KR0143993B1 - 전기화학 발광성 분석 - Google Patents

전기화학 발광성 분석

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KR0143993B1
KR0143993B1 KR1019900701404A KR900701404A KR0143993B1 KR 0143993 B1 KR0143993 B1 KR 0143993B1 KR 1019900701404 A KR1019900701404 A KR 1019900701404A KR 900701404 A KR900701404 A KR 900701404A KR 0143993 B1 KR0143993 B1 KR 0143993B1
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Abstract

내용없음

Description

[발명의 명칭]
전기화학 발광성 분석]
[발명의 상세한 설명]
본 출원은 1986년 4월 30일에 마세이 일동에 의해 출원되어 계류중인 전기화학 발광성 분석(Electrochemiluminescent Assays)이란 제목의 출원 일련번호 제 858,354호, 1987년 4월 30일에 전기화학 발광성 분석이란 제목으로 마세이 일동에 의해 출원되어 계류중인 PCT 출원 (US87/00987호, 및 1987년 12월 18일에 전기화 확 발광성 분석이란 제목으로 마세이 일동에 의해 출원되어 계류중인 미합중국 국내 단계 PCT 출원 일련 번호 제 858,354호의 일부 계속 출원이다. 본 출원은 또한 1987년 11월 4일에 출원되어 계류중인 마세이 일동의 출원 일련번호제 117,017호의 일부 계속 출원이다. 이러한 출원의 내용들은 참고로 본원에 포함된다.
[발명의 영역]
본 출원은 결합분석, 보다 구체적으로 분석 시스템의 하니 이상의 성분에 의해 방출되는 전자기 방사선을 검출하거나 정량 함으로써 관심있는 분석물의 존재를 측정하는결합분석에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 전기화학 발광성인 부분을 함유하는 분석 조성물에 의해 전자기 방사선이 방출되는 정밀하고 재생가능하며 정확한 비분리 특이결합 분석에 관한 것이다.
[발명의 배경]
생화학 및 생물학적 물질내에서 관심있는 분석물의 검출 및 정량을 위해 수많은 방법 및 시스템이 개발되어 왔다. 미량의 미생물, 의약품, 호르몬, 비루스, 항체, 핵산 및 기타 단백질을 측정할 수 있는 방법 및 시스템은 연구자 및 임상에게 매우 가치가 있다.
당분야에서 매우 본질적인 요체는 잘 알려진 결합 반응, 예컨대, 항원-항체 반응, 핵산 혼성(hibridization)기술 및 단백질-리간드 시스템에 기초하여 개발되어 왔다. 많은 생화학 및 생물학적 결합 시스템에서 고도의 특이성은 연구 및 진단학에서 가치있는 많은 분석 방법 및 시스템을 초래하였다. 전형적으로, 관심있는 분석물의 존재는 하나 이상의 결합 물질에 부착된 관찰가능한 라벨(label)의 존재 또는 부재에 의해 지시된다.
관심있는 분석물을 함유하는 샘플이 화학발광성 라벨로 라벨링된 반응물질과 혼합되는 화학발광성 분석 기술이 개발되어 왔다. 반응혼합물을 항온처리(incubation)하고 라벨링된 반응물질의 일부를 분석물에 결합시킨다. 항온처리후에, 혼합물의 결함된 단편과 결합되지 않은 단편은 분리되고 단편들중 하나 또는 두 단편에서의 라벨의 농도는 화학발광 기술에 의해 측정될 수 있다. 하나 또는 두 단편 내에서 측정되는 화학발광정도는 생물학적 샘플내의 관심있는 분석물의 양을 지시한다.
전기화학발광성(Electrochemiluminescent: ECL) 분석기술은 화학발광기술에 있어서 개선된 것이다. 이는 관심있는 분석물의 존재 및 농도를 민감하고 정밀하게 측정한다. 이런 기술에서, 항온처리된 샘플은 발광을 개시하기 위해 전압계 작동 전극에 노출된다. 적당한 화학 환경에서, 이런 전기화학 발광성은 특별한 방식으로 특정 시간에 작동 전극상에 가해진 전압에 의해 개시된다. 라벨에 의해 발생되는 빛이 측정되며 이는 분석물의 존재 및 양을 지시한다. 이런 ECL 기술의 보다 충분한 설명을 위해, 1985년 10월 24일에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 789,115호, 1986년 4월 30일에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 858,354호, PCT 공개 출원번호 US87/00987호, 1987년 12월 18일에 출원된 미합중국 국내 단계 PCT 출원 일련 번호 제 858,354호 및 1987년 11월 4일에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 117,017호가 참고된다. PCT 공개 출원 US85/02153호(WO 86/02734)가 또한 참고된다. 상기 출원의 개시내용이 참고로 포함된다.
