CN104655617A - 用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用,特点是包括磁性氧化石墨烯合成步骤;将电化学发光体和海洋致病菌抗体同时标记到磁性氧化石墨烯材料表面形成多功能化石墨烯材料的步骤;最后取5~10μL多功能化石墨烯材料溶液滴涂于磁性玻碳电极表面得到用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的步骤;利用该电化学发光免疫传感器并根据电化学发光强度值与海洋致病菌溶液浓度之间的定量关系可确定待测样品中海洋致病菌的浓度,优点是检测方法简单、快速,检测结果灵敏、准确、特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学发光免疫传感器及其检测方法,尤其是涉及一种用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用方法。
背景技术
海洋致病菌是生活在海洋中、不含叶绿素和藻蓝素的原核单细胞生物。海洋致病菌以革兰氏阴性杆菌为主,常见的菌属有弧菌属、假单胞杆菌属、不动杆菌属、棒状杆菌属、黄杆菌属、螺菌属、芽孢杆菌属等。海洋致病菌会导致海洋水产动物如鱼、虾、蟹、贝类等患病,人类如果进食受海洋致病菌污染的海产品,可导致胃肠道疾病如:腹痛、呕吐、腹泻、脱水、休克、昏迷,甚至死亡;通过伤口或接触性感染可导致中耳炎、泌尿系统感染、败血症等疾病。因此,快速准确地检测海洋致病菌,对保护海洋水产动物、减少经济损失和促进人类健康具有重要意义。
目前海洋致病菌的检测方法主要有:传统的培养方法;免疫学方法如:酶联免疫吸附(ELISA)法、免疫荧光抗体技术等;分子生物学技术如:聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、变性高效液相色谱(DHPLC)技术、DNA芯片技术等;传感器技术如电化学技术、电子鼻技术等。目前,国内也有基于上述方法的检测海洋致病菌的一些相关专利:用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒及方法(200710027105.6);霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的三重PCR检测方法(201210037697.0);一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法(200610124337.9);等。这些方法有些检测周期长、技术要求高,有些仪器昂贵、操作复杂、步骤繁多、容易出现假阳性,有些特异性不强、灵敏度不高。因此,开发灵敏、准确、快速、简便的海洋致病菌检测方法是迫切需求。
免疫传感器是基于抗原−抗体的特异性亲和作用、将特异性免疫反应与适宜的信号转换技术相结合、用以检测目标抗原的生物传感器,具有特异性强、可逆性好、试剂利用效率高等优点。电化学发光(ECL)免疫传感器是集电化学发光和免疫传感器为一体的技术,具有灵敏度高、线性范围宽、检测迅速、稳定性好、不使用放射性试剂等优点。但是,目前未见检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方法简单、快速,检测结果灵敏度和准确性高、特异性强的用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)多功能化石墨烯材料的合成
a. 磁性氧化石墨烯的合成:在干净的烧瓶中加入30~50 mL的1 mg/mL氧化石墨烯(GO),超声1 h;然后在氮气气氛保护下加入20~30 mL 0.05~0.07 mol/L氯化亚铁溶液和20~30 mL 0.10~0.15 mol/L氯化高铁溶液,于70~90℃搅拌回流,同时缓慢滴加10~15 mL 20%~30%氨水至溶液pH = 10~11,回流处理3~5 h后冷却;再用水洗涤至pH = 7,定容为50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液,4 ℃储存备用;
b. 取步骤(a)所得磁性氧化石墨烯材料溶液200 μL于试管中,超声1 h,然后加入200~400 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸至溶液pH = 4~6,振荡孵育1 h后,水洗3次;再加入30~50 μL 0.001~0.1 mol/L电化学发光体溶液和30~50 μL 0.1~1 μg/mL海洋致病菌抗体溶液,混合均匀,同时滴加0.1 mol/L氢氧化钠溶液至溶液pH = 8~10,振荡孵育4 h后,水洗3次;加入质量百分浓度为2%的牛血清白蛋白溶液50~100 μL以封闭非特异性活性位点,4℃下孵育1 h后,水洗3次,定容为200 μL,即可得到海洋致病菌抗体和电化学发光体同时标记的多功能化石墨烯材料溶液,4 ℃下储存备用;
