JP7039481B2 - 電気化学発光検出における分枝鎖アミン - Google Patents

電気化学発光検出における分枝鎖アミン Download PDF

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Description

本発明は、新規試薬組成物を用いた、電気化学発光による、試料中の分析物の検出のための方法に関する。新規試薬組成物、電気化学発光（ＥＣＬ）を測定するための試薬キット、および新規試薬組成物を用いる電気化学発光検出法を開示する。特に、本発明は、改善されたアッセイ性能を提供するために、前記測定において使用可能である化合物の新規組み合わせの使用に関する。
背景と先行技術
電気化学発光現象を測定するための方法は数年来知られている。こうした方法は、酸化および還元反応によって、特別な金属錯体が励起状態を達成し、そこから基底状態に崩壊して光子を放出しうる能力を利用する。概説には、Ｒｉｃｈｔｅｒ， Ｍ．Ｍ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １０４（２００４） ３００３－３０３６を参照されたい。
現時点で、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ診断適用の分野において、分析測定に電気化学発光（ＥＣＬ）を利用する、いくつかの商業的に入手可能な装置がある。ＥＣＬを放出するよう誘導可能な種（ＥＣＬ活性種）は、ＥＣＬ標識として用いられてきている。ＥＣＬ標識の例には、有機金属化合物、例えばトリス－ビピリジル－ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）部分が含まれ、ここで、金属は、例えばＲｅ、Ｒｕ、ＩｒおよびＯｓを含むＶＩＩおよびＶＩＩＩ族の金属由来である。ＥＣＬプロセスにおいてＥＣＬ標識と反応する種は、本明細書において、ＥＣＬ共反応体と称される。ＥＣＬに一般的に用いられる共反応体には、三級アミン（例えばトリプロピルアミン（ＴＰＡ））、シュウ酸塩、および過硫酸塩が含まれる。光は、ＥＣＬ標識またはＥＣＬリガンドによって生じ；ＥＣＬ標識から放出されたＥＣＬを測定することによって、結合相互作用における結合試薬の関与を監視することも可能である。あるいは、ＥＣＬ活性化合物からのＥＣＬシグナルは、化学環境の指標となりうる（例えば、特殊なＥＣＬ共反応体の存在または分解を監視するＥＣＬアッセイを説明する、米国特許第５，６４１，６２３号および第５，６４３，７１３号を参照されたい）。ＥＣＬ、ＥＣＬ標識、ＥＣＬアッセイおよびＥＣＬアッセイを実施するための装置に関するより多くの背景に関しては、米国特許第５，０９３，２６８号；第５，１４７，８０６号；第５，２４０，８６３号；第５，３０８，７５４号；第５，３２４，４５７号；第５，５９１，５８１号；第５，５９７，９１０号；第５，６７９，５１９号；第５，７０５，４０２号；第５，７３１，１４７号；第５，７８６，１４１号；第５，８４６，４８５号；第５，８６６，４３４号；第６，０６６，４４８号；第６，１３６，２６８号および第６，２０７，３６９号、ならびにＥＰ ０ ４４１ ８７５、ならびに公開ＰＣＴ第ＷＯ９０／０５２９６号、第ＷＯ９７／３６９３１号；第ＷＯ９８／１２５３９号；第ＷＯ９９／１４５９９号；第ＷＯ９９／３２６６２号；第ＷＯ９９／５８９６２号；第ＷＯ９９／６３３４７号；第ＷＯ００／０３２３３号および第ＷＯ９８／５７１５４号を参照されたい。
ｉｎ ｖｉｖｏ診断のための商業的に入手可能なＥＣＬ装置は、非常に優れた性能を有することが立証されてきている。これらは、優れた感度、ダイナミックレンジ、正確さ、および複雑な試料マトリックスの耐性を含む理由のために広く用いられてきている。商業的に入手可能な装置は、永続的に再使用可能なフローセルを伴う、フローセルに基づく設計を用いる。
分析物の決定のための利用可能な試料体積は、しばしば限定され、そして１つの試料から決定すべき異なる分析物はますます多くなってきている。アッセイ自動化のためのより迅速な実験室装置の開発および分析物検出のためのより高感度な方法もまた必要である。これは、高感度でそして高特異性である電気化学発光アッセイ、およびこれらを実行するための方法に関する必要性につながる。さらに、安全上の問題または環境に対する懸念に関連する改善も考慮しなければならない。
特に、分析物のさらにより高感度な検出が非常に有効であろう。したがって、本発明の目的は、前記の既知の方法および試薬組成物を、特にＥＣＬシグナルの増進、および電気化学発光法と組み合わされた改善された分析物検出に関して、改善することであった。電気化学発光アッセイにおいて、改善された性能を有する新規シグナル増進試薬および／または化合物を発見することが望ましいであろう。
１つの態様において、本発明は、電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを検出する方法であって
ａ）
ｉ）少なくとも１つの分枝鎖三級アミンおよび
ｉｉ）遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物
を含む反応組成物を、電極と接触させ、
ｂ）発光の放出を電気化学的に誘発し、そして
ｃ）ＥＣＬシグナルを検出する
工程を含む、前記方法に関する。
本発明は、さらなる態様において、電気化学発光検出を通じて、試料中の分析物を検出するための方法であって：
ａ）試料を、遷移金属錯体を含む、１つの態様において、トリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋）を含む、電気化学発光基で標識された検出試薬とインキュベートし、
ｂ）分析物に結合したおよび分析物に結合していない標識検出試薬を分離し、
ｃ）分離した分析物に結合した標識検出試薬を、本発明の分枝鎖三級アミンおよび電極と接触させ、
ｄ）発光の放出を電気化学的に誘発し、そして
ｅ）電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを検出し、それによって分析物を検出する
工程を含む、前記方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、ＥＣＬを検出するための試薬組成物であって、
ｉ）共反応体としての、分枝鎖三級アミン、特に式Ｉ
Figure 0007039481000001
の分枝鎖三級アミン、および
ｉｉ）さらなるＥＣＬ試薬
を含む、前記試薬組成物に関する。
１つの態様において、本発明はまた、ｉ）遷移金属錯体を含む少なくとも１つのＥＣＬ化合物およびｉｉ）少なくとも１つの分枝鎖三級アミンを含むＥＣＬ反応組成物にも関する。
本発明はまた、本発明のいずれか１つに明記するような分枝鎖三級アミンの、本発明記載の試薬組成物の、および／またはＥＣＬの検出における本発明記載の反応組成物の使用にも関する。
さらに、本発明は、ｉ）分枝鎖三級アミンおよびｉｉ）ＥＣＬ試薬を含む、ＥＣＬを検出するためのキットに関する。
さらに、本発明は、本発明の態様のいずれか一つに明記するような分枝鎖三級アミンを含むＥＣＬデバイスに関する。
さらに、本発明は、本発明の分枝鎖三級アミンを含むＥＣＬデバイスに関する。
本発明、ならびにそのさらなる目的、特徴および利点は、以下の特定の態様の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
図１は、６つの異なる共反応体に関する、ＲｕＢｐｙ標識微粒子を含む人工的イムノアッセイ（「ＳＡＰアッセイ」）において、適用される測定電圧に依存して測定されるＥＣＬシグナルを示す。Ｘ軸：ｍＶでの測定電圧、Ｙ軸：シグナル強度／最大シグナル強度（Ｓ／Ｓｍａｘ）；ＴＰＡ：トリプロピルアミン、ＴＢＡ：トリブチルアミン、ＥＰ：エチルピペリジン、ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｎ－エチルアミン、ＤＰＩＢＡ：Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミン、ＤＩＢＰＡ；Ｎ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－プロピルアミン。 図２は、６つの異なる共反応体に関する、ＲｕＢｐｙ標識微粒子の非存在下での（「バックグラウンドシグナル」）、適用される測定電圧に依存して測定されるＥＣＬシグナルを示す。Ｘ軸：ｍＶでの測定電圧、Ｙ軸：シグナル強度／最大シグナル強度（Ｓ／Ｓｍａｘ）；さらなる略語に関しては、図１のレジェンドを参照されたい。 図３は、４つの異なる共反応体に関する、適用される測定電圧に依存したシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／ＢＧ）を示す。 ＳＡＰアッセイにおける、多様なビーズおよび２つの異なる共反応体を用いた、バックグラウンドシグナルおよび陽性対照シグナルの比較。Ａ）多様なビーズタイプおよびＤＢＩＰＡまたはＴＰＡを含有する緩衝剤に関する相対バックグラウンド（「低」）および陽性対照シグナル（「高」）。ＴＰＡで得たシグナルを１に設定した。見かけ上、ＤＰＩＢＡの使用は、バックグラウンド（低）および特異的（高）シグナルの減少を導く。しかし、バックグラウンドシグナルの減少は、特異的シグナルの減少に比較してより強い。これは、全体のＳ／ＢＧ比の改善につながる。Ｂ）Ｓ／ＢＧ比の改善；ＴＰＡを用いて測定した試料に比較した、ＤＰＩＢＡの存在下で測定した試料のＳ／ＢＧ比。 ＳＡＰアッセイにおける本発明の方法の遷移金属としてのＲｕおよびＩｒの比較。Ｉｒ標識を用いる場合、減少した電圧で測定した際の特異的シグナルの減少は、Ｒｕ標識に比較して、より低い。 図６は、３つの異なる共反応体に関するサイクリック・ボルタンメトリーデータを示す。Ｘ軸：Ｖでの適用電圧、Ｙ軸：ｍＡでの電流；ＴＰＡ：トリプロピルアミン、ＤＰＩＢＡ：Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミン、ＤＩＢＰＡ Ｎ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）プロピルアミン。分枝置換基の数が増加するにつれて、所定の電位での酸化電流は、化合物の標準的酸化電位の減少のために増加する。
本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術範囲内にある、化学、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の慣用技術を使用するであろう。こうした技術は、文献、例えば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， 第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）； ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ監修、１９８４）； ”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ監修、１９８７）； ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら監修、１９８７、および定期的な改訂）； ”ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”， （Ｍｕｌｌｉｓら監修、１９９４）に十分に説明される。
別に定義しない限り、本明細書で用いる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の一般的な当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）； Ｍａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， 第４版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）； Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊行（１９９４）， ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７ ９）； Ｋｅｎｄｒｅｗ， Ｊ．ら（監修）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．刊行（１９９４）， ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＭｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （監修）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．刊行（１９９５）， ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９ ８）は、当業者に、本出願で使用する用語の多くに関する一般的な指針を提供する。
本明細書に引用するすべての参考文献は、特許出願および公報を含めて、その全体が本明細書に援用される。
定義
本明細書において、以下の用語は各々、このセクションにおいて、本明細書と関連する意味を有する。
以下で用いるように、用語「有する」、「含む」または「含まれる」あるいはそのいずれの恣意的な文法的変形は、非排他的な方式で用いられる。したがって、これらの用語は、これらの用語によって導入される特徴に加えて、さらなる特徴がこの背景に記載される実体に存在しない状況、および１またはそれより多いさらなる特徴が存在する状況の両方を指すことも可能である。例えば、表現「ＡはＢを有する」、「ＡはＢを含む」および「ＡにはＢが含まれる」は、Ｂに加えて、Ａに他の要素がまったく存在しない状況（すなわち、単に、そしてもっぱらＢからなる状況）、およびＢに加えて、実体Ａに１またはそれより多いさらなる要素、例えば要素Ｃ、要素ＣおよびＤまたはさらにさらなる要素が存在する状況の両方を指すことも可能である。
さらに、以下で用いるように、用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「具体的に」、「より具体的に」、「明確に」、「より明確に」または類似の用語は、さらなる可能性を限定することなく、場合による特徴と組み合わせて用いられる。したがって、これらの用語によって導入される特徴は、場合による特徴であり、そしていかなる意味でも、請求項の範囲を制限することは意図されない。本発明は、当業者が認識するであろうように、別の特徴を用いることによって実行されることも可能である。同様に、「本発明の態様において」または類似の表現によって導入される特徴は、本発明のさらなる態様に関するいかなる制限も伴わず、本発明の範囲に関するいかなる制限も伴わず、そして本発明の他の場合によるまたは場合によらない特徴のように、導入される特徴と組み合わせる可能性に関していかなる制限も伴わない、場合による特徴であると意図される。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的対象の１または１より多く（すなわち少なくとも１つ）を指す。例えば、「分析物」は、１つの分析物または１より多い分析物を意味する。用語「少なくとも」は、場合によって１またはそれより多くのさらなる対象が存在可能であることを示すように用いられる。例えば、少なくとも２つの別個の領域を含むアレイは、場合によって、２またはそれより多い別個の試験領域を含むことも可能である。表現「１またはそれより多く」は、１つの態様において、１～５０、さらなる態様において、１～２０、さらなる態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５を示す。さらに、別に示さない限り、用語「約」は、示す値±２０％に関する。
本発明の方法は、１つの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。さらに、これらは、本明細書で明確に言及したものに加えて、工程を含むことも可能である。例えば、さらなる工程は、例えば、分析のために試料を得るか、あるいは検出したＥＣＬ値から測定値または修正した測定値を計算することに関することも可能である。さらに、本発明の方法の工程の１またはそれより多くは、自動化装置によって実行可能である。
