CN109946289B - 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于自发光材料Ru@MOF‑5为发光体，用于检测雌二醇的无标型电致化学发光免疫传感器的制备方法，本发明属于新型功能材料与生物传感技术领域。具体是以孔隙率高、稳定性好的金属‑有机骨架复合物(MOF)材料MOF‑5负载Ru(bpy)3 2+合成新型材料Ru@MOF‑5，以此作为电致化学发光传感平台。合成的新型发光材料Ru@MOF‑5具有自发光特性，在检测目标物时PBS缓冲溶液中无需添加共反应剂，即可产生高且稳定的ECL信号。此策略降低了对环境的污染，且操作更为简便。以此构建的无标型电致化学发光传感器，用于灵敏准确检测雌二醇。
Description
技术领域
本发明涉及一种电致化学发光免疫传感器的制备与应用，具体说是一种以自发光材料Ru@MOF-5为传感平台灵敏检测雌二醇的无标型免疫传感器，本发明属于新型功能材料、生物传感技术领域。
背景技术
雌二醇是一种是促进女性内外生殖器发育，维持女性性功能及第二性征的重要雌激素，并与孕激素协同作用，形成月经周期。体内雌激素的不同含量预示着不同的身体状况，如体内雌二醇含量过高可能诱发卵巢疾患、心脏病、肝硬化等疾病。因此准确测定雌二醇的含量对判断人体健康状况有重要意义。
电致化学发光(ECL)是将电化学手段与化学发光技术相结合的一种研究方法，近几年在免疫分析等方面受到的广泛地关注。ECL传感器具有高灵敏性、高选择性、高专一性和检出限低等优点，可快速准确的检测待测物的含量。
金属-有机骨架复合物(MOF)是近十年来发展迅速的一种配位聚合物，具有三维的孔结构，一般以金属离子为连接点，有机配体位支撑构成空间3D延伸，系沸石和碳纳米管之外的又一类重要的新型多孔材料，在催化，传感，储能和分离中都有广泛应用。本发明中采用的MOF-5具有大的比表面积及高孔隙率，用于承载更多的Ru(bpy)3 2+，从而增大发光信号；此外MOF-5含有丰富的羧基基团，用于结合雌二醇抗体。将自发光材料Ru@MOF-5作为基底构建的电致化学发光免疫传感器，能有效提高雌二醇检测的灵敏度和特异性。
发明内容
本发明的目的之一是制备一种以Ru@MOF-5为传感平台的无标型电致化学发光免疫传感器。
本发明的目的之二是将该传感器用于雌二醇的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的制备方法如下：
（1）将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
（2）将8 μL，3 ~ 6 mg/mL Ru@MOF-5复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
（3）将8 μL，1 ~ 2 μg/mL 雌二醇抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
（4）将3 μL，质量分数为1 ~ 2% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
（5）将8 μL，0.0005 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的雌二醇抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥。
2. 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的Ru@MOF-5材料的制备步骤如下：
(1) MOF-5的制备
将1 ~ 3 mmol Zn(NO3)2·6H2O与1 ~ 3 mmol对苯二甲酸(H2BDC)溶解于200 ~300 mmol 的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌使其溶解，后将7 ~ 9 mmol三乙胺(TEA)加入混合溶液中，连续搅拌2 ~ 4小时，离心洗涤数次，将获得的白色沉淀放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到MOF-5；
(2) Ru@MOF-5的制备
称取100 ~ 200 mg的MOF-5溶解于DMF中，加入20 ~ 40 mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌，70 ˚C油浴加热12小时，后通过离心洗涤收集沉淀，放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到Ru@MOF-5。
3. 雌二醇的检验，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.6V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL PBS缓冲溶液(pH 6.0 ~ 8.5)中，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的雌二醇标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测雌二醇样品溶液代替雌二醇标准溶液进行测定。
本发明的有益成果
（1）本发明采用Ru@MOF-5作为自发光材料，免去了缓冲溶液中添加共反应剂的步骤，降低了对环境的污染，此外，自发光材料Ru@MOF-5产生高且稳定的ECL发光信号，有效提高传感器的灵敏度；
（2）本发明采用Ru@MOF-5作为传感平台构建的超灵敏电致化学发光免疫传感器应用于雌二醇的检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽（0.0005 ng/mL ~ 100 ng/mL）和检出限低（0.13 pg/mL）的优点。
具体实施方式
实施例1 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的Ru@MOF-5材料的制备步骤如下：
(1) MOF-5的制备
将1 mmol Zn(NO3)2·6H2O与2 mmol对苯二甲酸(H2BDC)溶解于200 mmol 的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌使其溶解，后将7 mmol三乙胺(TEA)加入混合溶液中，连续搅拌3小时，离心洗涤数次，将获得的白色沉淀放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到MOF-5；
(2) Ru@MOF-5的制备
称取150 mg的MOF-5溶解于DMF中，加入20 mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌，70 ˚C油浴加热12小时，后通过离心洗涤收集沉淀，放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到Ru@MOF-5。
实施例2 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的Ru@MOF-5材料的制备步骤如下：
(1) MOF-5的制备
将2 mmol Zn(NO3)2·6H2O与1 mmol对苯二甲酸(H2BDC)溶解于260 mmol 的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌使其溶解，后将7.91 mmol三乙胺(TEA)加入混合溶液中，连续搅拌2小时，离心洗涤数次，将获得的白色沉淀放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到MOF-5；
(2) Ru@MOF-5的制备
称取100 mg的MOF-5溶解于DMF中，加入30 mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌，70 ˚C油浴加热12小时，后通过离心洗涤收集沉淀，放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到Ru@MOF-5。
实施例3 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的Ru@MOF-5材料的制备步骤如下：
