CN105301241B - 用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其用于，包括磁性氧化石墨烯合成以及依次将偶联试剂、肿瘤标志物一抗固载到磁性氧化石墨表面得到功能化氧化石墨烯制备的步骤：功能化氮化碳的制备以及依次将纳米金颗粒、肿瘤标志物二抗固载氮化碳薄膜表面得到功能化氮化碳的步骤；最后将功能化氧化石墨烯、待测肿瘤标志物和功能化氮化碳依次吸附于磁性玻碳电极表面即可，将得到夹心式电化学发光免疫传感器作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，即可计算得到待测样品溶液中肿瘤标志物的准确浓度，优点是检测速度快、检测结果灵敏度和准确性高、特异性强。

Description

用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备 方法及其应用
技术领域
本发明涉及电化学发光免疫传感器，尤其是涉及用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。
背景技术
肿瘤是人类健康的杀手。恶性肿瘤也称为癌症，是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病，它是机体受各种内在或外在致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失掉了对其自身生长的正常调控，导致不正常增生而形成的新生物。据WHO研究，2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居世界第一位。WHO也指出，及早诊断和治疗是对抗肿瘤疾病的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重要因素。肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和增殖过程中产生的、反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶、基因等，是肿瘤早期诊断的重要指标。一般而言，肿瘤细胞越多，恶性程度越高，越晚期，肿瘤标志物的浓度越高。随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代，越来越多的高特异性、低丰度肿瘤标志物被发现，这就对建立快速、高灵敏度、高特异性肿瘤标志物检测技术提出了更高的要求。
免疫分析法是利用抗体与抗原之间的特异性识别与结合而建立的高选择性生物化学方法。目前，检测肿瘤标志物的免疫分析方法主要有：放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、电化学免疫分析法(ECIA)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)和免疫电镜法等，这些方法都有一定的灵敏度和准确度，但也各有一定的不足之处：有的仪器昂贵、操作复杂、技术要求高，有的步骤繁多、易出现假阳性和假阴性，有的使用放射性试剂，有的特异性不强、灵敏度不高、选择性差，有的响应时间长、无法重复测量。因此，开发灵敏、准确、快速、简便的肿瘤标志物检测方法仍是迫切需求。
电化学发光免疫传感器是电化学发光和免疫传感器相结合的产物，由于其灵敏度高、特异性好、重现性好、操作简便等优点，具有广阔的应用前景，并被广泛应用于临床分析和环境检测领域。
氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，是一种性能优异的新型碳材料，具有较高的比表面积和丰富的官能团，而基于氧化石墨烯制备的功能化氧化石墨烯稳定性高、制备简单，是构建电化学发光传感器的理想材料。氮化碳材料(g-C3N4)是一种类似石墨的纳米薄膜，具有比表面积大、稳定性强、硬度大、导电性好、生物相容性良好等特点，并且氮化碳材料本身具有极强的电化学发光的能力，非常适合用于开发电化学发光免疫传感器。目前国内外还没有公开任何关于基于氧化石墨烯和氮化碳两种纳米复合材料的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、检测结果灵敏度和准确性高、特异性强的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)功能化氧化石墨烯(Ab1-nanoFe3O4@GO)的制备
a.磁性氧化石墨烯的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入30～50mL 1mg/mL的氧化石墨烯，超声1h；然后在氮气氛保护下逐滴加入20～30mL 0.05～0.07mol/L的氯化亚铁溶液和20～30mL 0.10～0.15mol/L的氯化高铁溶液，于70～90℃搅拌回流，同时缓慢滴加10～15mL 20～30wt％的氨水至溶液的pH＝10～11，搅拌回流处理3～5h；冷却后，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至溶液的pH＝7，定容到50mL，即得纳米四氧化三铁颗粒(nanoFe3O4)均匀覆盖在氧化石墨烯(GO)表面的磁性氧化石墨烯(nanoFe3O4@GO)溶液，4℃储存备用；
