JP2003057243A

JP2003057243A - 新規の固相分析方法

Info

Publication number: JP2003057243A
Application number: JP2001244765A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Otake; 和彦大竹; Masaharu Akimoto; 雅治秋本
Original assignee: Iatron Laboratories Inc; Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: Iatron Laboratories Inc; Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Priority date: 2001-08-10
Filing date: 2001-08-10
Publication date: 2003-02-26

Abstract

(57)【要約】【課題】被検試料に含まれる分析対象物質を、簡便
に、且つ高感度に分析することのできる分析方法を提供
する。【解決手段】第１の分析方法は、被検試料と、分析対
象物質に特異的に結合可能な標識化パートナーとを接触
させる工程；得られた反応物を、複合体を担持可能で且
つ未反応の標識化パートナーを除去可能な固相支持体と
接触させる工程；及び固相支持体上の標識物質に由来す
る信号を分析する工程を含む。第２の分析方法は、被検
試料と、標識化パートナーと、標識化パートナーを除去
可能な固相支持体に固定化された別のパートナーとを接
触させる工程；及び固相支持体上の標識物質に由来する
信号を分析する工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規の固相分析方
法に関する。なお、本明細書における「分析」には、分
析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対
象物質の存在量を決定する「定量」との両方が含まれ
る。

【０００２】

【従来の技術】分析対象物質を高感度に分析する方法
は、従来からあらゆる分野で多岐に検討されてきた。特
に臨床検査の分野では、疾病を正確に把握するために、
より高感度な分析法が求められている。例えば、１９５
０年代後半にラジオイムノアッセイが開発され、その感
度及び特異性の高さから広く用いられるようになった。
しかし、この方法は、放射性同位元素を用いるため、そ
の取扱には多くの制限を受け、専用の施設を有する機関
でしか実施することができないというデメリットも存在
していた。そこで、放射性同位元素を用いて標識する代
わりに、酵素、蛍光物質、又は発光物質などを用いて標
識しようという試みがなされ、様々な測定方法が開発さ
れてきた。

【０００３】酵素標識を用いる測定方法は、一般に酵素
免疫測定法といわれ、例えば、ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、又はアルカリ
フォスファターゼ等が用いられている。酵素量を知るに
は、その酵素に適した基質を用い、その変化量を検出す
る。発色反応の場合には、一定の波長における吸光度を
測定し、蛍光物質が遊離する基質の場合には、励起光を
照射し、放射された蛍光を測定する。また、発光反応を
起こす基質の場合には、光源は必要なく、暗室で光電子
倍増管を用いて光量を測定する。

【０００４】標識に用いられている発光物質としては、
例えば、イソルミノール又はアクリジニウムエステル等
がある。前者は過酸化水素とミクロペルオキシダーゼと
の組み合わせにより、後者はアルカリ性過酸化水素の添
加により発光反応が起こり、前記の発光基質と同様にし
て測定する。

【０００５】また、蛍光物質としては、例えば、フルオ
レッセイン、ローダミン、ユーロピウムキレート、サマ
リウムキレート、又はテルビウムキレート等が用いられ
ており、特にユーロピウムキレート、サマリウムキレー
ト、又はテルビウムキレートなどのランタノイド属キレ
ートでは、蛍光消光時間が他の物質に比べて長いため、
励起光をパルスであてて、測定干渉物質の蛍光が消光し
た後の蛍光を測定する時間分解蛍光測定によって感度及
び特異性を向上させている。更に、ランタノイド属キレ
ートを用いた蛍光測定では、ランタノイド属と配位する
リガンドの種類によって蛍光強度に差が出ることが知ら
れている。ユーロピウムキレートの場合には、ユーロピ
ウムイオンと配位するリガンドとして、例えば、４，７
−ビス−（クロロスルフォフェニル）−１，１０−フェ
ナントロリン−２，９−ジカルボン酸、１，１，１−ト
リフルオロ−４−（２’−ナフチル）−２，４−ブタン
ジオン、又は４，４’−ビス（１”，１”，１”，
２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”
−ヘキサンジオン−６”−イル）−クロロスルホ−ο−
テルフェニル等が開発されている。

【０００６】これらの標識物質を用いる測定系にも、種
々の形態がある。例えば、分析対象物質が抗原である場
合には、（１）抗体を固定化した担体と、標識物質を結
合した抗体とにより、分析対象物質である抗原を挟むよ
うに結合し、洗浄操作の後に、担体に結合した標識物質
の量から抗原量を知るサンドイッチ法、（２）分析対象
物質と同じ抗原をコートした担体と、標識抗体とを組み
合わせ、未知量の分析対象物質と反応させ、担体に結合
した標識抗体の減少量から分析対象物質量を知る競合
法、あるいは、（３）同様に、抗体コート担体と標識抗
原とを組み合わせ、未知量の分析対象物質と反応させ、
担体に結合した標識抗原の減少量から分析対象物質量を
知る競合法である。また、分析対象物質が抗体である場
合には、抗原を固定化した担体と、標識物質を結合した
抗原とにより、分析対象物質である抗体を挟むように結
合し、洗浄操作の後に、担体に結合した標識物質の量か
ら抗体量を知るサンドイッチ法というように、前記の抗
原と抗体とを入れ替えた形で測定系を組むことができ
る。この測定系では、抗原コート担体と標識抗原とは、
分析対象物質である抗体の二価の結合部位とそれぞれ反
応する。

