CN113325060B - 石墨烯磁性纳米电极、电化学免疫传感器及制备方法及应用 - Google Patents

石墨烯磁性纳米电极、电化学免疫传感器及制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于电化学免疫传感器技术领域，具体来说是石墨烯磁性纳米电极、电化学免疫传感器及制备方法及应用，石墨烯磁性纳米电极的制备包括如下步骤：将金电极进行清洗处理；将Graphene/Fe3O4纳米复合材料修饰至金电极表面，室温下晾干成膜得到修饰电极，将修饰电极依次浸泡于纳米金溶胶4‑6h、0.01～100ng·mL‑1的甲胎蛋白抗体溶液9‑12h、0.25wt％的牛血清白蛋白溶液30‑45min。本发明将石墨烯构建的磁性纳米复合物构建在金电极表面，并基于石墨烯磁性纳米电极制得了电化学免疫传感器。电化学免疫传感器的灵敏度高、对抗体吸附能力强、检测浓度范围宽，适用于对免疫蛋白的检测。

Description

石墨烯磁性纳米电极、电化学免疫传感器及制备方法及应用
技术领域
本发明属于电化学免疫传感器技术领域，涉及石墨烯磁性纳米复合物、电化学免疫传感器及制备方法及应用。
背景技术
免疫球蛋白(immunoglobulin)指具有抗体活性的动物蛋白，其中的甲胎蛋白是甲种胎儿球蛋白(Alpha fetoprotein,ERAFP)的简称，AFP是肝细胞在胚胎发育早期产生的一种酸性糖蛋白，正常成人血清中的AFP约为10ng·mL-1，而在大多数原发性肝癌和畸胎瘤病人的血清中甲胎蛋白含量较高，AFP对消化道恶性肿瘤及肺癌的诊断有较高的阳性率，血清中AFP的升高对原发性肝癌的诊断有重要意义。目前甲胎蛋白的检测方法主要采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、间接血凝法、琼脂双扩散法等。
生物传感器是将生物敏感物质，如抗原、抗体、酶、激素和生物分子固定在电极上，从而将这类生物敏感物质的特异性反应产生的信号转化成电流、阻抗电位等信号，实现了对生物敏感物质的定性或定量的检测。根据生物传感器的不同，电化学生物传感器可分为DNA传感器、酶传感器、微生物传感器、免疫传感器和细胞传感器。
现阶段已经开发了多种方法用于检测AFP的含量，例如酶联免疫测定、表面等离子体共振、原子吸收光谱法、化学发光荧光法和电化学发光免疫测定。上述检测方法具有准确、高效等优点，但步骤繁琐耗时、样品量大、设备庞大、成本高。电化学免疫的测定方法已开发较为广泛，其中电极修饰方法是研究的重点。为了满足对早期恶性肿瘤病变快速便捷的临床筛查需求，开发一种简单、快捷、灵敏度高、对抗体吸附能力强、检测浓度范围宽的电化学免疫传感器具有现实意义。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明提供了石墨烯磁性纳米复合物、电化学免疫传感器及制备方法及应用，本发明将石墨烯构建的磁性纳米复合物构建在金电极表面，并基于石墨烯磁性纳米电极制得了电化学免疫传感器。电化学免疫传感器的灵敏度高、对抗体吸附能力强、检测浓度范围宽，适用于对免疫蛋白的检测。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
石墨烯磁性纳米电极的制备方法，包括如下步骤：
(1)将金电极进行清洗处理；
(2)石墨烯磁性纳米电极的制备：将Graphene/Fe3O4纳米复合材料修饰至金电极表面，室温下晾干成膜得到修饰电极，将修饰电极依次浸泡于纳米金溶胶 4-6h、0.01～100ng·mL-1甲胎蛋白抗体溶液9-12h、0.25wt％的牛血清白蛋白溶液 30-45min，得到石墨烯磁性纳米电极。
优选的，所述步骤(1)中金电极的清洗处理方法为：将金电极依次经粒径分别为0.03μm、0.05μm的Al2O3糊打磨后用超纯水冲洗干净，再依次于超纯水、乙醇、超纯水中超声洗涤5min，清洗后的电极置于室温下晾干。
优选的，所述步骤(2)中修饰的方法为：将Graphene/Fe3O4纳米复合材料浸泡或滴涂至金电极表面。
本发明还保护了制备方法制得的石墨烯磁性纳米电极。
优选的，所述电化学免疫传感器包括参比电极、对电极、电解液及制得的石墨烯磁性纳米电极，并将石墨烯磁性纳米电极、参比电极及对电极共同置于电解液中。
本发明还保护了电化学免疫传感器在免疫蛋白的超灵敏检测中的应用，所述免疫蛋白包括甲种胎儿球蛋白、癌胚抗原。