b.取步骤(a)中所得的磁性氧化石墨烯(nanoFe3O4@GO)溶液200μL置于玻璃瓶中，超声1h，然后加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH＝4～6，振荡孵育1h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤以去除偶联试剂，定容至200～300μL；用0.1～0.2mol/L NaOH溶液调pH为8.0～10.0，再加入30～50μL 10-4～10-6mg/mL肿瘤标志物一抗(Ab1)孵育3～5h后，再加入50～100μL 2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中性后，定容至100～200μL，即得到功能化氧化石墨烯(Ab1-nanoFe3O4@GO)溶液；
(2)功能化氮化碳(Ab2-Au@g-C3N4)的制备
a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5g氮化碳粉末加入到80～120mL 4～6mol/L硝酸溶液中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心后弃去上清液，加入二次水洗涤；重复离心去上清洗涤步骤，直至上清液为中性；取沉淀加入50～100mL水，超声4个小时，8000rpm离心半个小时，保留上清液，即得到氮化碳薄膜溶液；
b.取30～70mL氮化碳薄膜溶液加入到30～70mL直径10～30nm的胶体金溶液中，室温下搅拌16～24h，6000～8000rpm离心半个小时后，取上部溶液即得到表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液；取200μL表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液于玻璃瓶中，加入30～50μL10-4～10-6mg/mL肿瘤标志物二抗(Ab2)后孵育3～5h，通过抗体表面的氨基与纳米金的结合作用，将肿瘤标志物二抗Ab2固载到氮化碳薄膜表面；然后加入50～100μL 2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h；12000rpm离心，去除上清液后加入水清洗；重复离心去上清洗涤3次后，取沉淀加入水定容至200～300μL，即得功能化氮化碳(Ab2-Au@g-C3N4)溶液；
(3)电化学发光免疫传感器的组装
a.将直径为3～5mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，然后依次用体积比为50％的乙醇水溶液、体积比为50％的硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗2min；
b.取5～10μL步骤(1)得到的功能化氧化石墨烯(Ab1-nanoFe3O4@GO)溶液，滴在上述预处理过的磁性玻碳电极表面，功能化氧化石墨烯即被均匀、牢固地吸附于电极表面；将吸附有功能化氧化石墨烯的磁性玻碳电极浸入在待测肿瘤标志物溶液中，置于35℃孵育1～2h后，清洗；再置于5～10μL步骤(2)得到的功能化氮化碳溶液中，于35℃中孵育1～2h后，清洗，即得到用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器。
步骤(1)b中所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为10～100mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔浓度为1～10mmol/L。
步骤(2)b中所述的胶体金溶液制备方法如下：将1～3mL 1wt％氯金酸溶液加入到80～120mL蒸馏水，在磁力搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入3～5mL的1wt％柠檬酸钠水溶液，继续煮沸直至溶液变为深红色，沸腾状态下继续加热搅拌20min，即得到胶体金溶液，4℃密封保存。
所述的肿瘤标志物为：鳞状细胞癌抗原(SCCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、碱性磷酸酶(ALP)、组织多肽抗原(TPA)。
利用上述夹心式电化学发光免疫传感器检测肿瘤标志物的方法，具体步骤如下：将上述夹心式电化学发光免疫传感器作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将上述三电极体系放入含共反应试剂的缓冲溶液，启动电化学反应，测量电化学发光强度，获得待测肿瘤标志物溶液对应的电化学发光强度值；根据电化学发光强度值与肿瘤标志物溶液浓度对数之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中肿瘤标志物的准确浓度。
所述的缓冲溶液为：含有10～30mmol/L K2S2O8和80～100mmol/L KCl的pH为7.5～8.5的磷酸盐缓冲溶液，。
所述的电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0.25秒；脉冲间隔：30秒；初始电压：0V；脉冲电压：1.6V。