정밀하고 민감한 측정을 할 수 있도록 분석 과정동안 분리 단계를 필요로 하지 않고 전기화학발광성 분석을 수행하고, 분석물의 여러 다른 농도에서 신호조절을 최대화하는 것이 바람직할 것이다. 비분리 분석을 위한 선행기술 방법들 중에는 분석물의 하나이상의 결합 성분들에 결합하기 위해 분석샘플에 현탁된 미립자(microparticulate) 물질을 사용하는 것이 있다. 미합중국 특허 제 4,305,925호는 비탁계 및 탁도계 방법(nephelometric and turbidimetric methods)에 의한 임상적으로 관련있는 단백질 및 펩티드의 검출 및 측정에 관한 것이다. 공개된 방법은 광 산란 또는 흡착의 기능을 수행하는 라텍스(latex) 입자에 항원 또는 항체를 결합시키는 것과 관련된다.
미합중국 특허 제 4,480,042호는 쉘(shell)-코어(core) 입자로 이루어진 입자 반응물을 사용하는 기술에 관한 것이다. 쉘은 관심있는 생물학적 화합물이 공유결합될 수 있는 관능기를 함유하고, 코어의 고굴절율은 광산란 측정에 높은 민감도를 초래한다. 이 기술은 다가 항원과 이가 항체가 반응하여 다양한 방식으로 검출되고 또는 측정될 수 있는 응집물을 생산하는 반응으로부터 초래되는 응집 반응에 기초한다.
미합중국 특허 제 4,419,453호는 마찬가지로 항체 및 면역원과 같은 면역화학물질의 존재를 검출하는데 유용한 착색된 라텍스 응집 시험 방법의 사용에 관한 것이다.
선행 기술에서의 분석 기술 및 분석 매체내 미립자 물질의 사용은 발광 현상이 측정되는 분석에 적용가능하지 않은 것으로 보일 것이다. 자유로운 화학 발광성 또는 전기화학 발광성 부분으로부터의 발광은 흡수되고 산란되거나 또는 그렇지 않으면 미립자 물질로부터 간섭될 것이라고 기대된다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 시험 샘플내에 넓은 농도의 범위에 걸쳐 존재하는 작거나 큰 분석물의 검출을 위한 시약 조성물 및 비분리, 전기화학 발광성 특이결합 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 종래의 비분리 분석방법 및 시약과 비교하여, 보다 빠른 분석 시간, 보다 높은 민감성 및 보다 높은 정밀도를 가지는 개선된 성능을 제공하는 분석방법 및 시약조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 부가적인 목적은 결합반응과 발광성의 측정에 기초하여 다양한 분자 크기 및 농도의 범위를 갖는 다양한 분석물을 검출하는 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 목적과 다른 목적들 및 장점은 본 발명의 아래 설명을 고려한 후에 보다 명백해질 것이다.
[발명의 서술]
한 측면에서 본 발명은 불활성 미립자 물질이 분석 시스템의 결합 반응물질들 중의 하나에 특이적으로 결합되는, 발광현상에 기초한 민감성 특이결합 분석방법에 관한 것이다. 본 발명은 이종(하나 이상의 분리 단계) 분석형태로 이용될 수 있고, 가장 유리하게는 동종 (비분리) 분석 형태로 이용될 수 있다.
또 다른 면에서, 본 발명은 발광현상의 측정을 위한 결합반응에 기초하는 분석용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 분석 혼합물의 일성분에 결합할 수 있는 표면을 갖는 다수의 현탁된 입자를 포함한다.
부가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 분석 조성물을 사용하여 본 발명의 분석 방법을 수행할 수 있는, 샘플내의 관심있는 분석물을 검출하거나 정량하기 위한 시스템에 관한 것이다. 이 시스템은 분석 매체내의 라벨 화함물이 발광하도록 유도하는 수단 및 발광을 측정하는 수단을 포함하여 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 결정한다.
놀랍게도, 전기화학 발광성 부분이 결합되어 있는 분석 시스템의 성분이 현탁된 미립자 물질에 결합되면 상기 성분에 결합된 전기화학 발광성 부분에 의하여 발생되는 발광신호의 세기를 크게 바꿈으로써, 분석 시스템의 특이결합 반응을 모니터하는 수단을 제공하게 됨을 발견하였다. 더 놀랍게는, 현탁된 입자들이 현탁된 미립자 물질에 결합되지 않고 남아 있는 시스템의 상기 성분에 결합된 전기화학 발광성 부분에 의하여 발생되는 발광성 신호의 세기에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다는 것이다.
따라서, 본 발명은 샘플내 관심있는 분석물을 검출하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
(1) 하기 (a),(b) 및 (c)로 이루어지는 조성물을 형성하고;
(a) 관심있는 분석물을 함유하는 것으로 보이는 샘플,
(b) (i) 관심있는 분석물 또는 이의 유사물,
(ii) 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 결합 파트너, 및
(iii) (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응 성분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질(여기서 상기 물질들 중 하나는 발광하도록 유도될 수 있는 화학적 부분을 갖는 라벨 화합물에 결합된다), 및
(c) 상기 분석물 및/또는 (b) (i), (ii) 또는 (iii)에서 정의된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 현탁된 입자;
(2) 상기 라벨 화합물이 발광하도록 유도하고;
(3) 상기 조성물에 의해 방출되는 발광성을 측정하여 상기 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 결정하는 단계로 이루어진다.