(2)电化学发光免疫传感器的组装
将直径为3~5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的三氧化二铝浆抛光处理,在乙醇、水中依次超声2 min,洗净,氮气吹干;取5~10 μL步骤(1)得到的多功能化石墨烯材料溶液,滴涂于上述已处理的磁性玻碳电极表面,多功能化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附于电极表面;即得到用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器。
所述的电化学发光体溶液中溶质为鲁米诺或N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI),溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液。
所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到,所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为10~100 mmol/L,所述的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)摩尔浓度为1~10 mmol/L。
所述的海洋致病菌为创伤弧菌(VV)、副溶血弧菌(VP)、哈维氏弧菌(VH)、阴沟肠杆菌(EC)或黄海希瓦氏菌(SM)。
一种利用上述电化学发光免疫传感器检测海洋致病菌的方法,具体步骤如下:
将用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器浸泡在含有不同浓度的海洋致病菌溶液中,于37℃下温育1 h后取出,水清洗后,作为工作电极;采用铂电极作为对电极,Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极,构成三电极体系;将三电极体系放入缓冲溶液,启动电化学反应,测定电化学发光强度;获得一系列不同浓度的海洋致病菌溶液对应的电化学发光强度值,建立电化学发光强度值与海洋致病菌溶液浓度之间的定量关系;根据这个定量关系检测待测样品中海洋致病菌的浓度。
所述的缓冲溶液为含有1~3 mmol/L H2O2的0.05 mol/L pH 9~11 的Na2CO3-NaHCO3体系缓冲溶液。
所述的电化学反应的条件如下:电位阶跃计时电流法,脉冲宽度:0.25秒;脉冲间隔:30秒;初始电压:0 V;脉冲电压:1 V。
发明原理:多功能化石墨烯材料,在氧化石墨烯上同时负载有纳米四氧化三铁粒子、海洋致病菌抗体和电化学发光体,具有多种功能:(1)氧化石墨烯具有巨大的表面积和丰富的表面基团,可以负载大量的纳米四氧化三铁粒子、海洋致病菌抗体和电化学发光体,且具有良好的导电性,有利于电子传递,增强电化学发光;(2)纳米四氧化三铁粒子,可以使得多功能化石墨烯材料均匀、牢固地吸附于电极表面,实现电化学发光免疫传感器的一步制备,极大简化了传感器制备方法,且纳米四氧化三铁粒子可以进一步提高多功能化石墨烯材料的导电性;(3)海洋致病菌抗体,可以特异性识别、俘获海洋致病菌;(4)电化学发光体,可以给出电化学发光信号;(5)一体化的多功能化石墨烯材料,使得所有负载的电化学发光体都处于电极表面的外赫姆霍兹面之内,都可以产生电化学发光信号,进一步提高电化学发光强度。
本发明将多功能化石墨烯材料滴涂于磁性玻碳电极表面之后,功能化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附于电极表面,构建成电化学发光免疫传感器,电化学反应激发下,即会产生稳定的电化学发光;如果样品中含有海洋致病菌,海洋致病菌就会被电化学发光免疫传感器中的海洋致病菌抗体俘获,阻碍电极表面的电子传递和电化学发光,电化学发光强度降低;海洋致病菌浓度越大,电化学发光强度越低,电化学发光强度与海洋致病菌浓度的对数之间呈线性关系。据此可以实现待测样品中海洋致病菌的浓度的检测。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1)高灵敏度,本发明的检测限达到1 CFU/mL,而目前的检测方法检测限为105~10 CFU /mL。原因在于:电化学发光方法以及采用多功能化石墨烯材料大幅提高灵敏度。
(2)高特异性,常见其他海洋致病菌对本检测体系均无干扰。原因在于:本发明是基于海洋致病菌抗体与海洋致病菌之间的特异性识别与结合而构建的电化学发光免疫传感器,干扰菌种不是抗体的目标物,因此待测液中的干扰菌种并不能与抗体结合,故对本检测体系无干扰。