发明原理：本发明利用免疫反应的高特异性，结合两种片层网状纳米结构材料，制备了一种电化学发光免疫传感器并用来检测多种肿瘤标志物。多功能化氧化石墨烯材料是在氧化石墨烯上同时修饰有四氧化三铁纳米磁珠和第一抗体的复合材料；多功能化氮化碳材料是在氮化碳上同时负载有纳米金和第二抗体；这两种纳米复合材料具有多种功能：(1)氧化石墨烯和氮化碳材料均具有巨大的表面积、丰富的表面基团和良好的生物相容性，可以负载大量肿瘤标志物抗体和其他纳米粒子，并且具有良好的导电性，有利于电子传递，增强电化学发光；(2)氮化碳材料自身具有极强的电化学发光，不需要另外标记电化学发光体，大大简化了制备步骤；(3)负载的肿瘤标志物抗体，可以特异性识别肿瘤标志物；(4)使用两种大表面积片层网状结构的纳米材料，通过形成“第一抗体-抗原-第二抗体”夹心式免疫复合物，氧化石墨烯和氮化碳这两种网状结构的材料就会搭接在一起，结合在免疫复合物中的所有氮化碳都如同直接固载在电极表面，都可以直接参与电极反应，大大增强电化学发光信号。
本发明构建的电化学发光免疫传感器，可以特异性地俘获样品中的肿瘤标志物，当多功能化氮化碳材料通过形成“第一抗体-抗原-第二抗体”夹心式免疫复合物被结合到传感器表面之后，在电化学反应激发下，氮化碳即会产生稳定的电化学发光信号；肿瘤标志物的浓度越大，结合的氮化碳材料就会越多，电化学发光强度就会越高，电化学发光强度与肿瘤标志物浓度的对数之间呈线性关系。据此可以实现样品中肿瘤标志物的未知浓度的检测。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)高灵敏度。本发明的检测灵敏度大约是现有方法的10倍以上，本发明检测限为0.3～3pg/mL左右，现行方法的检测限大致为5～100pg/mL左右。原因在于：首先，传统夹心式电化学发光免疫传感器，是将电化学发光物质标记在肿瘤标志物第二抗体上，可以标记的电化学发光物质数量有限，且其距离电极表面的距离较大，可以参与电化学反应的电化学发光物质数量很有限，造成发光效率不高。本发明使用两种片层网状纳米结构材料，形成“第一抗体-抗原-第二抗体”夹心式免疫复合物后，这两种二维网状结构的材料就会搭接在一起，所有电化学发光体氮化碳都如同直接固载在电极表面，都可以直接参与电极反应，大大增强电化学发光信号，提高了检测灵敏度。
(2)高特异性，常见其他肿瘤标志物对本检测体系均无干扰。原因在于：本发明是基于肿瘤标志物抗体与肿瘤标志物之间的特异性识别与结合而构建的电化学发光免疫传感器，干扰物质不是特定抗体的目标物，因此待测液中的干扰物质并不能与特定抗体结合，故对本检测体系无干扰。
(3)结果准确，回收率均在90％～110％之间。
(4)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快。
(5)只需改变抗体种类即可实现多种肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测，此方法简单、经济，有利于促进传感器的商品化。
综上所述，本发明制备的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器，兼具免疫分析的高选择性和电化学发光技术的高灵敏度，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现对超低浓度肿瘤标志物的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为不同浓度鳞状细胞癌抗原(SCCA)的电化学发光强度(y)—浓度(x)对数线性图；
图2为不同浓度甲胎蛋白(AFP)的电化学发光强度(y)—浓度(x)对数线性图；
图3为不同浓度癌胚抗原(CEA)的电化学发光强度(y)—浓度(x)对数线性图；
图4为不同浓度前列腺特异性抗原(PSA)的电化学发光强度(y)—浓度(x)对数线性图；
图5为不同浓度碱性磷酸酶(ALP)的电化学发光强度(y)—浓度(x)对数线性图；
图6为不同浓度组织多肽抗原(TPA)的电化学发光强度(y)—浓度(x)对数线性图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
一种用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)功能化氧化石墨烯(Ab1-nanoFe3O4@GO)的制备
a.磁性氧化石墨烯的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入30～50mL 1mg/mL的氧化石墨烯，超声1h；然后在氮气氛保护下逐滴加入20～30mL0.05～0.07mol/L的氯化亚铁溶液和20～30mL 0.10～0.15mol/L的氯化高铁溶液，于70～90℃搅拌回流，同时缓慢滴加10～15mL 20～30wt％的氨水至溶液的pH＝10～11，搅拌回流处理3～5h；冷却后，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至溶液的pH＝7，定容到50mL，即得纳米四氧化三铁颗粒(nanoFe3O4)均匀覆盖在氧化石墨烯(GO)表面的磁性氧化石墨烯(nanoFe3O4@GO)溶液，4℃储存备用；