천연 또는 합성된 것일 수 있는 관심있는 분석물의 유사물은 분석물에 필적할 만한 결합성질을 갖는 화합물이지만, 더 높거나 낮은 결합능력을 갖는 화합물도 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 결합 파트너는 공지되어 있다. 예로는 항체, 효소, 핵산, 보조인자 및 수용체가 있다. 분석물 또는 그 유사물 및/또는 그 결합 파트너와 결합할 수 있는 반응 성분들은 제 2 항체 또는 단백질 a 또는 단백질 g 와 같은 단백질일 수 있거나, 또는 아비딘이나 비오틴 또는 결합 반응에 참여되는 당분야에 공지된 또 다른 성분일 수 있다.
여기에 제공되는 방법, 분석 조성물, 분석 시약 및 시스템이 관심있는 분석물을 정량하기 위해 사용될 수 있다는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서 본 발명은 샘플내 관심있는 분석물의 검출 및 정량 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은
(1) 하기 (a), (b) 및 (c)를 혼합하고;
(a) 관심있는 분석물을 함유하는 것으로 보이는 샘플,
(b) (i) 첨가된 관심있는 분석물 또는 관심있는 분석물의 유사물,
(ii) 상기 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 결합 파트너, 및
(iii) (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응 성분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 주지량(known amount)의 하나 이상의 물질(여기서 상기 물질들 중 하나는 발광하도록 유도될 수 있는 화학 부분을 갖는 라벨화합물에 결합된다),
(c) 상기 분석물 및/또는 (b) (i),(ii) 또는 (iii)에서 규정된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 주지량의 현탁된 입자;
(2) 상기 라벨 화합물이 발광하도록 유도하고;
(3) 상기 혼합물에서의 발광성과 주지량의 관심있는 분석물을 함유하는 혼합물 내 발광성을 비교하는 단계로 이루어진다.
유리하게는, 발광은 특이결합 파트너에 결합되거나 결합되지 않는 라벨 화합물을 전압계 작용 전극에 노출시킴으로써 유도되는 전기화학발광(ECL)으로부터 생겨난다. 따라서 ECL 반응 혼합물은 빛을 발생시키기 위한 특정방식 및 특정한 시간에 작업 전극에 가해지는 전압에 의해, 빛을 방출하도록 조절가능하게 개시된다.
본원에서 ECL 부분, 금속-함유 ECL 부분, 라벨, 라벨화합물 및 라벨물질이란 용어는 상호 교환 가능하다. 분석물 또는 그 유사물, 분석물 또는 그 유사물의 결합 파트너 및 상기 결합 파트너의 또 다른 결합 파트너, 또는 분석물과 결합할 수 있는 반응 성분, 그 유사 화합물 또는 결합 파트너와 같은 다른 분자에 결합되는 ECL 부분, 금속-함유 ECL 부분, 유기금속, 금속 킬레이트, 전이금속 킬레이트, 회토류 금속 클레이트, 라벨 화합물, 라벨 물질 및 라벨 이라 불리는 종들이 본 발명의 영역내에 포함된다. 상기 종들은 또한 하나 이상의 결합 파트너 및/또는 하나 이상의 반응성분들의 조합물에 결합될 수 있다. 또한 상기 종들은 결합 파트너, 반응 성분, 또는 하나이상의 결합 파트너 및/또는 하나 이상의 반응 성분의 조합물에 결합된 분석물 또는 그 유사물에 결합될 수 있다. 다수의 상기 종들이 상기와 같은 다른 분자를 통하거나 또는 직접 분석물 또는 그 유사물에 결합되는 것 또한 본 발명의 영역내에 있다.
유사하게, 상기 조성물 또는 시스템이 상기 강한 환원제 및 상기와 같은 여기 상태에서의 ECL 부분과 같이 ECL 반응 과정에서 형성되는 불안정하고 준(準)안정한 다른 중간 종들을 포함한다는 것도 본 발명의 영역내에 있다.
또한 가시광의 방출이 본 발명의 특정한 실시양태에서는 유리한 특징일지라도, 조성물 또는 시스템이 적외선 또는 자외선, X-선, 마미크로파 등과 같은 다른 형태의 전자기 방사선을 방출하는 것도 본 발명의 영역내에 있다. 본 발명에서 전기화학발광, 전기화학발광성의, 전기화학발광하다, 발광, 발광성의 및 발광하다라는 용어는 방출되는 것이 빛일 것을 요하지 않으며, 방출이 상기 다른 형태의 전자기 방사선인 경우도 허용한다.