(1) MOF-5的制备
将3 mmol Zn(NO3)2·6H2O与3 mmol对苯二甲酸(H2BDC)溶解于300 mmol 的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌使其溶解，后将9 mmol三乙胺(TEA)加入混合溶液中，连续搅拌4小时，离心洗涤数次，将获得的白色沉淀放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到MOF-5；
(2) Ru@MOF-5的制备
称取200 mg的MOF-5溶解于DMF中，加入40 mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌，70 ˚C油浴加热12小时，后通过离心洗涤收集沉淀，放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到Ru@MOF-5。
实施例4 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的制备方法：
（1）将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
（2）将8 μL，3 mg/mL Ru@MOF-5复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
（3）将8 μL，1.5 μg/mL 雌二醇抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
（4）将3 μL，质量分数为1.5% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
（5）将8 μL，0.0005 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的雌二醇抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥。
实施例5 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的制备方法：
（1）将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
（2）将8 μL，5 mg/mL Ru@MOF-5复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
（3）将8 μL，1 μg/mL 雌二醇抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
（4）将3 μL，质量分数为1% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
（5）将8 μL，0.0005 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的雌二醇抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥。
实施例6 一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的制备方法：
（1）将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
（2）将8 μL，6 mg/mL Ru@MOF-5复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
（3）将8 μL，2 μg/mL 雌二醇抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
（4）将3 μL，质量分数为2% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
（5）将8 μL，0.0005 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的雌二醇抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥。
实施例7 雌二醇的检验，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.6V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL PBS缓冲溶液(pH 6.0 ~ 8.5)中，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的雌二醇标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测雌二醇样品溶液代替雌二醇标准溶液进行测定；
（4）雌二醇检测的线性范围是0.0005 ng/mL ~ 100 ng/mL，检测限是0.13 pg/mL。
Claims (3)
1.一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，并在-0.2 ~ 0.6 V电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mV；
（2）将8 μL，3 ~ 6 mg/mL Ru@MOF-5复合物溶液滴加在电极上，室温下干燥；
（3）将8 μL，1 ~ 2 μg/mL 雌二醇抗体滴加在电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗体，室温下干燥；
（4）将3 μL，质量分数为1 ~ 2% BSA溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用PBS洗去多余BSA，室温下干燥；
（5）将8 μL，0.0005 ~ 100 ng/mL一系列不同浓度的雌二醇抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用PBS清洗，除去多余抗原，室温下干燥。
2.如权利要求 1所述的一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的制备方法，其所述的Ru@MOF-5材料的制备步骤如下：
(1) MOF-5的制备
将1 ~ 3 mmol Zn(NO3)2·6H2O与1 ~ 3 mmol对苯二甲酸(H2BDC)溶解于200 ~ 300mmol 的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌使其溶解，后将7 ~ 9 mmol三乙胺(TEA)加入混合溶液中，连续搅拌2 ~ 4小时，离心洗涤数次，将获得的白色沉淀放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到MOF-5；
(2) Ru@MOF-5的制备
称取100 ~ 200 mg的MOF-5溶解于DMF中，加入20 ~ 40 mg三(2,2'-联吡啶)二氯化钌，70 ˚C油浴加热12小时，后通过离心洗涤收集沉淀，放置于60 ˚C真空干燥箱中干燥24小时，得到Ru@MOF-5。
3.如权利要求 1所述的一种基于自发光材料Ru@MOF-5检测雌二醇的无标型电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，用于雌二醇的检验，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.6 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 6.0 ~ 8.5的PBS缓冲溶液中，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的雌二醇标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测雌二醇样品溶液代替雌二醇标准溶液进行测定。
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