【０００７】これまで述べた例は、抗原と抗体との結合
性を利用するイムノアッセイについての例であったが、
その他に、ＤＮＡが二重鎖を形成する性質を利用するハ
イブリダイゼイション法がある。標的ＤＮＡと相補的な
プローブを担体に結合しておき、標的ＤＮＡと反応させ
た後に、もう１個の別なプローブにビオチンを結合した
ものを反応させ、最後にアビジンと標識物質との複合体
を反応させるというものである。この場合も、担体に結
合した標識物質量から標的ＤＮＡの量を知ることができ
る。

【０００８】各種の前記標識物質の中でも、蛍光物質
は、酵素のように室温でも失活してしまうような不安定
さもなく、取り扱いに便利な面もあるが、酵素のように
シグナルを増幅する機能がない。その結果、蛍光物質を
用いた測定系は、酵素標識を用いた測定系よりも感度が
劣るという欠点を持っていた。蛍光物質の有する扱い易
さ及び安定さを生かし、しかも、酵素標識のような高感
度な測定系を構築する方法としては、例えば、（１）被
検試料量を増やし、結果的に低濃度の分析対象物質まで
測定する方法、（２）より多くの蛍光物質をリガンドに
標識するために、タンパク質ポリマー、糖、又は合成高
分子等に多くの蛍光物質を結合し、それをリガンドに結
合する方法、あるいは、（３）被検試料中の分析対象物
質をより効率的に集めるために、リガンドを結合した磁
性粒子を被検試料中に分散反応させ、磁石で集める方法
などが考えられる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかし、被検試料量を
増やす前記方法（１）は、被検試料量が少ない場合には
適用することができない。また、前記方法（２）及び方
法（３）においては、蛍光物質で標識したリガンドを調
製する工程が複雑である。従って、本発明の課題は、よ
り簡便で、且つ高感度な分析方法を提供することにあ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
る、（１）分析対象物質を含む可能性のある被検試料
と、（２）前記分析対象物質に特異的に結合可能であっ
て、しかも、直接又は間接的に標識物質で標識化された
パートナーとを接触させる工程（被検試料及びパートナ
ー接触工程）；前記接触により得られた反応物を、前記
分析対象物質と前記標識化パートナーとの複合体を担持
可能であって、しかも、未反応の前記標識化パートナー
を除去可能な固相支持体と接触させる工程（固相支持体
接触工程）；及び前記固相支持体上の前記標識物質に由
来する信号を分析する工程（分析工程）を含むことを特
徴とする、固相分析方法［以下、１パートナー法（ａ）
と称する］により解決することができる。また、本発明
は、（１）分析対象物質を含む可能性のある被検試料
と、（２）前記分析対象物質に特異的に結合可能であっ
て、しかも、間接的に標識物質で標識化することのでき
るパートナーとを接触させる工程（被検試料及びパート
ナー接触工程）；前記接触により得られた反応物におい
て、前記パートナーを間接的に標識化する工程（標識化
工程）；前記標識化により得られた反応物を、前記分析
対象物質と前記標識化パートナーとの複合体を担持可能
であって、しかも、未反応の前記標識化パートナーを除
去可能な固相支持体と接触させる工程（固相支持体接触
工程）；及び前記固相支持体上の前記標識物質に由来す
る信号を分析する工程（分析工程）を含むことを特徴と
する、固相分析方法［以下、１パートナー法（ｂ）と称
する。また、前記１パートナー法（ａ）と１パートナー
法（ｂ）とを併せて、１パートナー法と称する］に関す
る。

【００１１】また、本発明は、（１）分析対象物質を含
む可能性のある被検試料と、（２）前記分析対象物質に
特異的に結合可能であって、しかも、直接又は間接的に
標識物質で標識化されたパートナーと、（３）前記標識
化パートナーとは異なる部位で前記分析対象物質に特異
的に結合可能であって、しかも、前記標識化パートナー
を除去可能な固相支持体に固定化されたパートナーとを
接触させる工程（三者接触工程）；及び前記固相支持体
上の前記標識物質に由来する信号を分析する工程（分析
工程）を含むことを特徴とする、固相分析方法［以下、
２パートナー法（ａ）と称する］に関する。更に、本発
明は、（１）分析対象物質を含む可能性のある被検試料
と、（２）前記分析対象物質に特異的に結合可能であっ
て、しかも、間接的に標識物質で標識化することのでき
るパートナーと、（３）前記標識化パートナーとは異な
る部位で前記分析対象物質に特異的に結合可能であっ
て、しかも、前記標識化パートナーを除去可能な固相支
持体に固定化されたパートナーとを接触させる工程（三
者接触工程）；前記接触により得られた固相支持体と、
前記標識化可能パートナーを間接的に標識化することの
できる標識物質とを接触させる工程（標識物質接触工
程）；及び前記固相支持体上の前記標識物質に由来する
信号を分析する工程（分析工程）を含むことを特徴とす
る、固相分析方法［以下、２パートナー法（ｂ）と称す
る。また、前記２パートナー法（ａ）と２パートナー法
（ｂ）とを併せて、２パートナー法と称する］に関す
る。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の分析方法は、同じ信号量
（すなわち、標識物質の存在量）を検出する場合に、液
相中での信号検出量に比較して、固相上での信号検出量
が高感度になるという、本発明者が今回始めて見出した
知見に基づくものである。本発明の分析方法の第１の態
様である「１パートナー法」は、（ａ）分析対象物質を
含む可能性のある被検試料と、前記分析対象物質に特異
的に結合可能な標識化パートナー（すなわち、直接又は
間接的に標識物質で標識化されたパートナー）とを接触
させた後に［１パートナー法（ａ）］；あるいは、
（ｂ）分析対象物質を含む可能性のある被検試料と、前
記分析対象物質に特異的に結合可能であって、間接的に
標識化可能なパートナーとを接触させた後、得られた反
応物において前記パートナーを間接的に標識化した後に
［１パートナー法（ｂ）］；得られた反応物を特定の固
相支持体と接触させ、被検試料が分析対象物質を含む場
合、その固相支持体上に集積された複合体（すなわち、
分析対象物質と標識化パートナーとの複合体）に含まれ
る標識物質に由来する信号を分析する方法である。ま
た、本発明の分析方法の第２の態様である「２パートナ
ー法」は、（ａ）特定の固相支持体に予め固定化された
第１のパートナーと、被検試料と、標識化された第２の
パートナー（すなわち、第１のパートナーとは異なる部
位で分析対象物質に特異的に結合可能であって、しか
も、直接又は間接的に標識物質で標識化されたパートナ
ー）とを接触させた後に［２パートナー法（ａ）］；あ
るいは、（ｂ）特定の固相支持体に予め固定化された第
１のパートナーと、被検試料と、間接的に標識化可能な
第２のパートナーとを接触させた後、得られた反応物に
おいて、前記パートナーを間接的に標識化した後に［２
パートナー法（ｂ）］；被検試料が分析対象物質を含む
場合、前記固相支持体上に集積された複合体（すなわ
ち、固定化第１パートナーと分析対象物質と標識化第２
パートナーとの複合体）に含まれる標識物質に由来する
信号を分析する方法である。このように本発明の分析方
法は、分析対象物質を含む複合体を、特定の固相支持体
上に集積させ、前記固相支持体上において標識物質に由
来する信号を分析するものである。

