복시기 사이의 아미드 결합의 형성을 통해서 카르복실레이트 폴리스티렌 비드의 표면에 공유적으로 결합시켰다. 2.6% PSB 현탁액 250μL에서 분리한 PSB와 반응시키기 위해 5mM 비오틴-PEO-LC-아민 1mL를 이용했다. 반응은 회전속도 40rpm으로 2시간 동안 수행했다. PSB-CO-NH-LC-PEO-비오틴으로 지정한, 가교제 변형 PSB를 순차적으로 분리시키고 1X B&W 완충액으로 3회 세척했으며, 1X B&W 완충액 250μL 내에 재부유시킨 다음 이용할 때까지 4℃로 유지시켰다.
두 개의 상이한 크기의 스트렙타비딘/폴리스티렌 코팅 자기 비드(1.0 및 2.8㎛ 직경의 Dynal 비드)와 함께 10㎛직경의 PSB-CO-NH-LC-PEO-비오틴 비드를 이용하여 포아송 분산 측정을 수행했다. PSB-CO-NH-LC-PEO-비오틴 비드 1000개 중 10개가 용액에, 동일한 수 또는 보다 큰 수의 1.0㎛ 또는 2.0㎛ 자기 비드 중 하나와 함께 용액에서 충분히 혼합될 경우, PSB-CO-NH-LC-PEO-비오틴 비드가 PSB의 비오틴과 MB의 스트렙타비딘 사이의 비가역 반응을 통해 고착될 개연성이 관찰될 수 있고, 이를 포아송 분산실험을 위해 예상된 데이터와 비교할 수 있다. 실험적으로는 PSB-CO-NH-LC-PEO-비오틴 비드 1μL(총 3.3×106 PSB) 당 ~6.5×104개의 비드를 1X B&W 완충액 175μL에 희석했고, 제조자의 원래 현택액에서 자기적으로 분리된 공지된 수의 스트렙타비딘 코팅 자기 비드(직경 1.0㎛)를 함유한 2.OmL짜리 마이크로원심분리용 튜브로 옮겼으며, 2X B&W 완충액 200μL로 1회 세척했다. 이 혼합물을 즉시 흔들고 40rpm에서 1시간 동안 회전시킨 후 PSB-MB 응집물을 혼합물로부터 자기적으로 분리시켰다. 비결합 자유 PSB-CO-NH-LC-PEO-비오틴 비드를 함유한 수득된 상징액 및 이 상징액 내 다수의 PSB를 도립 현미경을 이용한 광학적 시험으로 측정했다. 직경이 2.8㎛인 MB의 포아송 분산을 연구하기 위해 유사한 절차를 이용했다. 그러나, 이 경우에는 공지된 양의 MB와 반응하는데 절반, 즉 1.6×106개의 PSB-CO-NH-LC-PEO-비오틴 비드를 이용했다.
매우 큰 수의 자기 비드 및 폴리스티렌 비드를 함께 혼합할 경우에, 이 두 종류의 비드가 충돌하고 가역적으로 반응할 개연성 P(m, n)은 하기의 포아송 분산을 따를 것이며 하기의 두 변수에 의존할 것이다: (a) 자기 비드 대 폴리스티렌 비드의 초기 비율 m, 및 (b) 각 폴리스티렌 비드에 결합한 자기 비드의 수 n. 예를 들어, 같은 수의 MB 및 PS 비드가 혼합되었다면(m=1), PS에 결합한 MB의 수는 1일 것이다. 그러나, 이러한 평균 값을 유도하는 데에는 n=0, 1, 2....인 분산이 존재할 것이다. P(m, n), m 및 n 사이의 관계는 하기와 같은 포아송 분산에 의해 설명될 수 있다:
P(m,n) = e-m[mn/n!] n = 0, 1 , 2,...