「検出」には、直接および間接検出を含むいずれの検出法が含まれる。用語「検出」は、電気化学発光シグナルの定性的および定量的測定；ならびに分析物の定性的および定量的測定の両方を含む、最も広い意味で用いられ、本明細書において、分析物の測定ともまた称される。１つの側面において、本明細書に記載するような検出法は、検出組成物中のＥＣＬまたは試料中の関心対象の分析物の単なる存在を同定するために用いられる。別の側面において、方法は、検出組成物中のＥＣＬシグナルまたは試料中の分析物の量を定量化するために使用可能である。定量的検出のため、ＥＣＬシグナルの絶対的もしくは正確な強度、または分析物の絶対的もしくは正確な量のいずれかが検出されるであろうし；あるいはＥＣＬシグナルの相対的強度または分析物の相対量が検出されるであろう。相対的強度または相対量は、正確な強度または量が検出不能であるかまたは検出すべきでない場合に検出されうる。この場合、参照強度を提供するか、または第二の量、１つの態様において、あらかじめ決定された量で、前記分析物を含む、第二の試料に対して、強度または量が増加するかまたは減少するかを検出可能である。
１つの態様において、検出は測定である。用語、「測定すること」／「測定」は、科学において、量、例えば長さまたは質量の度合いを、測定単位、例えばメートルまたはキログラムに概算するかまたは決定するプロセスに関する。測定すること／測定は、他のものが評価可能であるものに対する参照ポイントを用いる。用語、測定はまた、測定プロセスから得られる特定の結果（決定された値）を指すように使用可能である。それは比較のためのベースである。当業者は、測定されたシグナルまたは決定された値を、濃度に相関させる材料および方法を知っている。
「減少させる」または「阻害する」は、参照に比較した際に、活性、機能、および／または量を減じさせるかまたは減少させることである。減少させるまたは阻害するによって、１つの態様において、１０％またはそれより多い、さらなる態様において、２５％またはそれより多い、さらなる態様において、５０％、７５％、９０％、９５％、またはそれより多い、全体の減少を引き起こす能力を意味する。
「増進させる」、例えば「特異的シグナルを増進させる」または「ＥＣＬシグナルの増進」は、参照に比較した際に、活性、機能、および／または量を増加させるかまたは上昇させることである。増加または上昇によって、１つの態様において、１０％またはそれより多い、さらなる態様において、２５％またはそれより多い、さらなる態様において、５０％またはそれより多い、全体の増加を引き起こす能力を意味する。
用語「発光」は、エネルギー供給源（例えば電磁放射、化学反応、機械的エネルギーの供給源）の温度からエネルギーを得ないいずれの光の放出を指す。一般的に、供給源は、原子の電子を、より低いエネルギー状態から、「励起した」、より高いエネルギー状態に移動させ；次いで電子は、より低いエネルギー状態に再び落ちる際に、放出される光の形でそのエネルギーを放出する。こうした光放出は、通常、電磁スペクトルの可視または近可視範囲で生じる。用語「発光」には、限定されるわけではないが、光放出現象、例えばリン光、蛍光、生物発光、放射発光、電気発光、電気化学発光および熱発光が含まれる。１つの態様において、発光は電気化学発光（ＥＣＬ）である。当業者によって理解されるように、ＥＣＬは本明細書の別の個所に明記するような電気化学反応中に生じる発光である。したがって、ＥＣＬシグナルは、１つの態様において、可視的に検出可能であるか、または適切な計測手段、１つの態様において、光度測定計測手段を用いることによって検出可能であるか、いずれであっても、検出可能な電気化学発光シグナルである。
用語「接触させること」は、本発明の方法の背景において用いた際、当業者に理解される。１つの態様において、該用語は、化合物を、さらなる化合物またはデバイスに物理的に接触させ、それによって、該化合物およびさらなる化合物またはデバイスが相互作用することを可能にすることに関する。特に、該用語は、本発明の分枝鎖三級アミンを、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物および電極と物理的に接触させ；そして／または検出試薬を試料と物理的に接触させることに関する。
用語「遷移金属錯体」は、本明細書において、適切な錯化剤によって錯体形成された遷移金属イオンを含む化合物に関する。用語「遷移金属錯体を含む化合物」は、遷移金属錯体および第二の化学的化合物を含むいずれの化合物に関する。１つの態様において、遷移金属錯体および第二の化学的化合物は、共有結合している。さらなる態様において、第二の化学的化合物は、生物学的巨大分子である。さらなる態様において、第二の化学的化合物は、以下に明記するような分析物に特異的な試薬である。本明細書において、用語「遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物」は、遷移金属錯体を含む化合物に関連し、ここで該遷移金属錯体は、適切な条件下でＥＣＬを放出する。１つの態様において、ＥＣＬ化合物は、遷移金属錯体を含んでいる。１つの態様において、遷移金属は、ルテニウム（＝Ｒｕ）、イリジウム（＝Ｉｒ）、レニウム、オスミウム、ユーロピウム、テルビウム、およびジスプロシウムからなる群より選択され；さらなる態様において、遷移金属は、ルテニウム、イリジウム、レニウム、またはオスミウムであり；さらなる態様において、遷移金属は、ルテニウムまたはイリジウムである。適切な錯化剤は、当該技術分野に知られ、そしてビピリジン、フェナントロリン、フェニル－ピリジン、フェニル－キノリン、フェニルフェナントリジンまたはピリジン－２－カルボン酸を含む。
遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物は、例えば、ＷＯ ８７０６７０６ Ａ１、ＷＯ ２００３００２９７４、ＥＰ７２０６１４（Ａ１）およびＵＳ ６，４５１，２２５（Ｂ１）に開示される。
１つの態様において、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物は、以下からなる群より選択される。
Ｒｕ（ｂｐｙ）２－ｂｐｙＣＯ－ＯＳｕ、Ｃａｓ登録番号１１５２３９－５９－３（Ｒｕ（ｂｐｙ）２－ｂｐｙＣＯ２Ｈ）＝ＢＰＲｕのＮ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステル、当該技術分野において、ルテニウム（１＋）、ビス（２，２’－ビピリジン－κＮ１，κＮ１’）（４’－メチル［２，２’－ビピリジン］－４－ブタノアト－κＮ１，κＮ１’）－、（ＯＣ－６－３３）－、ヘキサフルオロリン酸水素（１－）（１：１：２）としてもまた知られ、ルテニウム（１＋）、ビス（２，２’－ビピリジン－Ｎ，Ｎ’）（４’－メチル［２，２’－ビピリジン］－４－ブタノアト－Ｎ１，Ｎ１’）－、（ＯＣ－６－３３）－、ヘキサフルオロリン酸水素（１－）（１：１：２））としてもまた知られる；
スルホ－ＢＰＲｕ ＮＨＳエステル（＝ＣＡＳ登録番号４８２６１８－４２－８）、当該技術分野において、ルテネート（２－）、ビス［［２，２’－ビピリジン］－４，４’－ジメタンスルホナト（２－）－κＮ１，κＮ１’］［１－［４－（４’－メチル［２，２’－ビピリジン］－４－イル－κＮ１，κＮ１’）－１－オキソブトキシ］－２，５－ピロリジンジオン］－、ナトリウム（１：２）、（ＯＣ－６－３１）としてもまた知られ、さらにルテネート（２－）、ビス［［２，２’－ビピリジン］－４，４’－ジメタンスルホナト（２－）－κＮ１，κＮ１’］［１－［４－（４’－メチル［２，２’－ビピリジン］－４－イル－κＮ１，κＮ１’）－１－オキソブトキシ］－２，５－ピロリジンジオン］－、二ナトリウム、（ＯＣ－６－３１）－（９ＣＩ））としてもまた知られる；
ＢＰＲｕＵＥＥＫ－スベレート－ＯＳｕ（＝ＣＡＳ登録番号４０６２１８－５９－５）、当該技術分野において、Ｒｕ（ｂｐｙ）２－ｂｐｙＣＯ－ＵＥＥＫ－スベレート－ＯＳｕまたはルテネート（３－）、ビス（２，２’－ビピリジン－κＮ１，κＮ１’）［Ｎ－［４－（４’－メチル［２，２’－ビピリジン］－４－イル－κＮ１，κＮ１’）－１－オキソブチル］－β－アラニル－Ｌ－α－グルタミル－Ｌ－α－グルタミル－Ｎ６－［８－［（２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル）オキシ］－１，８－ジオキソオクチル］－Ｌ－リジナト（３－）］－、（ＯＣ－６－３３）－（９ＣＩ））としてもまた知られ、ペプチドリンカーを伴うＢＰＲｕ－標識である、Ｕ＝ベータ－アラニン、Ｅ＝グルタミン酸、Ｋ＝リジン；
ＢＰＲｕ－（ＵＥ）－２５－Ｋ－スベレート－ＯＳｕ（＝ＣＡＳ登録番号４０６６７９－８８－７のスベレートＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体）、当該技術分野において、ルテネート（２４－）、ビス（２，２’－ビピリジン－κＮ１，κＮ１’）［Ｎ－［４－（４’－メチル［２，２’－ビピリジン］－４－イル－κＮ１，κＮ１’）－１－オキソブチル］－（ＵＥ）２５－Ｌ－リジナト（２６－）］－、（ＯＣ－６－３３）－（９ＣＩ））としてもまた知られる、Ｕ＝β－アラニル、Ｅ＝Ｌ－α－グルタミル；
ＢＰＲｕ２－ＳＫ２－スベレート－ＯＳｕ（＝ＣＡＳ登録番号４０６２１８－６０－８のスベレートＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体）、当該技術分野において、ルテネート（７－）、ビス（２，２’－ビピリジン－κＮ１，κＮ１’）［Ｎ－［４－（４’－メチル［２，２’－ビピリジン］－４－イル－κＮ１，κＮ１’）－１－オキソブチル］－β－アラニル－Ｎ６－（Ｎ－アセチル－（ＥＵ）３）－Ｌ－リジル－Ｎ６－（Ｎ－アセチル－（ＥＵ）３）－Ｌ－リジル－（ＵＥ）２－Ｌ－リジナト（９－）］－９水素（９ＣＩ））としてもまた知られる、Ｕ＝β－アラニル、Ｅ＝Ｌ－α－グルタミル；４，４’，５’，５－テトラメチルビピリジンＲｅ（Ｉ）（４－エチルピリジン）（ＣＯ）３ ＋ＣＦ３ＳＯ３ －；および
Ｐｔ（２－（２－チエニル）ピリジン）２。
さらに知られるキレートは、ビス［（４，４’－カルボメトキシ）－２，２’－ビピリジン］－２－［３－（４－メチル－２，２’－ビピリジン－４－イル）プロピル］－１，３－ジオキソラン・ルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’ビピリジン）［４－（ブタン－１－アール）－４’－メチル－２，２’－ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’－ビピリジン）［４－（４’－メチル－２，２’－ビピリジン－４’－イル）－酪酸］ルテニウム（ＩＩ）；（２，２’－ビピリジン）［ビス－ビス（１，２－ジフェニルホスフィノ）エチレン］２－［３（４－メチル－２，２’－ビピリジン－４’－イル）プロピル］－１，３－ジ－オキソラン・オスミウム（ＩＩ）；ビス（２，２’－ビピリジン）［４－（４’－メチル－２，２’－ビピリジン）－ブチルアミン］ルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’－ビピリジン）［１－ブロモ－４－（４’－メチル－２，２’－ビピリジン－４－イル）－ブタン］ルテニウム（ＩＩ）；およびビス（２，２’－ビピリジン）マレイミド－ヘキサン酸、４－メチル－２，２’－ビピリジン－４’－ブチルアミド・ルテニウム（ＩＩ）である。１つの態様において、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物は、Ｒｕ（ｂｐｙ）としてもまた知られるトリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム（Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋またはその誘導体、例えば（ＢＰＲｕ＝Ｒｕ（ｂｐｙ）２－ｂｐｙＣＯ－ＯＳｕ）、（スルホ－ＢＰＲｕ ＮＨＳエステル）である。
さらなる態様において、ＥＣＬ化合物は、ＢＰＲｕ（＝Ｒｕ（ｂｐｙ）２－ｂｐｙＣＯ－ＯＳｕ）；スルホ－ＢＰＲｕ ＮＨＳエステル；ＢＰＲｕＵＥＥＫ－スベレート－ＯＳｕ；ＢＰＲｕ－（ＵＥ）－２５－Ｋ－スベレート－ＯＳｕおよびＢＰＲｕ２－ＳＫ２－スベレート－ＯＳｕからなる群より選択される。
当業者には、前述のＥＣＬ化合物の親水性誘導体もまた使用可能であることが知られる。したがって、さらなる態様において、用語、ＥＣＬ化合物にはまた、前述のＥＣＬ化合物の親水性誘導体も含まれる。
さらなる態様において、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物は、ＷＯ ２０１４／０１９７０７（Ａ２）に開示されるようなＩｒ錯体であり、１つの態様において、Ｉｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－ピリジン－２－カルボン酸またはその誘導体であり、例えばＩｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－３－ヒドロキシピリジン－２－カルボン酸、Ｉｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－４－（ヒドロキシメチル）ピリジン－２－カルボン酸、Ｉｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－２－（カルボキシエチル－フェニル）ピリジン－２－カルボン酸、Ｉｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－５－（メトキシ）ピリジン－２－カルボン酸、またはＩｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－２－（カルボキシエチル－フェニル）ピリジン－２－カルボン酸エステル、またはその誘導体、例えば１またはそれより多いスルホン酸で置換されたリガンドを含むイリジウム錯体、またはＷＯ２０１２１０７４１９（Ａ１）、ＷＯ２０１２１０７４２０（Ａ１）、ＷＯ２０１４０１９７０７（Ａ２）、ＷＯ２０１４０１９７０８（Ａ１）、ＷＯ２０１４０１９７０９（Ａ２）、ＷＯ２０１４０１９７１０（Ａ１）、ＷＯ２０１４０１９７１１（Ａ１）に記載されるようなイリジウム錯体である。
さらなる態様において、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物は、ＣＡＳ登録番号１５５６７３０－０７－４（＝ＩＢ３／４７）、当該技術分野において、イリデート（３－），［５－［４－（２－カルボキシエチル）フェニル］－２－ピリジンカルボキシラト（２－）－κＮ１，κＯ２］ビス［２－（６－フェナントリジニル－κＮ）－５－（３－スルホナトプロポキシ）フェニル－κＣ］－、セシウム水素（１：２：１）またはそのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
さらなる態様において、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物は、２つのスルホナトプロポキシ置換基、２つのスルホ－メチルを有し、２，９－フェナントリジンジメタンスルホン酸、６－フェニル、ナトリウム塩を含む、２つのフェニル－フェナントリジンリガンドを含むイリジウム錯体（ＣＡＳ登録番号１５５４４６５－５０－７）、または２つのポリエチレングリコール置換基、または各々の３つ、またはその組み合わせを有するイリジウム錯体である。
ルテニウム錯体を含むさらなる態様において、異なるリンカー、例えば（ＵＥ）２５、またはポリエチレングリコール、またはその他が使用可能である。
１つの態様において、遷移金属錯体を含む化合物は、分析物特異的試薬および標識を含む検出試薬である。用語、本発明にしたがった「分析物特異的試薬」（ＡＳＲ）は、分析物に特異的に結合する能力を持つ分子または生体分子（例えばタンパク質または抗体）と理解されなければならない。「分析物特異的試薬」（ＡＳＲ）は、生物学的標本における個々の化学物質を同定するかまたはその量を測定するために使用可能な生物学的分子クラスである。ＡＳＲは、標本中の物質との特異的結合または化学反応を通じて、生物学的標本における個々の化学物質またはリガンドの同定および定量化のための診断適用における使用が意図される、例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗体、特異的受容体タンパク質、リガンド、核酸配列、ならびに類似の試薬である。ＡＳＲは、分析物に結合するアフィニティならびに特異性に関する基準の両方を満たすであろう。特定の分析物は、ピコモル未満の範囲の濃度であっても、高い医学的および診断適切性を有する。特に、感染性疾患パラメータ群、例えばＢ型肝炎ウイルス可溶性抗原（ＨＢｓＡｇ）、ヒト免疫不全ウイルス抗原（ＨＩＶＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルス抗原（ＨＣＶＡｇ）、特にＣ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＣＶｃＡｇ）および心臓マーカー、例えばトロポニン－Ｔ（ＴｎＴ）が、こうした分析物の例である。特に、これらの場合、感度の改善は、患者に対する大きな医学的価値がある。