【００１３】本発明の分析方法で分析することのできる
分析対象物質は、特異的に結合可能なパートナーが存在
し、しかも、安定な複合体（すなわち、分析対象物質と
そのパートナーとの複合体）を形成することのできる物
質である限り、特に限定されるものではない。分析対象
物質とそのパートナーとの組み合わせとしては、例え
ば、抗原と抗体との組み合わせ、酵素と基質との組み合
わせ、受容体とリガンドとの組み合わせ、あるいは、遺
伝子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）とプローブとの組み
合わせ等を挙げることができる。従って、本発明の分析
方法で分析することのできる分析対象物質としては、例
えば、抗原、抗体、酵素、基質、受容体、リガンド、又
は遺伝子を挙げることができる。

【００１４】本発明の分析方法で使用する標識化パート
ナーは、分析対象物質に対する適当なパートナーを、適
当な標識物質で、直接又は間接的に標識することにより
調製することができる。前記標識物質としては、従来周
知の物質をそのまま適用することができ、具体的には、
例えば、酵素としては、ペルオキシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、又はアルカリフォス
ファターゼ等を挙げることができ、発光物質としては、
イソルミノール又はアクリジニウムエステル等を挙げる
ことができ、蛍光物質としては、フルオレッセイン、ロ
ーダミン、ユーロピウムキレート、サマリウムキレー
ト、又はテルビウムキレート等を挙げることができる。
また、発光遺伝子群を導入した菌も、標識物質として用
いることができる。パートナーと標識物質とは、標識物
質の種類に応じて適宜選択可能な公知の結合方法によ
り、直接的に結合させることもできるし、あるいは、公
知の適当なリンカーを介して、間接的に結合させること
もできる。前記リンカーとしては、例えば、ビオチンと
アビジン（ストレプトアビジンを含む）との組み合わ
せ、キレート様物質［例えば、４，４’−ビス（１”，
１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ
−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）−クロロ
スルホ−ο−テルフェニル（ＢＨＨＣＴ）又はエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等］、及びウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）などを挙げることができる。

【００１５】本発明の１パートナー法では、固相支持体
として、分析対象物質と標識化パートナーとの複合体を
担持可能であって、しかも、未反応の標識化パートナー
（すなわち、分析対象物質と複合体を形成する前の遊離
の標識化パートナー）を除去可能な固相支持体を用い
る。このような固相支持体としては、例えば、多孔性
膜、例えば、メンブレンフィルター（例えば、ポリアミ
ド膜又はセルロース膜など）又は濾紙などを挙げること
ができる。固相支持体として、孔径が、分析対象物質と
標識化パートナーとの複合体の大きさよりも小さく、し
かも、未反応の標識化パートナーの大きさよりも大きい
多孔性膜を使用した場合には、被検試料と標識化パート
ナーとを接触させて得られる反応液を、前記多孔性膜に
通過させると、被検試料が分析対象物質を含む場合、複
合体（すなわち、分析対象物質と標識化パートナーとの
複合体）は多孔性膜上に集積される一方、未反応の標識
化パートナーは多孔性膜を通過し、多孔性膜上には残ら
ない。また、固相支持体として、分析対象物質と標識化
パートナーとの複合体を吸着可能であって、しかも、未
反応の標識化パートナーを吸着させない固相支持体を用
いた場合には、被検試料と標識化パートナーとを接触さ
せて得られる反応液を、前記固相支持体に通過させる
と、被検試料が分析対象物質を含む場合、複合体（すな
わち、分析対象物質と標識化パートナーとの複合体）は
多孔性膜上に集積される一方、未反応の標識化パートナ
ーは多孔性膜を通過し、多孔性膜上には残らない。

【００１６】本発明の１パートナー法（ａ）における被
検試料及びパートナー接触工程では、被検試料と標識化
パートナーとを、被検試料が分析対象物質を含む場合
に、分析対象物質と標識化パートナーとが複合体を形成
することが可能な条件下で接触させる。接触時の反応条
件（例えば、温度又は時間など）は、分析対象物質及び
そのパートナーの種類に応じて適宜選択することができ
る。