(문헌[Haight, Handbook of the Poisson Distribution; John Willey & Sons, Inc.: New York, 1967]을 참조바람)
표 2에는 상이한 m 및 n 값에 대한 P(m, n) 값을 열거했다. 이 표 및 포아송 분포 시험 데이터(상기 제공됨)로써, 당업자는 반응 용액에서 단 한 개의 폴리스티렌 비드를 결합 및 이탈시키는데 요구되는 자기 비드의 최소 개수를 가늠할 수 있다. 예를 들어, 상징액에서 수집한 PSB의 수로부터, MB와 결합한 PSB 및 반응 혼합물에서 자기적으로 이탈된 PSB의 백분율을 계산할 수 있다. 그 다음, 다수의 공지된 m값과 함께 "결합 PSB%" 데이터의 세트를 실험적으로 수득할 수 있다. 만약 이 데이터가 이론적 값인 P(m, n>j)(표 2)에 들어맞는다면(이 식에서 m은 수행된 실험으로부터 알게된 것이고, j=0. 1, 2, 3....
Figure 112007006193819-pct00002
이다), 한 개의 폴리스티렌 비드를 결합 및 이탈하는데 필요한 자기 비드의 최소 수는 j+1임에 틀림없다.
Figure 112007006193819-pct00003
도 9는 그러한 시험의 두 실시예를 나타낸다. 제1실시예(도 9a)에서, 2.8㎛ MB 및 10㎛ PSB를 이용했고, MB/PSB의 최소 결합 비율은 1이라고 추론할 수 있었다. 제2실시예에서는(도 9b), 10㎛ PSB와 반응시키기 위하여 2.8㎛ MB 대신 1.0㎛ MB를 이용했다. 이러한 경우에 MB 대 PSB 최소 결합비율이 3보다 높았다. 이러한 결합 비율은 MB와 PSB사이에 DNA 하이브리드화를 위한 실험 조건을 최적화하기 위해 이용할 수 있으며, 그 결과 최소 농도의 표적 DNA가 검출될 수 있다.
실시예 8: 두 방향족 탄화수소, DPA 및 루브렌을 폴리스티렌 비드에 적재
Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2 이외에도, 방향족 탄화수소, 예컨대 9,10-디페닐안트라센(DPA, 도 11a) 및 루브렌(RUB, 도 11b)를 또한 폴리스티렌 비드(PSB)에 적재했다. 그 결과, 상이한 방출 파장을 갖는 ECL 표지를 수득했다. 적재 절차는 5% THF-95% MeOH "팽윤성 용매(swelling solvent)"를 5% 벤젠-95%MeOH로 대체하여 두 방향족 탄화수소가 벤젠을 함유한 용매에 충분하게 용해될 수 있도록 한 것을 제외하고는 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2를 가두는 것과 유사했다. 도12에는 적재절차를 요약해 놓았다.
DPA 및 RUB를 PSB에 가둔 것을 UV 광 여기에 의한 형광 이미지화를 이용하여 시각적으로 확인했다. 도 13a 및 도 13b에 나타낸 바와 같이, 오렌지색 형광 이미지에 대하여 강한 청색 및 황색이 각각 DPA 및 RUB를 적재한 PSB에서 관찰했다. 대조적으로, 방향족 탄화수소가 없는 PSB는 약한 녹색 형광을 나타냈다(도 13c).
MeCN에 용해된 DPA 또는 RUB 적재 PSB 및 공반응물로서 트리-폴리아민(TPrA)를 이용한 표준 DPA 또는 RUB 용액에서 수득한 ECL 데이터를 기초로 하여 비드 당 DPA 분자 7.5×109개 또는 비드 당 RUB 분자 4.8×108개의 적재 용량이 가능했다. 도 14에는 (a) MeCN에 용해된 DPA적재 PSB 및 (b) 공반응물로서 TPrA를 이용한 DPA 아세토니트릴 용액 0.25mM의 CV 및 ECL 거동을 나타냈다. MeCN에 용해된 RUB 적재 PSB의 CV 및 ECL 거동 및 공반응물로서 TPrA를 이용한 35μM RUB 아세토니트릴 용액을 각각 도 15a 및 15b에 나타냈다.