(3)结果准确,回收率均>90%。
(4)制备与检测方法简单、快速。将多功能化石墨烯材料滴涂于磁性玻碳电极表面之后,即可一步构建成电化学发光免疫传感器,制备方法极其简单;孵育完成后,即可检测得到即时的电化学发光信号,实现定量检测。
综上所述,本发明一步制备一种基于多功能化石墨烯材料的检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器,兼具免疫分析的高特异性、电化学发光分析与功能化石墨烯结合的高灵敏度,具有高灵敏度、高特异性、简单、快速、易于操作等优点,可以实现对超低浓度海洋致病菌的检测,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为多功能化石墨烯材料的制备流程图;
图2为磁性氧化石墨烯透射电镜TEM图;
图3为不同浓度副溶血弧菌(VP)的ECL强度(y)—浓度(x)对数关系图;
图4为不同浓度创伤弧菌(VV)的ECL强度(y)—浓度(x)对数关系图;
图5为不同浓度哈维氏弧菌(VH)的ECL强度(y)—浓度(x)对数关系图;
图6为不同浓度阴沟肠杆菌(EC)的ECL强度(y)—浓度(x)对数关系图;
图7为不同浓度黄海希瓦氏菌(SM)的ECL强度(y)—浓度(x)对数关系图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
一种用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)多功能化石墨烯材料的合成,其制备流程如图1所示
a. 磁性氧化石墨烯的合成:在干净的烧瓶中加入30~50 mL的1 mg/mL氧化石墨烯(GO),超声1 h(超声波处理一般功率为200W左右);然后在氮气气氛保护下加入20~30 mL 0.05~0.07 mol/L氯化亚铁溶液和20~30 mL 0.10~0.15 mol/L氯化高铁溶液,于70~90℃搅拌回流,同时缓慢滴加10~15 mL 20%~30%氨水至溶液pH = 10~11,回流处理3~5 h后冷却;再用水洗涤至pH = 7,定容为50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液,4 ℃储存备用;磁性氧化石墨烯的透射电镜TEM图如图2所示,磁性氧化石墨烯的分散性良好,形貌整齐,适合制备传感器。
b. 取步骤(a)所得磁性氧化石墨烯材料溶液200 μL于2 mL试管中,超声1 h,然后加入200~400 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸至溶液pH = 4~6,振荡孵育1 h后,水洗3次;再加入30~50 μL 0.001~0.1 mol/L电化学发光体和30~50 μL 0.1~1 μg/mL海洋致病菌抗体溶液(抗体冻干粉溶于水配制而成),混合均匀,同时滴加0.1 mol/L氢氧化钠溶液至溶液pH = 8~10,振荡孵育4 h后,水洗3次后,加入质量百分浓度为2%的牛血清白蛋白溶液50~100 μL以封闭非特异性活性位点,4℃下孵育1 h后,水洗3次,定容为200 μL,即可得到海洋致病菌抗体和电化学发光体同时标记的多功能化石墨烯材料溶液,4 ℃下储存备用;
(2)电化学发光免疫传感器的组装
将直径为3~5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的三氧化二铝浆抛光处理,在乙醇、水中依次超声2 min,洗净,氮气吹干;取5~10 μL步骤(1)得到的多功能化石墨烯材料溶液,滴涂于上述已处理的磁性玻碳电极表面,多功能化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附于电极表面,即得到用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器。
上述电化学发光体溶液中溶质为鲁米诺或N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI),溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液。
上述偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到,其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为10~100 mmol/L, N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)摩尔浓度为1~10 mmol/L。