用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、そして特に、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、抗体断片、一本鎖抗体、ナノボディ等を含む。用語「抗体」は、完全抗体および抗体断片を含む抗体構造の多様な型を含む。本発明記載の抗体は、１つの態様において、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス、ヤギまたはヒツジのような他の動物種由来の抗体、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、あるいはＴ細胞抗原枯渇抗体である。抗体の遺伝子操作は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１－６８５５； ＵＳ ５，２０２，２３８およびＵＳ ５，２０４，２４４； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３－３２７； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８－２７０； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３（２００５）１１１７－１１２５に記載される。
分析物特異的試薬の上記基準を保持するいずれの抗体断片が使用可能である。抗体は、例えばＴｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， １１， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、書籍全体、特に４３～７８ページ）に記載されるような最新技術の方法によって生成される。さらに、当業者は、抗体の特異的単離に使用可能な免疫吸着剤に基づく方法を熟知している。これらの手段によって、抗体の品質およびしたがってイムノアッセイにおけるその性能は増進可能である（Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．、上記、１０８～１１５ページ）。
本発明記載の「検出試薬」は、電気化学発光基で標識された分析物特異的試薬（ＡＳＲ）、または電気化学発光基で標識された分析物相同体を含む。試験形式に応じて、当業者には、多様なアッセイ形式（例えばサンドイッチアッセイ、二重抗原架橋アッセイ（ＤＡＧＳ）、競合アッセイ、均一アッセイ、不均一アッセイ）のために、どのタイプの検出試薬を選ぶべきかを知っている。不均一イムノアッセイにおける検出試薬は、例えば、標識抗体であってもよい。当業者には、検出試薬が固相に固定可能であることが知られる。１つの態様において、電気化学発光検出を通じて試料中の分析物を測定するための方法は、均一アッセイとして実行可能である。１つの態様において、方法は、不均一アッセイとして実行可能である。１つの態様において、方法は、サンドイッチアッセイ形式で実行可能である。１つの態様において、方法は、競合アッセイ形式で実行可能である。やはり１つの態様において、方法は、二重抗原架橋アッセイ形式（ＤＡＧＳ）で実行可能である。既知のイムノアッセイ形式は、Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｐ．およびＮｅｗｍａｎ， Ｄ．Ｊ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， 第２版（１９９７）の書籍に詳細に記載される。
用語「分枝鎖三級アミン」は、本明細書において、アルキル鎖のアルファ位の二級炭素原子を有する少なくとも１つのアルキル鎖を含む三級アミンに、すなわち少なくとも１つの１－分枝アルキル鎖を含む三級アミンに関する。本明細書において、三級アミンの側鎖のＣ－アルファ原子は、中央の窒素原子に共有結合した炭素原子である。したがって、１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、アルファ分枝鎖三級アミンである。１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、式（Ｉ）
Figure 0007039481000002
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つ、１つの態様において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の１または２は、独立に、式（ＩＩ）
Figure 0007039481000003
式中、
ｍは０、１、または２、１つの態様において、０または１であり；
Ｒ４はアルキル、１つの態様において、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキル、さらなる態様において、エチルまたはメチル、別の態様において、メチルであり、
Ｒ５はアルキル、１つの態様において、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキル、別の態様において、エチルまたはメチル、１つの態様において、メチルである、
に記載の独立に選択される側鎖であり、
そして式中、残基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立に、アルキルより選択され、さらなる態様において、独立に、直鎖アルキルより選択され、別の態様において、独立に、ｎ－ペンチル、ｎ－ブチル、ｎ－プロピル、エチルおよびメチルからなる群より選択され、１つの態様において、独立に、ｎ－プロピル、エチル、およびメチルより選択される
の一般構造を有する。
本明細書において、用語「化学的化合物」、「塩」、および「溶媒和物」は、熟練の化学者に知られる一般的な意味で用いられる。本発明記載の化合物の純電荷が正である場合、１つの態様において、対イオンは、トリフルオロメタンスルホン酸（トリフレート）、硫酸、アルキルスルホン酸、トシル酸、リン酸、テトラフルオロホウ酸、ヘキサフルオロリン酸、トリフルオロ酢酸、過塩素酸、塩素または硝酸イオンである。本発明記載の化合物の純電荷が負である場合、１つの態様において、対イオンは、リチウム、ナトリウム、および／またはカリウムイオン、あるいはテトラメチルアンモニウムイオンである。１つの態様において、本発明記載の化合物の純電荷は、本明細書の別の箇所に明記するような標準条件下での水溶液中の化合物の純電荷である。
用語「側鎖」は、当業者に理解され、そして本明細書に記載するような化学的化合物のコア部分に共有結合している原子または化学基に関し、前記コア部分はまた、「主鎖」または「バックボーン」とも称される。１つの態様において、側鎖は、本明細書の以下に記載するように、有機側鎖である。用語「置換」側鎖は、１またはそれより多い位、１つの態様において１、２、または３つの位で置換されている側鎖に関し、ここで、置換基は、任意の利用可能な原子で付着して、安定な化学的化合物を産生することが可能である。当業者には、用語「場合によって置換された」側鎖は、非置換または置換側鎖に関することが理解される。
用語「有機側鎖」は、本明細書において、少なくとも１つの炭素原子を含む、任意の、場合によって置換された側鎖に関する。用語「アルキル」は、本明細書において、少なくとも１つの炭素原子の少なくとも１つに、共有結合によって、三級アミンの主鎖または中央窒素に連結された、直鎖または分枝鎖飽和炭化水素基に関する。アルキル基の例は、直鎖アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、または分枝鎖アルキル基、例えば、－ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、－ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）である。したがって、アルキル基には、一級アルキル基、二級アルキル基、および三級アルキル基が含まれ；１つの態様において、アルキル基は一級アルキル基または二級アルキル基である。
さらなる態様において、式（ＩＩ）にしたがって選択されない残基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つは、直鎖アルキルであり、１つの態様において、ｎ－ペンチル、ｎ－ブチル、ｎ－プロピル、エチルまたはメチルからなる群より選択され、さらなる態様において、プロピル、エチル、またはメチルである。さらなる態様において、式（ＩＩ）にしたがって選択されない残基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のすべては、直鎖アルキルであり、１つの態様において、ｎ－ペンチル、ｎ－ブチル、ｎ－プロピル、エチルまたはメチルからなる群より選択され、さらなる態様において、プロピル、エチル、またはメチルである。
さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、一般式（ＩＩＩ）：
Figure 0007039481000004
にしたがった化合物であり、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、メチル、エチル、ｎ－プロピル、およびｎ－ペンチルからなる群より選択され；そして
Ｒ５は、メチル、エチル、およびｎ－プロピルより選択される。さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、Ｒ２およびＲ３が、独立に、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、およびｎ－ペンチルからなる群より選択され；そしてＲ５が、メチル、エチル、およびｎ－プロピルより選択される、前述の一般式（ＩＩＩ）にしたがった化合物である。したがって、１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、表１の化合物の１つである。さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、表１の化合物の１つ、または表２の化合物４６～６０の１つである。
さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、一般式（ＩＶ）：
Figure 0007039481000005
にしたがった化合物であり、
Ｒ３は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、およびｎ－ペンチルからなる群より選択され、そして
Ｒ５およびＲ６は、独立に、メチル、エチル、およびｎ－プロピルより選択される。さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、Ｒ３が、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、およびｎ－ペンチルからなる群より選択され、そしてＲ５およびＲ６が、独立に、メチル、エチル、およびｎ－プロピルからなる群より選択される、前述の一般式（ＩＶ）にしたがった化合物である。したがって、１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、表２の化合物の１つである。さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、表２の化合物３１～４５または６１～７５の１つである。
さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、一般式（Ｖ）：
Figure 0007039481000006
にしたがった化合物であり、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、独立に、メチル、エチルおよびｎ－プロピルより選択される。したがって、１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、表３の化合物の１つである。
さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、一般式（ＶＩ）：
Figure 0007039481000007
にしたがった化合物であり、
Ｒ８およびＲ９は、独立に、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル（１－メチルプロピル）、ｓｅｃ－ペンチル（１－メチルブチル）、および３－ペンチル（１－エチルプロピル）より選択される。したがって、１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、表４の化合物の１つである。
さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、一般式（ＶＩＩ）：
Figure 0007039481000008
にしたがった化合物であり、
Ｒ１０～Ｒ１５は、独立に、－Ｈおよびメチルより選択され、Ｒ１０～Ｒ１２の少なくとも１つはメチルであり；そしてＲ１０、Ｒ１１およびＲ１２がメチルである場合、Ｒ１３～Ｒ１５の少なくとも１つはメチルである。したがって、１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、表１～４の化合物番号：６、７、１０、２１、２２、２５、３２、３３、３６、３７、３８、３８、４２、４３，７６、７８、または８１である。
１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミン（慣用名「ジプロピル－イソブチルアミン」または「ＤＰＩＢＡ」としてもまた知られる、ＣＡＳ ６００２１－９１－２、表１の化合物番号２５）、Ｎ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－プロピルアミン（慣用名「ジイソブチル－プロピルアミン」または「ＤＩＢＰＡ」としてもまた知られる、表２の化合物番号４３）、またはＮ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｎ－エチルアミン（ＤＩＥＡ、ＣＡＳ ７０８７－６８－５、表２の化合物番号３２）である。さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミンまたはＮ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－Ｎ－プロピルアミンである。さらなる態様において、分枝鎖三級アミンはＮ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－Ｎ－プロピルアミンである。
表１：ジ（ｎ－アルキル）－（１－メチル－アルキル）アミンの態様、置換基は式（Ｉ）に関する
Figure 0007039481000009
Figure 0007039481000010
表２：（ｎ－アルキル）－ジ（１－メチル－アルキル）アミンおよび三級ｓｅｃ－ペンチル－アミンの態様；置換基は式（Ｉ）に関する
Figure 0007039481000011
Figure 0007039481000012
Figure 0007039481000013
表３：トリ（１－メチル－アルキル）アミンの態様；置換基は式（Ｉ）に関する
Figure 0007039481000014
表４：三級（１－エチル－アルキル）－アミンの態様
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さらなる態様において、本発明の分枝鎖アミンは、有効量の電気化学エネルギーによって酸化された際、強い還元剤を形成するアミンである（”Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ６９： Ｔｈｅ Ｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）， （Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋）／Ｔｒｉ－ｎ－ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ （ＴＰｒＡ） Ｓｙｓｔｅｍ Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ”， Ｍｉａｏら（２００２）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４（４８）：１４４７８）。