优选的，所述免疫蛋白检测的具体步骤为：
(1)孵育：将石墨烯磁性纳米电极置于不同的浓度的免疫蛋白抗原溶液中进行特异性反应；
(2)检测免疫蛋白的光电化学传感器的电信号：
将饱和Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，与孵育后的石墨烯磁性纳米电极为工作电极组成三电极体系，连接到光电化学检测设备上，以 K3[Fe(CN)6]+K4[Fe(CN)6]+0.1mol·L-1KCl溶液为电解液，K3[Fe(CN)6]+ K4[Fe(CN)6]为5mmol/L，电解液的pH为5-9，采用循环伏安法，根据电流-电势绘制工作曲线。
优选的，其特征在于，所述电解液的pH为8-9，所述孵育时间为20-30min，所述孵育温度为20-30℃。
优选的，所述电解液的pH为8，所述孵育时间为20min，所述孵育温度为 25℃。
优选的，所述免疫蛋白抗原溶液的浓度为0.003-100ng·mL-1。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明选用金电极的原因在于：(1)金电极具有导电性能佳且化学稳定性高的特性，金电极的电位窗口大约在-1.0-0.8V，实验以K3[Fe(CN)6]+ K4[Fe(CN)6]+0.1mol·L- 1KCl溶液为电解液，K3[Fe(CN)6]+K4[Fe(CN)6]为5mmol/L，其电位在-0.2～0.6V范围内，在金电极的电位窗口；玻碳电极的电位窗口大约在 -1.0～1.0V，应用面较广，玻璃碳电极的优点是导电性好、化学稳定性高、热胀系数小、电势适用范围宽，但与金电极相比，其灵敏性还有一定差距，所以本发明选用金电极用于生物传感器；(2)金电极更容易修饰官能团，实验制备氨基化的Graphene/Fe3O4纳米复合材料，并修饰至洁净金电极表面，增强电极表面的导电性；(3)由于纳米金具有生物相容性，能促进电子的传递，能与氨基结合；同时纳米金带负电，甲胎蛋白带正点，两者能够通过静电吸附。所以复合材料越多修饰在金电极表面，就能吸附结合更多的纳米金颗粒，从而吸附更多的甲胎蛋白抗体，最终能与更多的甲胎蛋白反应，提高其免疫传感器的性能。
(2)石墨烯(Graphene)是二维单原子层平面蜂窝状结构碳纳米材料，以 sp2杂化碳原子形成的稳定的六元环结构，它具有优良的导电性、良好的力学性能、强吸附能力；Graphene与碳纳米管(CNTs)传感器相比，Graphene具有更高的灵敏度和导电性，因此Graphene被广泛应用于免疫传感器的研究；磁性纳米材料被广泛用作各种抗癌药物的载体及磁性免疫细胞的分离，磁性纳米Fe3O4微粒具有比表面积大、表面官能团密度大、吸附能力强、选择性强、具有吸附平衡时间短、粒子稳定性高等诸多优点。
本发明制备Graphene/Fe3O4复合材料，该复合物相对于其它单一纳米材料，比表面积大，有利于活性组分的吸附；导电性更好，有利于提高电化学传感器的灵敏度；较小的孔径，有利于吸附纳米金；同时，磁性纳米材料的引入可以增强 Graphene的铁磁性，有利于纳米复合材料的磁性回收。
(3)本发明制得的Graphene//Fe3O4纳米复合材料能有效地提高电极的比表面积，Graphene//Fe3O4/nano-Au复合纳米粒子具有良好的生物相容性，选择性和稳定性，提高了免疫传感器的灵敏性；nano-Au单层吸附固定抗体时，其界面具有固定抗体的活性高、检测时的非特异性吸附小、传感器能反复再生等优点；而且该电化学免疫传感器具有制备简单、成本低、灵敏度好、回收率高、环保等优点，具有良好的应用前景。在本实验中，以AFP作为免疫物质模型，实现了对 AFP的定量检测，同时该方法也可应用于其他免疫物质的测定。
附图说明
图1为本发明的电极在修饰过程中的循环伏安图，其中，曲线a是裸金电极在电解液中的CV曲线；曲线b是金电极上修饰了Graphene//Fe3O4的CV曲线；曲线c是修饰电极吸附nano-Au后的CV图；曲线d、e依次是修饰电极浸泡AFP 抗体、BSA封闭非特异性吸附位点后的CV曲线；
图2为本发明实施例1的电化学免疫传感器在不同扫描速度下的循环伏安图；
其中，图2中的插图为扫速与氧化峰、还原峰电流的线性关系图；
图3为本发明的电解液pH与氧化峰电流值的关系图；
图4为本发明的孵育时间对免疫传感器的影响图；
图5为本发明的实施例1的电化学免疫传感器检测不同浓度甲胎蛋白的循环伏安图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