[도면의 간단한 설명]
제 1 도는 본 발명의 미소 미립자에 기초한 비분리 분석을 수행하기 위한 전기화학발광 셀의 개략도;
제 2 도는 제 1 도의 셀과 함께 사용하기 위한 전압 조절장치의 간단한 도면임.
[바람직한 실시양태의 설명]
본 발명은 특정한 바람직한 실시양태의 하기 기술로부터 보다 분명하고 충분하게 이해될 것이다.
비분리 결합 분석 방법, 분석 조성물, 분석 시약 및 시스템에 관한 본 발명은 결합반응에 참여할 수 있는 관심있는 분석물에 넓게 적용할 수 있다. 이런 반응은 예컨대 항원-항체, 리간드 수용체, DNA 및 RNA 상호작용 및 다른 공지된 반응을 포함한다. 본 발명은 다성분 샘플내의 관심있는 분석물의 존재를 정성 및 정량적으로 검출하기 위한 서로 다른 방법 및 분석법에 관한 것이다.
금속-함유 ECL 부분 외에도 전형적인 관심있는 분석물에는 전체세포 또는 표면항원, 아세포(suvcellular)입자, 비루스, 프리온(prion), 비로이드(viroid), 항체, 항원, 합텐(hapten), 지방산, 핵산, 단백질, 리포단백질, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 당단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 세포 신진대사물, 호르몬, 약리학제, 비생물학적 중합체(바람직하게는 가용성), 합성 유기분자, 유기금속 분자, 진정제, 수면제, 알카로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 설탕, 렉틴, 재조합 또는 유도 단백질, 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 샘플에 존재하는 무기 분자가 있다.
전형적으로, 관심있는 분석물은 10 -3몰 이하, 예컨대 적어도 10 -18몰 만큼은 낮은 농도로 존재한다.
관심있는 분석물을 함유하는 샘플과 조합되는 시약은 (i) 상술한 바와 같은 첨가된 관심있는 분석물 또는 그 사유물, (ii) 상기 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 결합 파트너, 및 (iii) 상기 (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 상술한 바와 같은 반응 성분으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하며, 여기서 상기 물질들 중 하나는 발광하도록 유도될 수 있는 ECL 부분과 결합된다. 예컨대, 라벨링된 물질은 전체세포 또는 표면항원, 아세포 입자, 비루스, 프리온, 비로이드, 항체, 항원, 합텐, 지방, 지방산, 핵산, 폴리사카라이드, 단백질, 리포단백질, 리포폴리사카라이드, 당단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 세포 신진 대사물, 호르몬, 약리학제, 진정제, 수면제, 알카로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 설탕, 비생물학적 중합체(바람직하게는 가용성), 렉틴, 재조합 또는 유도 단백질, 합성 유기분자, 유기금속 분자, 무기분자, 비오틴, 아비딘 또는 스트렙트아비딘일 수 있다. 한 실시양태에서, 시약은 단백질 상호작용을 통해 일차 결합 파트너에 결합할 수 있는 다른 이차 결합 파트너 또는 항원, 항체 , 핵산, 합텐, 작은 뉴클레오티드 서열, 올리고머, 리간드, 효소 또는 비오틴, 아비딘, 스티렙트아비딘, 단백질 A, 단밸질 G, 또는 그 복합체에 결합된(conjugated) 전기 화학 발광성 부분이다.
본 발명의 본질적인 특징은 전기화학발광(ECL) 할 수 있는 금속-함유 ECL 부분을 사용하는 것이다. 이는 발광하는 유기 금속 화합물, 예를 들어 4,4',5',5 테트라메틸 비피리딘 Re(I) (4-에틸피리딘) (CO)3+CF3SO3; 및 Pt2-(2-티에닐)2 피리딘과 같은 화합물을 포함한다.
유리하게는, ECL 부분은 금속 킬레이트이다. 상기 킬레이트의 금속은 적합하게는, 문제의 반응 시스템에 가해지는 전기 화학적 조건하에서 발광하는 금속킬레이트의 그러한 임의 금속이다. 이러한 금속 킬레이트의 금속의 예는 전이금속(예컨대, d-블록 전이금속) 또는 회토류 금속이 있다. 금속은 바람직하게 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 백금, 인듐, 팔라듐, 몰리브덴, 테크네륨, 구리 크롬 또는 텅스텐이다. 특히 바람직한 것은 루테늄 및 오스뮴이다.