上述海洋致病菌为创伤弧菌(VV)、副溶血弧菌(VP)、哈维氏弧菌(VH)、阴沟肠杆菌(EC)或黄海希瓦氏菌(SM)。
具体实施例二
利用上述具体实施例一制备得到的电化学发光免疫传感器检测海洋致病菌的方法,具体步骤如下:将用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器浸泡在不同浓度的海洋致病菌溶液中,于37℃下温育1 h后取出,水清洗后,作为工作电极;采用铂电极作为对电极,Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极,构成三电极体系;将三电极体系放入缓冲溶液中,启动电化学反应,测定电化学发光强度;即获得一系列不同浓度的海洋致病菌溶液对应的电化学发光强度值,建立电化学发光强度值与海洋致病菌溶液浓度之间的定量关系;根据这个定量关系可以检测待测样品中海洋致病菌的浓度。
上述缓冲溶液为含有1~3 mmol/L H2O2的0.05 mol/L pH = 9~11 的Na2CO3-NaHCO3体系缓冲溶液。
上述电化学反应的条件如下:电位阶跃计时电流法,脉冲宽度:0.25秒;脉冲间隔:30秒;初始电压:0 V;脉冲电压:1 V。
上述海洋致病菌为创伤弧菌(VV)、副溶血弧菌(VP)、哈维氏弧菌(VH)、阴沟肠杆菌(EC)或黄海希瓦氏菌(SM)。
具体实施例三
一种用于检测副溶血弧菌(VP)的电化学发光免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)多功能化石墨烯材料的合成
a. 磁性氧化石墨烯的合成:在干净的烧瓶中加入40mL的1 mg/mL氧化石墨烯,超声1 h;然后在氮气气氛保护下加入25 mL 0.06 mol/L氯化亚铁溶液和25mL 0.12 mol/L氯化高铁溶液,于80℃搅拌回流,同时缓慢滴加12 mL 25%氨水至溶液pH = 10.5,回流处理4 h后冷却;再用水洗涤至pH = 7,定容为50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液,4 ℃储存备用;
b. 取步骤(a)所得磁性氧化石墨烯材料溶液200 μL于2 mL试管中,超声1 h,然后加入300 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸至溶液pH = 5,振荡孵育1 h后,水洗3次;再加入40 μL 0.01 mol/L鲁米诺溶液(溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液)和40 μL 0.5 μg/mL副溶血弧菌抗体溶液,混合均匀,同时滴加0.1 mol/L氢氧化钠溶液至溶液pH =9,振荡孵育4 h后,水洗3次,加入质量百分浓度为2%的牛血清白蛋白溶液50~100 μL以封闭非特异性活性位点,4℃下孵育1 h后,水洗3次,定容为200 μL,即可得到副溶血弧菌抗体和电化学发光体同时标记的多功能化石墨烯材料溶液,4 ℃下储存备用;偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到,其中EDC的摩尔浓度为50 mmol/L, NHS摩尔浓度为5mmol/L;
(2)电化学发光免疫传感器的组装
将直径为3~5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的三氧化二铝浆抛光处理,在乙醇、水中依次超声2 min,洗净,氮气吹干;取8 μL步骤(1)得到的多功能化石墨烯材料溶液,滴涂于上述已处理的磁性玻碳电极表面,多功能化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附于电极表面,即得到用于检测副溶血弧菌的电化学发光免疫传感器。
将用于检测副溶血弧菌的电化学发光免疫传感器浸泡在含有不同浓度的副溶血弧菌溶液中,于37℃下温育1 h后取出,水清洗后,作为工作电极;采用铂电极作为对电极,Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极,构成三电极体系;将三电极体系放入缓冲溶液,启动电化学反应,测定电化学发光强度;获得一系列不同浓度的副溶血弧菌溶液对应的电化学发光强度值,建立电化学发光强度值与副溶血弧菌溶液浓度之间的定量关系;不同浓度副溶血弧菌VP的ECL强度(y)—浓度(x)对数线性关系如图3所示。线性方程为:y=–968.68*logx+7322.8,相关系数R=0.9925,线性范围为2~108 CFU/mL,检测限为1 CFU/mL。线性良好,可用于检测样品中副溶血弧菌的未知浓度。
上述缓冲溶液为含有1~3 mmol/L H2O2的0.05 mol/L pH = 9~11 的Na2CO3-NaHCO3体系缓冲溶液。
