CN108698047A - 电化学发光检测中的支链胺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用新的试剂组合物通过电化学发光来检测样品中的分析物的方法。公开了新的试剂组合物、用于测量电化学发光(ECL)的试剂盒以及使用所述新的试剂组合物的电化学发光检测方法。具体而言，本发明涉及可用于所述测量以提供改进的测定性能的新型化合物组合的用途。

Description

电化学发光检测中的支链胺
发明领域
本发明涉及使用新试剂组合物通过电化学发光来检测样品中的分析物的方法。公开了新试剂组合物、用于测量电化学发光(ECL)的试剂盒和使用所述新试剂组合物的电化学发光检测方法。具体而言，本发明涉及可用于所述测量以提供改进的测定性能的新型化合物组合的用途。
背景和现有技术
用于测量电化学发光现象的方法已知道一些年。此类方法利用特定金属配合物借助氧化和还原反应实现激发状的能力，所述特定金属配合物从该激发态衰变到基态，发射光子。对于综述，参见Richter, M.M., Chem. Rev. 104 (2004) 3003-3036。
此时，存在许多利用电化学发光(ECL)用于分析测量(例如，在体外诊断应用的领域中)的可商购仪器。可诱导发射ECL的物质(ECL-活性物质)已经用作ECL标记物。ECL标记物的实例包括有机金属化合物，诸如三-联吡啶-钌(RuBpy)部分，其中所述金属来自例如第VII和VIII族的金属，包括Re、Ru、Ir和Os。在ECL过程中与ECL标记物反应的物质在本文中称为ECL共反应剂。用于ECL的常用共反应剂包括叔胺(例如三丙胺(TPA))、草酸盐和过硫酸盐。光由ECL标记物或ECL配体生成；结合试剂在结合相互作用中的参与可通过测量从ECL标记物发射的ECL来监测。或者，来自ECL-活性化合物的ECL信号可指示化学环境(参见例如，美国专利号5,641,623和5,643,713，其描述了监测特定ECL共反应剂的存在或破坏的ECL测定)。对于ECL、ECL标记物、ECL测定和用于进行ECL测定的仪器的更多背景，参见美国专利号5,093,268；5,147,806；5,240,863；5,308,754；5,324,457；5,591,581；5,597,910；5,679,519；5,705,402；5,731,147；5,786,141；5,846,485；5,866,434；6,066,448；6,136,268和6,207,369以及EP 0 441 875和公开的PCT号WO90/05296；WO97/36931；WO98/12539；WO99/14599；WO99/32662；WO99/58962；WO99/63347；WO00/03233和WO98/57154。
可商购的用于体外诊断的ECL仪器已经表明优异的性能。它们由于包括其优异的灵敏度、动态范围、精度和对复杂样品基质的耐受性的原因已经变得广泛应用。可商购的仪器使用基于流动室的设计，所述设计具有持久可重复使用的流动室。
用于测定分析物的可用样品体积经常受到限制，并且越来越多的不同分析物必须从一个样品中测定出。还要求开发用于测定自动化的更快速的实验室设备和用于检测分析物的更灵敏的方法。这导致需要高度灵敏和特异性的电化学发光测定和用于进行它们的方法。此外，还应考虑与安全危害或者环境问题相关的改进。
具体而言，分析物的更灵敏的检测仍然是非常有利的。因此，本发明的目标是改进所述已知的方法和试剂组合物，尤其是关于ECL信号的增强和改进的与电化学发光程序组合的分析物检测。期望发现具有改进的电化学发光测定性能的新型信号增强试剂和/或化合物。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及检测电化学发光(ECL)信号的方法，其包括
a)使反应组合物与电极接触，所述反应组合物包含
i)至少一种支链叔胺，和
ii)包含过渡金属配合物的ECL化合物，
b)电化学触发发光的释放，和
c)检测ECL信号。
在一个进一步实施方案中，本发明涉及用于经由电化学发光检测来检测样品中的分析物的方法，其包括以下步骤：
a) 使样品与用包含过渡金属配合物、在一个实施方案中包含三(2,2'-联吡啶)钌配合物(Ru(bpy)3 2+)的电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，
b) 分离分析物结合和不含分析物的标记的检测试剂，
c) 使分离的分析物结合的标记的检测试剂与本发明的支链叔胺并与电极接触，
d) 电化学触发发光的释放，和
e) 检测电化学发光(ECL)信号，由此检测分析物。
在一个进一步实施方案中，本发明涉及用于检测ECL的试剂组合物，其包含
i)支链叔胺，特别是式I的支链叔胺
(I)，作为共反应剂，和
ii)另外的ECL试剂。
在一个实施方案中，本发明还涉及ECL反应组合物，其包含i)至少一种包含过渡金属配合物的ECL化合物，和ii)至少一种支链叔胺作为共反应剂。
本发明还涉及如本发明的任一项中所指定的支链叔胺、根据本发明的试剂组合物和/或根据本发明的反应组合物在检测ECL中的用途。
进一步，本发明涉及用于检测ECL的试剂盒，其包含i)支链叔胺和ii)ECL试剂。
此外，本发明涉及ECL设备，其包含如本发明的实施方案任一项中所指定的支链叔胺。
此外，本发明涉及ECL设备，其包含本发明的支链叔胺。
本发明以及其额外的目标、特征和优点将通过以下对某些实施方案的具体描述更完全地理解。
详述
除非另外指出，否则本发明的实施将采用本领域技术内的化学、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在以下文献中得到充分解释，诸如"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"，第二版(Sambrook等人,1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait编, 1984); "Animal CellCulture" (R. I. Freshney编, 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press,Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel等人编, 1987及定期更新); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis等人编, 1994)。
除非另外定义，否则本文中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology，第2版，J. Wiley & Sons, New York (1994); March, AdvancedOrganic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 第4版, John Wiley &Sons, New York (1992); Lewin, B., Genes V, 由Oxford University Press出版(1994), ISBN 0-19-854287 9); Kendrew, J. 等人(编), The Encyclopedia ofMolecular Biology, 由Blackwell Science Ltd.出版(1994), ISBN 0-632-02182-9);和Meyers, R.A. (编), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive DeskReference, 由VCH Publishers, Inc.出版 (1995), ISBN 1-56081-569 8)为本领域技术人员提供了对本申请中使用的许多术语的一般性指导。
本文中引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)通过引用以其整体并入本文。
定义：
如本文所用，以下术语各自在此部分中具有与其有关的含义。
如下文所用，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任意语法变化以非排他性的方式使用。因此，这些术语可以既指其中除通过这些术语引入的特征外无其它特征存在于该上下文中所述的实体的情况，也指其中存在一种或多种其它特征的情况。作为实例，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”可以既指其中除B外A中不存在其它要素的情况(即其中仅仅且排他地由B组成的情况)，也指其中除B外实体A中存在一种或多种其它要素(诸如要素C、要素C和D或甚至另外的要素)的情况。
此外，如下文所用，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“具体地”、“更具体地”、“特定地”、“更特定地”或相似的术语可以与任选的特征结合使用，而不限制进一步的可能性。因此，由这些术语引入的特征是任选的特征且并非意在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到，本发明可通过使用替代特征进行。类似地，由“在本发明的一个实施方案中”或类似表述引入的特征意欲为任选的特征，而并非是对本发明的进一步实施方案的任何限制，并非是关于本发明的范围的任何限制且并非是关于组合以这种方式引入的特征与本发明的其它任选或非任选的特征的可能性的任何限制。
冠词“一个”和“一种”在本文是指一个/种或超过一个/种(即至少一个/种)的冠词语法对象。通过实例的方式，“一种分析物”意指一种分析物或超过一种分析物。术语“至少”用于指示任选地可以存在一个/种或多个/种另外的对象。通过实例的方式，任选地，包括至少两个离散区域的阵列可以包括两个或更多个离散测试区。表述“一个/种或多个/种”在一个实施方案中表示1至50，在一个进一步实施方案中表示1至20，在一个进一步实施方案中表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。此外，如果没有另外说明，术语“约”涉及指示值±20％。
在一个实施方案中，本发明的方法是体外方法。此外，它们可以包括除了本文明确提及的步骤之外的步骤。例如，另外的步骤可以涉及例如获得样品用于分析，或者从检测的ECL值计算测量值或校正的测量值。此外，本发明的方法的一个或多个步骤可以通过自动化设备进行。
“检测”包括任何检测(包括直接和间接检测)的方法。术语“检测”以最广义使用，包括电化学发光信号的定性和定量测量两者；和分析物的定性和定量测量两者，本文中也称为分析物的测量。在一个方面，使用如本文所述的检测方法来鉴定检测组合物中ECL的少量存在或样品中相关分析物的少量存在。在另一个方面，可以使用所述方法来定量检测组合物中的ECL信号或样品中分析物的量。对于定量检测，将检测ECL信号的绝对或精确强度或分析物的量；或者将检测ECL信号的相对强度或分析物的量。在不可以或不应该检测到精确强度或量的情况下，可以检测相对强度或量。在所述情况下，可以检测强度或量相对于提供参考强度或包含第二(在一个实施方案中预定)量的所述分析物的第二样品是增加还是减少。
在一个实施方案中，检测是测量。术语“测量”在科学上是指估计或确定数量(诸如长度或质量)相对于测量单位(诸如米或千克)的大小的过程。测量使用参照点，针对该参照点可评估其它事物。术语测量也可用于指从测量过程获得的特定结果(测定的值)。它是比较的基础。技术人员知道用于将测量的信号或测定的值与浓度关联的材料和方法。