用語「組成物」は、当業者に知られ、そして少なくとも２つの化学的化合物の均一なまたは不均一な混合物に関する。本発明記載の「試薬組成物」または「ＥＣＬ試薬組成物」は、ＥＣＬシグナル生成を補助する試薬、例えば共反応体、ｐＨ調節のための緩衝剤、および場合によって他の構成要素を含む。当業者は、電気化学発光検出法において、ＥＣＬシグナル生成に必要な試薬組成物の構成要素を知っている。また、本明細書において、用語「反応混合物」は、第一の化合物と第二の化合物、例えば分枝鎖三級アミンおよび遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物を接触させ、前記の第一および第二の化合物が反応することを可能にする、いずれの混合物に関する。１つの態様において、反応混合物は、さらに、溶媒を含み、１つの態様において、水を含む。さらなる態様において、反応混合物は、さらに、１またはそれより多い補助化合物、例えば緩衝剤、保存剤、または界面活性剤、あるいはそのいずれの組み合わせを含む。１つの態様において、反応混合物は、ＷＯ ２０１２０５５８１５ Ａ１に記載するような化合物をさらに含む。１つの態様において、反応混合物は水溶液である。１つの態様において、本発明記載の分枝鎖三級アミンは、反応混合物中の唯一の三級アミンである。
「水溶液」は、本明細書において、水中に溶解された物質または液体化合物の均一な溶液である。水溶液はまた、有機溶媒を含むことも可能である。有機溶媒は当業者に知られ、例えばメタノール、エタノールまたはジメチルスルホキシドである。本明細書において、水溶液は最大５０％の有機溶媒を含むことも可能であることもまた、理解されるものとする。当業者に理解されるであろうように、用語、水溶液には、１つの態様において、粒子が分散された、１つの態様において均一に分散された、水溶液が含まれる。
ＥＣＬプロセス中のＥＣＬ標識に関与する種は、本明細書において、ＥＣＬ「共反応体」と称される。ＥＣＬに関して一般的に用いられる共反応体には、三級アミン（例えばトリプロピルアミン（ＴＰＡ））、シュウ酸塩および過硫酸塩が含まれる。当業者は、電気化学発光検出法に有用な、利用可能な共反応体を知っている。特定の態様にしたがって、本発明記載の共反応体は、分枝鎖三級アミンである。
用語「標識」は、本明細書において、可視的に検出可能であるか、または適切な計測手段を用いることによって検出可能であるか、いずれであっても、検出可能な電気化学発光シグナルを生じることが可能ないずれの物質を指す。本発明における使用に適した多様な標識には、電気化学発光化合物が含まれる。１つの態様において、標識は、上に明記するような遷移金属錯体または検出試薬である。
「電気化学発光アッセイ」または「ＥＣＬＡ」は、上に明記するような標識に連結された検出試薬への結合によって、そしてＥＣＬが生じるように誘導する（「発光の放出を電気化学的に誘発する」）ことによって、分析物分子が検出される、電気化学アッセイである。１つの態様において、電極は、化学標識の発光を電気化学的に開始する。さらなる態様において、ＥＣＬは、試薬組成物と接触している電極に、電圧を適用することによって、誘発される。ＥＣＬシグナルを検出するため、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物によって放出される光は、光検出装置によって測定され、結合した分析物分子／ターゲット分子複合体の存在または量を示す。ＥＣＬＡ法は、例えば、米国特許第５，５４３，１１２号；第５，９３５，７７９号；および第６，３１６，６０７号に記載される。正確でそして高感度の測定のため、異なる分析物分子濃度のためにシグナル調節を最大にすることも可能である。
１つの態様において、発光の放出の電気化学的な誘発は、トリプロピルアミンを共反応体として用いた匹敵する電気化学アッセイで用いられる測定電圧よりも、少なくとも０．１Ｖ低い、１つの態様において、少なくとも０．２Ｖ低い、さらなる態様において、少なくとも０．３Ｖ低い測定電圧の適用を含む。用語「匹敵する電気化学アッセイ」は、本明細書において、少なくとも本発明の電気化学アッセイと同じＥＣＬ試薬および同じ作用電極の使用を含む、電気化学アッセイに関する。１つの態様において、匹敵する電気化学アッセイは、共反応体が、本発明にしたがうと分枝鎖三級アミンであるが、匹敵する電気化学アッセイにしたがうとＴＰＡであることを除いて、本発明の電気化学アッセイと同じ工程および試薬を含む電気化学アッセイである。したがって、１つの態様において、発光の放出の電気化学的な誘発は、０．７Ｖ～１．６Ｖ、１つの態様において、０．８Ｖ～１．３Ｖ、さらなる態様において、０．９Ｖ～１．１Ｖの測定電圧の適用を含む。本発明にしたがって、別に記載しない場合、電位は、標準的Ａｇ／ＡｇＣｌ電極、１つの態様において、２５℃で飽和ＫＣｌを伴うＡｇ／ＡｇＣｌ電極に対して測定される。１つの態様において、本発明の反応電極と接触している電極は、作用電極とも称され、白金（＝Ｐｔ）、金（＝Ａｕ）、またはガラス状炭素を含むかまたはこれらからなり、１つの態様において、白金を含むかまたは白金からなる。したがって、さらなる態様において、発光の放出の誘発は、白金、金、またはガラス状炭素作用電極、１つの態様において、白金作用電極での、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に対する、０．８Ｖ～１．３Ｖ、さらなる態様において、０．９Ｖ～１．１Ｖの測定電圧の適用を含む。さらなる態様において、分枝鎖アミンはＤＩＢＰＡであり、そして発光の放出の誘発は、白金、金、またはガラス状炭素作用電極、１つの態様において、白金作用電極での、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に対する、０．８Ｖ～１．２Ｖ、さらなる態様において、０．８５Ｖ～１．１Ｖの測定電圧の適用を含む。さらなる態様において、分枝鎖アミンはＤＰＩＢＡであり、そして発光の放出の誘発は、白金、金、またはガラス状炭素作用電極、１つの態様において、白金作用電極での、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に対する、０．８Ｖ～１．２Ｖ、さらなる態様において、０．９Ｖ～１．１Ｖの測定電圧の適用を含む。
ＥＣＬＡ法において、検出試薬でコーティングされた微粒子を試料中に懸濁して、分析物に効率的に結合させ、そして／または結合した分析物の効率的な回収を可能にすることも可能である。例えば、粒子は、０．０５μｍ～２００μｍ、０．１μｍ～１００μｍ、または０．５μｍ～１０μｍの直径、および分析物分子と結合可能な表面構成要素を有することも可能である。１つの頻繁に用いられるＥＣＬＡシステム（Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ Ｄａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）において、微粒子は約３μｍの直径を有する。微粒子は、架橋デンプン、デキストラン、セルロース、タンパク質、有機ポリマー、スチレンコポリマー、例えばスチレン／ブタジエンコポリマー、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレンコポリマー、アクリル酸ビニルアセチルコポリマー、塩化ビニル／アクリル酸コポリマー、不活性無機粒子、二酸化クロム、鉄酸化物、シリカ、シリカ混合物、タンパク質性物質、またはその混合物で形成されてもよく、限定されるわけではないが、セファロースビーズ、ラテックスビーズ、シェルコア粒子等が含まれる。微粒子は、１つの態様において、単分散であり、そして磁性、例えば常磁性ビーズであることも可能である。例えば、米国特許第４，６２８，０３７号；第４，９６５，３９２号；第４，６９５，３９３号；第４，６９８，３０２号；および第４，５５４，０８８号を参照されたい。微粒子は、約１～１０，０００μｇ／ｍｌ、１つの態様において、５～１，０００μｇ／ｍｌの範囲の量で使用可能である。
「試料」は、本発明にしたがって用いられた際、ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の目的のために得られる。当業者が認識するであろうように、いずれのこうした評価は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。試料が患者試料である場合、その後、試料は廃棄される。１つの態様において、患者試料は、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法のみに用いられ、そして患者試料の材料は、患者の体内に戻されない。
本発明の態様を用いて、関心対象の分析物の存在または活性に関して、試料を試験することも可能である。こうした試料は、固形、エマルジョン、懸濁物、液体、または気体型であることも可能である。これらは、限定されるわけではないが、ヒトまたは動物が含有するかまたはこれらから得られる試料であることも可能であり、例えば、細胞（生存または死亡）および細胞由来産物、不死化細胞、細胞断片、細胞分画、細胞溶解物、細胞内小器官、細胞膜、ハイブリドーマ、細胞培養上清（抗体産生生物、例えばハイブリドーマ由来の上清を含む）、廃棄物または飲料水、食品、飲料、薬学的組成物、血液、血清、血漿、毛髪、汗、尿、糞便、便、唾液、組織、生検、流出液、分離されたおよび／または分画された試料、分離されたおよび／または分画された液体、臓器、植物、植物部分、植物副産物、土、水、給水設備、水源、液体からのろ過残渣（気体および液体）、スワイプ、吸収剤物質、ゲル、細胞骨格、未分画試料、未分画細胞溶解物、細胞核／仁、核分画、化学薬品、化学溶液、構造的生物学的構成要素、骨格（靭帯、腱）構成要素、分離されたおよび／または分画された骨格構成要素、毛髪部分および／または分離物、皮膚、皮膚試料、皮膚分画、真皮、内皮、真核細胞、原核細胞、真菌、酵母、免疫学的細胞、薬剤、療法薬剤、油、抽出物、粘膜、下水、環境試料、有機溶媒または空気であることも可能である。１つの態様において、試料はさらに、例えば水、アルコール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ－メチル－ピロリドン、メタノールまたは他の有機溶媒を含むことも可能である。
１つの態様において、試料は、細菌、古細菌、または真核生物の試料である。１つの態様において、試料は、哺乳動物、１つの態様において、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、モルモット、マウス、ラット、ネコ、イヌまたはヒトの試料である。さらなる態様において、試料はヒトの試料である。１つの態様において、試料は、体液、１つの態様において、唾液、血液、血漿、血清、または尿であり；１つの態様において、試料は細胞不含である。さらなる態様において、試料は、組織または臓器試料、あるいはそこから得られる抽出物である。
測定可能な分析物には、限定されるわけではないが、試料中に存在する、全細胞、細胞表面抗原、タンパク質複合体、細胞シグナル伝達因子および／または構成要素、二次メッセンジャー、二次メッセンジャーシグナル伝達因子および／または構成要素、細胞内小片（例えば細胞内小器官または膜断片）、ウイルス、プリオン、イエダニ（ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ）またはその断片、ウイロイド、免疫学的因子、抗体、抗体断片、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸（および合成類似体）、リボソーム、タンパク質（および合成類似体）、リポタンパク質、多糖、阻害剤、補因子、ハプテン、細胞受容体、受容体リガンド、リポ多糖、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、酵素基質、酵素産物、核酸プロセシング酵素（例えばポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、インテグラ―ゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、テロメラーゼ等）、タンパク質プロセシング酵素（例えばプロテアーゼ、キナーゼ、プロテインホスファターゼ、ユビキチン―タンパク質リガーゼ等）、細胞代謝産物、内分泌因子、パラクリン因子、自己分泌因子、サイトカイン、ホルモン、薬理学的剤、薬剤、療法薬剤、合成有機分子、有機金属分子、精神安定剤、バルビツール酸、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、組換えまたは派生タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、または無機分子が含まれる。
全細胞である分析物は、動物、植物、または細菌細胞であることも可能であり、そして生存していてもまたは死亡していてもよい。例には、植物病原体、例えば真菌および線虫が含まれる。用語「細胞内小片」は、例えば細胞内小器官、破壊された細胞からのような膜小片、細胞壁断片、リボソーム、多酵素複合体、および生存生物に由来しうる他の小片を含むよう意味される。核酸には、例えば、多数の供給源に由来する、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、および組換えＤＮＡが含まれる。核酸にはまた、ＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、およびトランスファーＲＮＡもまた含まれる。ポリペプチドには、例えば、酵素、輸送タンパク質、受容体タンパク質、および構造タンパク質、例えばウイルスコートタンパク質が含まれる。複数の態様において、ポリペプチドは、酵素および抗体である。特に、ポリペプチドは、モノクローナル抗体である。ホルモンには、例えば、インスリンおよびＴ４甲状腺ホルモンが含まれる。薬理学的剤には、例えば、心臓配糖体が含まれる。１つの態様において、化学的に生物学的材料に似ている合成物質、例えば、合成ポリペプチド、合成核酸、ならびに合成膜、小胞およびリポソームを含むことが、本発明の範囲内である。前述のものは、本発明で使用するために適した生物学的物質の包括的なリストであることは意図されず、本発明の広い範囲を例示することのみを意味する。
やはり典型的には、関心対象の分析物は、１０－３モルまたはそれ未満、例えば少なくとも１０－１８モルと同程度に低い濃度で存在する。
表現「関心対象の」は、分析または決定すべきありうる適切な分析物または物質を指す。
「固体支持体」としてもまた知られる「固相」は、検出試薬または他の試薬を固定するか、あるいはこれらが過剰な試薬、可溶性反応副産物、または溶媒から容易に分離される（ろ過、遠心分離、洗浄等によって）ことを可能にするように、（しばしばリンカーを通じて）これらを付着または共有結合させることが可能である、不溶性官能化ポリマー性物質である。本発明記載の方法のための固相は、当該技術分野に広く記載される（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ， Ｊ． Ｅ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２（２０００）４－２３を参照されたい）。用語「固相」は、非液体物質を意味し、そしてポリマー、金属（常磁性、強磁性粒子）、ガラス、およびセラミック；ゲル物質、例えばシリカ、アルミナ、およびポリマーゲルなどの材料から作製された粒子（微粒子およびビーズを含む）；ポリマー、金属、ガラス、および／またはセラミックで作製可能であるキャピラリー；ゼオライトまたは他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；ならびにキュベット、チューブ、チップまたは他の分光光度計試料容器を含む。アッセイの固相構成要素は、「固相」が、表面上に、検出試薬と相互作用するように意図される、少なくとも１つの部分を含有する点で、アッセイが接触しうる不活性固体表面とは区別される。固相は、定常の構成要素、例えばチューブ、ストリップ、キュベット、チップまたはマイクロタイタープレートであることも可能であるし、あるいは非定常構成要素、例えばビーズおよび微粒子であることも可能である。微粒子はまた、均一アッセイ形式のための固相としても使用可能である。タンパク質および他の物質の非共有または共有結合いずれかを可能にする、多様な微粒子が、使用可能である。こうした粒子には、ポリマー粒子、例えばポリスチレンおよびポリ（メチルメタクリレート）；金粒子、例えば金ナノ粒子および金コロイド；ならびにセラミック粒子、例えばシリカ、ガラス、および酸化金属粒子が含まれる。例えば、本明細書に援用される、Ｍａｒｔｉｎ， Ｃ．Ｒ．ら， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｎｅｗｓ ＆ Ｆｅａｔｕｒｅｓ （１９９８） ３２２Ａ－３２７Ａを参照されたい。