上述电化学反应的条件如下:电位阶跃计时电流法,脉冲宽度:0.25秒;脉冲间隔:30秒;初始电压:0 V;脉冲电压:1 V。
具体实施例四
一种用于检测创伤弧菌(VV)的电化学发光免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)多功能化石墨烯材料的合成,
a. 磁性氧化石墨烯的合成:在干净的烧瓶中加入30mL的1 mg/mL氧化石墨烯(GO),超声1 h;然后在氮气气氛保护下加入20mL 0.07 mol/L氯化亚铁溶液和20 mL 0.15 mol/L氯化高铁溶液,于70℃搅拌回流,同时缓慢滴加10 mL 30%氨水至溶液pH = 10,回流处理5 h后冷却;再用水洗涤至pH = 7,定容为50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液,4 ℃储存备用;
b. 取步骤(a)所得磁性氧化石墨烯材料溶液200 μL于2 mL试管中,超声1 h,然后加入200 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸至溶液pH = 4,振荡孵育1 h后,水洗3次;再加入30 μL 0.1 mol/L N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)溶液(溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液)和30 μL 1 μg/mL创伤弧菌抗体溶液,混合均匀,同时滴加0.1 mol/L氢氧化钠溶液至溶液pH = 8,振荡孵育4 h后,水洗3次,加入质量百分浓度为2%的牛血清白蛋白溶液50~100 μL以封闭非特异性活性位点,4℃下孵育1 h后,水洗3次,定容为200 μL,即可得到创伤弧菌抗体和电化学发光体同时标记的多功能化石墨烯材料溶液,4 ℃下储存备用;偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到,其中EDC的摩尔浓度为10 mmol/L, NHS摩尔浓度为10 mmol/L;
(2)电化学发光免疫传感器的组装
将直径为3~5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的三氧化二铝浆抛光处理,在乙醇、水中依次超声2 min,洗净,氮气吹干;取5~10 μL步骤(1)得到的多功能化石墨烯材料溶液,滴涂于上述已处理的磁性玻碳电极表面,多功能化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附于电极表面,即得到用于检测创伤弧菌的电化学发光免疫传感器。
将用于检测创伤弧菌的电化学发光免疫传感器浸泡在含有不同浓度的创伤弧菌溶液中,于37℃下温育1 h后取出,水清洗后,作为工作电极;采用铂电极作为对电极,Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极,构成三电极体系;将三电极体系放入缓冲溶液,启动电化学反应,测定电化学发光强度;即获得一系列不同浓度的创伤弧菌溶液对应的电化学发光强度值,建立电化学发光强度值与创伤弧菌溶液浓度之间的定量关系;不同浓度创伤弧菌的ECL强度(y)—浓度(x) 对数线性关系如图4所示,线性方程为: y=–887.56*logx+7223.6。相关系数R=0.9942,线性范围为2~108 CFU/mL,检测限为1 CFU/mL。线性良好,可用于检测样品中创伤弧菌的未知浓度。
具体实施例五
一种用于检测哈维氏弧菌(VH)的电化学发光免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)多功能化石墨烯材料的合成
a. 磁性氧化石墨烯的合成:在干净的烧瓶中加入50 mL的1 mg/mL氧化石墨烯,超声1 h;然后在氮气气氛保护下加入30 mL 0.05 mol/L氯化亚铁溶液和30 mL 0.10 mol/L氯化高铁溶液,于90℃搅拌回流,同时缓慢滴加15 mL 20%氨水至溶液pH = 11,回流处理3 h后冷却;再用水洗涤至pH = 7,定容为50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液;