이런 킬레이트에서 금속에 결합되는 리간드는 보통 천연의 복소환 또는 유기물질이며, 금속 킬레이트가 수성 환경 또는 유기 또는 다른 비수성 환경에서 가용성인지 아닌지 여부를 결정하는 역할을 한다. 리간드는 다좌배위(polydentate)일 수 있으며 치환될 수 있다. 다좌배위 리간드는 방향족 및 지방족 리간드를 포함한다. 적합한 방향족 다좌배위 리간드는 방향족 복소환식 리간드를 포함한다. 바람직한 방향족 복소환식 리간드는 예컨대, 비피리딜, 비피라질, 터피리딜(terpyridyl) 및 페난트롤릴(phenanthrolyl)과 같이 질소를 함유하는 것들이다. 적합한 치환체는 예컨대, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, 카르복실레이트, 카르복스알데히드, 카르복스아미드, 시아노, 아미노, 히드록시, 이미노, 히드록시카르보닐, 아미노카르보닐, 아미딘, 구아니디늄, 우레이드(ureid), 황-함유기, 인 함유기 및 N-히드록시숙신이미드의 카르복실레이트 에스테르를 포함한다. 킬레이트는 하나 이상의 일좌배위 리간드를 가질 수 있는데, 다양한 이들 리간드가 당분야에 공지되어 있다. 적합한 일좌배위 리간드는 예컨대, 일산화탄소, 시아니드, 이소시아니드, 할로겐화물 및 지방족, 방향족 및 복소환식 포스핀, 아민, 스틸벤 및 아르진(arsine)을 포함한다.
적합한 킬레이트의 예는 비스[(4,4'-카르보메톡시)-2,2'-비피리딘]2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)프로필]-1,3-디옥소란 루테늄(2); 비스 (2,2'비피리딘) [4-(부탄-1-알)-4'-메틸-2,2;비피리딘] 루테늄(2); 비스 (2,2'-비피리딘) [4-(4'-메틸-2,2;-비피리딘-4'-일)부티르산] 루테늄(2); (2,2'-비피리딘)[비스-비스(1,2-디페닐포스피노)에틸렌] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)프로필]-1,3-디옥소란 오스뮴(2); 비스 (2,2'-비피리딘) [4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘)부틸아민] 루테늄(2); 비스 (2,2'-비피리딘) [1-브로모-4(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)부탄] 루테늄(2); 비스 (2,2'-비피리딘)말레이미도헥사논산, 4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-부틸아미드 루테늄(2)이 있다. 또 다른 ECL 부분은 1987년 4월 30일에 출원되고 일반 양도된 PCT 출원 일련호 US 87/00987호 및 1987년 11월 4일에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 117,017호에 기술된다.
본 발명에서 ECL 부분의 기능은 전기화학적 에너지가 반응 시스템으로 도입된 결과로서 전기 방사선을 방출하는 것이다. 이를 수행학기 위하여 ECL 부분은 여기 에너지 상태로 자극될 수 있어야 하며 여기상태로부터 내려감에 따라 빛의 광자와 같은 전자기 방사선을 방출시킬 수 있어야만 한다. 전기화학 발광 반응에서 ECL 부분이 참여하는 메카니즘의 이론적 분석에 구속되기를 바라지는 않지만, ECL 부분은 반응 시스템으로 도입되는 전기화학 에너지에 의하여 산화된 다음 시스템에 존재하는 환원제과의 상호 장용을 통해 여기 상태로 전환되는 것으로 보인다. 이 상태는 비교적 불안정하여, 금속 킬레이트는 빨리 보다 안정한 상태로 내려간다. 이렇게 함으로써, 킬레이트는 검출가능한 빛의 광자와 같은 전자기 방사선을 발산한다.
모출원(parent applications)에서 기술된 바대로, ECL 부분은 (i) 첨가된 관심있는 분석물 또는 그 유사물, (2) 상기 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 결합 파트너, 및 (iii) 상기 (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 물질에 결합된다.
천연 또는 합성물일 수 있는 관심있는 분석물의 유사물은 전형적으로 분석물에 필적할만한 결합성질을 갖는 화합물이지만, 보다 높거나 낮은 결합능력의 화합물일 수 도 있다. 분석물 또는 그 유사물, 및/또는 그 결합 파트너에 결합할 수 있는 반응 성분들, 및 이를 통해 ECL 부분이 분석물에 결합될 수 있는 반응성분은 적합하게는 제 2항체 또는 단백질 A 또는 단백질 G 와 같은 단백질, 또는 아비딘 비오틴 또는 결합반응에 참여하는 당분야에 공지된 또 다른 성분이다.