b.取步骤(a)中所得的磁性氧化石墨烯(nanoFe3O4@GO)溶液200μL置于玻璃瓶中，超声1h，然后加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH＝4～6，振荡孵育1h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤以去除偶联试剂，定容至200～300μL；用0.1～0.2mol/L NaOH溶液调pH为8.0～10.0，再加入30～50μL 10-4～10-6mg/mL肿瘤标志物一抗(Ab1)孵育3～5h后，再加入50～100μL 2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中性后，定容至100～200μL，即得到功能化氧化石墨烯(Ab1-nanoFe3O4@GO)溶液；其中偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为10～100mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔浓度为1～10mmol/L；
(2)功能化氮化碳(Ab2-Au@g-C3N4)的制备
a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5g氮化碳粉末加入到80～120mL 4～6mol/L硝酸溶液中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心后弃去上清液，加入二次水洗涤；重复离心去上清洗涤步骤，直至上清液为中性；取沉淀加入50～100mL水，超声4个小时，8000rpm离心半个小时，保留上清液，即得到氮化碳薄膜溶液；
b.取30～70mL氮化碳薄膜溶液加入到30～70mL直径10～30nm的胶体金溶液中，室温下搅拌16～24h，6000～8000rpm离心半个小时后，取上部溶液即得到表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液；取200μL表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液于玻璃瓶中，加入30～50μL10-4～10-6mg/mL肿瘤标志物二抗(Ab2)后孵育3～5h，通过抗体表面的氨基与纳米金的结合作用，将肿瘤标志物二抗Ab2固载到氮化碳薄膜表面；然后加入50～100μL 2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h；12000rpm离心，去除上清液后加入水清洗；重复离心去上清洗涤3次后，取沉淀加入水定容至200～300μL，即得功能化氮化碳(Ab2-Au@g-C3N4)溶液；其中胶体金溶液制备方法如下：将1～3mL 1wt％氯金酸溶液加入到80～120mL蒸馏水，在磁力搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入3～5mL的1wt％柠檬酸钠水溶液，继续煮沸直至溶液变为深红色，沸腾状态下继续加热搅拌20min，即得到胶体金溶液，4℃密封保存；
(3)电化学发光免疫传感器的组装
a.将直径为3～5mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，然后依次用体积比为50％的乙醇水溶液、体积比为50％的硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗2min；
b.取5～10μL步骤(1)得到的功能化氧化石墨烯(Ab1-nanoFe3O4@GO)溶液，滴在上述预处理过的磁性玻碳电极表面，功能化氧化石墨烯即被均匀、牢固地吸附于电极表面；将吸附有功能化氧化石墨烯的磁性玻碳电极浸入在待测肿瘤标志物溶液中，置于35℃孵育1～2h后，清洗；再置于5～10μL步骤(2)得到的功能化氮化碳溶液中，于35℃中孵育1～2h后，清洗，即得到用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器。
上述肿瘤标志物为：鳞状细胞癌抗原(SCCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、碱性磷酸酶(ALP)、组织多肽抗原(TPA)。
具体实施例二
用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器检测肿瘤标志物的方法，具体步骤如下：
将上述具体实施例一步骤(3)制备得到的吸附有功能化氧化石墨烯的磁性玻碳电极分别孵育在含有不同浓度的肿瘤标志物溶液50～100μL中，置于4℃中孵育1～2h后，清洗；再取5～10μL上述具体实施例一步骤(2)制备得到的功能化氮化碳溶液中，于4℃中孵育1～2h后，清洗；以之作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将三电极体系放入缓冲溶液，启动电化学反应，测量电化学发光强度；获得一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液对应的电化学发光强度值，建立电化学发光强度值与肿瘤标志物溶液浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测样品中肿瘤标志物的未知浓度。
上述缓冲溶液为：含有10～30mmol/L K2S2O8和80～100mmol/L KCl的pH为7.5～8.5的磷酸盐缓冲溶液，。
上述电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0.25秒；脉冲间隔：30秒；初始电压：0V；脉冲电压：1.6V。