【００１７】一方、本発明の１パートナー法（ｂ）にお
ける被検試料及びパートナー接触工程では、被検試料
と、間接的に標識物質で標識化することのできるパート
ナーとを、被検試料が分析対象物質を含む場合に、分析
対象物質と前記パートナーとが複合体を形成することが
可能な条件下で接触させる。接触時の反応条件（例え
ば、温度又は時間など）は、分析対象物質及びそのパー
トナーの種類に応じて適宜選択することができる。間接
的に標識物質で標識化することのできるパートナーとし
ては、例えば、間接的に標識化するのに使用されるリン
カー［例えば、ビオチンとアビジン（ストレプトアビジ
ンを含む）との組み合わせ］の一方を結合したパートナ
ー、例えば、ビオチン結合パートナー、又はアビジン
（ストレプトアビジンを含む）結合パートナーを用いる
ことができる。

【００１８】続いて、本発明の１パートナー法（ｂ）に
おける標識化工程では、前記被検試料及びパートナー接
触工程で得られた反応物において、前記パートナーを間
接的に標識化する。具体的には、例えば、被検試料及び
パートナー接触工程で用いたリンカーの残る一方を結合
した標識物質［例えば、ビオチン結合標識物質、又はア
ビジン（ストレプトアビジンを含む）結合標識物質］
を、被検試料及びパートナー接触工程で得られた反応物
と接触させることにより実施することができる。

【００１９】本発明の１パートナー法［本発明の１パー
トナー法（ａ）及び本発明の１パートナー法（ｂ）を含
む］における固相支持体接触工程では、被検試料及びパ
ートナー接触工程で得られた反応物［本発明の１パート
ナー法（ａ）の場合］、あるいは、標識化工程で得られ
た反応物［本発明の１パートナー法（ｂ）の場合］を固
相支持体と接触させる。前記反応物を固相支持体と接触
させる方法は、特に限定されるものではないが、例え
ば、固相支持体中を反応物を通過（すなわち、濾過）さ
せることにより接触させることもできるし、あるいは、
適当な容器に入れた液状被検試料中に、固相支持体を浸
漬することにより接触させることもできる。

【００２０】続いて、反応物を接触させた固相支持体
を、必要に応じて洗浄することにより未反応の標識化パ
ートナーを完全に除去した後、本発明の１パートナー法
［本発明の１パートナー法（ａ）及び本発明の１パート
ナー法（ｂ）を含む］における分析工程では、固相支持
体上における標識物質に由来する信号を分析する。被検
試料が分析対象物質を含む場合には、固相支持体上に集
積された複合体（すなわち、分析対象物質と標識化パー
トナーとの複合体）に含まれる標識物質に由来する信号
を検出することができる。標識物質に由来する信号の分
析は、使用した標識物質の種類に応じて、それ自体公知
の方法により実施することができる。

【００２１】例えば、標識物質が酵素の場合には、基質
との反応が必要になる。この場合は、例えば、固相支持
体を、基質液を充分に含浸させた液体吸収体（例えば、
不織布、脱脂綿、又はガラスウール等）の上面に置くこ
とで、液体吸収体中の基質液が固相支持体に吸い上げら
れ、固相支持体上で酵素反応が発現する。必要に応じ
て、周知の手段で酵素反応を停止させた後に、あるい
は、一定時間経過後に、固相支持体上の発色を目視又は
光学的手法で検出することにより、分析対象物質の量に
依存する信号が得られる。

【００２２】標識物質が発光物質の場合には、必要に応
じて発光を誘発する反応が必要になる。この場合は、例
えば、別途、適当な反応容器内で発光誘発反応液を調製
しておき、この発光誘発反応液を、固相支持体接触工程
で得られた固相支持体に通過（濾過）させるか、あるい
は、前記発光誘発反応液を充分に含浸させた液体吸収体
（例えば、不織布、脱脂綿、又はガラスウール等）の上
面に、固相支持体接触工程で得られた固相支持体を置
き、液体吸収体中の反応液が固相支持体に吸い上げられ
ることにより、固相支持体上で発光反応を発現させるこ
とができる。必要に応じて周知の手段で発光反応を停止
させた後に、あるいは、一定時間経過後に、固相支持体
上の発光を目視又は光学的手法で検出することにより、
分析対象物質の量に依存する信号が得られる。標識物質
が蛍光物質の場合には、例えば、固相支持体を、そのま
ま蛍光測定機にセットすることにより、分析対象物質の
量に依存する信号が得られる。

【００２３】本発明の１パートナー法では、固相支持体
として、孔径が、分析対象物質と標識化パートナーとの
複合体の大きさよりも小さく、しかも、未反応の標識化
パートナーの大きさよりも大きい多孔性膜を使用する場
合には、複合体の大きさと未反応標識化パートナーの大
きさとの差をより拡大することのできる微粒子担体、例
えば、ラテックス微粒子又は磁性粒子などを用いると、
複合体と未反応標識化パートナーとを容易に濾別するこ
とが可能となり、好ましい。前記微粒子担体の大きさ
は、固相支持体として使用する多孔性膜の孔径よりも大
きければ、特に限定されるものではないが、例えば、
０．０１μｍ〜１００μｍであることができる。