실시예 9: C 반응성 단백질( CRP )의 ECL 검출
하기와 같이 Ru(II)⊂PSB/아비딘←Anti-CRP 공액을 제조했다: Ru(II)⊂PSB/아비딘(6.5×104 비드/μL) 0.100-0.500mL(실시예 4 참고)를 0.10M PBS 버퍼(0.1M 인산나트륨, 0.15M 염화나트륨)(pH 7.2)(일리노이주 록포드 소재 피어스(Pierce)) 내 2.0 mg/mL 비오티닐화 anti-CRP 1mL와 회전속도 25rpm으로 실온에서 1시간 동안 혼합했다(Miao and Bard, 2003, Anal . Chem . 75:5825). 이 새롭게 형성된 공액을 원심분리에 의해 수집했고, 1X B&W 완충액으로 3회 세척했으며(실시예 4 참조), 2% 소혈청 알부민(BSA)/0.10M PBS(pH 7.2) 용액 1mL에 30분간 재부유시켰다. 원심분리 및 세척(상기와 같이) 후, 공액을 적절한 부피(0.100-0.500mL)의 0.10 M PBS (pH 7.2) 완충용액에 부유시키고, 사용할 때까지 4℃로 유지시켰다.
MB←Anti-CRP 공액을 하기와 같이 제조했다: 2.8㎛ 직경의 스트렙타비딘-코팅 자기 비드 (MB, 6.5×105 비드/μL) 0.100-0.500mL를 자기적으로 분리시켰고, 2X B&W 완충액으로 1회 세척했으며, 1X B&W 완충액으로 2회 세척한 후, 이어서, 0.10M PBS 완충액(pH 7.2) 내 2.0mg/mL 비오티닐화된 anti-CRP 1.5mL와 회전 속도 25rpm으로 실온에서 1시간 동안 혼합했다. 새롭게 형성한 MB←anti-CRP 공액을 1X B&W 완충액으로 3회 세척했고, 적절한 부피(0.100-0.500mL)의 0.10M PBS (pH 7.2) 완충용액에 재부유시켰으며, 사용할 때까지 4℃로 저장했다.
샌드위치형 Ru(II)⊂PSB/Avidin←Anti-CRP<CRP>MB←Anti-CRP 공액을 하기와 같이 형성시켰다: Ru(II)⊂PSB/아비딘←Anti-CRP 공액(총 1.3×106개의 PSB) 20μL 및 MB←Anti-CRP 공액(총 1.3×107개의 MB)을 실온에서 2시간 동안 0.10M PBS(pH 7.2) 완충용액 200μL에서 CRP 시료와 온화하게 혼합했다. 이 샌드위치형 공액을 혼합 용액과 자기적으로 분리시켰고, 1X B&W 완충액 200μL로 3회 세척했다. 이후, 사용했던 튜브의 벽면에 자유 Ru(II)⊂PSB/아비딘←Anti-CRP의 가능한 흡수를 최소화하기 위해, 이 공액을 작은 부피의 PBS 완충액과 함께 새로운 2mL짜리 원심분리용 튜브에 옮겼다(참고. 실시예 6). 최종적으로, 용액에서 "자기 공액(magnetic conjugates)"을 자석을 이용하여 분리시켰다.
ECL에 의해 CRP를 검출했다. 수득한 샌드위치형 공액을 0.10M TPrA-0.055 TFAA-0.10M (TBA)BF4 MeCN 용액 0.500mL에 용해시켰고, 스캔 속도 50mV/s에서 Ag/Ag+(0.10M (TBA)BF4 MeCN 내 10mM AgBF4)에 대하여 0 내지 2.8V 사이의 스캐닝 전위 창문이 구비된 환식 전압전류계를 이용하여 2.2mm 직경의 Pt 전극에서 ECL 실험을 수행했다. 예상한 바와 같이, 샌드위치형 공액에서 수득한 CV 및 ECL의 프로파일은 도 4a 및 도 4c에 나타낸 프로파일과 매우 유사했는데, 이는 두 경우 모두, "반응성 화학종", Ru(bpy)3 2+ 및 TPrA이 동일했기 때문이다. 도 16에 나타낸 바와 같이, ECL 강도(정방향 스캔 피이크 강도 및 역방향 스캔 피이크 강도의 평균값)은 0.010-10μg/mL 범위에 걸쳐 CRP농도에 직선상으로 비례했다.