b. 取步骤(a)所得磁性氧化石墨烯材料溶液200 μL于2 mL试管中,超声1 h,然后加入400 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸至溶液pH = 6,振荡孵育1 h后,水洗3次;再加入50 μL 0.001mol/L鲁米诺溶液(溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液)和50 μL 0.1 μg/mL哈维氏弧菌抗体溶液,混合均匀,同时滴加0.1 mol/L氢氧化钠溶液至溶液pH =10,振荡孵育4 h后,水洗3次,加入质量百分浓度为2%的牛血清白蛋白溶液50~100 μL以封闭非特异性活性位点,4℃下孵育1 h后,水洗3次,定容为200 μL,即可得到哈维氏弧菌抗体和电化学发光体同时标记的多功能化石墨烯材料溶液;偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到,其中EDC的摩尔浓度为100 mmol/L, NHS摩尔浓度为1 mmol/L;
(2)电化学发光免疫传感器的组装
将直径为3~5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的三氧化二铝浆抛光处理,在乙醇、水中依次超声2 min,洗净,氮气吹干;取5~10 μL步骤(1)得到的多功能化石墨烯材料溶液,滴涂于上述已处理的磁性玻碳电极表面,多功能化石墨烯材料即被均匀、牢固地吸附于电极表面,即得到用于检测哈维氏弧菌的电化学发光免疫传感器。
将用于检测哈维氏弧菌的电化学发光免疫传感器浸泡在含有不同浓度的哈维氏弧菌溶液中,于37℃下温育1 h后取出,水清洗后,作为工作电极;采用铂电极作为对电极,Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极,构成三电极体系;将三电极体系放入缓冲溶液,启动电化学反应,测定电化学发光强度;即获得一系列不同浓度的哈维氏弧菌溶液对应的电化学发光强度值,建立电化学发光强度值与哈维氏弧菌溶液浓度之间的定量关系;不同浓度哈维氏弧菌的ECL强度(y)—浓度(x) 对数线性关系如图5所示,线性方程为: y=–765.1*logx+6142.06,相关系数R=0.9913,线性范围为5~108 CFU/mL,检测限为2 CFU/mL。线性良好,可用于检测样品中哈维氏弧菌的未知浓度。
具体实施例六
同上述具体实施例三,其区别在于海洋致病菌为阴沟肠杆菌,不同浓度阴沟肠杆菌的ECL强度(y)—浓度(x) 对数线性关系如图6所示,线性方程为: y=–957.19*logx+7880.3,相关系数R=0.9956,线性范围为5~108 CFU/mL,检测限为2 CFU/mL。线性良好,可用于检测样品中阴沟肠杆菌的未知浓度。
具体实施例七
同上述具体实施例三,其区别在于海洋致病菌为黄海希瓦氏菌,不同浓度黄海希瓦氏菌的ECL强度(y)—浓度(x) 对数线性关系如图7所示,线性方程为: y=–1011.26*logx+8392.8,相关系数R=0.9950,线性范围为5~108 CFU/mL,检测限为2 CFU/mL。线性良好,可用于检测样品中黄海希瓦氏菌的未知浓度。
具体实施例八
特异性试验
选取创伤弧菌(VV)、哈维氏弧菌(VH)、阴沟肠杆菌(EC)、黄海希瓦氏菌(SM)、副溶血弧菌(VP)5种菌来证明按上述具体实施例三的方法制备的用于检测副溶血弧菌(VP)的电化学发光免疫传感器的选择性。将制备的副溶血弧菌电化学发光免疫传感器分别测定108 CFU/mL的VV、VH、EC、SM及空白对照组,对应的电化学发光强度都在7500左右,而测定104 CFU/mL的VP,对应的电化学发光强度明显降低,在3000左右;同时将副溶血弧菌电化学发光免疫传感器测定含108 CFU/mL的VV、108 CFU/mL的VH、108 CFU/mL的EC、108 CFU/mL的SM和104 CFU/mL的VP的混合溶液,也在3000左右。以上结果显示:其他菌种浓度很高,信号却和空白大致相当,表示其他菌种对该传感器检测无干扰。结果表明:副溶血弧菌电化学发光免疫传感器选择性良好,常见干扰菌种无显著性干扰。
同理,上述具体实施例四的方法制备的用于检测创伤弧菌(VV)的电化学发光免疫传感器、具体实施例五的方法制备的用于检测哈维氏弧菌(VH)的电化学发光免疫传感器、具体实施例六的方法制备的用于检测阴沟肠杆菌(EC)的电化学发光免疫传感器以及具体实施例七的方法制备的用于检测黄海希瓦氏菌(SM)的电化学发光免疫传感器均选择性良好,常见干扰菌种无显著性干扰。
具体实施例九
海水中海洋致病菌的检测
准确移取海水空白样品,进行加标回收检测,按照上述具体实施例三-七中的具体实验步骤构建传感器并按具体实施例二方法进行检测,检测结果见表1。
表1 多种海洋致病菌的检测结果
由表1检测结果可知,结果的相对标准偏差(RSD)小于2.6%,回收率为91.9~101.9%,表明本发明对于海水中海洋致病菌的检测精密度高,结果准确可靠。
以上结果说明,本发明构建的检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器,灵敏度高、检测限低、选择性高、操作简单、结果准确可靠。只需改变本电化学发光免疫传感器中的抗体,即可实现对不同目标海洋致病菌的高灵敏度、特异性、简单、快速检测。