上述肿瘤标志物为：鳞状细胞癌抗原(SCCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、碱性磷酸酶(ALP)、组织多肽抗原(TPA)。
具体实施例三
一种用于检测鳞状细胞癌抗原(SCCA)的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)功能化氧化石墨烯的制备
a.磁性氧化石墨烯的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入40mL 1mg/mL的氧化石墨烯，超声1h；然后在氮气氛保护下逐滴加入25mL 0.06mol/L的氯化亚铁溶液和25mL 0.12mol/L的氯化高铁溶液，于80℃搅拌回流，同时缓慢滴加12mL 25wt％的氨水至溶液的pH＝10，搅拌回流处理4h；冷却后，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至溶液的pH＝7，定容到50mL，即得纳米四氧化三铁颗粒均匀覆盖在氧化石墨烯表面的磁性氧化石墨烯溶液，4℃储存备用；
b.取步骤(a)中所得的磁性氧化石墨烯溶液200μL置于玻璃瓶中，超声1h，然后加入300μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH＝5，振荡孵育1h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤以去除偶联试剂，定容至250μL；用0.15mol/L NaOH溶液调pH为9.0，再加入40μL 10-5mg/mL鳞状细胞癌抗原一抗(Ab1)孵育4h后，再加入75μL2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1.5h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中性，定容至150μL，即得到功能化氧化石墨烯溶液；其中偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到，偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为50mmol/L，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔浓度为5mmol/L；
(2)功能化氮化碳的制备
a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在550℃下加热4h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取1.2g氮化碳粉末加入到100mL 5mol/L硝酸溶液中，于135℃下回流36小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心后弃去上清液，加入二次水洗涤；重复离心去上清洗涤步骤，直至上清液为中性；取沉淀加入75mL水，超声4个小时，8000rpm离心半个小时，保留上清液，即得到氮化碳薄膜溶液；
b.取50mL氮化碳薄膜溶液加入到50mL直径20nm的胶体金溶液中，室温下搅拌20h，7000rpm离心半个小时后，取上部溶液即得到表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液；取200μL表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液于玻璃瓶中，加入40μL10-4mg/mL鳞状细胞癌抗原二抗(Ab2)后孵育4h，通过抗体表面的氨基与纳米金的结合作用，将鳞状细胞癌抗原二抗Ab2固载到氮化碳薄膜表面；然后加入75μL 2wt％牛血清白蛋白溶液，继续孵育1.5h；12000rpm离心，去除上清液后加入水清洗；重复离心去上清洗涤3次后，取沉淀加入水定容至250μL，即得功能化氮化碳溶液；其中胶体金溶液制备方法如下：将2mL 1wt％氯金酸溶液加入到100mL蒸馏水，在磁力搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入4mL的1wt％柠檬酸钠水溶液，继续煮沸直至溶液变为深红色，沸腾状态下继续加热搅拌20min，即得到胶体金溶液，4℃密封保存；
(3)电化学发光免疫传感器的组装
a.将直径为4mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，然后依次用体积比为50％的乙醇水溶液、体积比为50％的硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗2min；
b.取7.5μL步骤(1)得到的功能化氧化石墨烯溶液，滴在上述预处理过的磁性玻碳电极表面，功能化氧化石墨烯即被均匀、牢固地吸附于电极表面；将吸附有功能化氧化石墨烯的磁性玻碳电极浸入在待测鳞状细胞癌抗原溶液中，置于35℃孵育1.5h后，清洗；再置于7.5μL步骤(2)得到的功能化氮化碳溶液中，于35℃中孵育1.5h后，清洗，即得到用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器。