본원에서 인용한 모든 참고문헌은 본원에 그 전부가 참고인용되어 있다. 본 명세서에 첨부된 게시 내용과 모순적인 참고인용된 공개공보 및 특허 또는 특허 출원에 대해서, 본 명세서는 그러한 모순적인 부분을 극복 및/또는 우선권을 취하려는 의도에서 제작되었다.
본 명세서 및 청구의 범위에서 사용된 내용성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 있어서 "약"이라는 용어에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 이와 반대되는 언급이 없는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에 설명된 숫자 매개변수는 본 발명에 의해 수득되도록 추구되는 바람직한 특성에 의존적으로 변형될 수 있다. 본 청구의 범위에 대하여 균등론의 적용을 제한하려는 의도가 아니지만, 적어도 각각의 숫자 매개변수는 유효숫자 및 통상의 ㄱ근사값을 고려하여 파악해야만 한다.
본 발명의 정신 및 범주에서 벗어남이 없이 본 발명의 많은 변형 및 변화가 이루어질 수 있고, 이는 당업자에게는 자명할 것이다. 본원에 기술된 특정 구체예는 예시의 목적으로만 제공된 것이며, 어떤 방법으로든 제한을 가하려는 의도가 아니다. 본 명세서 및 실시에는 예시적으로만 여겨져야하고 본 발명의 실제 범주 및 정신은 하기의 청구의 범위에 의해 나타나도록 의도한 것이다.
<110> Bard, Alan J WUJIAN, MIAO <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE DETECTION OF BIOLOGICAL MOLECULES USING A TWO PARTICLE COMPLEX <130> 09526.0010-00000 <150> US 60/581,719 <151> 2004-06-23 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 1 aacgatagct cctacatttg gag 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 2 ctccaaatgt aggagctatc gtt 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 3 ttaacacctt agcgacggct agt 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 4 ctccaaacgt aggagttatc gtt 23

Claims (206)

  1. (a) 하기의 성분을 함유하는 조성물을 형성하는 단계:
    (A)k, (B)u, (C), (D)x
    (b) A, B, D 및 해당 분석대상물을 함유하는 착물을 조성물의 다른 성분과 분리시키는 단계;
    (c) 착물 내 ECL 모이어티를 전기화학적 에너지에 직접적으로 노출시켜 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 모이어티를 유도하는 단계; 및
    (d) 방출된 전자기적 방사선을 검출하고, 이로써 해당 분석대상물의 존재를 검출하는 단계를 포함하되,
    여기서, A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고;
    B는 B 내부에 갇힌(entrapped) 두 개 이상의 A를 함유하는 고체 비드 형태의 제1운반체이고, B는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며;
    C는 해당 분석대상물을 함유할 수 있는 시료이고;
    D는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 제2운반체이며;
    u 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이고; k는 2보다 크거나 같은 정수인데;
    단, B와 D 모두가 해당 분석대상물에 결합되는 것은 아닌, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 해당 분석대상물은 핵산이고; 제1 특이적 결합 파트너는 핵산이고; 제2 특이적 결합 파트너는 핵산인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서, 해당 분석대상물은 단백질이고; 제1 특이적 결합 파트너는 항체, 항체의 일부분 또는 결합 단백질(binding protein)이고; 제2 특이적 결합 파트너는 항체, 항체의 일부분 또는 결합 단백질인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, B는 제1 특이적 결합 파트너에 결합되고; D는 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1운반체는 폴리스티렌 비드이며 상기 제2운반체는 자기 비드(magnetic bead)인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서, ECL 공반응물을 조성물에 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 ECL 공반응물은 아민 또는 아민 모이어티인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서, B 및 D는 독립적으로 폴리아크릴, 비닐 중합체, 아크릴산, 나일론, 폴리메타아크릴산(polymethacrylate), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴니트릴, 및 폴리올레핀으로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 함유하는 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서, 유기 용매에 B를 용해시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 ECL 모이어티는 오스뮴 및 루테늄에서 선택된 금속 이온을 함유하는 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 ECL 모이어티는 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 ECL 모이어티는 루테늄 및 3개의 비덴테이트(bidentate) 리간드를 포함하는 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출 방법.