본 발명에 따라 이용되는 금속 킬레이트 또는 다른 금속-함유 ECL 부분의 양은 시스템에 따라 변화할 것이다. 일반적으로 사용되는 이러한 ECL 부분의 양은 상기 조성물 또는 시스템으로부터 검출 가능하고 원한다면 정량 가능한 전자기 에너지의 방출을 초래하기에 효과적인 양이다. 관심있는 분석물의 검출 및/또는 정량은 관심있는 분석물 및 ECL 부분을 함유하는 샘플로부터의 발광과 그 양을 알고 있는 일정량의 분석물 및 ECL 부분에 대하여 개발된 검정표준물질(calibration standard)에 의해 방출되는 발광을 비교함으로써 전형적으로 이루어진다. 이는 동종(homogeneous) 형태로 생각된다. 이종(heterogeneous) 방식에서는, 상술된 바와 같은 분리가 ECL 분석 전에 수행된다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 금속-함유 ECL 부분의 정체 및 양은 유력한 조건에 따라 시스템마다 다를 수 있다. 원하는 결과를 얻기에 적절한 금속-함유 ECL 부분 및 그 충분한 양은 일단 본원의 발명내용에 비추어 불필요한 실험 없이도 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
고형물, 유탁액, 현탁액, 액체 또는 기체일 수 있는 관심있는 분석물을 함유할 수 있는 샘플은 예컨대, 세포 및 세포-유래 생성물, 물, 음식물, 혈액, 혈청, 모발, 땀, 소변, 배설물, 조직, 타액, 오일, 유기용매 또는 공기로부터 유래할 수 있다. 이 샘플은 또한 예컨대, 물, 아세토니트릴, 디메틸설폭시드, 디메틸포름아미드, n-메틸-피룰리돈 또는 알콜로 구성될 수 있다.
입자들은 유리하게는 0.05-200, 바람직하게는 0.1-100, 가장 바람직하게는 0.5-10의 지름을 가지는 미립자 물질 및 분석물 및/또는 상기 (b) (i), (b) (ii), 또는 (b) (iii)에 규정된 하나 이상의 다른 물질들에 결합할 수 있는 표면성분으로 구성된다. 예컨대, 미소 미립자물질은 가교결합된 전분, 덱스트란, 셀룰로스, 단백질, 유기 중합체, 스티렌/부타디엔 공중합체 또는 아크릴로니트릴/부타디엔/스티렌 공중합체와 같은 스티렌 공중합체, 비닐아세틸 아크릴레이트 공중합체, 염화비닐/아크릴레이트 공중합체, 불활성 무기 입자, 이산화크롬, 산화철, 실리카, 실리카 혼합물, 단백질 함유 물질 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는, 입자는 ECL 시스템에 현탁된다.
본 발명의 방법은 전기화학 발광이 유도되어 측정되기 전에 ECL 부분(예컨대, 라벨 화합물)이 먼저 분석혼합물로부터 분리되어 있는 이종 분석형으로 이용될 수 있으며, 또는 유리하게, 발광이 분석 혼합물에서 유도되고 측정되는 동종 분석형으로 이용될 수 있다.
전극이 전기화학 에너지를 유도하는 시스템을 작동시키기 위하여, 전극이 침지되어 있고 ECL 부분을 함유하는 전해질을 제공할 필요가 있다. 전해질은 전하가 이온에 의해 전달되는 상(phase)이다. 일반적으로, 전해질은 액체상이며, 물, 유기액체 또는 유기액체들의 혼합물, 또는 물 및 하나 이상의 유기 액체들의 혼합물 내의 하나 이상의 염 또는 다른 종들의 용액이다. 그러나 다른 형태의 전해질 또한 본 발명의 특정한 실시양태에서 유용하다. 예컨대, 전해질은 유체--예컨대 액체, 증기 또는 초임계(supercritical) 유체 내의 하나 이상의 물질을 분산액일 수 있거나 고형물, 증기 또는 초임계 유체내의 하나 이상의 물질의 용액일 수 있다.
전해질은 적합하게는 물내 염 용액이다. 염은 바람직하게는 나트륨염 또는 칼륨염일 수 있지만, 양이온이 전기화학발광성 상호작용 순서를 방해하지 않는 한 다른 양이온을 사용하는 것도 특정 실시양태에서 적합하다 염의 음이온은 예컨대 포스페이트일 수 있지만, 선택된 음이온이 전기화학발광성 상호작용 순서를 방해하지 않는 한 다른 음이온의 사용도 본 발명의 특정한 실시양태에서 허용 가능하다.
조성물은 또한 비수성(nonaqueous)일 수 있다. 초임계 유체가 어떤 경우 유리하게 사용될 수 있지만, 비수성 조성물 내 유기 액체로 구성되는 전해질을 사용하는 것이 보다 전형적이다. 수성 전해질과 같이 비수성 전해질도 전하가 이온에 의해 전달되는 상이다. 보통, 이는 염이 유기액체 매질 내에 용해되어 있는 것을 의미한다. 적합한 유기 액체의 예로는 아세토니트릴, 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide; DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF), 메탄올, 에탄올, 및 둘 이상의 상기 물질들의 혼합물이 있다. 예시적으로, 유기 액체내에 가용성인 테트라부틸암모늄 테트라플루로로보레이트와 같은 테트라알킬암모늄염이 함께 사용되어 비수성 전해질을 형성할 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 전해질은 완충된 시스템이다. 포스페이트 완충액 또한 유리하다. 예로는 인산나트륨/염화나트륨의 수용액 및 인산나트륨/불화나트륨의 수용액이 있다.