用語「チップ」、「バイオチップ」、「ポリマーチップ」または「タンパク質チップ」は、交換可能に用いられ、そしてシリコンウェハ、ナイロンストリップ、プラスチックストリップ、またはガラススライドの一部であることが可能な共有される支持体（例えば固相）上に配置された、多数のプローブ、マーカーまたは生化学マーカーのコレクションを指す。
方法：
１つの態様において、本発明は、電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを検出する方法であって
ａ）
ｉ）少なくとも１つの分枝鎖三級アミンおよび
ｉｉ）遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物
を含む反応組成物を、電極と接触させ、
ｂ）発光の放出を電気化学的に誘発し、そして
ｃ）ＥＣＬシグナルを検出する
工程を含む、前記方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、電気化学発光検出を通じて、試料中の分析物を検出するための方法であって：
ａ）試料を、遷移金属錯体を含む、１つの態様において、トリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋）を含む、電気化学発光基で標識された検出試薬とインキュベートし、
ｂ）分析物に結合したおよび分析物に結合していない標識検出試薬を分離し；
ｃ）分離した分析物に結合した標識検出試薬を、本発明の分枝鎖三級アミンと、そして電極と接触させ、
ｄ）発光の放出を電気化学的に誘発し、そして
ｅ）電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを検出し、それによって分析物を検出する
工程を含む、前記方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、電気化学発光検出を通じて、試料中の分析物を検出するための方法であって：
ａ）試料を、遷移金属錯体を含む、１つの態様において、Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２－を含む、電気化学発光基で標識された検出試薬とインキュベートし、
ｂ）分析物に結合したおよび分析物に結合していない標識検出試薬を分離し；
ｃ）本発明の方法にしたがってＥＣＬを検出し、該検出試薬は遷移金属錯体を含む化合物であり、そして
ｄ）工程ｃ）におけるＥＣＬ検出の結果に基づいて、分析物を検出する
工程を含む、前記方法に関する。
本発明の１つの側面は、本発明の試薬組成物に基づく改善されたＥＣＬ法、特に低い検出限界を特徴とするＥＣＬ法に関する。本発明の分枝鎖三級アミンを含む試薬組成物は、驚くべきことに、系のバックグラウンドを劇的に減少させることが可能である。より具体的には、本発明の方法は、ＥＣＬ標識の非存在下で、バックグラウンド電気化学発光を減少させることによって、低い検出レベルで、改善された感度を提供する。
本発明者は、驚くべきことに、ＥＣＬ反応における共反応体として、分枝鎖三級アミン群の特定の化合物を使用すると、いくつかの利点、例えば前記化合物の酸化電位の減少、およびＥＣＬ検出法における改善されたシグナル／バックグラウンド（Ｓ／ＢＧ）比、そしてしたがって、改善されたＥＣＬアッセイ性能が提供されることを発見した。
本発明の特徴は、電気化学発光標識を用いて、調べるべき試料中の分析物を決定するための方法であり、ここで、電気化学発光現象を測定するため、以下の列挙する方法の１つを使用する。
驚くべきことに、分枝鎖三級アミン群より選択される化合物を用いる方法は、これらの化合物を伴わない慣用的な試験試薬よりもより少ないバックグラウンド発光を放出する。これは、シグナル対バックグラウンド比（＝シグナル対ノイズ比）の増加が感度を非常に改善させる、低検出レベルで、特に好適である。驚くべきことに、本発明者は、本発明記載の方法を用いて電気化学発光検出を実行すると、ＥＣＬ検出の改善されたシグナル対ノイズ比が生じることを見出している。
本発明にしたがって、電気化学発光検出を通じて、試料中の分析物を測定するための方法を実行可能であり、１つの態様において、これは、水溶液中である。
１つの態様において、方法において用いる分枝鎖三級アミンは、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミン（ＤＰＩＢＡ）、Ｎ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－Ｎ－プロピルアミン（ＤＩＢＰＡ）、またはＮ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｎ－エチルアミン（ＤＩＥＡ）からなる群より選択され、１つの態様においてＤＰＩＢＡまたはＤＩＢＰＡであり、さらなる態様においてＤＰＩＢＡであり、さらなる態様においてＤＩＢＰＡである。
疑念を回避するため、１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、１，４－ピペラジン－ビス（エタン－スルホン酸）、１－ピペリジンエタノール、１，４－ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン、トリイソプロピルアミン、またはジブチルエタノールアミンではない。
１つの態様において、分枝鎖三級アミンは、少なくとも５０ｍＭ（すなわち５０ｍｍｏｌ／ｌ）の濃度、さらなる態様において、最大５００ｍＭの濃度、さらなる態様において、５０ｍＭ～５００ｍＭの濃度、さらなる態様において、７５ｍＭ～３５０ｍＭの濃度、さらなる態様において、１００ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で、該方法において用いられる。
１つの態様において、本発明記載の方法は、関心対象の試料において、生体分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、ホルモン、ペプチド（ｐｅｔｉｄ）ホルモン、ビタミン、プロビタミン、ビタミン代謝産物、およびアミノ酸を検出するために特によく適している。さらなる態様において、本発明記載の方法は、ステロイド、薬剤、および療法剤のさらなるクラス由来の生体分子を検出するために特によく適している。
本発明記載の方法で用いられる試料は、１つの態様において、液体試料、例えば全血、血清または血漿である。試料、またはより具体的には関心対象の試料は、１つの態様において、いずれの体液および便を含むことも可能である。１つの態様において、試料は、唾液、糞便抽出物、尿、全血、血漿または血清のような液体試料であろう。１つの態様において、試料は、全血、血漿または血清であろう。
当業者は、１つの態様において、本発明の方法におけるすべての工程は、同じ位置において、例えば同じ反応容器において実行可能であることを知っている。前記工程はまた、制御手段によって制御される自動化プロセスでも実行可能である。
非特異的試料構成要素および分析物不含標識検出試薬は、分離プロセスにおいて除去可能である。例えば、分析物に結合したおよび分析物に結合していない標識検出試薬は、洗浄工程を用いて分離可能である。次いで、分析物に結合した標識検出試薬をインキュベートして、方法のＥＣＬ検出を実行する。
分析物の電気化学発光検出を補助する他の試験化合物もまた、本発明記載の方法で使用可能である。
三級アミンによって生じるバックグラウンド（ＢＧ）は、その酸化のために適用される電圧の指数関数であることが本発明者により見出されてきている。さらに、本発明者は、分枝鎖三級アミンが、非分枝類似体、特にトリプロピルアミン（ＴＰＡ）に比較した際、有意により低い酸化電位を示すことを見出した。したがって、本発明者は、分枝鎖三級アミンを用い、電気化学発光検出を通じて、試料中の分析物を測定するための方法は、減少した酸化電位しか必要とせず、ＥＣＬ検出におけるシグナル対ノイズ比（Ｓ／ＢＧ比）を改善することを見出した。１つの態様において、Ｓ／ＢＧ比は、少なくとも１．２倍、さらなる態様において、少なくとも１．４倍、改善される。さらに、改善効果は、イリジウム標識を用いることによって、さらに増進可能であることが見出された。試薬組成物中の分枝鎖三級アミンおよびイリジウム標識の集積効果は、ＥＣＬ検出において、少なくとも１．３倍の改善されたＳ／ＢＧ比を導く。さらに、本発明記載のＥＣＬ反応は、より低い電圧で実行可能であるため、作用電極における消耗もまた減少する。
１つの態様において、本発明は、電気化学発光検出を通じて、試料中の分析物を測定するための方法であって、ａ）試料を、電気化学発光基で標識された検出試薬とインキュベートし、ｂ）分析物に結合したおよび分析物に結合していない標識検出試薬を分離し、ｃ）ｉ）共反応体としての少なくとも１つの分枝鎖三級アミン、およびｉｉ）Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２－を含む試薬組成物と、分離した標識検出試薬をインキュベートし、ｄ）発光の放出を電気化学的に誘発し、そしてｅ）電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを決定し、それによって分析物を測定する工程を含む、前記方法に関する。
１つの態様において、本発明の方法は、試薬組成物が、さらに、界面活性剤および／または緩衝剤を含むことで特徴付けられる。
１つの態様において、本発明の方法は、試薬組成物が、さらに、塩および／または消泡剤を含むことで特徴付けられる。
１つの態様において、本発明は、電気化学発光アッセイを実行するための方法であって、電気化学発光が、本発明記載の試薬組成物の存在下で誘導される、前記方法に関する。
ＥＣＬイムノアッセイのための典型的なＥＣＬ測定プロセスは、ＥＣＬ測定セル（例えばフローセル）における液体および／または混合物の多数の交換を含む。１つの態様において、典型的なＥＣＬ測定プロセスは、以下に説明するいくつかの工程からなる。
当業者は、ＥＣＬ測定セルが、１つの態様において、前記ＥＣＬ測定セルを、本発明記載の試薬組成物および電位のさらなる適用でリンスすることによって、ＥＣＬ検出工程実行前に条件付けされるかまたは再生されることを知っている。この工程は、１つの態様において、ＥＣＬを用いて分析物を決定するプロセスの１つの部分である。この条件付け工程中に、ＥＣＬ測定セルにおける分析物測定中のシグナル生成を補助する、測定電極（単数または複数）の表面上に層が形成されることが、ＥＰ １ ０５１ ６２１に記載されてきている。
ＥＣＬ測定プロセスの１つの態様において、試薬混合物が、清浄化され、そして条件付けされたＥＣＬ測定セル内に、ＥＣＬ測定セル空洞内への液体流入チャネルを通じて導入され、ここで、前記混合物は、試料、試薬および磁気粒子の構成要素を含む。測定セル内に導入された前記混合物は、前記混合物の前および後に流入する、本発明記載の試薬組成物によって取り巻かれていることも可能である。
１つの態様において、こうしたＥＣＬイムノアッセイにおいて、電気化学発光基で標識され、そして分析のために特徴的である錯体分子を含む検出試薬は、特異的生化学的結合パートナー対、例えばストレプトアビジンおよびビオチンによって、これらの磁気粒子に結合される。磁気粒子は、例えば、ストレプトアビジン―ポリマーでコーティングされ、一方、ビオチンは錯体分子に結合する。
１つの態様において、ＥＣＬ測定セルにおいて、磁気粒子は、電極近傍に配置された磁石の磁場において、該粒子に結合した標識錯体分子とともに、前記電極表面に捕捉される。混合物の連続流動中に、磁場を適用し、それによって、インキュベートおよび／または試薬組成物は、液体流出チャネルを通じて、ＥＣＬ測定セル空洞から排出される。
磁気粒子を捕捉した後、次の工程において、ＥＣＬ共反応体を含有する本発明記載の試薬組成物を、ＥＣＬ測定セル内に導入し、それによって、前記試薬組成物によって、磁気粒子を洗浄する。この洗浄工程は、電気化学反応と潜在的に干渉しうる前記インキュベート物の未結合構成要素を、電極から除去するためのものである。１つの態様において、洗浄工程はまた、磁気粒子と本発明記載の試薬組成物を接触させる前に、例えば洗浄緩衝液で実行することも可能である（前洗浄法）。
その後、電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルの放出は、電位の適用によって電気化学的に誘発され、それによって、光センサーによって発光の強度が検出され、そしてこれを電極表面に位置する磁気粒子上の標識錯体分子の濃度に関する測定値として評価することも可能であり、それによって、この濃度は再び、試料中の分析物濃度に関する測定値として働く。
電気化学発光検出後、ＥＣＬ測定セルを、通常、クリーニング液でリンスする。
電気化学発光によって、検出法を実行するための装置は、実施例セクション（実施例２、３、および４）に言及されるか、またはＥＰ １ ８９２ ５２４（Ａ１）に記載される。さらに、こうした装置は、測定ユニットおよび／または液体容器の温度を調節するための手段を含むことも可能である。測定ユニットは、電気化学発光を測定するセルであると理解される。液体容器は、保存容器であることも可能であるが、供給デバイス；例えば測定中に測定ユニット中に包含される、試薬溶液用のチューブであることも可能である。
組成物：
本発明の側面は、ＥＣＬシグナル生成のための改善された試薬組成物、特に増進されたシグナル対ノイズ比（Ｓ／ＢＧ比）を導くものに関する。より具体的には、本発明の試薬組成物は、ＥＣＬ標識の非存在下で、バックグラウンド電気化学発光を減少させることによって、低い検出レベルで、改善された感度を提供する。驚くべきことに、分枝鎖三級アミンを含む試薬組成物は、これらの化合物を含まない慣用的な試験試薬よりも、より低いバックグラウンド発光を放出する。これは、シグナル対バックグラウンド比（＝シグナル対ノイズ比）の増加が感度を非常に改善させる、低検出レベルで、特に好適である。この改善された試薬組成物は、分枝鎖三級アミン群由来の化合物、ならびに場合によるさらなるＥＣＬ補助試薬を含有する。驚くべきことに、本発明者は、本発明記載の試薬組成物を用いて電気化学発光検出を実行すると、本明細書において上に明記するようにＥＣＬ検出の改善されたシグナル対ノイズ比（Ｓ／ＢＧ比）が生じることを見出した。
本発明の側面は、電気化学発光アッセイにおいて、高いシグナル対バックグラウンド比を生じる試薬組成物に関する。特異的シグナルおよびバックグラウンドシグナルの間のシグナル相違が増加する。こうした改善された特性は、ＥＣＬ共反応体、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤およびｐＨの好適な組み合わせの同定を通じて、そして特に共反応体として分枝鎖三級アミンの使用を通じて、達成されてきている。
試薬組成物は、ＥＣＬ標識がＥＣＬを放出するように効率的に誘導するために、そしてＥＣＬ測定を通じて、ＥＣＬ標識を高感度に測定するために、適切な環境を提供する。本発明の試薬組成物は、場合によって、保存剤、界面活性剤、消泡剤、ＥＣＬ活性種、塩、ｐＨ調節のための酸性および塩基性化合物（緩衝剤）、金属イオンおよび／または金属キレート剤を含むさらなる構成要素を場合によって含むことも可能である。本発明の試薬組成物にはまた、ＥＣＬ標識で標識されていることも可能である、生物学的アッセイの構成要素も含まれることが可能であり、これは、いくつかの場合、結合試薬、酵素、酵素基質、補因子、および／または酵素阻害剤を含む。本発明にはまた、本発明の試薬組成物、および場合によってさらなるアッセイ構成要素を含む、アッセイ試薬、組成物、キット、システムおよびシステム構成要素も含まれる。本発明にはまた、本発明の試薬組成物を用いてＥＣＬアッセイを実行するための方法も含まれる。
１つの態様において、本発明は
ｉ）共反応体としての分枝鎖三級アミン、および
ｉｉ）場合によるさらなるＥＣＬ試薬
を含む、ＥＣＬを検出するための試薬組成物に関する。