【００２４】具体的には、例えば、被検試料と標識化パ
ートナーとを接触させる際に、前記標識化パートナーと
は異なる部位で分析対象物質に特異的に結合可能な別の
パートナーと前記微粒子担体との複合体（以下、微粒子
結合パートナーと称する）を接触させることができる。
被検試料と標識化パートナーと微粒子結合パートナーと
の３者を接触させる場合の接触順序は、被検試料中に分
析対象物質が含まれている場合に、微粒子結合パートナ
ーと分析対象物質と標識化パートナーとの複合体（微粒
子結合パートナー−分析対象物質−標識化パートナー）
が形成可能である限り、特に限定されるものではなく、
例えば、３者の内から選択した２者を先に接触させた
後、その反応物と残る１者とを接触させることもできる
し、あるいは、３者を同時に接触させることもできる。
前者の場合には、被検試料と標識化パートナーとを接触
させた後、残る微粒子結合パートナーを接触させること
もできるし、被検試料と微粒子結合パートナーとを接触
させた後、残る標識化パートナーを接触させることもで
きるし、あるいは、微粒子結合パートナーと標識化パー
トナーとを接触させた後、残る被検試料を接触させるこ
ともできる。

【００２５】より具体的には、例えば、微粒子結合パー
トナーと被検試料とを反応させた後、次に、この反応液
に標識化パートナーを添加し（あるいは、微粒子結合パ
ートナーと被検試料と標識化パートナーとを同時に反応
させ）、被検試料中に分析対象物質が含まれている場合
には、「微粒子担体−パートナー−分析対象物質−パー
トナー−標識物質」の複合体を形成させることができ
る。得られた反応物を固相支持体に展開すると、固相支
持体上には「微粒子担体−パートナー−分析対象物質−
パートナー−標識物質」と未反応の「微粒子担体−パー
トナー」とが集積され、余剰の「パートナー−標識物
質」は濾別される。必要に応じて固相支持体を洗浄した
後、固相支持体の信号を、例えば、光学的な測定（例え
ば、蛍光測定、又は発光測定等）により分析すると、分
析対象物質の量に依存する信号が得られる。

【００２６】また、微粒子担体として磁性粒子を用いた
場合、例えば、反応容器内で、磁性粒子結合パートナー
と被検試料とを反応させた後、次に、この反応液に標識
化パートナーを添加し（あるいは、磁性粒子結合パート
ナーと被検試料と標識化パートナーとを同時に反応さ
せ）、被検試料中に分析対象物質が含まれている場合に
は、「磁性粒子−パートナー−分析対象物質−パートナ
ー−標識物質」の複合体を形成させることができる。磁
石を用いることにより、反応容器内で「磁性粒子−パー
トナー−分析対象物質−パートナー−標識物質」及び未
反応の「磁性粒子−パートナー」と、余剰の「パートナ
ー−標識物質」とを分離し、磁性粒子を含む複合体以外
の物質を廃棄する。必要に応じて洗浄した後、反応容器
に適当な溶液（例えば、蒸留水又は緩衝液）を添加し
て、反応及び／又は未反応磁性粒子を懸濁し、得られた
懸濁液を固相支持体に展開すると、固相支持体上には
「磁性粒子−パートナー−分析対象物質−パートナー−
標識物質」と未反応の「磁性粒子−パートナー」だけが
集積される。固相支持体の信号を、例えば、光学的な測
定（例えば、蛍光測定、又は発光測定等）により分析す
ると、分析対象物質の量に依存する信号が得られる。

【００２７】本発明の２パートナー法では、固相支持体
として、分析対象物質に対するパートナーを直接的又は
間接的に固定可能であって、しかも、未反応の標識化パ
ートナー（すなわち、分析対象物質と複合体を形成する
前の遊離の標識化パートナー）を除去可能な固相支持体
を用いる。このような固相支持体としては、例えば、多
孔性膜、例えば、メンブレンフィルター（例えば、ポリ
アミド膜又はセルロース膜など）又は濾紙などを挙げる
ことができる。固相支持体に、分析対象物質に対するパ
ートナーを固定化する方法は、用いる固相支持体及びパ
ートナーの種類に応じて、それ自体公知の固定化方法を
適宜選択することができる。例えば、固相支持体として
メンブレンフィルターを使用し、パートナーとして抗体
又は核酸を使用する場合には、物理的又は化学的に固定
化することができる。間接的にパートナーを固相支持体
に固定化する方法としては、例えば、抗体感作ラテック
ス微粒子を固相支持体に展開する方法を挙げることがで
きる。

【００２８】本発明の２パートナー法（ａ）における三
者接触工程では、固相支持体上に固定化されたパートナ
ー（固定化パートナー）と被検試料と標識化パートナー
とを、被検試料が分析対象物質を含む場合に、固定化パ
ートナーと分析対象物質と標識化パートナーとが複合体
を形成することが可能な条件下で接触させる。接触時の
反応条件（例えば、温度又は時間など）は、分析対象物
質及びそのパートナーの種類に応じて適宜選択すること
ができる。また、３者を接触させる順序も、被検試料中
に分析対象物質が含まれている場合に、固定化パートナ
ーと分析対象物質と標識化パートナーとの複合体（固定
化パートナー−分析対象物質−標識化パートナー）が形
成可能である限り、特に限定されるものではなく、例え
ば、３者の内から選択した２者を先に接触させた後、そ
の反応物と残る１者とを接触させることもできるし、あ
るいは、３者を同時に接触させることもできる。前者の
場合には、固定化パートナーと被検試料とを接触させた
後、残る標識化パートナーを接触させることもできる
し、被検試料と標識化パートナーとを接触させた後、そ
の反応物と固定化パートナーとを接触させることもでき
るし、あるいは、固定化パートナーと標識化パートナー
とを接触させた後、残る被検試料を接触させることもで
きる。