表1主要实验仪器
实验仪器 型号 生产厂家
电化学工作站 CHI660D 上海辰华仪器有限公司
超声波清洗器 BRANSONIC 200 德国Branson Ultrashall公司
电子分析天平 FA3204B 上海天美天平仪器有限公司
酸度计 PHSJ-3F 上海仪电科学仪器股份有限公司
磁力搅拌器 DF-101S 上海兴创科学仪器设备有限公司
实验所需要用到的主要试剂如表2所示：
表2主要实验试剂
化学试剂 规格 生产厂家
氧化石墨烯 1g 南京先丰纳米材料科技有限公司
氨水 分析纯 成都市科龙化工试剂厂
甲胎蛋白抗原、抗体 48人份 郑州博赛生物技术股份有限公司
牛血清白蛋白 1g 上海伯奥生物科技有限公司
铁氰化钾 分析纯 成都金山化学试剂有限公司
亚铁氰化钾 分析纯 成都市科龙化工试剂厂
无水乙醇 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
硫酸亚铁 分析纯 成都市科龙化工试剂厂
氯化钾 分析纯 成都市科龙化工试剂厂
本发明使用的纳米金溶胶均按照如下步骤制备：在100mL水中加入1mL、 1wt％HAuCl4溶液，煮沸，然后迅速加入4mL、1wt％柠檬酸三纳，继续沸腾15min，然后冷却至室温，即得到纳米金颗粒。
本发明中的Graphene/Fe3O4纳米复合材料均按照如下步骤制得：
将100g氧化石墨烯加入至100mL超纯水中得到1mg/mL溶液，超声分散3h 后，将1.16g的FeSO4·7H2O加入到氧化石墨烯溶液中，滴加体积分数为28wt％的NH3·H2O溶液至pH达到9-11；常温搅拌2h后于80℃继续反应1h，经磁分离、洗涤、常温干燥得到Graphene/Fe3O4纳米复合材料。
实施例1
石墨烯磁性纳米电极的制备方法，包括如下步骤：
(1)将金电极进行清洗处理；
将金电极依次经粒径分别为0.03μm、0.05μm的Al2O3糊打磨后用超纯水冲洗干净，再依次于超纯水、乙醇、超纯水中超声洗涤5min，清洗后的电极置于室温下晾干；
(2)石墨烯磁性纳米电极的制备：将Graphene/Fe3O4纳米复合材料浸泡或滴涂至金电极表面，室温下晾干成膜得到修饰电极，将修饰电极依次浸泡于纳米金溶胶4h、甲胎蛋白抗体溶液12h、0.25wt％的牛血清白蛋白溶液30min，得到石墨烯磁性纳米电极。
基于石墨烯磁性纳米电极的电化学免疫传感器的制备方法：
(1)孵育：将石墨烯磁性纳米电极置于20ng·mL-1的免疫蛋白抗原溶液中进行特异性反应，孵育时间为20min，所述孵育温度为25℃；
(2)将饱和Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，与孵育后的石墨烯磁性纳米电极工作电极组成三电极体系，连接到光电化学检测设备上，以 K3[Fe(CN)6]+K4[Fe(CN)6]+0.1mol·L-1KCl溶液为电解液，K3[Fe(CN)6]+ K4[Fe(CN)6]为5mmol/L，电解液的pH为8，采用循环伏安法，根据电流-电势绘制工作曲线。
实施例2
石墨烯磁性纳米电极的制备方法，包括如下步骤：
(3)将金电极进行清洗处理；
将金电极依次经粒径分别为0.03μm、0.05μm的Al2O3糊打磨后用超纯水冲洗干净，再依次于超纯水、乙醇、超纯水中超声洗涤5min，清洗后的电极置于室温下晾干；
(2)石墨烯磁性纳米电极的制备：将Graphene/Fe3O4纳米复合材料浸泡或滴涂至金电极表面，室温下晾干成膜得到修饰电极，将修饰电极依次浸泡于纳米金溶胶5h、甲胎蛋白抗体溶液10h、0.25wt％的牛血清白蛋白溶液45min，得到石墨烯磁性纳米电极。
实施例3
石墨烯磁性纳米电极的制备方法，包括如下步骤：
(4)将金电极进行清洗处理；
将金电极依次经粒径分别为0.03μm、0.05μm的Al2O3糊打磨后用超纯水冲洗干净，再依次于超纯水、乙醇、超纯水中超声洗涤5min，清洗后的电极置于室温下晾干；
(3)石墨烯磁性纳米电极的制备：将Graphene/Fe3O4纳米复合材料浸泡或滴涂至金电极表面，室温下晾干成膜得到修饰电极，将修饰电极依次浸泡于纳米金溶胶6h、甲胎蛋白抗体溶液9h、0.25wt％的牛血清白蛋白溶液40min，得到石墨烯磁性纳米电极。