分枝鎖三級アミンの定義および態様を本明細書の別の箇所に提供する。１つの態様において、試薬組成物の分枝鎖三級アミンは、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミン（ＤＰＩＢＡ、表１の化合物番号２５）、Ｎ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－プロピルアミン（ＤＩＢＰＡ、表２の化合物番号４３）、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピル－エチルアミン（ＤＩＥＡ、ＣＡＳ ７０８７－６８－５、表２の化合物番号３２）からなる群より選択される。さらなる態様において、分枝鎖三級アミンは、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミンまたはＮ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－プロピルアミンである。さらなる態様において、分枝鎖三級アミンはＮ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－プロピルアミンである。
１つの態様において、分枝鎖三級アミン濃度は、場合によって、例えば実施例に示すような、ＥＣＬ増進効果のために最適に選択される。試薬組成物または反応組成物中の分枝鎖三級アミンの最適な濃度を決定する方法が、当業者に知られる。
１つの態様において、試薬組成物は、５０ｍＭ～５００ｍＭの濃度で分枝鎖三級アミンを含む。さらなる態様において、試薬組成物は、７５ｍＭ～３５０ｍＭの濃度で分枝鎖三級アミンを含む。さらなる態様において、試薬組成物は、１００ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で分枝鎖三級アミンを含む。当業者には、試薬組成物をストック溶液として提供する場合、前記ストック溶液は、反応組成物を得るために希釈が必要である可能性があり、そしてこうしたストック溶液の構成要素の濃度は、意図される希釈係数にしたがって調節可能であることが、理解されるであろう。したがって、前述の濃度は、１つの態様において、反応組成物中の分枝鎖三級アミンの最終濃度である。
１つの態様において、本発明の試薬組成物は、さらなるＥＣＬ試薬を含む。本明細書において、用語「ＥＣＬ試薬」には、ＥＣＬ補助試薬、ならびに本明細書の別の箇所に明記するような、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物が含まれる。ＥＣＬ補助試薬は、原則として、当業者に知られる。１つの態様において、ＥＣＬ補助試薬は、保存剤、緩衝化合物、界面活性剤、無機塩、特にハロゲン化ナトリウム、または消泡剤、あるいはその任意の組み合わせである。１つの態様において、ＥＣＬ補助試薬は、カルボキサミドまたはアミドであるかまたはこれらを含む。用語「カルボキサミド」は、１つの態様において、ＷＯ ２０１２／０５５８１５ Ａ１に記載されるカルボキサミドに関し、１つの態様において、場合によってハロゲン化されたアセトアミド、プロパンアミド、またはブチルアミドに関し、さらなる態様において、プロパンアミドである。
試薬組成物を保存する際には、微生物増殖を防止する保存剤を含むことが有益である可能性もある。さらに、細菌および真菌増殖を制御して、試薬組成物の長期保存および使用を可能にする、適切な保存剤が同定されている。本発明記載の試薬組成物は、さらに、１またはそれより多い保存剤を含有することも可能である。本発明の態様において、試薬組成物は、本明細書の別の箇所に明記するような保存料（保存剤）を含む。
１つの態様において、試薬組成物は、さらに界面活性剤を含む。本発明記載の試薬組成物に適した界面活性剤は、ポリ（エチレングリコール）エーテル、例えばポリドカノールまたは式ＣＸＥＯＹ、式中、Ｘ＝８～１８であり、そしてＹ＝２～９である、の他のポリ（エチレングリコール）エーテルを含む脂肪酸アルコールエトキシレート、ゲナポール（イソトリデシルポリ（（エチレングリコールエーテル）ｎ）、プランタレン（登録商標）（アルキルポリグルコシド）、オクチルグルコシド（オクチル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド）ならびにＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３～１２のような双性イオン性界面活性剤、またはその混合物からなる群由来のものである。界面活性剤は、０．０１％～２％の間の範囲の濃度で用いられる。最適濃度は、各界面活性剤に関して容易に決定可能である。最も適切な濃度は、０．０５％～１％の間の範囲のものである。１つの態様において、本発明記載の試薬組成物は、ポリドカノールまたは式ＣＸＥＯＹ、式中、Ｘ＝８～１８であり、そしてＹ＝２～９である、の他のポリ（エチレングリコール）エーテル、オクチルグルコシド（オクチル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド）またはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３～１２のような双性イオン性界面活性剤、あるいはその混合物からなる群より選択される界面活性剤を含む。１つの態様において、試薬組成物は、ポリドカノール、オクチルグルコシド（オクチル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド）およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３～１２またはその混合物からなる群より選択される界面活性剤を含む。
さらに、１つの態様において、電気化学発光シグナルはまた、ｐＨを６．０～８．０の間、１つの態様において、６．０～７．５の間、１つの態様において、６．２～６．９の間に調節することによって、増加させることも可能である。これは、慣用的に、当業者に知られる、この範囲に適したｐＨ緩衝剤を用いることによって、実行可能である。１つの態様において、試薬組成物に適した緩衝剤は、ＫＯＨおよびリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を含み；１つの態様において、緩衝剤はリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム緩衝剤であり、１つの態様において、リン酸カリウム緩衝剤である。
さらに、シグナルは、例えばＮａＢｒ、ＮａＣｌ、ＮａＪのような無機塩を含む塩を添加することによって増加させうる。塩、特にＮａＣｌは、１ｍＭ～１Ｍの間の範囲、１つの態様において、１０ｍＭ～１００ｍＭ、さらなる態様において、１０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で添加される。
特にＨＴＳ適用においては、バブルまたは泡の産生を回避することが有益でありうる。このため、試薬組成物に消泡剤を添加することが望ましい可能性もある。多くの商業的消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍｓ о－３０、Ａｎｔｉｆｏｒｍ ２０４、Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ ＳＥ－１５、Ａｎｔｉｆｏａｍ ＳＯ－２５およびＡｎｔｉｆｏａｍ ２８９を含む）を、本発明記載の試薬組成物に添加することも可能である。
本発明の試薬組成物にはさらに、本明細書の別の箇所に明記するような、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物が含まれることも可能である。遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物は、慣用的なＥＣＬ標識であることも可能である。ＥＣＬ標識の例には、トリス－ビピリジル―ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）および他の有機金属化合物が含まれ、この場合、金属は、例えばＲｅ、Ｒｕ、ＩｒおよびＯｓを含むＶＩＩおよびＶＩＩＩ族の金属由来である。これらのＥＣＬ標識は電気化学発光基で、分析物特異的試薬を標識するか、または電気化学発光基で分析物自体を標識するために、当業者に用いられる。１つの態様において、本発明の試薬組成物は、本明細書の別の箇所に明記するような、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物で標識された分析物および／または遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物で標識された分析物特異的試薬を含有する。
試薬組成物中で用いられる試薬およびその混合物は、使用前に、液体、凍結、急速凍結、蒸発凍結、凍結乾燥、気体、固形または乾燥型のいずれで提供されることも可能である。試薬組成物の使用前に、試薬は、１つの態様において、溶媒に、１つの態様において、水に溶解される。
本発明の試薬組成物は、特に、高感度アッセイにおいて価値がある。本発明のいくつかの態様において、ＥＣＬアッセイの性能は、電極組成と試薬組成の最適な組み合わせを通じて、さらに改善される。１つの態様において、本発明の手段および方法と組み合わせて使用するためのＥＣＬ電極は、Ａｕ、Ｉｒ、Ｐｔまたは炭素を含むかまたはこれらからなり、１つの態様において、ホウ素ドープダイヤモンド電極を含む。
反応組成物：
ＥＣＬの決定のため、本発明記載の試薬組成物をさらなる化合物と混合して、反応組成物を形成することも可能である。１つの態様において、本発明は、ｉ）遷移金属錯体を含む少なくとも１つのＥＣＬ化合物、ｉｉ）共反応体としての少なくとも１つの分枝鎖三級アミンを含む、ＥＣＬを決定するための反応組成物に関する。１つの態様において、反応組成物は、さらに分析物を含む。
１つの態様において、本発明は、ｉ）遷移金属錯体を含む少なくとも１つのＥＣＬ化合物、ｉｉ）共反応体としての少なくとも１つの分枝鎖三級アミン、ｉｉｉ）分析物、およびｉｖ）少なくとも１つの分析物特異的試薬を含む、ＥＣＬ反応組成物に関する。
当業者に理解されるであろうように、遷移金属錯体を含む少なくとも１つのＥＣＬ化合物、および少なくとも１つの分析物特異的試薬は、共有結合されていてもよく、すなわち組み合わされて検出試薬であることも可能である。しかし、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物が分析物特異的試薬に特異的に結合する剤に結合することもまた想定される。当業者に認識されるであろうように、１つの態様において、前述の反応組成物は、反応混合物から、遷移金属錯体を含む非特異的に結合したＥＣＬ化合物を除去した後の組成物である。
さらなる態様において、反応組成物は、ｉ）分析物または分析物の構造類似体に共有カップリングした、遷移金属錯体を含む少なくとも１つのＥＣＬ化合物、ｉｉ）共反応体としての少なくとも１つの分枝鎖三級アミン、およびｉｉｉ）分析物を含む、ＥＣＬを決定するための反応組成物である。
１つの態様において、前述の反応組成物は、上に明記するような、少なくとも１つのさらなるＥＣＬ補助試薬をさらに含む。
使用：
本発明の１つの側面は、電気化学発光検出法を実行するための、分枝鎖三級アミン、本発明の試薬組成物、または本発明の反応組成物の使用に関する。
キット：
本発明の１つの側面は、１またはそれより多い容器中に、本明細書で上に明記するような分枝鎖三級アミンおよびＥＣＬ試薬を含む、キットに関する。構成要素を、場合によってさらなる試薬と組み合わせて、本発明の試薬組成物または反応組成物を形成することも可能である。キットはまた、１つの態様において、さらなるアッセイ関連構成要素、例えば希釈剤、洗浄溶液、タンパク質変性試薬、１またはそれより多い酵素、結合試薬、アッセイプレート、消耗品、電極等も含むことも可能である。
用語「キット」は、本明細書において、一緒にパッケージングされていてもまたはされていなくてもよい、本発明の前述の化合物、手段または試薬のコレクションを指す。キットの構成要素は別個のバイアルに含まれていてもよいし（すなわち別個の部分のキットとして）、または単一バイアル中で提供されてもよい。さらに、本発明のキットは、１つの態様において、本明細書で上に言及する方法を実施するために使用されるものと理解されるものとする。１つの態様において、すべての構成要素は、上に言及する方法を実施するために、すぐに使える方式で提供される。さらに、キットは、１つの態様において、前記方法を実施するための指示を含有する。指示は、紙または電子形式の使用者マニュアルによって提供されることも可能である。さらに、マニュアルは、本発明のキットを用いて、前述の方法を実施した際に得られる結果を解釈するための指示を含むことも可能である。
１つの態様において、キットの化学的剤は、適切な保存および使用に関する内容物および指示に関する情報を適切に表示された、１またはそれより多いガラスまたはプラスチック容器内に含有される。内容物、ロット番号、製造日、推奨使用期限、適切な保存および使用に関する指示に関連することも可能であるさらなる情報は、また、ガラスまたはプラスチック容器上に配置されたＲＦＩＤチップ上に保存されることも可能である。こうしたＲＦＩＤチップ上に保存された情報は、ＲＦＩＤ読み取りデバイスに連結されたアンテナによって読み取り可能であり、そしてさらに、制御手段においてプロセシングされることも可能である。
１つの態様において、試薬組成物の構成要素のいくつかまたはすべてが、１つの態様において、液体または乾燥状態で保存されることも可能である。
１つの態様において、本発明は、本明細書で上に明記するようなＥＣＬを決定するための試薬組成物を含む、ＥＣＬを測定するためのキットに関する。
以下の実施例および図は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は、態様および請求項に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示す方法に修飾を行いうることが理解される。
デバイス：
本発明のさらなる側面は、本明細書において上に明記するような、分枝鎖三級アミンを含むＥＣＬデバイスに関する。
用語「デバイス」は、本明細書において、ＥＣＬを検出するために適応された手段のシステムに関し、検出結果が得られることを可能にするように、前記デバイスに機能可能であるように連結された少なくとも前述の手段をさらに含む。分枝鎖三級アミンを本発明のデバイスに機能可能であるように連結するための典型的な手段は、１つの態様において、測定チャンバー内への前記分枝鎖三級アミンの輸送を仲介するポンプに連結された容器である。作動する方式で手段を連結する方法は、デバイスに含まれる手段のタイプに応じるであろう。１つの態様において、手段は、単一デバイスに含まれる。
１つの態様において、デバイスは、試料のための容器を含む、試料処理ユニットを含む。容器は、試料に直接接触することも可能であるし、または試料を受け入れるさらなる手段のための容器であることも可能であり、ここでさらなる手段は、例えばマルチウェルプレートであることも可能であり、該プレートに、試料または多数の試料を適用することも可能である。さらに、試料処理ユニットは、１つの態様において、例えば乾燥型で、または投薬手段に連結されたリザーバー、例えばポンプに連結されたチュービング中に、分枝鎖三級アミンを含む。１つの態様において、試料処理ユニットは、例えば乾燥型で、または投薬手段に連結されたリザーバー、例えばポンプに連結されたチュービング中に、遷移金属錯体を含む少なくとも１つのＥＣＬ化合物を含む。さらなる態様において、試料処理ユニットは、混合手段および反応混合物の温度を調節するための手段を含む。場合によって、試料処理ユニットは、非特異的に結合した、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物および／または結合剤を除去するための洗浄手段を含むことも可能である。
１つの態様において、検出結果は、使用者による視覚的検査によって、または適切なデバイス上で検出測定を実行することによって、デバイスの分析ユニットで得られうる。１つの態様において、本発明のデバイスの分析ユニットは、本発明記載のＥＣＬを検出するための検出ユニットをさらに含む。本発明記載の検出ユニットとして適切な手段が当業者に知られ、そしてこれには、例えば光測定デバイス、特に発光測定デバイスが含まれる。