“降低”或“抑制”是与参照相比，减少或降低活性、功能和/或量。降低或抑制意指引起在一个实施方案中10%或更大，在一个进一步实施方案中25%或更大，在一个进一步实施方案中50%、75%、90%、95%或更大的总体降低的能力。
“增强”，例如“增强特异性信号”或者“增强ECL信号”是与参照相比增加或提升活性、功能和/或量。增加或提升意指引起在一个实施方案中10%或更大、在一个进一步实施方案中25%或更大、在一个进一步实施方案中50%或更大的总体提高的能力。
术语“发光”是指不从能源(例如，电磁辐射、化学反应、机械能的来源)的温度获得能量的任何光发射。通常，该来源引起原子的电子从较低的能量状态迁移至“激发的”较高能量状态；然后电子在其回落至较低能量状态时以发射光的形式释放该能量。此类光发射通常在电磁谱的可见或近可见范围中发生。术语“发光”包括但不限于此类光发射现象诸如磷光、荧光、生物发光、辐射发光、电致发光、电化学发光和热致发光。在一个实施方案中，发光是电化学发光(ECL)。如技术人员所理解，ECL是如本文别处所指定的电化学反应期间产生的发光。因此，在一个实施方案中，ECL信号是可检测的电化学发光信号，无论是可见地可检测还是通过使用合适的仪器(在一个实施方案中光度测定仪器)可检测。
如本发明的方法的上下文中使用的术语“接触”是本领域技术人员理解的。在一个实施方案中，该术语涉及使化合物与另外的化合物或设备物理接触，由此允许所述化合物和另外的化合物或设备相互作用。具体而言，该术语涉及使本发明的支链叔胺与包含过渡金属配合物的ECL化合物和电极物理接触；和/或使检测试剂与样品物理接触。
如本文所用，术语“过渡金属配合物”涉及包含通过适当配位剂配位的过渡金属离子的化合物。术语“包含过渡金属配合物的化合物”涉及包含过渡金属配合物和第二化学化合物的任何化合物。在一个实施方案中，过渡金属配合物和第二化学化合物共价连接。在一个进一步实施方案中，第二化学化合物是生物大分子。在进一步实施方案中，第二化学化合物是如下所指定的分析物特异性试剂。如本文所用，术语“包含过渡金属配合物的ECL化合物”涉及包含过渡金属配合物的化合物，其中过渡金属配合物在适当条件下发射ECL。在一个实施方案中，ECL化合物包含过渡金属配合物。在一个实施方案中，过渡金属选自钌(=Ru)、铱(= Ir)、铼、锇、铕、铽和镝；在一个进一步实施方案中，过渡金属是钌、铱、铼或锇；在一个进一步实施方案中，过渡金属是钌或铱。适当的配位剂是本领域已知的，并且包括联吡啶、菲咯啉、苯基-吡啶、苯基-喹啉、苯基菲啶或吡啶-2-甲酸。
包含过渡金属配合物的ECL化合物例如公开于WO 8706706 A1、WO 2003002974、EP720614(A1)和US 6,451,225 (B1)中。
在一个实施方案中，包含过渡金属配合物的ECL化合物选自：
Ru(bpy)2-bpyCO-OSu，其为CAS登记号115239-59-3 (Ru(bpy)2-bpyCO2H)的N-羟基-琥珀酰亚胺酯 = BPRu，在本领域中也称为钌(1+)，双(2,2'-联吡啶-κN1,κN1')(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-丁酸根合-κN1,κN1')-，(OC-6-33)-，六氟磷酸氢盐(1-) (1:1:2)，也称为钌(1+)，双(2,2'-联吡啶-N,N')(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-丁酸根合-N1,N1')-，(OC-6-33)-，六氟磷酸氢盐(1-) (1:1:2)；
磺基-BPRu NHS酯( = CAS登记号482618-42-8 在本领域中也称为钌酸盐(2-)，双[[2,2'-联吡啶]-4,4'-二甲磺酸根合(2-)-κN1,κN1'][1-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κN1,κN1')-1-氧代丁氧基]-2,5-吡咯烷二酮]-，钠(1:2)，(OC-6-31)，进一步被称为钌酸盐(2-)，双[[2,2'-联吡啶]-4,4'-二甲磺酸根合(2-)-κN1,κN1'][1-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κN1,κN1')-1-氧代丁氧基]-2,5-吡咯烷二酮]-，二钠，(OC-6-31)-(9CI) )；
BPRuUEEK-辛二酸酯-OSu (= CAS登记号406218-59-5 在本领域中也称为Ru(bpy)2-bpyCO-UEEK-辛二酸酯-OSu或钌酸盐(3-)，双(2,2'-联吡啶-κN1,κN1')[N-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κN1,κN1')-1-氧代丁基]-β-丙氨酰基-L-α-谷氨酰基-L-α-谷氨酰基-N6-[8-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1,8-二氧代辛基]-L-赖氨酸根合(3-)]-，(OC-6-33)- (9CI) )，其为具有肽接头的BPRu-标记物，U =β-丙氨酸，E =谷氨酸，K =赖氨酸；
BPRu-(UE)-25-K-辛二酸酯-OSu (= CAS登记号406679-88-7的辛二酸酯N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物，在本领域中也称为钌酸盐(24-)，双(2,2'-联吡啶-κN1,κN1')[N-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κN1,κN1')-1-氧代丁基]-(UE)25-L-赖氨酸根合(26-)]-，(OC-6-33)- (9CI) )，其中U = β-丙氨酰基，E = L-α-谷氨酰基；
BPRu2-SK2-辛二酸酯-OSu (= CAS登记号406218-60-8的辛二酸酯N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物，在本领域中也称为钌酸盐(7-)，双(2,2'-联吡啶-κN1,κN1')[N-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κN1,κN1')-1-氧代丁基]-β-丙氨酰基-N6-(N-乙酰基-(EU)3)-L-赖氨酰基-N6-(N-乙酰基-(EU)3)-L-赖氨酰基-(UE)2-L-赖氨酸根合(9-)]-，九氢 (9CI) )，其中U= β-丙氨酰基，E = L-α-谷氨酰基；4,4‘,5‘,5-四甲基联吡啶 Re(I)(4-乙基吡啶)(CO)3 +CF3SO3 -；和
Pt(2-(2-噻吩基)吡啶)2。
另外已知的螯合物是双[(4,4‘-甲氧甲酰基)-2,2‘-联吡啶]-2-[3-(4-甲基-2,2‘-联吡啶-4-基)丙基]-1,3-二氧杂环戊烷钌(II)；双(2,2‘-联吡啶)[4-(丁-1-醛)-4‘-甲基-2,2‘-联吡啶]钌(II)；双(2,2‘-联吡啶)[4-(4‘-甲基-2,2‘-联吡啶-4‘-基)-丁酸]钌(II)；(2,2‘-联吡啶)[双-双(1,2-二苯基膦基)亚乙基]2-[3(4-甲基-2,2‘-联吡啶-4‘-基)丙基]-1,3-二氧杂环戊烷锇(II)；双(2,2‘-联吡啶)[4-(4‘-甲基-2,2‘-联吡啶)-丁胺]钌(II)；双(2,2‘-联吡啶)[1-溴-4-(4‘-甲基-2,2‘-联吡啶-4-基)-丁烷]钌(II)；和双(2,2‘-联吡啶)马来酰亚胺基-己酸，4-甲基-2,2‘-联吡啶-4‘-丁酰胺钌(II)。在一个实施方案中，包含过渡金属配合物的ECL化合物是三(2,2'-联吡啶)钌Ru(bpy)3 2+，也称为Ru(bpy)或其衍生物如(BPRu = Ru(bpy)2-bpyCO-OSu)，(磺基-BPRu NHS酯)。
在一个进一步实施方案中，ECL化合物选自BPRu (= Ru(bpy)2-bpyCO-OSu)；磺基-BPRu NHS酯；BPRuUEEK-辛二酸酯-OSu; BPRu-(UE)-25-K-辛二酸酯-OSu和BPRu2-SK2-辛二酸酯-OSu。
本领域技术人员已知，也可以使用前述ECL化合物的亲水衍生物。因此，在一个进一步实施方案中，术语ECL化合物还包括前述ECL化合物的亲水衍生物。
在一个进一步实施方案中，包含过渡金属配合物的ECL化合物是如WO 2014/019707 (A2)中所公开的Ir-配合物，在一个实施方案中是Ir(6-苯基菲啶)2-吡啶-2-甲酸或其衍生物，包括例如Ir(6-苯基菲啶)2-3-羟基吡啶-2-甲酸、Ir(6-苯基菲啶)2-4-(羟基甲基)吡啶-2-甲酸、Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-甲酸、Ir(6-苯基菲啶)2-5-(甲氧基)吡啶-2-甲酸或Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-甲酸酯或其衍生物，如具有被一个或多个磺酸取代的配体的铱配合物或如WO2012107419 (A1)、WO2012107420 (A1)、WO2014019707 (A2)、WO2014019708 (A1)、WO2014019709 (A2)、WO2014019710 (A1)、WO2014019711 (A1)中所述的铱配合物。
在一个进一步实施方案中，包含过渡金属配合物的ECL化合物是CAS登记号1556730-07-4 (= IB3/47，在本领域中也称为铱酸盐(3-)，[5-[4-(2-羧基乙基)苯基]-2-吡啶甲酸根合(2-)-κN1,κO2]双[2-(6-菲啶基-κN)-5-(3-磺酸根合丙氧基)苯基-κC]-，氢铯(1:2:1)或其N-羟基琥珀酰亚胺酯。
在一个进一步实施方案中，包含过渡金属配合物的ECL化合物是具有两个苯基-菲啶配体的铱配合物，所述苯基-菲啶配体具有两个磺酸根合丙氧基取代基、两个磺基-甲基，其包含2,9-菲啶二甲磺酸，6-苯基-，钠盐(CAS登记号1554465-50-7)或两个聚乙二醇取代基，或每一种三个，或其组合。
在具有钌配合物的一个进一步实施方案中，可以使用不同的接头，如(UE)25或聚乙二醇或其它。
在一个实施方案中，包含过渡金属配合物的化合物是包含分析物特异性试剂和标记物的检测试剂。根据本发明的术语“分析物特异性试剂”(ASR)必须理解为具有特异性结合分析物的能力的分子或生物分子(例如蛋白或抗体)。“分析物特异性试剂”(ASR)是可用于鉴定和测量生物样本中的个别化学物质的量的一类生物分子。ASR例如是抗体(多克隆或单克隆抗体)、特异性受体蛋白、配体、核酸序列以及类似试剂，其旨在通过与样本中的物质进行特异性结合或化学反应而用于诊断应用中以用于鉴定和定量生物样本中的个别化学物质或配体。ASR将满足结合分析物的亲和力标准以及特异性标准。某些分析物甚至在亚皮摩尔范围内的浓度下也具有高医学和诊断相关性。尤其地，传染病参数组，诸如乙型肝炎病毒可溶性抗原(HBsAg)、人类免疫缺陷病毒抗原(HIVAg)、丙型肝炎病毒抗原(HCVAg)、特别是丙型肝炎病毒核心抗原(HCVcAg)和心脏标志物诸如肌钙蛋白-T (TnT)是此类分析物的实例。尤其是在这些情况下，改进灵敏度对患者具有重要的医疗价值。