【００２９】一方、本発明の２パートナー法（ｂ）にお
ける三者接触工程では、固定化パートナーと、被検試料
と、間接的に標識物質で標識化することのできるパート
ナー（標識化可能パートナー）とを、被検試料が分析対
象物質を含む場合に、固定化パートナーと分析対象物質
と標識化可能パートナーとが複合体を形成することが可
能な条件下で接触させる。接触時の反応条件（例えば、
温度又は時間など）は、分析対象物質及びそのパートナ
ーの種類に応じて適宜選択することができる。間接的に
標識物質で標識化することのできるパートナーとして
は、例えば、間接的に標識化するのに使用されるリンカ
ー［例えば、ビオチンとアビジン（ストレプトアビジン
を含む）との組み合わせ］の一方を結合したパートナ
ー、例えば、ビオチン結合パートナー、又はアビジン
（ストレプトアビジンを含む）結合パートナーを用いる
ことができる。

【００３０】続いて、本発明の２パートナー法（ｂ）に
おける標識物質接触工程では、前記三者接触工程で得ら
れた固相支持体と、標識化可能パートナーを間接的に標
識化することのできる標識物質とを接触させることによ
り、被検試料が分析対象物質を含む場合に、固相支持体
上に形成される、固定化パートナーと分析対象物質と標
識化可能パートナーとの複合体中の標識化可能パートナ
ーを間接的に標識化することができる。標識化可能パー
トナーを間接的に標識化することのできる標識物質とし
ては、例えば、三者接触工程で用いたリンカーの残る一
方を結合した標識物質［例えば、ビオチン結合標識物
質、又はアビジン（ストレプトアビジンを含む）結合標
識物質］を用いることができる。

【００３１】三者接触工程で得られた固相支持体［本発
明の２パートナー法（ａ）の場合］、あるいは、標識物
質接触工程で得られた固相支持体［本発明の２パートナ
ー法（ｂ）の場合］を、必要に応じて洗浄することによ
り未反応の標識化パートナーを完全に除去した後、本発
明の２パートナー法［本発明の２パートナー法（ａ）及
び本発明の２パートナー法（ｂ）を含む］における分析
工程では、固相支持体上における標識物質に由来する信
号を分析する。被検試料が分析対象物質を含む場合に
は、固相支持体上に集積された複合体（すなわち、固定
化パートナーと分析対象物質と標識化パートナーとの複
合体）に含まれる標識物質に由来する信号を検出するこ
とができる。標識物質に由来する信号の分析は、使用し
た標識物質の種類に応じて、それ自体公知の方法（例え
ば、１パートナー法において先に説明した各種方法）に
より実施することができる。

【００３２】本発明の２パートナー法において、固定化
パートナーとして抗体感作ラテックス微粒子を用いる場
合には、例えば、以下の手順に従って実施することがで
きる。すなわち、抗体感作ラテックス微粒子を予め固相
支持体に展開して乗せておく。別途、分析対象物質と標
識化抗体とを反応させ、その反応液を前記固相支持体に
展開する。被検試料中に分析対象物質が含まれている場
合、固相支持体上には「ラテックス微粒子−抗体−分析
対象物質−抗体−標識物質」と未反応の「ラテックス微
粒子−抗体」とが集積され、余剰の「抗体−標識物質」
は濾別される。必要に応じて固相支持体を洗浄した後、
固相支持体の信号を、例えば、光学的な測定（例えば、
蛍光測定、又は発光測定等）により分析すると、分析対
象物質の量に依存する信号が得られる。

【００３３】本発明の趣旨は、同じ信号量（標識物質の
存在量）を検出するにおいて、液相中での信号検出量に
比較して、固相支持体上での信号検出量が高感度にな
る、という知見から成り立っている。例えば、蛍光物質
の蛍光量を蛍光測定装置を用いて測定する場合には、測
定対象にその蛍光物質に特異的な波長の励起光を照射
し、その照射された部分から放射される蛍光を特異的な
波長で測定する方法がとられる。液相の場合、散乱等に
よる測定感度のロスが生じ、被検試料中の分析対象物質
の存在量が少ない場合にはその影響は大きい。対して、
本発明の場合、少なくとも液相による溶液由来の散乱ロ
スの影響がなくなり、且つ、分子の運動量が無くなるこ
とで蛍光の揺らぎが軽減し、結果的に検出し得る蛍光強
度が高くなり、感度が上昇したものと思われる。

【００３４】以下、本発明の具体的態様を示すが、当業
者であれば本件技術範囲内での様々な改変が可能であ
る。なお、以下に示す具体的態様は、本発明の１パート
ナー法を前提としたものであるが、本発明の２パートナ
ー法にも適用可能である。例えば、大量の検体について
分析を行なうには既存の自動分析装置に適用することが
好適である。９６ウェル（あるいは、８ウェル、１６ウ
ェル、又は３２ウェルでも可能である）のプラスチック
プレートを用いれば、各種検出装置（例えば、蛍光測
定、発光測定、又は吸光度測定のための各種検出装置）
の利用が可能であり、最終検出方法の選択肢が広がる。
この場合、固相支持体としてメンブレンフィルターをウ
ェルのサイズに切り抜き、吸収パッド（例えば、不織布
等）上に準備する。例えば、別途反応させた「粒子−抗
体−抗原−抗体−蛍光」複合体を含む反応液の全量をメ
ンブレンフィルター上に展開（アプライ）する。吸収パ
ッドの作用により、反応液はメンブレンフィルターを通
過しやすくなり、大量の反応液を処理することができ
る。続いて、メンブレンフィルターをプレートのウェル
に挿入して、このプレートを測定装置にセットして蛍光
測定を行なうことで抗原の量に依存する蛍光量が検出さ
れる。あるいは、メンブレンフィルターがウェルの底部
に設置されているプラスチックプレートを用いても良
い。分析対象物質濃度が微量であれば、試料の量を増加
させて感度を稼ぐことができる。