레란드 및 포웰이 발명자인 아민-유도 환원제를 사용한 전기화학 발광반응(CMS 사건번호 제 370068-2570)이란 제목의, 본원과 동일자에 출원된 일반 양도된 미합중국 특허 출원 일련번호 제 266,914호에 기술된 바와 같이, 고도의 환원종으로 전환시키기 위해 산화될 수 있는 환원제, 전형적으로 아민 또는 아민 부분(보다 큰 분자의)을 포함하는 것이 바람직하다. 본 출원의 내용도 참고된다. 아민 또는 아민 부분 또한 반응 시스템에 도입되는 전기화학에너지에 의해 산화되는 것으로 보인다. 아민 또는 아민 부분은 전자 하나를 잃고 난 다음 탈양자화되거나, 스스로 강한 환원제로 재배열된다. 이는 산화된 금속-함유 ECL 부분과 상호작용하여 상술한 여기상태로 되도록 한다. 이러한 역할을 수행하기 위해, 아민 또는 아민부분은 바람직하게는 탄소로부터 제공될 수 있는 전자를 갖는 탄소-중심의 라디칼 및 환원제를 형성하기 위해 탈양자화되는 동안 양자 공여체로서 작용할 수 있는 알파 탄소를 갖는다. 아민-유도 환원제는 금속-함유 ECL 부분을 여기상태로 전환하는데 필요한 자극을 제공하는데, 여기상태로부터 검출 가능한 전자기 방사선이 방출된다.
일반적으로 말해서 아민 또는 아민 부분으로부터 형성된 환원제는 다음식: Ea≤-hc/λ + K + Em에 따라 정의되는 산화환원전위, Ea를 갖는다. 이 식에서, h는 플랑크 상수이고, c는 광속이며, λ는 금속-함유 ECL 부분의 여기상태로부터 방출되는 빛의 특징적 파장이고, K는 ECL 상호작용이 일어나는 환경의 캘빈 절대온도 및 상기 전기화학발광성 반응의 결과로서의 엔트로피의 변화를 곱한 값이고, Em은 ECL 부분의 산화환원전위이다. 보통, 엔트로피의 변화 및 온도의 곱은 약 0.1 eV 이다.
하기 계산식은 산화되고 탈양자된 아민 생성물의 최소 환원력을 결정하고 적합한 아민 또는 아민부분을 선택하기위한 일반식
(1)
의 사용을 설명하고 있다.
ECL 부분으로서 Ru(bpy)32+에 있어서, 방출 파장 λ는 620nM이다. 토켈 N.E. 일동, J. Am. Chem. Soc. 94, 2862(1972)를 참고하라. Em은 NHE(NHE는 표준 수소 기준전극이다)에 비교될 때 1.3V이다.
윌킨스, D.H. 일동의 Anal. Chim. Acta. 9, 538(1953)을 참고하라. K는 0.1 eV로 취해진다. 파울크너, L.R. 일동의 J. Am. Chem. Soc. 94, 691(1972)을 참고하라. 식 1에 이런 값들을 대입하면
Ea≤2.0+0.1+1.3 (3)
Ea≤-0.6 (4)
을 얻는다. 식 4는 환원제의 환원강도가 표준수소기준전극(NHE)과 비교할 때 -0.6V와 같거나 또는 이보다 더 적어야 한다는 것을 나타낸다.(전위차, 즉 Ea 또는 Em에 대해 언급할 때, 전위 단위는 볼트이고, hc/λ 및 K는 eV의 에너지 단위를 가지나; 전위차의 eV로의 전환은 일정하다.)
넓은 범위의 아민 및 대응하는 아민 부분은 본 발명을 실행할 때 사용 될 수 있다. 일반적으로, 아민 또는 아민 부분은 전기화학 발광적으로 분석되는 시스템의 pH를 맞추기 위해 선택된다. 또한 다른 관련있는 요인은 아민 또는 아민부분이 분석하는 동안 그것이 작용해야만 하는 환경과 양립 가능하여야 한다는 것인데, 즉 경우에 따라서는 수성 또는 비수성 환경과 양립 가능하여야 한다는 것이다. 그러나 또 다른 고려점은 선택된 아민 또는 아민 부분이 시스템에서 산화된 금속-함유 ECL 부분을 환원시키기에 충분히 강한 아민-유도 환원제를 우세한 조건하에서 형성해야만 한다는 것이다.