本发明实施例1-3均制得了导电性好且活性组分吸附多的石墨烯磁性纳米电极，下面以实施例1制得的石墨烯磁性纳米电极为例进行研究，并以实施例1制得的石墨烯磁性纳米电极做为工作电极，构建电化学免疫传感器，具体研究方法和研究结果如下：
研究方法：
对比例1
与实施例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，将工作电极由实施例1制得的石墨烯磁性纳米电极替换为裸金电极。
对比例2
与实施例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，将工作电极由实施例1制得的石墨烯磁性纳米电极替换为修饰有Graphene/Fe3O4纳米复合材料的金电极。
研究结果：
1、电极在不同修饰过程中的电化学表征：
图1是电极在不同修饰过程的CV图，由图1可见，图中曲线a是裸金电极在电解液中的CV曲线；金具有较好的导电性，且电解液中含有Fe3+/Fe2+这对氧化还原电对，因此金电极在电解液中产生一对可逆的氧化还原峰；曲线b的氧化电流值较曲线a升高，这是因为Graphene/Fe3O4纳米复合材料能增大电极的电子传输，表明Graphene/Fe3O4复合材料被成功修饰到电极上；修饰电极吸附纳米金颗粒后，曲线c的氧化峰电流进一步增大，这是由于nano-Au颗粒有助于电子的传输。纳米金带负电，因而修饰电极可吸附带正电荷的抗体分子，因为蛋白质分子被吸附到电极上，阻碍了电子的传递，修饰电极上的非特异性吸附位点用BSA 封闭后，氧化还原电流进一步减小，图1曲线e所示。当免疫传感器与20ng·mL-1的AFP发生免疫反应后，会使电流再次减小，这是因为免疫复合物覆盖了电极表面，电子传递被阻断；因此，实验中，可以根据免疫反应前后电流改变值实现对AFP的定量检测。
由图2可见，随着扫描速率的增加，氧化峰电流不断增强，还原峰电流不断减小。由图2插图可见，扫速与氧化峰、还原峰电流的大小呈正比关系，其线性关系为氧化峰I＝0.41056V+82.0965，还原峰I＝-0.31019V-77.92598。表明免疫传感器在电解液的电化学过程中是受表面吸附控制的。
2、实验条件的优化：
(1)溶液pH值的影响：
电解液的pH影响蛋白分子的活性，实验考察了免疫传感器在不同电解液pH 中的电流响应情况，pH选自3.5-9.0，实验结果如图3所示，当电解液的pH为8 时的峰电流最小，因此免疫传感器的电解液选定pH＝8；实验结果表明，该修饰电极的电化学行为受溶液的pH值的影响较大。
(2)孵育温度的影响
温度是影响免疫反应的一个重要因素。一般来说，当温度升高时，免疫反应的速率增加，但温度过高也会导致免疫蛋白分子变性而导致失活；为了获得最佳反应温度，在0～40℃的温度范围内，研究了温度与响应信号的关系。实验中，选择修饰电极在不同的温度下与20ng·mL-1的AFP抗原反应，记录下不同温度下 CV响应的峰电流值；实验结果表明，当温度过低时，蛋白质分子活性降低，抗原与抗体结合速度慢，反应时间长。当温度较高时，蛋白质分子活性高，抗原与抗体结合速度快，反应时间短。最大的免疫在25℃时，免疫反应的程度基本最大，电流响应最大；当温度持续上升时，响应电流会下降，这是由于反应温度高导致免疫分子变性或失活，致使免疫电极表面的AFP抗原和抗体部分分离。因此，本实验以25℃为最佳免疫反应温度。
(3)孵育时间的影响
免疫电极分别在20ng·mL-1的抗原的溶液中孵育1min、2min、5min、8min、10min、12min、15min、20min、25min和30min，作为电极的孵育时间，测定免疫反应达到饱和的时间。实验结果如图4所示，由图4可见，在前20min内，氧化峰随着反应时间的增加，氧化峰电流急剧下降，免疫特异性反应在逐渐增强；当达到20min后，电流值变化缓慢，说明与免疫电极结合的AFP基本饱和，因此，选择20min作为免疫传感器的孵育时间。
3、电化学免疫传感器的分析性能测试结果
(1)抗原浓度的影响
在含不同浓度甲胎蛋白的标准溶液中孵育15min后，用CV法对所制备的免疫传感器进行扫描；实验结果如图5所示，随着AFP浓度的增加，免疫传感器上的复合物增加，氧化峰电流减小。结果表明，在0.01～100ng·mL-1的浓度范围内，氧化峰值电流与AFP浓度呈对数关系。其线性回归方程分别为 I＝-5.206lgc+87.85，检测下限为0.003ng·mL-1(S/N)。
(2)免疫传感器的稳定性