当然,上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,作出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)多功能化石墨烯材料的合成
a. 磁性氧化石墨烯的合成:在干净的烧瓶中加入30~50 mL的1 mg/mL氧化石墨烯,超声1 h;然后在氮气气氛保护下加入20~30 mL 0.05~0.07 mol/L氯化亚铁溶液和20~30 mL
0.10~0.15 mol/L氯化高铁溶液,于70~90℃搅拌回流,同时缓慢滴加10~15 mL 20%~30%氨水至溶液pH = 10~11,回流处理3~5 h后冷却;再用水洗涤至pH = 7,定容为50 mL,即得磁性氧化石墨烯材料溶液,4 ℃储存备用;
b. 取步骤(a)所得磁性氧化石墨烯材料溶液200
μL于试管中,超声1 h,然后加入200~400 μL偶联试剂,混合均匀,同时滴加稀盐酸至溶液pH = 4~6,振荡孵育1 h后,水洗3次;再加入30~50 μL 0.001~0.1 mol/L电化学发光体溶液和30~50 μL 0.1~1 μg/mL海洋致病菌抗体溶液,混合均匀,同时滴加0.1 mol/L氢氧化钠溶液至溶液pH = 8~10,振荡孵育4 h后,水洗3次,加入质量百分浓度为2%的牛血清白蛋白溶液50~100 μL以封闭非特异性活性位点,4℃下孵育1 h后,水洗3次,定容为200 μL,即可得到海洋致病菌抗体和电化学发光体同时标记的多功能化石墨烯材料溶液,4
℃下储存备用;
(2)电化学发光免疫传感器的组装
将直径为3~5 mm的磁性玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的三氧化二铝浆抛光处理,在乙醇、水中依次超声2 min,洗净,氮气吹干;取5~10 μL步骤(1)得到的多功能化石墨烯材料溶液,滴涂于上述已处理的磁性玻碳电极表面,即得到用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法,其特征在于:所述的电化学发光体溶液中溶质为鲁米诺或N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺,溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法,其特征在于:所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中得到,所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为10~100 mmol/L,所述的N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为1~10 mmol/L。
4.根据权利要求1所述的用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法,其特征在于:所述的海洋致病菌为创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、阴沟肠杆菌或黄海希瓦氏菌。
5.一种利用权利要求1-4中任一项所述的电化学发光免疫传感器检测海洋致病菌的方法,其特征在于具体步骤如下:将用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器浸泡在含有海洋致病菌的溶液中,于37℃下温育1 h后取出,水清洗后,作为工作电极;采用铂电极作为对电极,Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极,构成三电极体系;将三电极体系放入缓冲溶液,启动电化学反应,测定电化学发光强度;检测不同浓度的海洋致病菌溶液,获得一系列不同浓度的海洋致病菌溶液对应的电化学发光强度值,建立电化学发光强度值与海洋致病菌溶液浓度之间的定量关系;根据这个定量关系可以检测待测样品中海洋致病菌的浓度。
6.根据权利要求5所述的电化学发光免疫传感器检测海洋致病菌的方法,其特征在于:所述的缓冲溶液为含有1~3 mmol/L H2O2的0.05 mol/L pH = 9~11 的Na2CO3-NaHCO3体系缓冲溶液。
7.根据权利要求5所述的电化学发光免疫传感器检测海洋致病菌的方法,其特征在于所述的电化学反应的条件如下:电位阶跃计时电流法,脉冲宽度:0.25秒;脉冲间隔:30秒;初始电压:0 V;脉冲电压:1 V。
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