术语“抗体”以最广义使用，且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、单链抗体、纳米抗体等。术语“抗体”涵盖各种形式的抗体结构，包括完整抗体和抗体片段。根据本发明的抗体在一个实施方案中是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、源自其它动物物种如小鼠、山羊或绵羊的抗体、单克隆或多克隆抗体，或T细胞抗原耗竭的抗体。抗体的基因工程例如描述于Morrison, S.L.,等人, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238和US 5,204,244; Riechmann, L.,等人, Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S.,等人,Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125中。
可使用保留分析物特异性试剂的上述标准的任何抗体片段。抗体通过现有技术程序生成，例如，如Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzymeimmunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam，整本书，尤其是第43-78页)中所述。此外，技术人员熟知可用于特异性分离抗体的基于免疫吸附剂的方法。通过这些方式，可以提高抗体的质量，因此提高其在免疫测定中的性能(Tijssen,P.，同上，第108-115页)。
根据本发明的“检测试剂”包括用电化学发光基团标记的分析物特异性试剂(ASR)，或用电化学发光基团标记的分析物同源物。根据测试形式，技术人员已知必须选择何种类型的检测试剂用于各种测定形式(例如夹心测定、双重抗原桥接测定(DAGS)、竞争测定、均相测定、非均相测定)。在非均相免疫测定中的检测试剂可能是例如标记的抗体。本领域技术人员已知检测试剂可以在固相上固定化。在一个实施方案中，经由电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法可以作为均相测定进行。在一个实施方案中，该方法可以作为非均相测定进行。在一个实施方案中，该方法可以以夹心测定形式进行。在一个实施方案中，该方法可以以竞争测定形式进行。还有在一个实施方案中，该方法可以以双重抗原桥接测定(DAGS)形式进行。已知的免疫测定形式详细描述于书籍Price, C.P.和Newman, D.J.,Principles and Practice of Immunoassay, 第2版(1997)中。
如本文所用，术语“支链叔胺”涉及包含至少一个在烷基链的α-位具有仲碳原子的烷基链的叔胺，即包含至少一个1-支链烷基链的叔胺。如本文所用，叔胺的侧链的C-α原子是与中心氮原子共价键合的碳原子。因此，在一个实施方案中，支链叔胺是α-支链叔胺。在一个实施方案中，支链叔胺具有式(I)的通式结构
其中
R1、R2和R3中的至少一个，在一个实施方案中R1、R2和R3中的一个或两个是独立选择的根据式(II)的侧链
其中
m是0、1或2，在一个实施方案中是0或1；
R4是烷基，在一个实施方案中是直链C1-C3烷基，在一个进一步实施方案中是乙基或甲基，在另一个实施方案中是甲基，
R5是烷基，在一个实施方案中是直链C1-C3烷基，在另一个实施方案中是乙基或甲基，在一个实施方案中是甲基，
且其中残基R1、R2和R3独立地选自烷基，在一个进一步实施方案中独立地选自直链烷基，在另一个实施方案中独立地选自正戊基、正丁基、正丙基、乙基和甲基，在一个实施方案中独立地选自正丙基、乙基和甲基。
如本文所用的术语“化学化合物”、“盐”和“溶剂化物”以有技术的化学家已知的其通常含义使用。如果根据本发明的化合物的净电荷为正，则在一个实施方案中，抗衡离子为三氟甲磺酸根(三氟甲基磺酸根)、硫酸根、烷基磺酸根、甲苯磺酸根、磷酸根、四氟硼酸根、六氟磷酸根、三氟乙酸根、高氯酸根、氯离子或硝酸根离子。如果根据本发明的化合物的净电荷为负，则在一个实施方案中，抗衡离子为锂、钠和/或钾离子，或四甲基铵离子。在一个实施方案中，根据本发明的化合物的净电荷是在如本文别处所指定的标准条件下水溶液中化合物的净电荷。
术语“侧链”由技术人员理解且涉及与如本文所述的化学化合物的核心部分共价连接的原子或化学基团，所述核心部分还指“主链”或“骨架”。在一个实施方案中，侧链为如下文所述的有机侧链。术语“取代的”侧链涉及在一个或多个位置(在一个实施方案中，在位置1、2或3)处取代的侧链，其中取代基可以在任何可用的原子处连接以产生稳定的化学化合物。技术人员理解的是，术语“任选取代的”侧链涉及未取代或取代的侧链。
如本文所用，术语“有机侧链”涉及任何任选取代的侧链，所述侧链包含至少一个碳原子。如本文所用，“烷基”涉及直链或支链饱和烃基，其通过与其至少一个碳原子的至少一个的共价键连接至主链或叔胺的中心氮。烷基的实例为直链烷基，例如，甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基或支链烷基，例如，-CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)。因此，烷基包括伯烷基、仲烷基和叔烷基；在一个实施方案中，烷基是伯烷基或仲烷基。
在一个进一步实施方案中，未根据式(II)选择的残基R1、R2和R3中的至少一个是直链烷基，在一个实施方案中，选自正戊基、正丁基、正丙基、乙基或甲基，在进一步实施方案中，是丙基、乙基或甲基。在一个进一步实施方案中，未根据式(II)选择的残基R1、R2和R3中的所有都是直链烷基，在一个实施方案中，选自正戊基、正丁基、正丙基、乙基或甲基，在进一步实施方案中，是丙基、乙基或甲基。
在一个进一步实施方案中，支链叔胺是根据通式(III)的化合物：
其中
R2和R3独立地选自甲基、乙基、正丙基和正戊基；且R5选自甲基、乙基和正丙基。在一个进一步实施方案中，支链叔胺是根据前述通式(III)的化合物，其中R2和R3独立地选自甲基、乙基、正丙基、正丁基和正戊基；且R5选自甲基、乙基和正丙基。因此，在一个实施方案中，支链叔胺是表1的化合物之一。在一个进一步实施方案中，支链叔胺是表1的化合物之一或表2的化合物46至60之一。
在一个进一步实施方案中，支链叔胺是根据通式(IV)的化合物：
其中
R3选自甲基、乙基、正丙基和正戊基，且R5和R6独立地选自甲基、乙基和正丙基。在一个进一步实施方案中，支链叔胺是根据前述通式(IV)的化合物，其中R3选自甲基、乙基、正丙基、正丁基和正戊基，且R5和R6独立地选自甲基、乙基和正丙基。因此，在一个实施方案中，支链叔胺是表2的化合物之一。在一个进一步实施方案中，支链叔胺是表2的化合物31至45或61至75之一。
在一个进一步实施方案中，支链叔胺是根据通式(V)的化合物：
其中R5、R6和R7独立地选自甲基、乙基和正丙基。因此，在一个实施方案中，支链叔胺是表3的化合物之一。
在一个进一步实施方案中，支链叔胺是根据通式(VI)的化合物：
其中
R8和R9独立地选自甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、仲丁基(1-甲基丙基)、仲戊基(1-甲基丁基)和3-戊基(1-乙基丙基)。因此，在一个实施方案中，支链叔胺是表4的化合物之一。
在一个进一步实施方案中，支链叔胺是根据通式(VII)的化合物：
其中R10至R15独立地选自-H和甲基，其中R10至R12中的至少一个是甲基；且其中如果R10、R11和R12是甲基，则R13至R15中的至少一个是甲基。因此，在一个实施方案中，支链叔胺是表1至表4的化合物编号：6、7、10、21、22、25、32、33、36、37、38、38、42、43、76、78或81。
在一个实施方案中，支链叔胺是N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺(也以其俗名“二丙基-异丁胺”或“DPIBA”已知，CAS 60021-91-2，表1中的化合物编号：25)，N,N-二(仲丁基)-丙胺(也以其俗名“二异丁基-丙胺”或“DIBPA”已知，表2的化合物编号：43)或N,N-二异丙基-N-乙胺(DIEA，CAS 7087-68-5，表2的化合物编号：32)。在一个进一步实施方案中，支链叔胺是N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺或N,N-二(仲丁基)-N-丙胺。在一个进一步实施方案中，支链叔胺是N,N-二(仲丁基)-N-丙胺。
表 1：二(正烷基)-(1-甲基-烷基)胺的实施方案，取代基涉及式(I)
表 2：(正烷基)-二(1-甲基-烷基)胺和叔仲戊基胺的实施方案；取代基涉及式(I)
表 3：三(1-甲基-烷基)胺的实施方案；取代基涉及式(I)
表 4：叔(1-乙基-烷基)-胺的实施方案：
在一个进一步实施方案中，本发明的支链胺是这样的胺，当通过有效量的电化学能量氧化时，其形成强还原剂("Electrogenerated Chemiluminescence 69: The Tris(2,2'-bipyridine)ruthenium(II), (Ru(bpy)32+)/Tri-n-propylamine (TPrA) SystemRevisited", Miao等人 (2002), Journal of the American Chemical Society 124(48):14478)。
术语“组合物”是技术人员已知的，并且涉及至少两种化学化合物的均相或非均相的混合物。根据本发明的“试剂组合物”或“ECL-试剂组合物”包含支持ECL-信号生成的试剂，例如共反应剂、用于pH控制的缓冲剂以及任选的其它组分。技术人员知道电化学发光检测方法中的ECL信号生成所需的试剂组合物的组分。此外，如本文所用，术语“反应混合物”涉及使第一化合物与第二化合物(例如，支链叔胺和包含过渡金属配合物的ECL化合物)接触、允许所述第一和第二化合物反应的任何混合物。在一个实施方案中，反应混合物额外包含溶剂，在一个实施方案中包含水。在一个进一步实施方案中，反应混合物进一步包含一种或多种辅助化合物，例如，缓冲剂、防腐剂或洗涤剂或其任何组合。在一个实施方案中，反应混合物进一步包含如WO 2012055815 A1中描述的化合物。在一个实施方案中，反应混合物是水溶液。在一个实施方案中，根据本发明的支链叔胺是反应混合物中唯一的叔胺。
如本文所用，“水溶液”是物质或液体化合物溶解于水中的均相溶液。水溶液也可以包含有机溶剂。有机溶剂是本领域技术人员已知的，例如甲醇、乙醇或二甲亚砜。如本文所用，还应理解水溶液可以包含至多50%有机溶剂。如技术人员将理解，在一个实施方案中，术语水溶液包括颗粒分散于其中、在一个实施方案中均匀分散于其中的水溶液。
在ECL过程中参与ECL标记物的物质在本文称为ECL“共反应剂”。用于ECL的常用的共反应剂包括叔胺(例如三丙胺(TPA))、草酸盐和过硫酸盐。技术人员知道可用于电化学发光检测方法的可用的共反应剂。根据一个具体实施方案，根据本发明的共反应剂是支链叔胺。
如本文所用，术语“标记物”是指能够产生可检测电化学发光信号(无论是可见地可检测还是通过使用合适的仪器可检测)的任何物质。适用于本发明中的各种标记物包括电化学发光化合物。在一个实施方案中，标记物是如上所指定的过渡金属配合物或检测试剂。