将上述用于检测鳞状细胞癌抗原的夹心式电化学发光免疫传感器作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将三电极体系放入缓冲溶液，启动电化学反应，测定电化学发光强度；获得一系列不同浓度的鳞状细胞癌抗原溶液对应的电化学发光强度值，建立电化学发光强度值与鳞状细胞癌抗原溶液浓度之间的定量关系；不同浓度鳞状细胞癌抗原的ECL强度(y)—浓度(x)对数线性关系如图1所示。线性方程为：y＝2442.65*logx+5279.78。相关系数R2＝0.9822，线性范围为0.01～100ng/mL，检测限为3pg/mL。线性良好，可用于检测样品中鳞状细胞癌抗原的未知浓度。
具体实施例四
同上述实施例三，其区别在于：
步骤(1)功能化氧化石墨烯的制备中
a.磁性氧化石墨烯的合成：在三颈烧瓶中加入30mL的氧化石墨烯，超声1h；然后逐滴加入20mL 0.07mol/L的氯化亚铁溶液和20mL 0.15mol/L的氯化高铁溶液，于70℃搅拌回流，同时缓慢滴加10mL 30wt％的氨水至溶液的pH＝10，搅拌回流处理3h；
b.在含有磁性氧化石墨烯溶液的玻璃瓶中加入200μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH＝4，振荡孵育1h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤，定容至200μL；用0.1mol/L NaOH溶液调pH为8.0，再加入30μL 10-4mg/mL鳞状细胞癌抗原一抗孵育3h后，再加入50μL牛血清白蛋白溶液，继续孵育1h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中性，定容至100μL，即得到功能化氧化石墨烯溶液；其中偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为10mmol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为10mmol/L。
步骤(2)功能化氮化碳的制备中：
a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500℃下加热5h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8g氮化碳粉末加入到80mL 6mol/L硝酸溶液中，于120℃下回流48小时后，自然冷却至室温，离心后弃去上清液加入二次水洗涤；重复离心去上清洗涤步骤，直至上清液为中性；取沉淀加入50mL水，超声离心后取上清液，即得到氮化碳薄膜溶液；
b.取30mL氮化碳薄膜溶液加入到30mL直径10nm的胶体金溶液中，室温下搅拌16h，6000rpm离心半个小时后，取200μL上部溶液于玻璃瓶中，加入30μL 10-4mg/mL鳞状细胞癌抗原二抗后孵育3h，然后加入50μL牛血清白蛋白溶液，继续孵育1h；离心去上清液后加入水清洗；重复离心去上清洗涤3次后，取沉淀加入水定容至200μL，即得功能化氮化碳溶液；其中胶体金溶液制备方法如下：将1mL 1wt％氯金酸溶液加入到80mL蒸馏水，在磁力搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入3mL的1wt％柠檬酸钠水溶液，继续煮沸直至溶液变为深红色，沸腾状态下继续加热搅拌20min，即得到胶体金溶液。
步骤(3)电化学发光免疫传感器的组装中：采用直径为3mm的磁性玻碳电极抛光至镜面；取5μL功能化氧化石墨烯溶液，滴在上述预处理过的磁性玻碳电极表面，然后浸入在待测鳞状细胞癌抗原溶液中，孵育1h后，清洗；再置于5μL功能化氮化碳溶液中，孵育1h后，清洗即可。
具体实施例五
同上述实施例三，其区别在于：步骤(1)功能化氧化石墨烯的制备中
a.磁性氧化石墨烯的合成：在三颈烧瓶中加入50mL氧化石墨烯；然后逐滴加入30mL0.05mol/L的氯化亚铁溶液和30mL 0.10mol/L的氯化高铁溶液，于90℃搅拌回流，同时缓慢滴加15mL 20wt％的氨水至溶液的pH＝11，搅拌回流处理5h；
b.在含有磁性氧化石墨烯溶液的玻璃瓶中加入400μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH＝6，振荡孵育，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤，定容至300μL；用0.2mol/L NaOH溶液调pH为10.0，再加入50μL 10-6mg/mL鳞状细胞癌抗原一抗孵育5h后，再加入100μL牛血清白蛋白溶液，继续孵育2h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中性，定容至200μL，即得到功能化氧化石墨烯溶液；其中偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为100mmol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为1mmol/L；
步骤(2)功能化氮化碳的制备中：
a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在600℃下加热3h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取1.5g氮化碳粉末加入到120mL 4mol/L硝酸溶液中，于150℃下回流24小时后；取沉淀加入100mL水，超声离心取上清液即可；