１つの態様において、本発明のデバイスは、検出ユニットに連結されたデータ出力ユニットをさらに含む。データ出力ユニットは、１つの態様において、検出ユニットによって得られた出力データに適応している。適切なデータ出力ユニットは、当業者に知られ、そしてこれには、検出閾値を超えるＥＣＬが検出されたことを示す、インディケーターランプまたはディスプレイなどの単純な出力ユニットが含まれる。しかし、出力ユニットはまた、評価デバイスに対するインターフェースであることも可能であり、ここで、前記インターフェースは、例えばＵＳＢのようなケーブル連結、ワイヤレスＬＡＮ、ブルートゥース等のようなワイヤレス連結、またはインスタントメッセージ、電子メール等によるデータトランスファーなどの間接的連結を含む、いずれの種類のデータトランスファー手段であることも可能である。
１つの態様において、本発明のデバイスは、分析システムの一部であり、前記分析システムはさらに、評価デバイスを含む。当業者に理解されるであろうように、評価デバイスは、本発明のデバイスと、例えば評価ユニットと、同じ筐体に含まれることも可能であるし、または別個のデバイスであることも可能である。１つの態様において、評価デバイスは、本発明のデバイスの出力ユニットから出力データを受け入れ、そして前記出力データの評価を提供する論理演算を実行するようにプログラミングされたマイクロプロセッサを含む。出力データの評価は、例えば１またはそれより多いコントロール検出反応、統計計算、例えば２またはそれより多い平行検出反応の計算手段において測定された値に関して、データを修正し、希釈因子に関してデータを修正し、出力データを参照値に対して比較し、データをリストにコンパイルする等の工程を含むことも可能である。１つの態様において、評価デバイスは、データ保存ユニットをさらに含む。さらなる態様において、前記データ保存ユニットは、例えば参照値データベース中に、参照値を含む。さらに、１つの態様において、データ保存ユニットは、上に明記するような、本発明のデバイスから受け取った出力データを保存するよう適応されている。
１つの態様において、ＥＣＬを自動的に検出するための手段を適用した場合、前記の自動的に作動する手段によって得たデータは、診断を確立するために、例えばコンピュータプログラムによってプロセシング可能である。検出のための典型的な手段は、上記の本発明の方法に関連する態様と関連して開示される。こうした場合、手段は、システムの使用者が、ＥＣＬの決定結果およびその診断値を、マニュアルに提供される指示および解釈によってまとめる点で、操作的に関連付けられる。当業者は、さらなる発明的技術を伴わずに、手段を連結する方法を知っているであろう。典型的なデバイスは、専門臨床医の特定の知識を伴わずに適用可能なものであり、例えば単に試料を装填すればよい試験ストリップまたは電子デバイスである。結果は、パラメータ診断生データの出力として、１つの態様において、絶対または相対量として、提供されうる。これらのデータは、臨床医による解釈が必要であろうことが理解されるものとする。しかし、やはり想定されるのは、出力が、その解釈に専門臨床医を必要としない、プロセシングされた診断生データを含む、エキスパートシステムデバイスである。
上記を考慮して、以下の態様が特に想定される：
１． 電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを検出する方法であって
ａ）
ｉ）少なくとも１つの分枝鎖三級アミンおよび
ｉｉ）遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物
を含む反応組成物を、電極と接触させ、
ｂ）発光の放出を電気化学的に誘発し、そして
ｃ）ＥＣＬシグナルを検出する
工程を含む、前記方法。
２． 前記分枝鎖三級アミンが、式（Ｉ）
Figure 0007039481000018
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つ、１つの態様において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の１または２は、独立に、式（ＩＩ）
Figure 0007039481000019
式中、
ｍは０、１、または２、１つの態様において、０または１であり；
Ｒ４はアルキル、１つの態様において、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキル、さらなる態様において、エチルまたはメチル、別の態様において、メチルであり、
Ｒ５はアルキル、１つの態様において、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキル、別の態様において、エチルまたはメチル、１つの態様において、メチルである、
に記載の独立に選択される側鎖であり、
そして式中、残基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立に、アルキルより選択され、さらなる態様において、独立に、直鎖アルキルより選択され、別の態様において、独立に、ｎ－ペンチル、ｎ－ブチル、ｎ－プロピル、エチルおよびメチルからなる群より選択され、１つの態様において、独立に、ｎ－プロピル、エチル、およびメチルより選択される
の一般構造を有する、態様１の方法。
３． 式（ＩＩ）にしたがって選択されない残基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つが、直鎖アルキルであり、１つの態様において、ｎ－ペンチル、ｎ－ブチル、ｎ－プロピル、エチルまたはメチルからなる群より選択され、さらなる態様において、プロピル、エチル、またはメチルである、態様１または２の方法。
４． 前記分枝鎖三級アミンが、表１～４のいずれか１つの化合物１～１２２の１つである、態様１～３のいずれか１つの方法。
５． 前記分枝鎖三級アミンが、表１～３のいずれか１つの化合物１～８３の１つである、態様１～４のいずれか１つの方法。
６． 前記分枝鎖三級アミンが、表１または２の化合物１～７５の１つである、態様１～５のいずれか１つの方法。
７． 前記分枝鎖三級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミン（ＤＰＩＢＡ）、Ｎ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－Ｎ－プロピルアミン（ＤＩＢＰＡ）、またはＮ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｎ－エチルアミン（ＤＩＥＡ）であり、１つの態様において、ＤＰＩＢＡまたはＤＩＢＰＡであり、さらなる態様において、ＤＰＩＢＡであり、さらなる態様において、ＤＩＢＰＡである、態様１～６のいずれか１つの方法。
８． 前記分枝鎖三級アミンが、トリイソプロピルアミンではない、態様１～７のいずれか１つの方法。
９． 前記電極が、Ａｕ、Ｉｒ、Ｐｔまたは炭素を含むかまたはこれらからなり、１つの態様において、ホウ素ドープダイヤモンド電極またはガラス状炭素電極であり；１つの態様において、白金、金またはガラス状炭素を含むかまたはこれらからなり、１つの態様において、白金を含むかまたは白金からなる、態様１～８のいずれか１つの方法。
１０． 発光の放出の前記の電気化学的誘発が、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に対する作用電極での０．８Ｖ～１．３Ｖ、１つの態様において、０．９Ｖ～１．１Ｖの電位の適用を含む、態様１～９のいずれか１つの方法。
１１． 前記遷移金属錯体が、ルテニウムイオン、イリジウムイオン、レニウムイオン、オスミウムイオン、ユーロピウムイオン、テルビウムイオン、およびジスプロシウムイオンの少なくとも１つを含み；１つの態様において、前記遷移金属錯体がルテニウムイオンを含むかまたはイリジウムイオンを含み、さらなる態様において、イリジウムイオンを含む、態様１～１０のいずれか１つの方法。
１２． 遷移金属錯体を含む前記化合物が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋、Ｒｕ（ｂｐｙ）２－ｂｐｙＣＯ－ＯＳｕ）、スルホ－ＢＰＲｕ ＮＨＳエステル、ＢＰＲｕＵＥＥＫ－スベレート－ＯＳｕ、ＢＰＲｕ－（ＵＥ）－２５－Ｋ－スベレート－ＯＳｕ、ＢＰＲｕ２－ＳＫ２－スベレート－ＯＳｕ、４，４’，５’，５－テトラメチルビピリジンＲｅ（Ｉ）（４－エチルピリジン）（ＣＯ）３ ＋ＣＦ３ＳＯ３ －、Ｐｔ（２－（２－チエニル）ピリジン）２、Ｉｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－２－（カルボキシエチル－フェニル）ピリジン－２－カルボン酸エステル、およびその親水性誘導体からなるリストより選択される、態様１～１１のいずれか１つの方法。
１３． 遷移金属錯体を含む前記化合物が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋、Ｒｕ（ｂｐｙ）２－ｂｐｙＣＯ－ＯＳｕ、スルホ－ＢＰＲｕ ＮＨＳエステル、Ｉｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－２－（カルボキシエチル－フェニル）ピリジン－２－カルボン酸エステル、またはその親水性誘導体からなるリストより選択され、１つの態様において、Ｉｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－２－（カルボキシエチル－フェニル）ピリジン－２－カルボン酸エステルである、態様１～１２のいずれか１つの方法。
１４． 前記反応組成物が、ＥＣＬ補助試薬をさらに含む、態様１～１３のいずれか１つの方法。
１５． 電気化学発光検出を通じて、試料中の分析物を検出するための方法であって：
ａ）試料を、遷移金属錯体を含む、１つの態様において、トリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋）を含む、電気化学発光基で標識された検出試薬とインキュベートし、
ｂ）分析物に結合したおよび分析物に結合していない標識検出試薬を分離し、
ｃ）分離した分析物に結合した標識検出試薬を、態様１～８のいずれか１つに明記するような分枝鎖三級アミンおよび電極と接触させ、
ｄ）発光の放出を電気化学的に誘発し、そして
ｅ）電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを検出し、それによって分析物を検出する
工程を含む、前記方法。
１６． 電気化学発光検出を通じて、試料中の分析物を検出するための方法であって：
ａ）試料を、遷移金属錯体、１つの態様において、Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋を含む、電気化学発光基で標識された検出試薬とインキュベートし、
ｂ）分析物に結合したおよび分析物に結合していない標識検出試薬を分離し；
ｃ）態様１～１２のいずれか１つの方法にしたがってＥＣＬを検出し、該検出試薬は遷移金属錯体を含む前記化合物であり、そして
ｄ）工程ｃ）におけるＥＣＬ検出の結果に基づいて、分析物を検出する
工程を含む、前記方法。
１７． 電極が、Ａｕ、Ｉｒ、Ｐｔまたは炭素を含むかまたはこれらからなり、１つの態様において、ホウ素ドープダイヤモンド電極またはガラス状炭素電極であり；１つの態様において、白金、金またはガラス状炭素を含むかまたはこれらからなり、１つの態様において、白金を含むかまたは白金からなることで特徴付けられる、態様１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１８． ＥＣＬを用いた、試料中の前記分析物の検出が、水溶液中で実行されることで特徴付けられる、態様１５～１７のいずれか記載の方法。
１９． 方法が、均一な反応条件下または不均一な反応条件下で、１つの態様において、均一な反応条件下で、さらなる態様において、不均一な反応条件下で行われることで特徴付けられる、態様１～１８のいずれか記載の方法。
２０． 分枝鎖三級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミン（ＤＰＩＢＡ）、Ｎ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－プロピルアミン（ＤＩＢＰＡ）、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｎ－エチルアミン（ＤＩＥＡ）からなる群より選択され、１つの態様において、ＤＰＩＢＡまたはＤＩＢＰＡであることで特徴付けられる、態様１～１９のいずれか記載の方法。
２１． 試薬組成物が、少なくとも５０ｍＭの濃度、最大５００ｍＭの濃度、１つの態様において、５０ｍＭ～５００ｍＭの濃度、さらなる態様において、７５ｍＭ～３５０ｍＭ、さらなる態様において、１００ｍＭ～２５０ｍＭの分枝鎖三級アミンを含むことで特徴付けられる、態様１～２０のいずれか記載の方法。
２２． 検出工程における試薬混合物が保存剤を含むことで特徴付けられる、態様１～２１のいずれか記載の方法。
２３． 検出工程における試薬混合物が、０．１％～５％の濃度で前記保存剤を含むことで特徴付けられる、態様２２記載の方法。
２４． 検出工程における試薬混合物が、界面活性剤および緩衝剤を含むことで特徴付けられる、態様１～２３のいずれか記載の方法。
２５． 検出工程における試薬混合物が、塩および／または消泡剤をさらに含み、１つの態様において、カルボキサミドをさらに含み、さらなる態様において、場合によってハロゲン化された、アセトアミド、プロパンアミド、またはブチルアミドをさらに含み、さらなる態様において、プロパンアミドをさらに含むことで特徴付けられる、態様１～２４のいずれか記載の方法。
２６． ＥＣＬを検出するための試薬組成物であって
ｉ）共反応体としての、分枝鎖三級アミン、特に式Ｉの分枝鎖三級アミン、および
ｉｉ）さらなるＥＣＬ試薬
を含む、前記試薬組成物。
２７． 前記のさらなるＥＣＬ試薬が、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物、保存剤、緩衝化合物、界面活性剤、無機塩、特にハロゲン化ナトリウム、消泡剤、またはその任意の組み合わせであり；そして／またはカルボキサミド、さらなる態様において、あってもよいハロゲン化された、アセトアミド、プロパンアミド、またはブチルアミド、さらなる態様において、プロパンアミドを含む、態様２６記載の試薬組成物。
２８． 前記のさらなるＥＣＬ試薬が、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物である、態様２６または２７記載の試薬組成物。
２９． 前記のさらなるＥＣＬ試薬が、イリジウム錯体を含むＥＣＬ化合物である、態様２６～２８のいずれか１つに記載の試薬組成物。
３０． ｉ）遷移金属錯体を含む少なくとも１つのＥＣＬ化合物およびｉｉ）共反応体としての少なくとも１つの分枝鎖三級アミンを含む、ＥＣＬ反応組成物。
３１． 分析物をさらに含む、態様３０のＥＣＬ反応組成物。
３２． 少なくとも１つの分析物特異的試薬をさらに含む、態様３１のＥＣＬ反応組成物。
３３． 前記分析物特異的試薬が、遷移金属錯体を含む前記ＥＣＬ化合物に共有結合している、態様３２のＥＣＬ反応組成物。
３４． 遷移金属錯体を含む前記ＥＣＬ化合物が、前記分析物特異的試薬に特異的に結合する剤に共有結合している、態様３２のＥＣＬ反応組成物。
３５． 遷移金属錯体を含む前記ＥＣＬ化合物が、分析物に、または分析物の構造的類似体に共有結合している、態様３１のＥＣＬ反応組成物。
３６． ＥＣＬ検出における、態様１～８のいずれか１つに明記するような分枝鎖三級アミンの、態様２６～２９のいずれか１つ記載の試薬組成物の、および／または態様３０～３５のいずれか１つに記載のＥＣＬ反応組成物の使用。
３７． ｉ）分枝鎖三級アミンおよびｉｉ）ＥＣＬ試薬を含む、ＥＣＬを検出するためのキット。
３８． 前記ＥＣＬ試薬が、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物および／またはＥＣＬ補助試薬である、態様３７のキット。
３９． 電極、１つの態様において、Ａｕ、Ｉｒ、Ｐｔまたは炭素を含むかまたはこれらからなる電極、１つの態様において、ホウ素ドープダイヤモンド電極またはガラス状炭素電極；さらなる態様において、白金、金を含むかまたはこれらからなる電極、あるいはガラス状炭素電極、１つの態様において、反応チャンバーに包埋された電極をさらに含む、態様３７または３８のキット。
４０． 態様１～８のいずれか１つに明記するような、分枝鎖三級アミンを含む、ＥＣＬデバイス。
実施例１：化合物の合成／供給源
Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミン（ＣＡＳ登録番号６００２１－９１－２、「ＤＰＩＢＡ」）を、Ｇｈｅｏｒｇｈｅ， Ｒｕｘａｎｄｒａら； Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ， ２００８ ， Ｖｏｌ． ２０， ＃１０， ｐ１０８５－１０９１、およびＴａｋａｙａｍａら； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９７９， Ｖｏｌ． ４４， ｐ２８７１－２８７２にしたがって合成した。
Ｎ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－プロピルアミン（ＣＡＳ登録番号１８７２８５０－０５－９、ＤＩＢＰＡ）を、以下の方法にしたがって合成した：１００ｇのジ－ｓｅｃ－ブチルアミンを、４２０ｍｌのメタノールに溶解し、そして激しく撹拌しながら０℃に冷却した。４９，４ｇのプロピオンアルデヒドを８２ｍｌのメタノールに溶解し、溶液に添加した。２０５ｇのトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを冷却した溶液に５部分で添加し、溶液を０℃で２時間撹拌し、その後、ゆっくりと３０℃まで加熱し、そして室温で３６時間撹拌した。懸濁物をろ過し、そしてエバポレーションによって、溶媒をおよそ５００ｍｌまで、部分的に除去した。
５００ｍｌの酢酸エチルおよび５００ｍｌのＨ２Ｏを添加し、そして１０モルのＮａＯＨ溶液を添加することによって、ｐＨをｐＨ１０に調節した。有機相を分離したのち、Ｈ２Ｏ相をもう一度、５００ｍｌの酢酸エチルで抽出し、そして合わせた有機相を乾燥させた後、完全にエバポレートした。
残渣を高真空で蒸留した。
Figure 0007039481000020
エチル－ジイソプロピル－アミン＝ジイソプロピルエチルアミン＝ＣＡＳ登録番号７０８７－６８－５（＝ＤＩＥＡ）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈのものであった。
実施例２：特異的およびバックグラウンドシグナルの電圧依存
作用電極で異なる電位を適用する能力を含む、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１０１０またはＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０と類似のＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ブレッドボードを用いて、ＥＣＬ測定を行った。以下に言及するアッセイのためのプロトコルを、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０に関して推奨されるように用いた。多様な組成物を有する緩衝剤を用いて、測定電圧に対するＥＣＬの依存を研究した。緩衝剤の一般的な組成は、以下の通りであった：
３００ｍＭリン酸
０．１％ポリドカノール
以下に明記するような共反応体；ＫＯＨ／Ｈ３ＰＯ４を用いて、最終ｐＨをｐＨ６．８に調節した。共反応体およびその濃度は以下の通りであった：
緩衝剤Ａ（ＴＰＡ）：１８０ｍＭトリプロピルアミン
緩衝剤Ｂ（ＤＰＩＢＡ）：１２０ｍＭジプロピルイソブチルアミン
緩衝剤Ｃ（ＤＩＥＡ）：２００ｍＭジイソプロピルエチルアミン
緩衝剤Ｄ（ＴＢＡ）：１８０ｍＭトリブチルアミン
緩衝剤Ｅ（ＥＰ）：２００ｍＭエチルピペリジン
緩衝剤Ｆ（ＤＩＢＰＡ）：８０ｍＭジイソブチルプロピルアミン
本明細書に報告する緩衝剤の共反応体濃度は、シグナル収率に関して最適化された濃度である。緩衝剤Ａは、保存剤を含まずにＰｒｏＣｅｌｌの緩衝剤組成物を含み、そして参照緩衝剤として働いた。ＰｒｏＣｅｌｌは、現在Ｅｌｅｃｓｙｓ分析装置に用いられる、最新技術の緩衝剤である。ＥＰ、ＴＢＡおよびリン酸をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、そしてさらなる精製なしに用いた。
緩衝剤Ａ～Ｆは、アッセイ緩衝剤自体（バックグラウンド、図２）および人工的イムノアッセイ（ＳＡＰ、図１）のＥＣＬを決定するために用いられた。後者は、高い特異的シグナルに関するＲｕＢｐｙ標識微粒子を含むアッセイである。バックグラウンドおよびＳＡＰの測定は、異なる測定電圧で行われ、そしてＥＣＬシグナルを記録した。ＳＡＰおよびバックグラウンドの間の比は、アッセイ感度に対する異なる緩衝剤の影響を比較するための優れた指標である（図３）。
適用電圧で、そのバックグラウンドが指数関数的に増加することがすべてのアミンの一貫した特性である。すべての曲線の正しい記述は：
Figure 0007039481000021
によって提供される。一般的に用いられるＴＰＡの測定電圧は、１４００ｍＶである。等式１にしたがって、１１００ｍＶまで電圧の減少は、～３．８の係数でＢＧを減少させる。しかし、この減少は、特異的ＥＣＬシグナルの強い喪失によって相殺される。対照的に、分枝鎖共反応体のユニークな電圧依存によって、低い測定電圧を利用することが可能になり、したがって、Ｓ／ＢＧ比が有意に改善される。
実施例３：ＴｎＴアッセイにおけるアッセイ性能の比較
商業的ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイとして、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ＴｎＴアッセイ（Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）のためのトロポニンＴ１．Ｇｅｎアッセイ；注文番号：０５０９２７４４－１９０）を用いて、シグナル対ノイズ比を決定した。分析物不含試料（ＤｉｌＭａ；注文番号：３６０９９８７）をＴｎＴアッセイにおいて用いて、低レベルのバックグラウンドシグナル（Ｎ）を生じた。ＴｎＴ較正２（ＴｎＴ Ｃａｌ２；注文番号：０５０９２７５２－１９０）をＴｎＴアッセイにおいて用いて、高シグナル値（Ｓ）を生じた。
多様なビーズタイプを用いて、各アッセイを行った。これらは、ビーズＡ（Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ＴｎＴアッセイで用いる標準的Ｅｌｅｃｓｙｓビーズ）、ビーズＢ（Ｍ－２７０、ストレプトアビジン・コーティング・カルボキシルビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびビーズＣ（Ｍ－２８０、ストレプトアビジン・コーティング・トシルビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。参照を得るため、標準的Ｅｌｅｃｓｙｓ条件（１４００ｍＶ測定電圧）下で、ビーズタイプＡ～Ｃを用いて、緩衝剤Ａでアッセイを行った。得たシグナルは、標準条件に関して、１００％参照として働いた。緩衝剤Ｂおよび実施例２に見られる結果にしたがった最適化条件を用いた以外、同じ方法で、第二のセットの実験を行った（１１００ｍＶ測定電圧）（図４Ａ）。図４Ｂからわかるように、～２のＳ／ＢＧ比の増加は、用いたビーズタイプとは独立に達成可能である。
実施例４：ＩｒおよびＲｕ標識の電圧依存性シグナル
さらに、ＳＡＰアッセイ中のルテニウムおよびイリジウム標識の電圧依存性のシグナルの振る舞いを分析した。１つの例において、用いたストレプトアビジン・コーティング微粒子を、ルテニウム錯体（ビオチン―ＤＡＤＯＯ－スルホーＲｕ、式（ＶＩＩＩ））で、そして別の場合、イリジウム錯体（ビオチン－ＤＡＤＯＯ－ＩＢ３／４７、式（ＩＸ））で標識した。最大ＥＣＬシグナルで、シグナルを基準化して、曲線を比較した。Ｉｒ標識の場合、測定電圧を１４００ｍＶから１１００ｍＶに低下させた際に、特異的シグナルの６％が失われる。測定電圧の同じ減少は、Ｒｕ標識の場合、２８％のシグナル減少を導く。
ビオチン－ＤＡＤＯＯ－スルホ－ＢＰＲｕ：
Figure 0007039481000022
ビオチン－ＤＡＤＯＯ－ＩＢ３／４７：
Figure 0007039481000023
実施例５：アミン酸化電位に対するアルファ－分枝側鎖の影響
三級アミン酸化電位に対する側鎖分枝の影響を評価するため、リン酸緩衝液中で、ＴＰＡ、ＤＰＩＢＡおよびＤＩＢＰＡのサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）を記録した。共反応体溶液をＥｌｅｃｓｙｓ測定セルＶ７．０内に導入し、これをＢｉｏｌｏｇｉｃ、フランスのＳＰ－３００ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔに連結した。開放回路電位を出発電位として選択し、そしてＣＶは０．３Ｖ／ｓのスキャン速度、１．１～－０．５Ｖの間で測定した。得たＣＶを続いて、Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔソフトウェア（ＥＣ－ｌａｂｓ）で利用可能な適合関数で適合させて、異なる共反応体の標準的酸化電位を概算した。明らかに、酸化電位は、異なる共反応体の分枝側鎖の数と一致して、ＴＰＡからＤＰＩＢＡ、さらにＤＩＢＰＡへと減少する。こうしたアミンの酸化電位減少は、ＥＣＬ生成に必要な電位の減少を説明する。

Claims (19)

  1. 電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを検出する方法であって
    ａ）
    ｉ）少なくとも１つの分枝鎖三級アミンおよび
    ｉｉ）遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物
    を含む反応組成物を、電極と接触させ、
    ｂ）発光の放出を電気化学的に誘発し、そして
    ｃ）ＥＣＬシグナルを検出する
    工程を含み、
    前記分枝鎖三級アミンが、式（Ｉ）
    Figure 0007039481000024
     で表され、そしてＲ １ 、Ｒ ２ 、及びＲ ３ の以下に示す組み合わせを含む化合物１～７５及び化合物８４～１１３
    Figure 0007039481000025
    Figure 0007039481000026
    Figure 0007039481000027
    Figure 0007039481000028
    Figure 0007039481000029
    Figure 0007039481000030
    Figure 0007039481000031
     の１つである、前記方法。
  2. 前記分枝鎖三級アミンが、化合物１～７５の１つである、請求項１の方法。
  3. 前記分枝鎖三級アミンが、一般式（ＶＩＩ）：
    Figure 0007039481000032
     式中、Ｒ１０～Ｒ１５は独立に、－Ｈおよびメチルより選択され、式中、Ｒ１０～Ｒ１２の少なくとも１つはメチルであり；そして式中、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２がメチルである場合、Ｒ１３～Ｒ１５の少なくとも１つはメチルである
    にしたがった化合物である、請求項１または２の方法。
  4. 前記分枝鎖三級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジ（ｓｅｃ－ブチル）－プロピルアミン（「Ｎ，Ｎ－ジイソブチル－プロピルアミン」、ＤＩＢＰＡ）、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－Ｎ－（ｓｅｃ－ブチル）アミン（「Ｎ，Ｎ－ジプロピル－イソブチルアミン」、ＤＰＩＢＡ）、および／またはＮ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｎ－エチルアミン（ＤＩＥＡ）である、請求項１～３のいずれか一項の方法。
  5. 前記遷移金属錯体が、イリジウムイオン、ルテニウムイオン、レニウムイオン、オスミウムイオン、ユーロピウムイオン、テルビウムイオン、およびジスプロシウムイオンの少なくとも１つを含む、請求項１～４のいずれか一項の方法。
  6. 前記遷移金属錯体が、ルテニウムイオンを含むかまたはイリジウムイオンを含む、請求項１～５のいずれか一項の方法。
  7. 遷移金属錯体を含む前記ＥＣＬ化合物が、Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋、Ｒｕ（ｂｐｙ）２－ｂｐｙＣＯ－ＯＳｕ、スルホ－ＢＰＲｕ ＮＨＳエステル、ＢＰＲｕＵＥＥＫ－スベレート－ＯＳｕ、ＢＰＲｕ－（ＵＥ）－２５－Ｋ－スベレート－ＯＳｕ、ＢＰＲｕ２－ＳＫ２－スベレート－ＯＳｕ、４，４’，５’，５－テトラメチルビピリジンＲｅ（Ｉ）（４－エチルピリジン）（ＣＯ）３ ＋ＣＦ３ＳＯ３ －、またはＰｔ（２－（２－チエニル）ピリジン）２、Ｉｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－２－（カルボキシエチル－フェニル）ピリジン－２－カルボン酸エステル、およびその親水性誘導体からなるリストより選択される、請求項１～６のいずれか一項の方法。
  8. 遷移金属錯体を含む前記ＥＣＬ化合物が、Ｉｒ（６－フェニルフェナントリジン）２－２－（カルボキシエチル－フェニル）ピリジン－２－カルボン酸エステルである、請求項１～７のいずれか一項の方法。
  9. 前記電極が、Ａｕ、Ｉｒ、Ｐｔまたは炭素を含むかまたはこれらからなり、１つの態様において、ホウ素ドープダイヤモンド電極またはガラス状炭素電極であり；１つの態様において、白金、金またはガラス状炭素を含むかまたはこれらからなり、１つの態様において、白金を含むかまたは白金からなる、請求項１～８のいずれか一項の方法。
  10. 前記の発光の放出の電気化学的な誘発が、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に対する作用電極での０．８Ｖ～１．３Ｖ、１つの態様において、０．９Ｖ～１．１Ｖの電位の適用を含む、請求項１～９のいずれか一項の方法。
  11. 電気化学発光検出を通じて、試料中の分析物を検出するための方法であって：
    ａ）前記試料を、遷移金属錯体を含む、１つの態様において、トリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋）を含む、電気化学発光基で標識された検出試薬とインキュベートし、
    ｂ）分析物に結合したおよび分析物に結合していない標識検出試薬を分離し；
    ｃ）請求項１～１０のいずれか一項の方法にしたがってＥＣＬを検出し、前記検出試薬は遷移金属錯体を含む前記ＥＣＬ化合物であり、そして
    ｄ）工程ｃ）におけるＥＣＬ検出の結果に基づいて、分析物を検出する
    工程を含む、前記方法。
  12. 試薬組成物が、少なくとも５０ｍＭの濃度、最大５００ｍＭの濃度、１つの態様において、５０ｍＭ～５００ｍＭの濃度、さらなる態様において、７５ｍＭ～３５０ｍＭ、さらなる態様において、１００ｍＭ～２５０ｍＭの分枝鎖三級アミンを含む、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
  13. ＥＣＬを検出するための試薬組成物であって
    ｉ）共反応体としての、請求項１～４のいずれか一項に明記するような分枝鎖三級アミン、および
    ｉｉ）さらなるＥＣＬ試薬
    を含む、前記試薬組成物。
  14. 前記のさらなるＥＣＬ試薬が、遷移金属錯体を含むＥＣＬ化合物、保存剤、緩衝化合物、界面活性剤、無機塩、もしくは消泡剤、またはそのいずれの組み合わせであり；そして／またはカルボキサミドまたはアミドを含み、さらなる態様において、ハロゲン化された、アセトアミド、プロパンアミド、またはブチルアミドをさらに含んでもよく、さらなる態様において、プロパンアミドをさらに含む、請求項１３記載の試薬組成物。
  15. 前記無機塩がハロゲン化ナトリウムである、請求項１４に記載の試薬組成物。
  16. 請求項１～４のいずれか一項に明記するような分枝鎖三級アミン、ならびに／あるいは、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の試薬組成物の、ＥＣＬの検出における使用。
  17. ｉ）請求項１～４のいずれか一項に明記するような分枝鎖三級アミンおよびｉｉ）ＥＣＬ試薬を含む、ＥＣＬを検出するためのキット。
  18. 前記ＥＣＬ試薬が、遷移金属錯体および／またはＥＣＬ補助試薬を含む、ＥＣＬ化合物である、請求項１７のキット。
  19. 請求項１～４のいずれか一項に明記するような分枝鎖三級アミンを含むＥＣＬデバイス。
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