“电化学发光测定”或“ECLA”是一种电化学测定，其中分析物分子通过其与检测试剂(所述检测试剂与如上所指定的标记物连接)的结合且通过诱导ECL发生(“电化学触发发光的释放”)来检测。在一个实施方案中，电极电化学引发化学标记物的发光。在一个进一步实施方案中，通过向接触试剂组合物的电极施加电压来触发ECL。为了检测ECL信号，通过光检测器测量由包含过渡金属配合物的ECL化合物发射的光，表明结合的分析物分子/靶分子复合物的存在或数量。ECLA方法描述于例如美国专利号5,543,112；5,935,779；和6,316,607中。对于不同的分析物分子浓度，可以使信号调制最大化，以进行精确和灵敏的测量。
在一个实施方案中，电化学触发发光的释放包括施加测量电压，所述测量电压比使用三丙胺作为共反应剂的可比的电化学测定中使用的测量电压低至少0.1 V，在一个实施方案中低至少0.2 V，在一个进一步实施方案中低至少0.3 V。如本文所用，术语“可比的电化学测定”涉及这样的电化学测定，其包括使用至少与本发明的电化学测定相同的ECL试剂和相同的工作电极。在一个实施方案中，可比的电化学测定是这样的电化学测定，其包括与本发明的电化学测定相同的步骤和试剂，除了共反应剂，所述共反应剂根据本发明为支链叔胺，但根据可比的电化学测定为TPA。因此，在一个实施方案中，电化学触发发光的释放包括施加0.7 V至1.6 V，在一个实施方案中0.8 V至1.3 V，在一个进一步实施方案中0.9 V至1.1 V的测量电压。根据本发明，如果没有另外说明，相对于标准Ag/AgCl电极、在一个实施方案中在25℃下具有饱和KCl的Ag/AgCl电极测量电位。在一个实施方案中，接触本发明的反应电极的电极(也称为工作电极)包含铂(= Pt)、金(= Au)或玻璃碳或由其组成，在一个实施方案中包含铂或由其组成。因此，在一个进一步实施方案中，触发发光的释放包括相对于Ag/AgCl电极在铂、金或玻璃碳工作电极处(在一个实施方案中，在铂工作电极处)施加0.8 V至1.3 V，在一个进一步实施方案中0.9 V至1.1 V的测量电压。在一个进一步实施方案中，支链胺是DIBPA且触发发光的释放包括相对于Ag/AgCl电极在铂、金或玻璃碳工作电极处(在一个实施方案中，在铂工作电极处)施加0.8 V至1.2 V，在一个进一步实施方案中0.85 V至1.1 V的测量电压。在一个进一步实施方案中，支链胺是DPIBA且触发发光的释放包括相对于Ag/AgCl电极在铂、金或玻璃碳工作电极处(在一个实施方案中，在铂工作电极处)施加0.8 V至1.2 V，在一个进一步实施方案中0.9 V至1.1 V的测量电压。
在ECLA程序中，可以将用检测试剂包被的微粒悬浮于样品中以有效结合分析物和/或允许有效回收结合的分析物。例如，颗粒可以具有0.05μm-200μm、0.1μm-100μm或0.5μm-10μm的直径，和能够结合分析物分子的表面组分。在一种频繁使用的ECLA系统(Elecsys®, Roche Dagnsotics, Germany)中，该微粒具有约3μm的直径。该微粒可以由以下形成：交联淀粉、葡聚糖、纤维素、蛋白、有机聚合物、苯乙烯共聚物诸如苯乙烯/丁二烯共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、乙烯基乙酰丙烯酸酯共聚物、氯乙烯/丙烯酸酯共聚物、惰性无机颗粒、二氧化铬、铁的氧化物、二氧化硅、二氧化硅混合物、蛋白质性物质或其混合物，包括但不限于琼脂糖珠粒、胶乳珠粒、壳芯颗粒等。在一个实施方案中，微粒是单分散的，并且可以是磁性的，诸如顺磁性珠粒。参见例如美国专利号4,628,037；4,965,392；4,695,393；4,698,302；和4,554,088。可以以范围为约1-10,000μg/ml，在一个实施方案中5-1,000μg/ml的量使用微粒。
如根据本发明使用的“样品”为了体外评估的目的而获得。如技术人员将理解，任何此类评估都在体外进行。如果样品是患者样品，则其后将其丢弃。在一个实施方案中，患者样品仅用于本发明的体外诊断方法，并且患者样品的材料不会转移回患者体内。
本发明的实施方案可用于测试样品中相关的分析物或活性的存在。此类样品可以呈固体、乳液、混悬液、液体或气体形式。它们可以是但不限于含有以下物质的样品或源自人或动物的样品：例如，细胞(存活或死亡)和细胞衍生产物、永生化细胞、细胞碎片、细胞级分、细胞裂解物、细胞器、细胞膜、杂交瘤、细胞培养上清液(包括来自产生抗体的生物体诸如杂交瘤的上清液)、废水或饮用水、食品、饮料、药物组合物、血液、血清、血浆、毛发、汗液、尿液、排泄物、粪便、唾液、组织、活检样品、流出物、分离和/或分级分离的样品、分离和/或分级分离的液体、器官、植物、植物部分、植物副产物、土壤、水、供水、水源、从流体(气体和液体)滤出的残留物、味道平淡的低级啤酒、吸收性材料、凝胶、细胞骨架、未分级分离的样品、未分级分离的细胞裂解物、细胞核、核级分、化学品、化学溶液、结构生物组分、骨骼(韧带、腱)组分、分离和/或分级分离的骨骼组分、毛发级分和/或分离物、皮肤、皮肤样品、皮肤级分、真皮、内皮层、真核细胞、原核细胞、真菌、酵母、免疫细胞、药物、治疗药物、油、提取物、粘液、污水、环境样品、有机溶剂或空气。在一个实施方案中，所述样品可以进一步包含，例如，水、醇、乙腈、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、n-甲基-吡咯烷酮、甲醇或其它有机溶剂。
在一个实施方案中，样品是细菌、古细菌或真核生物的样品。在一个实施方案中，在一个实施方案中，样品是哺乳动物的样品，在一个实施方案中，是绵羊、山羊、牛、马、猪、豚鼠、小鼠、大鼠、猫、狗或人的样品。在一个进一步实施方案中，样品是人的样品。在一个实施方案中，样品是体液样品，在一个实施方案中是唾液、血液、血浆、血清或尿液；在一个实施方案中，样品是不含细胞的。在一个进一步实施方案中，样品是组织或器官样品，或由其衍生的提取物。
可以测量的分析物包括但不限于，样品中存在的全细胞、细胞表面抗原、蛋白复合物、细胞信号传导因子和/或组分、第二信使、第二信使信号传导因子和/或组分、亚细胞颗粒(例如细胞器或膜片段)、病毒、朊病毒、粉尘螨或其片段、类病毒、免疫因子、抗体、抗体片段、抗原、半抗原、脂肪酸、核酸(和合成类似物)、核糖体、蛋白(和合成的类似物)、脂蛋白、多糖、抑制剂、辅助因子、半抗原、细胞受体、受体配体、脂多糖、糖蛋白、肽、多肽、酶、酶底物、酶产物、核酸加工酶(例如聚合酶、核酸酶、整合酶、连接酶、解旋酶、端粒酶等)、蛋白加工酶(例如蛋白酶、激酶、蛋白磷酸酶、泛素-蛋白连接酶等)、细胞代谢产物、内分泌因子、旁分泌因子、自分泌因子、细胞因子、激素、药剂、药物、治疗药物、合成有机分子、有机金属分子、镇静剂、巴比妥类药物、生物碱类、甾族化合物、维生素、氨基酸、糖、凝集素、重组或衍生蛋白、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或无机分子。
作为全细胞的分析物可以是动物、植物或细菌细胞，并且可以是存活或死亡的。实例包括植物病原体诸如真菌和线虫。术语“亚细胞颗粒”意在涵盖，例如，亚细胞细胞器，如来自破坏细胞的膜颗粒、细胞壁的碎片、核糖体、多酶复合物，和可源自活的生物体的其它颗粒。核酸包括，例如，源自多种来源的染色体DNA、质粒DNA、病毒DNA，和重组体DNA。核酸也包括RNA，例如信使RNA、核糖体RNA和转移RNA。多肽包括例如，酶、转运蛋白、受体蛋白和结构蛋白诸如病毒外壳蛋白。在实施方案中，多肽是酶和抗体。具体而言，多肽是单克隆抗体。激素包括例如，胰岛素和T4甲状腺激素。药剂包括例如，强心苷。在一个实施方案中，在本发明的范围内包括在化学上与生物物质相似的合成物质，诸如合成多肽、合成核酸以及合成膜、囊泡和脂质体。前述并不旨在是适用于本发明中的生物物质的全面列表，而仅仅意在举例说明本发明的宽泛范围。
而且，通常，相关的分析物以10-3摩尔或更低(例如，至少低至10-18摩尔)的浓度存在。
表述“相关的”表示应当分析或测定的可能关联的分析物或物质。
“固相”，也称为“固体支持物”，是不可溶的、官能化的聚合材料，可以对其附着或共价结合(经常经由接头)检测试剂或其它试剂以固定化或允许它们与过量的试剂、可溶性反应副产物或溶剂容易地分开(通过过滤、离心、洗涤等)。用于根据本发明的方法的固相广泛描述于现有技术(参见例如Butler, J. E., Methods 22 (2000) 4-23)中。术语“固相”意指非流体物质，并且包括由材料诸如聚合物、金属(顺磁性、铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷制成的颗粒(包括微粒和珠粒)；凝胶物质诸如硅胶、氧化铝凝胶和聚合物凝胶；可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成的毛细管；沸石和其它多孔物质；电极；微量滴定板；固体条；以及小池、管、芯片或其它分光计样品容器。测定的固相组分与测定可以接触的惰性固体表面的区别在于，“固相”在其表面上含有至少一个部分，该部分意在与检测试剂相互作用。固相可以是固定的组分，诸如管、条、小池、芯片或微量滴定板，或者可以是不固定的组分，诸如珠粒和微粒。微粒也可以用作用于均相测定形式的固相。可以使用允许蛋白和其它物质非共价或共价附着的多种微粒。此类颗粒包括聚合物颗粒诸如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒诸如金纳米颗粒和金胶体；以及陶瓷颗粒诸如硅土、玻璃和金属氧化物颗粒。参见例如Martin, C.R.等人, Analytical Chemistry-News & Features (1998) 322A-327A，其通过引用并入本文。
术语“芯片”、“生物芯片”、“聚合物芯片”或“蛋白芯片”可互换使用，并且是指在共享的基板(例如固相)上排列的大量探针、标志物或生物化学标志物的集合，所述基板可以是硅片、尼龙条、塑料条或玻璃载片的一部分。
方法：
在一个实施方案中，本发明涉及检测电化学发光(ECL)信号的方法，其包括
a)使反应组合物与电极接触，所述反应组合物包含
i)至少一种支链叔胺，和
ii)包含过渡金属配合物的ECL化合物，
b)电化学触发发光的释放，和
c)检测ECL信号。
在一个进一步实施方案中，本发明涉及用于经由电化学发光检测来检测样品中的分析物的方法，其包括以下步骤：
a)使样品与用包含过渡金属配合物、在一个实施方案中包含三(2,2'-联吡啶)钌配合物(Ru(bpy)3 2+)的电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，
b)分离分析物结合和不含分析物的标记的检测试剂，
c)使分离的分析物结合的标记的检测试剂与本发明的支链叔胺并与电极接触，
d)电化学触发发光的释放，和
e)检测电化学发光(ECL)信号，由此检测分析物。
在一个进一步实施方案中，本发明涉及用于经由电化学发光检测来检测样品中的分析物的方法，其包括以下步骤：
a)使样品与用包含过渡金属配合物、在一个实施方案中包含Ru(bpy)3 2+的电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，
b)分离分析物结合和不含分析物的标记的检测试剂，
c)根据本发明的方法检测ECL，其中所述检测试剂是包含过渡金属配合物的化合物，和
d)基于步骤c)中的ECL检测的结果检测分析物。