由于该电极的修饰膜有良好的电化学性能和稳定性，在-0.2～0.6V的工作电位下不会引起膜性质的明显改变，因此该膜可重复使用。通过连续6圈循环伏安曲线的测定，研究了连续测定对电极稳定性的影响。实验结果表明，该修饰电极具有良好的稳定性。在电极不用时，置于冰箱中，经过30天，对同一只电极在相同测试液中进行测试；电极的响应电流略有下降，为初始值的93.4％。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器在非疾病诊断目的的免疫蛋白的超灵敏检测中的应用，其特征在于，基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器按照如下步骤制备：
(1)将金电极进行清洗处理；
(2)基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器的制备：将Graphene/Fe3O4纳米复合材料修饰至金电极表面，室温下晾干成膜得到修饰电极，将修饰电极依次浸泡于纳米金溶胶4-6h、0.01～100ng·mL-1的甲胎蛋白抗体溶液9-12h、0.25wt％的牛血清白蛋白溶液30-45min，得到基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器；
所述免疫蛋白包括甲种胎儿球蛋白、癌胚抗原；
所述免疫蛋白检测的具体步骤为：
(1)孵育：将基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器置于不同的浓度的免疫蛋白抗原溶液中进行特异性反应；
(2)检测电化学免疫传感器的电信号：
将饱和Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，与孵育后的基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器为工作电极组成三电极体系，连接到光电化学检测设备上，以K3[Fe(CN)6]+K4[Fe(CN)6]+0.1mol·L-1KCl溶液为电解液，K3[Fe(CN)6]+K4[Fe(CN)6]为5mmol/L，电解液的pH为5-9，采用循环伏安法，根据电流-电势绘制工作曲线；
Graphene/Fe3O4纳米复合材料均按照如下步骤制得：
将100g氧化石墨烯加入至100mL超纯水中得到1mg/mL溶液，超声分散3h后，将1.16g的FeSO4·7H2O加入到氧化石墨烯溶液中，滴加体积分数为28wt％的NH3·H2O溶液至pH达到9-11；常温搅拌2h后于80℃继续反应1h，经磁分离、洗涤、常温干燥得到Graphene/Fe3O4纳米复合材料。
2.根据权利要求1所述的基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器在非疾病诊断目的的免疫蛋白的超灵敏检测中的应用，其特征在于，所述步骤(1)中金电极的清洗处理方法为：将金电极依次经粒径分别为0.03μm、0.05μm的Al2O3糊打磨后用超纯水冲洗干净，再依次于超纯水、乙醇、超纯水中超声洗涤5min，清洗后的电极置于室温下晾干。
3.根据权利要求1所述的基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器在非疾病诊断目的的免疫蛋白的超灵敏检测中的应用，其特征在于，所述步骤(2)中修饰的方法为：将Graphene/Fe3O4纳米复合材料浸泡或滴涂至金电极表面。
4.根据权利要求1所述的基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器在非疾病诊断目的的免疫蛋白的超灵敏检测中的应用，其特征在于，所述电解液的pH为8-9，所述孵育时间为20-30min，所述孵育温度为20-30℃。
5.根据权利要求1所述的基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器在非疾病诊断目的的免疫蛋白的超灵敏检测中的应用，其特征在于，所述电解液的pH为8，所述孵育时间为20min，所述孵育温度为25℃。
6.根据权利要求1所述的基于石墨烯磁性纳米材料的电化学免疫传感器在非疾病诊断目的的免疫蛋白的超灵敏检测中的应用，其特征在于，所述免疫蛋白抗原溶液的浓度为0.003-100ng·mL-1。
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