【００３５】また、標識した物質の信号を直接検出では
なく、酵素反応や発光反応を利用する場合には、前記と
同様の操作で「粒子−抗体−抗原−抗体−発光（又は酵
素）」をメンブレンフィルターに集積後、吸収パッドを
取り除き、反応に必要な試薬（例えば、基質等）を含ん
だ吸収パッド上にメンブレンフィルターを移動すること
で、逆に試薬がメンブレンフィルターに供給され、所望
の反応が発現する。これを同様にプレートのウェルに挿
入して、測定装置によって信号を検出することができ
る。

【００３６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】《液相と固相での検出感度の比較》ユーロ
ピウム結合ラテックス（製品名＝ＵｎｉｆｏｒｍＭｉ
ｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；セラダイン社）を蒸留水で
３０倍に希釈した希釈液を標準とした。この希釈液を更
に蒸留水で希釈して、１／１０、２／１０、４／１０、
６／１０、８／１０、及び１０／１０の希釈系列を調製
した。別途、９６ウェルマイクロプレート（製品名＝Ｍ
ａｘｉｓｏｒｐ９６Ｗｅｌｌ，底部＝側面黒タイプ；
Ｎｕｎｃ社）のウェル内に入るように、メンブレンフィ
ルター（ポアサイズ＝０．４５μｍ；ミリポア社）を打
ち抜き、吸収パッド（不織布）の上に置いた。これらの
メンブレンフィルター上に、ユーロピウム結合ラテック
スの各希釈系列３００μＬを展開（アプライ）した。希
釈液を吸収パッドに充分吸い込ませた後、９６ウェルマ
イクロプレート内にメンブレンフィルターを底部まで挿
入した。このプレートを蛍光測定機（ＣＹＴＯＦＬＵ
ＯＲＭｕｌｔｉ−ｗｅｌｌＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ
Ｓｅｒｉｅｓ４０００；ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にセットして、各ウェルの蛍光強
度を測定した。前記測定は、励起波長が３６０ｎｍであ
り、測定波長が６２０ｎｍであり、そして、スキャン／
サイクルが６である測定条件で実施した。また、比較例
として、前記希釈系列３００μＬを直接各ウェルに添加
し、蛍光強度を測定した。

【００３７】結果を表１に示す。表１に示すように、本
発明方法によれば、標識物質の量が同一の場合、液相に
比較して固相支持体上に集積して信号を検出すること
で、シグナル値が大幅に増加し、特に低濃度ほど効果が
大きいことが確認された。

【００３８】《表１》希釈系列 1/10 2/10 4/10 6/10 8/10 10/10 比較例 5874 10877 19461 28054 33736 37758実施例 32172 48399 63088 64873 77413 81205

【００３９】

【実施例２】《ＡＦＰ量の測定》（１）抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体の磁性粒子への
コーティングヒトαフェトプロテイン（ＡＦＰ）に対するモノクロー
ナル抗体（オリエンタル酵母社）を０．１ｍｏｌ／Ｌ炭
酸緩衝液（ｐＨ９．６）で３０μｇ／ｍＬになるように
希釈した。この希釈液と、磁気粒子（２．８μｍ；ダイ
ナル社）１×１０⁷〜１０⁸個／ｍＬを含む０．１ｍｏｌ
／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）とを、等量混合し、４℃
で一夜静置した。磁石で抗体感作磁気粒子を集め、上清
を吸引除去して、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１％
を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４回洗浄し、前記
緩衝液を加えて、４℃で一晩放置した。磁石で粒子を集
めて上清を吸引除去して、０．０２％アジ化ナトリウム
含有０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁
して、抗体感作磁気粒子懸濁液とした。

【００４０】（２）ビオチン標識抗ＡＦＰポリクローナ
ル抗体の調製抗ヒトＡＦＰウサギ血清よりアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いて得られた特異抗体を、ビオチン標識用
抗体として用いた。前記標識用抗体を０．１ｍｏｌ／Ｌ
炭酸緩衝液（ｐＨ９．１）で０．２５ｍｇ／ｍＬに希釈
し、得られた希釈液１ｍＬにＮ−ハイドロキシスクシン
イミド化ビオチン４５０μｇを加えた。室温で１時間反
応させた後に、反応に寄与しなかったＮ−ハイドロキシ
スクシンイミド化ビオチンをセファデッックスＧ２５カ
ラムにより除去し、ビオチン標識抗ＡＦＰポリクローナ
ル抗体を得た。

【００４１】（３）ユーロピウム標識ストレプトアビジ
ン−ＢＳＡポリマーの調製ストレプトアビジン５ｍｇとＢＳＡ５ｍｇとを０．１ｍ
ｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍＬに溶解し、
１％グルタルアルデヒド０．１ｍＬを加えた。４℃で２
４時間反応させた後に、水素化ホウ素ナトリウム２ｍｇ
を加え、室温で２時間静置反応させた。得られた反応液
を、生理食塩水４Ｌを用いて４℃で２回透析した後に、
全量が１５ｍＬになるように蒸留水を加えた。その溶液
に炭酸水素ナトリウム１２６ｍｇを加えた後、１ｍｏｌ
／Ｌ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを９．１に調整した。