本发明的一个方面涉及基于本发明的试剂组合物的改进的ECL方法，具体而言，特征在于低检测限值的ECL方法。包含本发明的支链叔胺的试剂组合物令人惊讶地使得能够急剧降低系统背景。更具体地，本发明的方法通过降低在ECL标记物不存在的情况下的背景电化学发光来提供在低检测水平下改进的灵敏度。
本发明人令人惊讶地发现，使用来自支链叔胺的组的某些化合物作为ECL反应的共反应剂提供了许多优点，诸如所述化合物的氧化电位降低，以及ECL检测方法的信号/背景(S/BG)比改进，和由此ECL测定性能改进。
本发明的一个特征是使用电化学发光标记物确定待研究的样品中的分析物的方法，其中采用用于测量电化学发光现象的下列方法之一。
令人惊讶地，使用选自支链叔胺的组的化合物的方法比没有这些化合物的常规测试试剂发射更少的背景发光。这在低检测水平下是尤其有利的，其中提高信号:背景比(=信噪比)大大改进了灵敏度。令人惊讶地，本发明人已经发现使用根据本发明的方法进行电化学发光检测导致ECL检测的信噪比改进。
在一个实施方案中，根据本发明的经由电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法可以在水溶液中进行。
在一个实施方案中，该方法中使用的支链叔胺选自N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺(DPIBA)，N,N-二(仲丁基)-N-丙胺(DIBPA)或N,N-二异丙基-N-乙胺(DIEA)，在一个实施方案中是DPIBA或DIBPA，在一个进一步实施方案中是DPIBA，在一个进一步实施方案中是DIBPA。
为了避免疑义，在一个实施方案中，支链叔胺不是三丙胺、三乙醇胺、三乙胺1,4-哌嗪-双(乙烷-磺酸)、1-哌啶乙醇、1,4-二氮杂双环(2.2.2)辛烷、三异丙胺或二丁基乙醇胺。
在一个实施方案中，支链叔胺在该方法中以至少50 mM(即50 mmol/l)的浓度，在一个进一步实施方案中以至多500 mM的浓度，在一个进一步实施方案中以50 mM至500 mM的浓度，在一个进一步实施方案中以75 mM至350 mM的浓度，在一个进一步实施方案中以100 mM至250 mM的浓度使用。
在一个实施方案中，根据本发明的方法特别适合于在相关的样品中检测生物分子，诸如蛋白、多肽、肽、肽片段、激素、肽激素、维生素、维生素原、维生素代谢物和氨基酸。在一个进一步实施方案中，根据本发明的方法特别适合于检测来自类固醇、药物和治疗剂的另外种类的生物分子。
用于根据本发明的方法中的样品在一个实施方案中是液体样品，例如，全血、血清或血浆。样品，或更具体而言相关的样品，在一个实施方案中，可以包含任何体液和粪便。在一个实施方案中，样品将是液体样品，如唾液、粪便提取物、尿液、全血、血浆或血清。在一个实施方案中，样品将是全血、血浆或血清。
本领域技术人员已知，在一个实施方案中，本发明的方法中的所有步骤可以在相同的位置进行，例如，在同一反应容器中进行。所述步骤也可以在由控制装置控制的自动化过程中进行。
非特异性样品组分和不含分析物的标记的检测试剂可以在分离方法中除去。例如结合分析物的和不含分析物的标记的检测试剂可以使用洗涤步骤分离。然后将分析物结合的标记的检测试剂孵育以进行该方法的ECL检测。
支持分析物的电化学发光检测的其它测试组分也可用于根据本发明的方法中。
本发明人已发现，由叔胺生成的背景(BG)是为了其氧化施加的电压的指数函数。此外，本发明人发现，与非支链的类似物、特别是三丙胺(TPA)相比，支链叔胺表现出显著更低的氧化电位。因此，本发明人发现，经由使用支链叔胺的电化学发光检测测量样品中的分析物的方法需要降低的氧化电位，改进ECL检测中的信噪比(S/BG比)。在一个实施方案中，S/BG比率改进至少1.2倍，在一个进一步实施方案中改进至少1.4倍。此外，发现可以通过使用铱标记物进一步增强改进的效果。试剂组合物中的支链叔胺和铱标记物的累积效果导致ECL检测中S/BG比率改进至少1.3倍。此外，由于根据本发明的ECL反应可以在较低的电压下进行，因此工作电极的磨损也降低。
在一个实施方案中，本发明涉及用于经由电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法，其包括以下步骤：a)使样品与用电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，b)分离分析物结合和不含分析物的标记的检测试剂，c)使分离的标记的检测试剂与试剂组合物一起孵育，所述试剂组合物包含i)至少一种支链叔胺作为共反应剂和ii) Ru(bpy)3 2+，d)电化学触发发光的释放，和e)测定电化学发光(ECL)信号，由此测量分析物。
在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于所述试剂组合物另外包含洗涤剂和/或缓冲剂。
在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于所述试剂组合物另外包含盐和/或消泡剂。
在一个实施方案中，本发明涉及用于进行电化学发光测定的方法，其中在根据本发明的试剂组合物存在的情况下诱导电化学发光。
用于EDL免疫测定的典型ECL测量过程包括在ECL测量室(例如流动室)中液体和/或混合物的多次交换。在一个实施方案中，典型的ECL测量过程由下面解释的几个步骤组成。
在一个实施方案中，技术人员知道ECL测量室在进行ECL检测步骤之前通过用根据本发明的试剂组合物冲洗所述ECL测量室且另外地施加电势来调理或再生。在一个实施方案中，该步骤是使用ECL测定分析物的过程的一部分。已经在EP 1 051 621中描述，在该调理步骤期间，在ECL测量室中测量分析物期间，在支持信号产生的测量电极（一个或多个）的表面上形成一层。
在ECL测量过程的一个实施方案中，通过进入ECL测量室腔中的流体入口通道，将试剂混合物引入清洁且调理的ECL测量室中，其中所述混合物包含样品的成分、试剂和磁性颗粒。引入测量室中的所述混合物可以被在所述混合物之前和之后流动的根据本发明的试剂组合物包围。
在一个实施方案中，在这样的ECL免疫测定中，包含用电化学发光基团标记且是分析特征性的复合物-分子的检测试剂通过一对特异性生物化学结合配偶体(例如链霉抗生物素蛋白和生物素)与这些磁性颗粒结合。磁性颗粒例如用链霉抗生物素蛋白-聚合物包被，而生物素与复合物-分子结合。
在一个实施方案中，在ECL测量室中，在布置于所述电极附近的磁铁的磁场中磁性颗粒与和其结合的标记的复合物-分子一起被俘获至电极的表面上。在混合物的连续流动期间施加磁场，由此孵育物和/或试剂组合物通过流体出口通道从ECL测量室腔中排出。
在俘获磁性颗粒之后，含有ECL共反应剂的根据本发明的试剂组合物在下一步骤中引入ECL测量室中，由此通过所述试剂组合物洗涤磁性颗粒。该洗涤步骤是从电极除去所述孵育物的未结合组分，其潜在地干扰电化学反应。在一个实施方案中，洗涤步骤也可以在使磁性颗粒与根据本发明的试剂组合物接触之前用例如洗涤缓冲液(预洗方法)进行。
其后，电化学发光(ECL)信号的释放通过施加电势而电化学触发，由此发光强度借助光传感器检测，并且可作为位于电极表面的磁性颗粒上的标记的复合物-分子的浓度的量度进行评估，由此该浓度再次充当样品中分析物的浓度的量度。
在电化学发光检测之后，ECL测量室通常用洁净流体冲洗。
借助电化学发光进行检测方法的设备在实施例部分(实施例2、3和4)中提及，或描述于EP 1 892 524 (A1)中。而且，这样的设备可包括用于控制测量单元和/或液体容器的温度的装置。测量单元被理解为其中测量电化学发光的室。液体容器可以是储存容器，但也可以是进料装置；例如，在测量期间在测量单元中含有的用于试剂溶液的管。
组合物：
本发明的一个方面涉及用于ECL-信号生成的改进的试剂组合物，具体而言导致提高的信噪比(S/BG比)的那些。更具体地，通过降低在ECL标记物不存在的情况下的背景电化学发光，本发明的试剂组合物提供在低检测水平下改进的灵敏度。令人惊讶地，包含支链叔胺的试剂组合物比没有这些化合物的常规测试试剂发射更少的背景发光。这在低检测水平下是尤其有利的，其中提高信号:背景比(=信噪比)大大改进了灵敏度。该改进的试剂组合物含有来自支链叔胺的组的化合物以及任选的另外的ECL支持试剂。令人惊讶地，本发明人已经发现使用根据本发明的试剂组合物进行电化学发光检测导致如上文指明的ECL检测的信噪比(S/BG比)改进。
本发明的一个方面涉及在电化学发光测定中给出高的信号:背景比的试剂组合物。特异性信号和背景信号之间的信号差异增加。此类改进的特性已经通过鉴定ECL共反应剂、pH缓冲剂、洗涤剂和pH的有利组合(具体而言，通过使用支链叔胺作为共反应剂)而实现。
所述试剂组合物提供用于有效诱导ECL标记物发射ECL和经由测量ECL而灵敏地测量ECL标记物的合适环境。本发明的试剂组合物可以任选地包含额外组分，包括防腐剂、洗涤剂、消泡剂、ECL活性物质、盐、用于pH控制的酸性和碱性化合物(缓冲剂)、金属离子和/或金属螯合剂。本发明的试剂组合物也可以包含生物测定的组分(其在一些情形中可以用ECL标记物标记)，包括结合试剂、酶、酶底物、辅助因子和/或酶抑制剂。本发明还包括包含本发明的试剂组合物以及任选额外的测定组分的测定试剂、组合物、试剂盒、系统和系统组件。本发明还包括使用本发明的试剂组合物进行ECL测定的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及用于检测ECL的试剂组合物，其包含
i)支链叔胺作为共反应剂，和
ii)任选地另外的ECL试剂。
本文别处提供了支链叔胺的定义和实施方案。在一个实施方案中，试剂组合物的支链叔胺选自N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺(DPIBA，表1的化合物编号：25)，N,N-二(仲丁基)-丙胺(DIBPA，表2的化合物编号：43)和N,N-二异丙基-乙胺(DIEA，CAS 7087-68-5，表2的化合物编号：32)。在一个进一步实施方案中，支链叔胺是N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺或N,N-二(仲丁基)-丙胺。在一个进一步实施方案中，支链叔胺是N,N-二(仲丁基)-丙胺。
在一个实施方案中，针对ECL增强效果最佳地选择支链叔胺的浓度，例如，如实施例中所示。确定试剂组合物或反应组合物中支链叔胺的最佳浓度的方法是技术人员已知的。
在一个实施方案中，试剂组合物包含浓度为50 mM至500 mM的支链叔胺。在一个进一步实施方案中，试剂组合物包含浓度为75 mM至350 mM的支链叔胺。在一个进一步实施方案中，试剂组合物包含浓度为100 mM至250 mM的支链叔胺。本领域技术人员将认识到，在试剂组合物作为储备溶液提供的情况下，所述储备溶液可能需要稀释以获得反应组合物，并且可以根据预期的稀释系数来调节这种储备溶液的成分的浓度。因此，在一个实施方案中，前述浓度是反应组合物中支链叔胺的最终浓度。
在一个实施方案中，本发明的试剂组合物包含另外的ECL试剂。如本文所用，术语“ECL试剂”包含ECL支持试剂以及包含过渡金属配合物的ECL化合物，如本文别处所指明。ECL支持试剂原则上是技术人员已知的。在一个实施方案中，ECL支持试剂是防腐剂、缓冲化合物、洗涤剂、无机盐，特别是卤化钠或消泡剂，或其任何组合。在一个实施方案中，ECL支持试剂是羧酰胺或酰胺或包含羧酰胺或酰胺。术语“羧酰胺”在一个实施方案中涉及WO 2012/055815 A1中描述的羧酰胺，在一个实施方案中涉及任选地卤化的乙酰胺、丙酰胺或丁酰胺，在一个进一步实施方案中是丙酰胺。