  13. (A)k, (B)u, (C), 및 (D)x
    를 포함하는, 시료 내 해당 분석대상물 검출용 조성물로서,
    A는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있는 ECL 모이어티이고;
    B는 제1운반체 내에 함유된 두 개 이상의 A를 함유하는 제1운반체이고, B는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되며;
    C는 해당 분석대상물을 함유할 수 있는 시료이고;
    D는 해당 분석대상물에 결합되거나, 또는 해당 분석대상물의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 제2운반체이며;
    u 및 x는 각각 1보다 크거나 같은 정수이고; k는 2보다 크거나 같은 정수이며;
    단, B와 D 모두가 해당 분석대상물에 결합되는 것은 아니며;
    B는 비드를 포함하는 고체 지지체이고, B는 그 내부에 갇힌(entrapped) 복수개의 ECL 모이어티 A를 포함하는 것이 특징인,
    시료 내 해당 분석대상물 검출용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 ECL 모이어티는 루테늄 및 3개의 비덴테이트 리간드를 함유하는 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물 검출용 조성물.
  15. 제1운반체 내부에 갇힌 2개 이상의 ECL 모이어티를 함유한, 고체 비드 형태의 제1운반체로서, 상기 ECL 모이어티는 전기화학적 에너지 공급원에 대한 직접적 노출에 의해 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도될 수 있고; 상기 제1운반체는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되는 제1운반체; 및
    해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제2 특이적 결합 파트너에 결합되는 제2운반체
    를 함유하고,
    상기 제1운반체와 제2운반체 모두가 해당 분석대상물에 결합되는 것은 아닌, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 키트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 ECL 모이어티는 각각 오스뮴 및 루테늄에서 선택된 금속 이온을 함유하는 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 ECL 모이어티는 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 키트.
  18. 제15항에 있어서, 상기 ECL 모이어티는 루테늄 및 3개의 비덴테이트 리간드를 함유하는 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 키트.
  19. 제15항에 있어서, 제1운반체는 폴리스티렌 비드이거나, 제2운반체는 자기 비드이거나, 제1운반체는 폴리스티렌 비드이고 제2운반체는 자기 비드인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 키트.
  20. 제15항에 있어서, 해당 분석대상물은 핵산이고; 제1 결합 파트너 및 제2 결합 파트너는 올리고뉴클레오티드인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 키트.
  21. 제15항에 있어서, 해당 분석대상물은 단백질이고; 제1 특이적 결합 파트너는 항체, 항체의 일부분 또는 결합 단백질(binding protein)이고; 제2 특이적 결합 파트너는 항체, 항체의 일부분 또는 결합 단백질인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 키트.
  22. 제15항에 있어서, ECL 모이어티가 유기 용매에는 용해성인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 키트.
  23. 제22항에 있어서, ECL 모이어티가 수성 용매에는 불용성인 것이 특징인, 시료 내 해당 분석대상물의 검출을 위한 키트.
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  27. 내부를 갖는 합성 유기 중합체 비드를 함유하는 해당 분석대상물 검출용 조성물로서,
    상기 합성 유기 중합체 비드는 해당 분석대상물에 결합되거나 또는 해당 분석대상물의 제1 특이적 결합 파트너에 결합되고,
    상기 합성 유기 중합체 비드는 그 내부에 갇힌 복수개의 ECL 모이어티를 포함하며,
    상기 ECL 모이어티는 전기화학적 에너지에 직접 노출시 전자기적 방사선을 반복적으로 방출하도록 유도되는 것이 특징인,
    해당 분석대상물 검출용 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 ECL 모이어티는 루테늄 및 3개의 비덴테이트 리간드를 함유하는 것이 특징인, 해당 분석대상물 검출용 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 ECL 모이어티는 Ru(bpy)3[B(C6F5)4]2를 포함하는 것이 특징인, 해당 분석대상물 검출용 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 합성 유기 중합체 비드는 폴리스티렌 비드인 것이 특징인, 해당 분석대상물 검출용 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 상기 ECL 모이어티가 유기 용매에는 용해성이고, 수용액에서는 비용해성인 것이 특징인, 해당 분석대상물 검출용 조성물.
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