【００４２】続いて、脱水エタノール０．３ｍＬに溶解
した４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，
３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジ
オン−６”−イル）−クロロスルホ−ο−テルフェニル
（ＢＨＨＣＴ）１０ｍｇを、反応液に攪拌しながら滴下
した。１時間攪拌した後に、沈殿物を遠心分離によって
取り除き、０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素アンモニウム緩
衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−５
０カラムクロマトグラフィーによって、ＢＨＨＣＴ標識
タンパク質と未反応のＢＨＨＣＴとを分離した。ＢＨＨ
ＣＴ標識タンパク質画分を集め、ＢＳＡ５０ｍｇとアジ
化ナトリウム２０ｍｇとを加え、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐ
Ｈ６．２に調整した。反応液を１．０×１０^-7Ｍ塩化ユ
ーロピウム、０．２％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウ
ム、及び０．９％塩化ナトリウム含有０．０５ｍｏｌ／
Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で７００倍に希釈
し、５６℃で２時間静置することによって、ユーロピウ
ム標識ストレプトアビジン−ＢＳＡポリマーを得た。

【００４３】（４）ＡＦＰのイムノアッセイ前記実施例２（１）で調製した、抗ＡＦＰモノクローナ
ル抗体をコートした磁気粒子２００μＬをミクロチュー
ブに加えた後、別途調製したＡＦＰ標準品の各溶液（０
ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎ
ｇ／ｍＬ、及び１４０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを加え
て、混合し、振とう条件下、３７℃で１時間反応させ
た。磁石で粒子を集めて、洗浄液［０．０５％トウィー
ン２０含有２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）］で３回洗浄した後に、前記実施例２（２）で調製
したビオチン標識抗ＡＦＰポリクローナル抗体（５μｇ
／ｍＬ）１００μＬを各ミクロチューブに添加した。振
とう条件下、３７℃で１時間反応させた後に、前記洗浄
液で４回洗浄した。続いて、前記実施例２（３）で調製
したユーロピウム標識ストレプトアビジン−ＢＳＡポリ
マー（３００ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを各ミクロチュー
ブに添加し、３７℃で１時間反応させた後に、磁石で粒
子を集め、０．０５％トウィーン２０含有０．１ｍｏｌ
／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．１）で４回洗浄し
た。各チューブに０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ
９．６）３００μＬを加えて粒子を懸濁させ、この懸濁
液２５０μＬを実施例１と同様にして、メンブレンフィ
ルター上に粒子を集積し、これをウェルに挿入して蛍光
強度を測定した。また、比較例として、懸濁液２５０μ
Ｌをメンブレンフィルターに集積させる代わりに、前記
各懸濁液２５０μＬを直接各ウェルに加えて、蛍光強度
を測定した。結果を表２に示す。

【００４４】

【００４５】

【発明の効果】本発明方法によれば、同じ数量の標識物
質の信号を測定する場合、液相での検出量に比較して、
固相上で検出を行った方が検出量が増加し、如いては検
出感度を高めることができ、従来は微量ゆえ正確に分析
できなかったものでも、信頼性のある結果が得られる。
また、感度を得るため、反応液を大量にメンブレンフィ
ルターに展開することができ、先の効果と合わせて、極
めて微量な物質の測定を簡便な操作で、しかも、特殊な
装置器具を用いることなく達成することができる。従っ
て、本発明の分析方法によれば、被検試料に含まれる分
析対象物質を、簡便に、且つ高感度に分析（検出又は測
定）することができる。本発明方法により得られる各種
データは、臨床上、重要な診断を下す手助けとなる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）分析対象物質を含む可能性のある
被検試料と、（２）前記分析対象物質に特異的に結合可
能であって、しかも、直接又は間接的に標識物質で標識
化されたパートナーとを接触させる工程；前記接触によ
り得られた反応物を、前記分析対象物質と前記標識化パ
ートナーとの複合体を担持可能であって、しかも、未反
応の前記標識化パートナーを除去可能な固相支持体と接
触させる工程；及び前記固相支持体上の前記標識物質に
由来する信号を分析する工程を含むことを特徴とする、
固相分析方法。
【請求項２】（１）分析対象物質を含む可能性のある
被検試料と、（２）前記分析対象物質に特異的に結合可
能であって、しかも、間接的に標識物質で標識化するこ
とのできるパートナーとを接触させる工程；前記接触に
より得られた反応物において、前記パートナーを間接的
に標識化する工程；前記標識化により得られた反応物
を、前記分析対象物質と前記標識化パートナーとの複合
体を担持可能であって、しかも、未反応の前記標識化パ
ートナーを除去可能な固相支持体と接触させる工程；及
び前記固相支持体上の前記標識物質に由来する信号を分
析する工程を含むことを特徴とする、固相分析方法。
【請求項３】（１）分析対象物質を含む可能性のある
被検試料と、（２）前記分析対象物質に特異的に結合可
能であって、しかも、直接又は間接的に標識物質で標識
化されたパートナーと、（３）前記標識化パートナーと
は異なる部位で前記分析対象物質に特異的に結合可能で
あって、しかも、前記標識化パートナーを除去可能な固
相支持体に固定化されたパートナーとを接触させる工
程；及び前記固相支持体上の前記標識物質に由来する信
号を分析する工程を含むことを特徴とする、固相分析方
法。
【請求項４】（１）分析対象物質を含む可能性のある
被検試料と、（２）前記分析対象物質に特異的に結合可
能であって、しかも、間接的に標識物質で標識化するこ
とのできるパートナーと、（３）前記標識化パートナー
とは異なる部位で前記分析対象物質に特異的に結合可能
であって、しかも、前記標識化パートナーを除去可能な
固相支持体に固定化されたパートナーとを接触させる工
程；前記接触により得られた固相支持体と、前記標識化
可能パートナーを間接的に標識化することのできる標識
物質とを接触させる工程；及び前記固相支持体上の前記
標識物質に由来する信号を分析する工程を含むことを特
徴とする、固相分析方法。