当储存试剂组合物时包含阻止微生物生长的防腐剂可能是有利的。另外，鉴定合适的防腐剂以控制细菌和真菌生长以使得能够长期储存和使用所述试剂组合物。根据本发明的试剂组合物可以额外含有一种或多种防腐剂。在本发明的一个实施方案中，所述试剂组合物包含如本文别处所指明的防腐剂(防腐试剂)。
在一个实施方案中，试剂组合物进一步包含洗涤剂。用于根据本发明的试剂组合物的合适洗涤剂是选自以下的那些：脂肪酸醇乙氧基化物，包括聚(乙二醇)醚，例如聚多卡醇或其它具有式CXEOY(X=8-18和Y=2-9)的聚(乙二醇)醚，genapol(异十三烷基聚(乙二醇醚)n)，Plantaren®(烷基多聚葡糖苷)，辛基葡糖苷(辛基-β-D-吡喃葡糖苷)以及两性离子洗涤剂如Zwittergent 3-12或其混合物。洗涤剂以范围为0.01%至2%的浓度使用。可以容易地确定各洗涤剂的最佳浓度。最合适的浓度是范围为0.05%至1%的那些。在一个实施方案中，根据本发明的试剂组合物包含洗涤剂，其选自聚多卡醇或其它具有式CXEOY (X=8-18和Y=2-9)的聚(乙二醇)醚，辛基葡糖苷(辛基-β-D-吡喃葡糖苷)或两性离子洗涤剂如Zwittergent 3-12或其混合物。在一个实施方案中，所述试剂组合物包含洗涤剂，其选自聚多卡醇、辛基葡糖苷(辛基-β-D-吡喃葡糖苷)和Zwittergent 3-12或其混合物。
进一步，在一个实施方案中，电化学发光信号也可通过调节pH至6.0至8.0、在一个实施方案中6.0至7.5、在一个实施方案中6.2至6.9的值来提高。这可通过使用本领域技术人员已知的适于该范围的pH缓冲剂来方便地进行。在一个实施方案中，适于所述试剂组合物的缓冲剂包括KOH和磷酸(H3PO4)；在一个实施方案中，缓冲剂是磷酸钠或磷酸钾缓冲液，在一个实施方案中，是磷酸钾缓冲液。
此外，信号可通过添加盐来提高，所述盐包括无机盐如NaBr、NaCl、NaJ。盐(具体而言NaCl)以范围为1mM至1M、在一个实施方案中10mM至100mM、在一个进一步实施方案中10mM至50mM的浓度添加。
避免产生气泡或泡沫可能是有利的，尤其在HTS应用中。由于该原因，可能期望向试剂组合物中添加消泡剂。许多商业消泡剂(包括Antifoam o-30、Antifoam 204、AntifoamA、Antifoam SE-15、Antifoam SO-25和Antifoam 289)可以添加至根据本发明的试剂组合物中。
本发明的试剂组合物可以进一步包含如本文别处所指定的包含过渡金属配合物的ECL化合物。包含过渡金属配合物的ECL化合物可以是常规的ECL标记物。ECL标记物的实例包括三-联吡啶-钌(RuBpy)和其它有机金属化合物，其中金属来自例如第VII和VIII族的金属，包括Re、Ru、Ir和Os。本领域技术人员使用这些ECL标记物来用电化学发光基团标记分析物特异性试剂，或用电化学发光基团标记分析物本身。在一个实施方案中，本发明的试剂组合物含有用包含过渡金属配合物的ECL化合物标记的分析物和/或用包含过渡金属配合物的ECL化合物标记的分析物特异性试剂，如本文别处所指定。
在试剂组合物中使用的试剂及其混合物在使用前可以以液体、冷冻、深度冷冻、蒸发冷冻、冻干、气体、固体或干燥形式提供。在使用试剂组合物之前，在一个实施方案中，将试剂溶解于溶剂中，在一个实施方案中，将试剂溶解于水中。
本发明的试剂组合物在高灵敏度测定中是尤其有价值的。在本发明的一些实施方案中，通过试剂组合物与电极组成的最佳组合甚至进一步改进ECL测定的性能。在一个实施方案中，与本发明的装置和方法结合使用的ECL电极包含Au、Ir、Pt或碳或由其组成，在一个实施方案中，包括掺硼金刚石电极。
反应组合物：
为了测定ECL，可以将根据本发明的试剂组合物与额外的化合物混合，形成反应组合物。在一个实施方案中，本发明涉及用于测定ECL的反应组合物，其包含i)至少一种包含过渡金属配合物的ECL化合物，ii)至少一种支链叔胺作为共反应剂。在一个实施方案中，所述反应组合物进一步包含分析物。
在一个实施方案中，本发明涉及ECL反应组合物，其包含i)至少一种包含过渡金属配合物的ECL化合物，ii)至少一种支链叔胺作为共反应剂，iii)分析物，和iv)至少一种分析物特异性试剂。
如技术人员将理解，至少一种包含过渡金属配合物的ECL化合物和至少一种分析物特异性试剂可以共价连接，即可以一起是检测试剂。然而，还设想包含过渡金属配合物的ECL化合物与特异性结合分析物特异性试剂的试剂结合。如技术人员将理解，在一个实施方案中，前述反应组合物是从反应混合物除去非特异性结合的包含过渡金属配合物的ECL化合物后的组合物。
在一个进一步实施方案中，反应组合物是用于测定ECL的反应组合物，其包含i)至少一种包含过渡金属配合物的ECL化合物，其与分析物或分析物的结构类似物共价偶联，ii)至少一种支链叔胺作为共反应剂，和iii)分析物。
在一个实施方案中，前述反应组合物进一步包含至少一种另外的ECL支持试剂，如上所指定。
用途：
本发明的一个方面涉及本发明的试剂组合物或本发明的反应组合物的支链叔胺用于进行电化学发光检测方法的用途。
试剂盒：
本发明的一个方面涉及试剂盒，其在一个或多个容器中包含支链叔胺和ECL试剂，如上文所指定。所述组分可以任选地与额外的试剂组合，以形成本发明的试剂组合物或反应组合物。在一个实施方案中，试剂盒还可以包含额外的测定相关组分，诸如稀释剂、洗涤溶液、蛋白变性剂、一种或多种酶、结合试剂、测定板、一次性用品、电极等。
如本文所用，术语“试剂盒”是指可以包装在一起或可以不包装在一起的本发明的前述化合物、装置或试剂的集合。试剂盒的组分可以由单独的小瓶(即，作为单独部分的试剂盒)包含或提供在单个小瓶中。此外，应当理解，在一个实施方案中，本发明的试剂盒用于实施上文所提及的方法。在一个实施方案中，设想为了实施上面提及的方法，所有组分都以即用方式提供。此外，在一个实施方案中，试剂盒含有用于实施所述方法的说明书。说明书可以由用户手册以纸张或电子形式提供。此外，所述手册可以包含用于解释当使用本发明的试剂盒实施上面提及的方法时获得的结果的说明书。
在一个实施方案中，所述试剂盒的化学试剂容纳在一个或多个玻璃或塑料容器中，其适当地用关于内容物的信息和关于正确储存和使用的说明标记。可以涉及内容物、批号、生产日期、保质期和关于正确储存和使用的说明的另外的信息也可以储存于置于玻璃或塑料容器上的RFID芯片上。在这样的RFID芯片上储存的信息可以通过与RFID读数器连接的天线读出并在控制装置中进一步处理。
在一个实施方案中，所述试剂组合物的一些或全部组分可以在一个实施方案中以液体或干燥状态储存。
在一个实施方案中，本发明涉及用于测量ECL的试剂盒，其包含如上文所提及的用于测定ECL的试剂组合物。
提供以下实施例和附图来帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附实施方案和权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明的精神的情况下对所列的程序做出修改。
设备：
本发明的一个进一步方面涉及ECL设备，其包含如上文所提及的支链叔胺。
如本文所用，术语“设备”涉及适于检测ECL的装置系统，其进一步包含至少上面提及的装置，其可操作连接至所述设备，以允许获得检测的结果。用于将支链叔胺与本发明的设备可操作连接的典型装置是与泵连接的容器，在一个实施方案中，其介导所述支链叔胺转移至测量室中。如何以操作方式连接装置将取决于设备中包括的装置的类型。在一个实施方案中，所述装置由单个设备组成。
在一个实施方案中，所述设备包括样品处理单元，其包括用于样品的容器。所述容器可以直接接触样品，或者可以是接收样品的另外的装置的容器，其中另外的装置可以是例如其中可以施加一种样品或多种样品的多孔板。此外，在一个实施方案中，样品处理单元包含支链叔胺，例如，呈干燥形式或在与进料装置连接的贮存器中，例如，连接至泵的管道中。在一个实施方案中，样品处理单元包含至少一种包含过渡金属配合物的ECL化合物，例如，呈干燥形式或在与进料装置连接的贮存器中，例如，连接至泵的管道中。在一个进一步实施方案中，样品处理单元包括用于混合的装置和用于调节反应混合物的温度的装置。任选地，样品处理单元可以包括用于去除非特异性结合的包含过渡金属配合物的ECL化合物和/或结合剂的洗涤装置。
在一个实施方案中，可以在设备的分析单元中通过用户的视觉检查或通过在适当的设备上进行检测测量来获得检测的结果。在一个实施方案中，本发明的设备的分析单元进一步包括用于检测根据本发明的ECL的检测单元。适合作为根据本发明的检测单元的装置是技术人员已知的，并且包括例如光度测量设备，特别是发光测量设备。
在一个实施方案中，本发明的设备进一步包括与检测单元连接的数据输出单元。在一个实施方案中，数据输出单元适于输出由检测单元获得的数据。合适的数据输出单元是技术人员已知的，并且包括简单的输出单元，诸如指示检测到高于检测阈值的ECL的指示灯或显示器。然而，输出单元也可以是评估设备的接口，其中所述接口可以是任何种类的传输数据的装置，包括例如，电缆连接如USB，无线连接如无线LAN、蓝牙等，或间接连接诸如通过即时消息、电子邮件等的数据传输。
在一个实施方案中，本发明的设备是分析系统的一部分，所述分析系统进一步包括评估设备。如技术人员将理解，评估设备可以包括在与本发明的设备(例如，与评估单元)相同的壳体中，或者可以是分开的设备。在一个实施方案中，评估设备包括微处理器，所述微处理器被编程为从本发明的设备的输出单元接收输出数据，并进行提供所述输出数据的评估的逻辑操作。输出数据的评估可以包括，例如，在一个或多个控制检测反应中测量的值的校正数据，统计计算，例如计算两个或更多个并行检测反应的平均值，稀释因子的校正数据，将输出数据与参考值进行比较，编译列表中的数据等。在一个实施方案中，评估设备进一步包括数据储存单元。在一个进一步实施方案中，所述数据储存单元包括参考值，例如在参考值数据库中。此外，在一个实施方案中，数据存储单元适于储存从本发明的设备接收的输出数据，如上所指定。
在一个实施方案中，在应用自动检测ECL的装置的情况下，由所述自动操作装置获得的数据可以由例如计算机程序处理，以便建立诊断。关于与上述本发明的方法相关的实施方案公开了用于检测的典型装置。在这种情况下，所述装置可操作连接，因为系统的用户由于手册中给出的指令和解释而将ECL的确定结果和其诊断值汇集在一起。本领域技术人员将意识到如何在没有进一步创造性技能的情况下连接所述装置。典型的设备是可以在没有专门临床医生的特定知识的情况下应用的设备，例如仅需要用样品上样的测试条或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出、在一个实施方案中作为绝对量或相对量给出。应当理解，这些数据将需要临床医生的解释。然而，还设想了专家系统设备，其中输出包括处理的诊断原始数据，其解释不需要专门的临床医生。
鉴于上述内容，特别设想了以下实施方案：
1.检测电化学发光(ECL)信号的方法，其包括
a)使反应组合物与电极接触，所述反应组合物包含
i)至少一种支链叔胺，和
ii)包含过渡金属配合物的ECL化合物，
b)电化学触发发光的释放，和
c)检测ECL信号。
2.实施方案1的方法，其中所述支链叔胺具有式(I)的通式结构
其中
R1、R2和R3中的至少一个，在一个实施方案中R1、R2和R3中的一个或两个是独立选择的根据式(II)的侧链
其中
m是0、1或2，在一个实施方案中是0或1；