b.取70mL氮化碳薄膜溶液加入到70mL直径30nm的胶体金溶液中，室温下搅拌24h，8000rpm离心半个小时后，取200μL上部溶液于玻璃瓶中，加入50μL 10-6mg/mL鳞状细胞癌抗原二抗后孵育5h，然后加入100μL牛血清白蛋白溶液，继续孵育2h；重复离心去上清洗涤后，取沉淀加入水定容至300μL，即得功能化氮化碳溶液；其中胶体金溶液制备方法如下：将3mL氯金酸溶液加入到120mL蒸馏水加热至沸腾，然后迅速加入5mL的柠檬酸钠水溶液；
步骤(3)电化学发光免疫传感器的组装中：
采用直径为5mm的磁性玻碳电极抛光至镜面，取10μL功能化氧化石墨烯溶液，滴在上述预处理过的磁性玻碳电极表面，然后浸入在待测鳞状细胞癌抗原溶液中，孵育2h后，清洗；再置于10μL功能化氮化碳溶液中，孵育2h后，清洗即可。
具体实施例六
用于检测甲胎蛋白(AFP)的夹心式电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为甲胎蛋白，不同浓度甲胎蛋白的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图2所示，线性方程为：y＝1739.61*logx+5952.83，相关系数R2＝0.9832，线性范围为0.001～5ng/mL，检测限为0.3pg/mL。线性良好，可用于检测待测样品中甲胎蛋白的浓度。
具体实施例七
用于检测癌胚抗原(CEA)的夹心式电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为癌胚抗原，不同浓度癌胚抗原的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图3所示，线性方程为：y＝1804.63*logx+5802.39。相关系数R2＝0.9906，线性范围为0.01～50ng/mL，检测限为3pg/mL。线性良好，可用于检测待测样品中癌胚抗原的浓度。
具体实施例八
用于检测前列腺特异性抗原(PSA)的夹心式电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为前列腺特异性抗原，不同浓度前列腺特异性抗原的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图4所示，线性方程为：y＝2266.90*logx+7308.83。相关系数R2＝0.9909，线性范围为0.001～50ng/mL，检测限为0.3pg/mL。线性良好，可用于检测待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。
具体实施例九
用于检测碱性磷酸酶(ALP)的夹心式电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为碱性磷酸酶，不同浓度碱性磷酸酶的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图5所示，线性方程为：y＝2205.58*logx+6968.97，相关系数0.9885，线性范围为0.001～50ng/mL，检测限为0.3pg/mL。线性良好，可用于检测待测样品中碱性磷酸酶的浓度。
具体实施例十
用于检测组织多肽抗原(TPA)的夹心式电化学发光免疫传感器，其具体制备方法同上述具体实施例三，其区别在于：肿瘤标志物为组织多肽抗原，不同浓度组织多肽抗原的ECL信号(y)—浓度(x)对数线性关系如图6所示，线性方程为：y＝2303.87*logx+7403.98，相关系数0.9898，线性范围为0.001～50ng/mL，检测限为0.3pg/mL。线性良好，可用于检测待测样品中组织多肽抗原的浓度。
具体实施例十一
特异性
将具体实施例三制备的用于检测鳞状细胞癌抗原(SCCA)的夹心式电化学发光免疫传感器，分别测定1μg/mL的AFP、CEA、PSA、ALP、TPA。对应的电化学发光强度在20左右，与空白值大致相当；而测定10-2ng/mL的SCCA，对应的电化学发光强度明显升高，在3000左右，结果表明：选择性良好，常见其它肿瘤标志物无显著性干扰。
同理验证上述具体实施例六-十的电化学发光免疫传感器均选择性良好，常见其它肿瘤标志物无显著性干扰。
具体实施例十二
表1多种肿瘤标志物的检测技术指标
肿瘤标志物 线性范围 检测限，pg/mL
SCCA 0.01～100ng/mL 3pg/mL
AFP 0.001～5ng/mL 0.3pg/mL
CEA 0.01～50ng/mL 3pg/mL
PSA 0.001～50ng/mL 0.3pg/mL
ALP 0.001～50ng/mL 0.3pg/mL
TPA 0.001～50ng/mL 0.3pg/mL
为了考察该方法的准确性与实际应用价值，采用加标回收法，在不同的血清样本中分别加入一定量的不同肿瘤标志物，使得浓度为0.50ng/mL。使用本发明方法检测结果可知，相对标准偏差(RSD)小于8.4％，回收率为92.7～107.8％，结果令人满意。表明本发明对于血清中多种肿瘤标志物的检测精密度高，结果准确可靠，具体结果见表2所示。
表2人血清中多种肿瘤标志物的检测结果