R4是烷基，在一个实施方案中是直链C1-C3烷基，在一个进一步实施方案中是乙基或甲基，在另一个实施方案中是甲基，
R5是烷基，在一个实施方案中是直链C1-C3烷基，在另一个实施方案中是乙基或甲基，在一个实施方案中是甲基，
且其中残基R1、R2和R3独立地选自烷基，在一个进一步实施方案中独立地选自直链烷基，在另一个实施方案中独立地选自正戊基、正丁基、正丙基、乙基和甲基，在一个实施方案中独立地选自正丙基、乙基和甲基。
3.实施方案1或2的方法，其中未根据式(II)选择的残基R1、R2和R3中的至少一个是直链烷基，在一个实施方案中，选自正戊基、正丁基、正丙基、乙基或甲基，在一个进一步实施方案中，是丙基、乙基或甲基。
4.实施方案1至3中任一项的方法，其中所述支链叔胺是表1至4中任一个的化合物1至122之一。
5.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述支链叔胺是表1至3中任一个的化合物1至83之一。
6.实施方案1至5中任一项的方法，其中所述支链叔胺是表1或2的化合物1至75之一。
7.实施方案1至6中任一项的方法，其中所述支链叔胺选自N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺(DPIBA)，N,N-二(仲丁基)-N-丙胺(DIBPA)或N,N-二异丙基-N-乙胺(DIEA)，在一个实施方案中是DPIBA或DIBPA，在一个进一步实施方案中是DPIBA，在一个进一步实施方案中是DIBPA。
8.实施方案1至7中任一项的方法，其中所述支链叔胺不是三异丙胺。
9.实施方案1至8中任一项的方法，其中所述电极包含Au、Ir、Pt或碳或由其组成，在一个实施方案中是掺硼金刚石电极或玻璃碳电极；在一个实施方案中包含铂、金或玻璃碳或由其组成，在一个实施方案中包含铂或由其组成。
10.实施方案1至9中任一项的方法，其中所述电化学触发发光的释放包括相对于Ag/AgCl-电极在工作电极处施加0.8 V至1.3 V，在一个实施方案中0.9 V至1.1 V的电位。
11.实施方案1至10中任一项的方法，其中所述过渡金属配合物包含钌离子、铱离子、铼离子、锇离子、铕离子、铽离子和镝离子中的至少一种；在一个实施方案中，其中所述过渡金属配合物包含钌离子或包含铱离子，在一个进一步实施方案中包含铱离子。
12.实施方案1至11中任一项的方法，其中所述包含过渡金属配合物的化合物选自Ru(bpy)3 2+、Ru(bpy)2-bpyCO-OSu)、磺基-BPRu NHS酯、BPRuUEEK-辛二酸酯-OSu、BPRu-(UE)-25-K-辛二酸酯-OSu、BPRu2-SK2-辛二酸酯-OSu、4,4‘,5‘,5-四甲基联吡啶Re(I)(4-乙基吡啶)(CO)3 +CF3SO3 -、Pt(2-(2-噻吩基)吡啶)2、Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸酯及其亲水衍生物。
13.实施方案1至12中任一项的方法，其中所述包含过渡金属配合物的化合物选自Ru(bpy)3 2+、Ru(bpy)2-bpyCO-OSu、磺基-BPRu NHS酯、Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸酯或其亲水衍生物，在一个实施方案中是Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸酯。
14.实施方案1至13中任一项的方法，其中所述反应组合物包含另外的ECL支持试剂。
15.用于经由电化学发光检测来检测样品中的分析物的方法，其包括以下步骤：
a)使样品与用包含过渡金属配合物、在一个实施方案中包含三(2,2'-联吡啶)钌配合物(Ru(bpy)3 2+)的电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，
b)分离分析物结合和不含分析物的标记的检测试剂，
c)使分离的分析物结合的标记的检测试剂与如实施方案1至8中任一项中所指定的支链叔胺并与电极接触，
d)电化学触发发光的释放，和
e)检测电化学发光(ECL)信号，由此检测分析物。
16.用于经由电化学发光检测来检测样品中的分析物的方法，其包括以下步骤：
a)使样品与用包含过渡金属配合物、在一个实施方案中包含Ru(bpy)3 2+的电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，
b)分离分析物结合和不含分析物的标记的检测试剂，
c)根据实施方案 1至12中任一项的方法检测ECL，其中所述检测试剂是包含过渡金属配合物的化合物，和
d)基于步骤c)中的ECL检测的结果检测分析物。
17.根据实施方案1至15中任一项所述的方法，其特征在于所述电极包含Au、Ir、Pt或碳或由其组成，在一个实施方案中是掺硼金刚石电极或玻璃碳电极；在一个实施方案中包含铂、金或玻璃碳或由其组成，在一个实施方案中包含铂或由其组成。
18.根据实施方案15至17中任一项所述的方法，其特征在于使用ECL检测样品中的所述分析物在水溶液中进行。
19.根据实施方案1至18中任一项所述的方法，其特征在于所述方法在均相反应条件或非均相反应条件下进行，在一个实施方案中在均相反应条件下进行，在一个进一步实施方案中在非均相反应条件下进行。
20.根据实施方案1至19中任一项所述的方法，其特征在于所述支链叔胺选自N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺(DPIBA)、N,N-二(仲丁基)-丙胺(DIBPA)和N,N-二异丙基-N-乙胺(DIEA)，在一个实施方案中是DPIBA或DIBPA。
21.根据实施方案1至20中任一项所述的方法，其特征在于所述试剂组合物包含浓度为至少50 mM，浓度为至多500 mM，在一个实施方案中浓度为50 mM至500 mM，在一个进一步实施方案中75mM至350mM，在一个进一步实施方案中100 mM至250 mM的支链叔胺。
22.根据实施方案1至21中任一项所述的方法，其特征在于检测步骤中的试剂混合物包含防腐剂。
23.根据实施方案22所述的方法，其特征在于检测步骤中的试剂混合物包含浓度为0.1％至5％的所述防腐剂。
24.根据实施方案1至23中任一项所述的方法，其特征在于检测步骤中的试剂混合物包含洗涤剂和缓冲剂。
25.根据实施方案1至24中任一项所述的方法，其特征在于检测步骤中的试剂混合物进一步包含盐和/或消泡剂，在一个实施方案中进一步包含羧酰胺，在一个进一步实施方案中进一步包含任选地卤化的乙酰胺、丙酰胺或丁酰胺，在一个进一步实施方案中进一步包含丙酰胺。
26.用于检测ECL的试剂组合物，其包含
i)支链叔胺，特别是式I的支链叔胺，作为共反应剂，和
ii)另外的ECL试剂。
27.根据实施方案26所述的试剂组合物，其中所述另外的ECL试剂是包含过渡金属配合物的ECL化合物、防腐剂、缓冲化合物、洗涤剂、无机盐，特别是卤化钠、消泡剂或其任何组合；和/或包含羧酰胺，在另一个实施方案中任选地卤化的乙酰胺、丙酰胺或丁酰胺，在一个进一步实施方案中丙酰胺。
28.根据实施方案26或27所述的试剂组合物，其中所述另外的ECL试剂是包含过渡金属配合物的ECL化合物。
29.根据实施方案26至28中任一项的试剂组合物，其中所述另外的ECL试剂是包含铱配合物的ECL化合物。
30.ECL反应组合物，其包含i)至少一种包含过渡金属配合物的ECL化合物，和ii)至少一种支链叔胺作为共反应剂。
31.实施方案30的ECL反应组合物，其进一步包含分析物。
32.实施方案31的ECL反应组合物，其进一步包含至少一种分析物特异性试剂。
33.实施方案32的ECL反应组合物，其中所述分析物特异性试剂与所述包含过渡金属配合物的ECL化合物共价结合。
34.实施方案32的ECL反应组合物，其中所述包含过渡金属配合物的ECL化合物与特异性结合所述分析物特异性试剂的试剂共价结合。
35.实施方案31的ECL反应组合物，其中所述包含过渡金属配合物的ECL化合物与分析物或分析物的结构类似物共价结合。
36.如实施方案1至8中任一项所指定的支链叔胺、根据实施方案26至29中任一项所述的试剂组合物和/或根据实施方案30至35中任一项所述的ECL反应组合物在检测ECL中的用途。
37.用于检测ECL的试剂盒，其包含i)支链叔胺和ii)ECL试剂。
38.实施方案37的试剂盒，其中所述ECL试剂是包含过渡金属配合物的ECL化合物和/或ECL支持试剂。
39.实施方案37或38的试剂盒，其进一步包含电极，在一个实施方案中包含Au、Ir、Pt或碳或由其组成的电极，在一个实施方案中掺硼金刚石电极或玻璃碳电极；在一个进一步实施方案中包含铂、金或玻璃碳或由其组成的电极，在一个实施方案中，其嵌入反应室中。
40.ECL设备，其包含如本实施方案1至8中任一项中所指定的支链叔胺。
附图说明
图1 显示在人工免疫测定中根据施加的测量电压测量的ECL信号，所述人工免疫测定包括用于6种不同的共反应剂的RuBpy标记的微粒(“SAP测定”)。X-轴：以mV计的测量电压，Y-轴：信号强度/最大信号强度(S/Smax)；TPA：三丙胺，TBA：三丁胺，EP：乙基哌啶，DIEA：N,N-二异丙基-N-乙胺，DPIBA：N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺，DIBPA：N,N-二(仲丁基)-丙胺。
图2 显示用于6种不同的共反应剂的RuBpy标记的微粒不存在的情况下根据施加的测量电压测量的ECL信号(“背景信号”)。X-轴：以mV计的测量电压，Y-轴：信号强度/最大信号强度(S/Smax)；对于其它缩写，参考图1的说明。
图3 显示用于4种不同的共反应剂的根据施加的测量电压的信号:背景比(S/BG)。X-轴：以mV计的测量电压，Y-轴：信号:背景比。
图4 在SAP测定中用各种珠粒和两种不同的共反应剂的背景信号和阳性对照信号的比较。A)各种珠粒类型和含有DBIPA或TPA的缓冲液的相对背景(“低”)和阳性对照信号(“高”)。用TPA获得的信号被设定为1。显然，DPIBA的使用导致背景(低)和特异性(高)信号的减少。然而，与特异性信号的减少相比，背景信号的减少更强。这导致整体S/BG比改进。B)S/BG比的改进；相对于用TPA测量的样品，在DPIBA存在的情况下测量的样品的S/BG比。
图5 在SAP测定中本发明的方法中作为过渡金属的Ru和Ir的比较。如果使用Ir标记物，则与Ru标记物相比，在降低的电压下测量时的特异性信号的降低较低。
图6 显示3种不同共反应剂的循环伏安法数据。X-轴：以V计的施加的电压，Y-轴：以mA计的电流；TPA：三丙胺，DPIBA：N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺，DIBPA：N,N-二(仲丁基)-丙胺。随着支链取代基数量的增加，在给定电位下的氧化电流由于化合物的标准氧化电位的降低而增加。
实施例1：化合物的合成/来源
N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺(CAS登记号60021-91-2，“DPIBA”)根据如下合成：Gheorghe, Ruxandra等人; Chirality, 2008 , Vol. 20, #10, p1085- 1091和Takayama等人; Journal of Organic Chemistry, 1979 , Vol. 44, p2871-2872。
N,N-二(仲丁基)-丙胺(CAS登记号1872850-05-9，DIBPA)根据以下程序合成：将100 g二仲丁胺溶解于420 ml甲醇中并在剧烈搅拌下冷却至0℃。将49.4 g丙醛溶解于82ml甲醇中并缓慢加入溶液中。将205 g三乙酰氧基硼氢化钠以5份加入冷却的溶液中，将溶液在0℃下搅拌2小时，其后缓慢加热至30℃并在室温下搅拌36小时。过滤悬浮液，并通过蒸发部分移除溶剂至约500 ml。
加入500 ml乙酸乙酯和500 ml H2O，并通过加入10摩尔NaOH溶液将pH调节至pH10。分离有机相后，将H2O相用500 ml乙酸乙酯再次萃取，并在干燥后将合并的有机相完全蒸发。
在高真空下蒸馏残余物。
1H-NMR (500 MHz): 0.85-0.99 ppm, 15 H (-CH3), 1.21-1.43 ppm, 6 H (-CH2-), 2.35-2.42和2.60-2.66 ppm, 4 H (-N-CH-)。
乙基-二异丙基-胺=二异丙基乙胺= CAS登记号7087-68-5 (=DIEA)，来自SigmaAldrich。
实施例2：特异性和背景信号的电压依赖性
ECL测量使用Roche Elecsys®案板进行，所述Roche Elecsys®案板类似于RocheElecsys® 1010或Roche Elecsys® 2010，其包括在工作电极处施加不同电位的能力。如对于Roche Elecsys® 2010所推荐使用下面提及的测定的方案。使用具有各种组成的缓冲液研究ECL对测量电压的依赖性。缓冲液的一般组成如下：
300 mM磷酸盐
0.1％聚多卡醇
共反应剂如下所指定；使用KOH/H3PO4将最终pH调节至pH 6.8。共反应剂及其浓度为：
缓冲液A (TPA)：180 mM三丙胺
缓冲液B (DPIBA)：120 mM二丙基异丁胺
缓冲液C (DIEA)：200 mM二异丙基乙胺
缓冲液D (TBA)：180 mM三丁胺
缓冲液E (EP)：200 mM乙基哌啶
缓冲液F (DIBPA)：80mM二异丁基丙胺。
这里报道的缓冲液的共反应剂浓度是关于信号产率的优化浓度。缓冲液A包含不含防腐剂的ProCell的缓冲液组合物，并充当参考缓冲液。ProCell是目前用于Elecsys分析仪的现有技术缓冲液。EP、TBA和磷酸盐购自Sigma Aldrich，并且不经进一步纯化即使用。
缓冲液A-F用于确定测定缓冲液本身(背景，图2)和人工免疫测定(SAP，图1)的ECL。后者是包括用于高特异性信号的RuBpy标记的微粒的测定。在不同测量电压下进行背景和SAP的测量，并记录ECL信号。SAP和背景之间的比率是比较不同缓冲液对测定灵敏度的影响的良好指标(图3)。
所有胺的一致特性在于它们的背景随着施加的电压指数增加。所有曲线的公平描述由下式给出：
(方程1)。
TPA常用的测量电压为1400mV。根据方程1，电压降低至1100mV使BG降低~ 3.8倍。然而，这种减少可以通过特异性ECL信号的强烈损失来补偿。相比之下，支链的共反应剂的独特电压依赖性允许利用低测量电压，因此显著改进S/BG比。
实施例3：TnT测定中的测定性能比较
作为商业体外诊断测定，使用Elecsys® TnT测定(Elecsys®的TroponinT1.Gen测定；订货号：05092744-190)来测定信噪比。在TnT测定中使用无分析物样品(DilMa；订货号：3609987)以给出低水平背景信号(N)。在TnT测定中使用TnT校准物2 (TnT Cal 2；订货号：05092752-190)以给出高信号值(S)。
使用各种珠粒类型进行每种测定。这些是珠粒A(Elecsys® TnT测定中使用的标准Elecsys珠粒)、珠粒B (M-270，链霉抗生物素蛋白包被的羧基珠粒，Invitrogen)和珠粒C(M-280，链霉抗生物素蛋白包被的甲苯磺酰基珠粒，Invitrogen)。为了获得参考，使用珠粒类型A-C在标准Elecsys条件(1400mV测量电压)下用缓冲液A进行测定。获得的信号充当标准条件的100％参考。第二组实验以相同的方式进行，但使用缓冲液B和根据实施例2中发现的结果优化的条件(1100mV测量电压)(图4A)。从图4B可见，可以独立于所使用的珠粒类型实现~2的S/BG比的提高。
实施例4：Ir和Ru标记物的电压依赖性信号行为
此外，分析钌和铱标记物在SAP测定中的电压依赖性信号行为。在一种情况下，使用的链霉抗生物素蛋白包被的微粒用钌-配合物(生物素-DADOO-磺基-Ru，式(VIII))标记，在另一种情况下用铱-配合物(生物素-DADOO-IB3/47，式(IX))标记。将信号用最大ECL信号进行归一化以比较曲线。在Ir-标记物的情况下，当测量电压从1400mV降低至1100mV时，6％的特异性信号丢失。在Ru-标记物的情况下，测量电压的相同降低导致28％信号降低。
生物素-DADOO-磺基-BPRu：
式(VIII)。
生物素-DADOO-IB3/47：
式(IX)。
实施例5：α-支链侧链对胺氧化电位的影响
为了评估侧链支化对叔胺氧化电位的影响，记录了磷酸盐缓冲液中TPA、DPIBA和DIBPA的循环伏安图(CV)。将共反应剂溶液引入Elecsys测量室V 7.0，其与来自Biologic,France的SP-300恒电位仪连接。选择开路电位作为起始电位，并且在1.1和-0.5V之间以0.3V/s的扫描速率测量CV。随后将获得的CV用恒电位仪软件(EC-labs)中可用的拟合函数拟合，以估计不同共反应剂的标准氧化电位。显然，氧化电位从TPA降低至DPIBA降低至DIBPA，这与不同共反应剂的支链侧链的数量一致。此类胺的氧化电位降低解释了ECL生成所需的降低的电位。

Claims (19)

1.检测电化学发光(ECL)信号的方法，其包括
a)使反应组合物与电极接触，所述反应组合物包含
i)至少一种支链叔胺，和
ii)包含过渡金属配合物的ECL化合物，
b)电化学触发发光的释放，和
c)检测ECL信号，
其中所述支链叔胺是表1至4中任一个的化合物1至122之一。
2.权利要求1的方法，其中所述支链叔胺是表1至3中任一个的化合物1至83之一。
3.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述支链叔胺是表1或2的化合物1至75之一。
4.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述支链叔胺是根据通式(VII)的化合物：
其中R10至R15独立地选自-H和甲基，其中R10至R12中的至少一个是甲基；且其中如果R10、R11和R12是甲基，则R13至R15中的至少一个是甲基。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述支链叔胺是N,N-二(仲丁基)-丙胺(“N,N-二异丁基-丙胺”，DIBPA)、N,N-二丙基-N-(仲丁基)胺(“N,N-二丙基-异丁胺”，DPIBA)和/或N,N-二异丙基-N-乙胺(DIEA)。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述支链叔胺是DIBPA或DPIBA，在一个实施方案中是DIBPA，在一个实施方案中是DPIBA。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述过渡金属配合物包含铱离子、钌离子、铼离子、锇离子、铕离子、铽离子和镝离子中的至少一种。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述过渡金属配合物包含钌离子或包含铱离子；在一个实施方案中，其中所述包含过渡金属配合物的化合物选自Ru(bpy)3 2+、Ru(bpy)2-bpyCO-OSu)、磺基-BPRu NHS酯、BPRuUEEK-辛二酸酯-OSu、BPRu-(UE)-25-K-辛二酸酯-OSu、BPRu2-SK2-辛二酸酯-OSu、4,4‘,5‘,5-四甲基联吡啶Re(I)(4-乙基吡啶)(CO)3 +CF3SO3 -或Pt(2-(2-噻吩基)吡啶)2、Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸酯及其亲水衍生物，在一个实施方案中，其中所述过渡金属配合物包含铱离子，在一个进一步实施方案中，其中所述包含过渡金属配合物的化合物是Ir(6-苯基菲啶)2-2-(羧乙基-苯基)吡啶-2-甲酸酯。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述电极包含Au、Ir、Pt或碳或由其组成，在一个实施方案中是掺硼金刚石电极或玻璃碳电极；在一个实施方案中包含铂、金或玻璃碳或由其组成，在一个实施方案中包含铂或由其组成。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述电化学触发发光的释放包括相对于Ag/AgCl-电极在工作电极处施加0.8 V至1.3 V，在一个实施方案中0.9 V至1.1 V的电位。
11.用于经由电化学发光检测来检测样品中的分析物的方法，其包括以下步骤：
a) 使所述样品与用包含过渡金属配合物、在一个实施方案中包含三(2,2'-联吡啶)钌配合物(Ru(bpy)3 2+)的电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，
b) 分离分析物结合和不含分析物的标记的检测试剂，
c) 根据权利要求 1至10中任一项的方法检测ECL，其中所述检测试剂是所述包含过渡金属配合物的化合物，和
d) 基于步骤c)中的ECL检测的结果检测分析物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于试剂组合物包含浓度为至少50 mM，浓度为至多500 mM，在一个实施方案中浓度为50 mM至500 mM，在一个进一步实施方案中75 mM至350 mM，在一个进一步实施方案中100 mM至250 mM的支链叔胺。
13.用于检测ECL的试剂组合物，其包含
i) 支链叔胺，特别是如权利要求1至6中任一项所述的支链叔胺，作为共反应剂，和
ii) 另外的ECL试剂。
14.根据权利要求13所述的试剂组合物，其中所述另外的ECL试剂是包含过渡金属配合物的ECL化合物、防腐剂、缓冲化合物、洗涤剂、无机盐，特别是卤化钠或消泡剂或其任何组合；和/或包含羧酰胺或酰胺，在一个进一步实施方案中进一步包含任选地卤化的乙酰胺、丙酰胺或丁酰胺，在一个进一步实施方案中进一步包含丙酰胺。
15.如权利要求1至6中任一项所述的支链叔胺和/或根据权利要求13或14所述的试剂组合物在检测ECL中的用途。
16.用于检测ECL的试剂盒，其包含i)如权利要求1至4中任一项所述的支链叔胺和ii)ECL试剂。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述ECL试剂是包含过渡金属配合物的ECL化合物和/或ECL支持试剂。
18.根据权利要求13或14所述的试剂组合物、根据权利要求15所述的用途或根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中所述支链叔胺是如权利要求1至6中任一项所述的支链叔胺。
19.ECL设备，其包括如权利要求1至6中任一项所述的支链叔胺。
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