以上结果说明，本发明构建的检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器，灵敏度高、检测限低、选择性高、操作简单、结果准确可靠。只需改变本电化学发光免疫传感器中的抗体，即可实现对不同目标肿瘤标志物的高灵敏度、特异性检测。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)功能化氧化石墨烯的制备
a.磁性氧化石墨烯的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入30～50mL 1mg/mL的氧化石墨烯，超声1h；然后在氮气氛保护下逐滴加入20～30mL 0.05～0.07mol/L的氯化亚铁溶液和20～30mL 0.10～0.15mol/L的氯化高铁溶液，于70～90℃搅拌回流，同时缓慢滴加10～15mL 20～30wt％的氨水至溶液的pH＝10～11，搅拌回流处理3～5h；冷却后，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至溶液的pH＝7，定容到50mL，即得磁性氧化石墨烯溶液，4℃储存备用；
b.取步骤a中所得的磁性氧化石墨烯溶液200μL置于玻璃瓶中，超声1h，然后加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH＝4～6，振荡孵育1h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤以去除偶联试剂，定容至200～300μL；用0.1～0.2mol/L NaOH溶液调pH为8.0～10.0，再加入30～50μL 10-4～10-6mg/mL肿瘤标志物一抗，孵育3～5h后，再加入50～100μL 2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中性后，定容至100～200μL，即得到功能化氧化石墨烯溶液；
(2)功能化氮化碳的制备
a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5g氮化碳粉末加入到80～120mL 4～6mol/L硝酸溶液中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心后弃去上清液，加入二次水洗涤；重复离心去上清洗涤步骤，直至上清液为中性；取沉淀加入50～100mL水，超声4个小时，8000rpm离心半个小时，保留上清液，即得到氮化碳薄膜溶液；
b.取30～70mL氮化碳薄膜溶液加入到30～70mL直径10～30nm的胶体金溶液中，室温下搅拌16～24h，6000～8000rpm离心半个小时后，取上部溶液即得到表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液；取200μL表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液于玻璃瓶中，加入30～50μL10-4～10-6mg/mL肿瘤标志物二抗后孵育3～5h；然后加入50～100μL2wt％牛血清白蛋白溶液，继续孵育1～2h；12000rpm离心，去除上清液后加入水清洗；重复离心去上清洗涤3次后，取沉淀加入水定容至200～300μL，即得功能化氮化碳溶液；
(3)电化学发光免疫传感器的组装
a.将直径为3～5mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，然后依次用体积比为50％的乙醇水溶液、体积比为50％的硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗2min；
b.取5～10μL步骤(1)得到的功能化氧化石墨烯溶液，滴在上述预处理过的磁性玻碳电极表面，功能化氧化石墨烯即被均匀、牢固地吸附于电极表面；将吸附有功能化氧化石墨烯的磁性玻碳电极浸入在待测肿瘤标志物溶液中，于35℃孵育1～2h后清洗；再置于5～10μL步骤(2)得到的功能化氮化碳溶液中，于35℃中孵育1～2h后清洗，即得到用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)b中所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为10～100mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为1～10mmol/L。
3.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于步骤(2)b中所述的胶体金溶液制备方法如下：将1～3mL 1wt％氯金酸溶液加入到80～120mL蒸馏水，在磁力搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入3～5mL的1wt％柠檬酸钠水溶液，继续煮沸直至溶液变为深红色，沸腾状态下继续加热搅拌20min，即得到胶体金溶液，4℃密封保存。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于所述的肿瘤标志物为：鳞状细胞癌抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、碱性磷酸酶或组织多肽抗原。
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