본 발명에서 유리하게 사용되는 아민(및 이로부터 유도된 대응하는 부분)은 일차, 이차 및 삼차 알킬아민과 같은 지방족 아민, 각각 1-3개 탄소원자를 갖는 알킬기 뿐만 아니라 치환된 지방족 아민이다. 트리프로필 아민이 특히 바람직한 아민인데, 이는 그것이 사용되는 실시양태에서 검출 및 정량의 감도 및 정확성을 향상시키는 전자기 방사선의 특히 높은 세기의 방출을 초래하기 때문이다. 또한 히드라진과 같은 디아민 및 폴리(에틸렌아민)과 같은 폴리아민이 적합하다. 본 발명의 아민 물질은 또한 아닐린과 같은 방향족 아민일 수 있다. 또한 피리딘, 피롤, 3-피롤린, 피롤리딘 및 1,4-디히드로피리딘과 같은 복소환식 아민이 특정한 실시양태에 적합하다.
상기 아민들은 예컨대, 하나 이상의 다음 체환체들:-OH, 알킬, 클로로, 플루오로, 브로모 및 요오도, -SO3, 아릴, -SH,, -COOH, 에스테르기, 에테르기, 알케닐, 알키닐,, N2+, 시아노, 에폭시드기 및 복소환기로 치환될 수 있다. 또한, 예컨대 R이 H 또는 상기 나열된 치환체인 경우의 일반식 R3N-H+의 양자화된 염이 적합하다. 상기 아민에 대응하는 아민 부분(치환되거나 비치환됨)이 또한 바람직하다.
상기와 같이 트리프로필 아민(또는 이로부터 유도된 아민 부분)은 매우 높은 광세기를 내기 때문에 특히 바람직하다. 본 발명에서 유용한 아민, 다른 아민 및 아민 부분들은 pH 6-9에서 적합하게 잘 작용한다. 그러나, 트리프로필 아민은 7-7.5 pH에서 가장 좋은 결과를 제공한다. 본 발명을 실행하는데 적합한 또 다른 아민의 예로는 트리에탄올아민, 트리에틸아민, 1,4-디아자비시클로(2.2.2)-옥탄(1,4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane), 1-피페리딘에탄올, 1,4-피페라진-비스-(에탄-설폰산), 트리-이소프로필 아민 및 폴리(에틸렌아민)이 있다.
전형적으로, 본 발명에서 이용되는 금속-함유 ECL 부분은 반응제한 구성요소이다. 딸서 아민 또는 아민 부분이 금속-함유 ECL 부분에 대해 화학량론적 과량으로 제공되는 것이 보통이다. 예시적으로, 아민 또는 아민 부분은 50-150 mM의 농도로 사용된다. 대략 7의 pH에서 이용하기 위해, 100 mM의 농도가 흔히 유용하다. 특정 실시양태에서, 아민 또는 아민부분 농도의 상한선은 사용되는 환경, 예컨대 물에서 아민 또는 부분의 최대 용해도에 의해 결정된다. 일반적으로, 사용되는 아민 또는 아민부분의 양은 발광이 일어나도록 산화된 금속-함유 ECL 부분을 여기상태로 변환시키기에 충분한 양이다. 당업자는 본원의 가르침으로 불필요한 실험없이 분석된 특정 시스템에 대해 유리하게 사용되는 아민 또는 아민 부분의 양을 경험적으로 결정할 수 있다.
본원과 동일자 출원되고 샤(Shah), 본 보르스텔(von Borstel) 및 티아기(Tyagi)가 발명자인 개선된 전기화학발광성 반응이라는 명칭의 일반 양도된 미합중국 출원 일련번호 제 267,509호에 기술된 것처럼, 본 발명의 분석은 중진제, 전형적으로 하기 일반식의 화합물의 존재하에서 바람직하게 수행된다.
상기 식에서, R은 수소 또는 CnHn2+1 이고, R'는 CnH2n이고, X는 0-70이고 n은 1-20이다. 특히, n은 1-4이다. 특정 예는 일반식
(여기서, x는 9-10임)의 트리톤 X-100이라는 이름으로 상업적으로 구입가능한 물질 및 일반식
(여기서, X는 40임)의 트리톤 N-401(NPE-40)이라는 이름으로 상업적으로 구입가능한 물질이다. 중진제의 존재 하에서 전자기 복사선의 방출이 바랍직하게 증가되기에 충분한 양으로 증진제가 일반적으로 이용된다. 전형적으로, 그 양은 0.01-5.0 v/v%, 특히 0.1-1.0 v/v%이다. 본 출원의 주제가 참고된다.
본 발명에 따라서 이용되는 ECL 부분은 여기 상태로 자극시킴으로써 전자기 복사선을 방출하도록 유도된다. 이는 ECL 부분이 이용되는 시스템을 전기화학 에너지에 노출시킴으로써 수행된다. 강환원제를 형성하는 종 및 ECL부분의 산화가 일어나는 전위는 그의 정확한 화학구조 및 전기화학 에너지를 유도시키기 위해 사용되는 전극의 성질 및 시스템의 pH와 같은 요인에 의존한다. 전기화학발광 시스템의 최적 전위 및 방출 파장을 결정하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. ECL 시스템을 자극하는 특정의 바람직한 방법은 1988년 4월 29일 출간된 일반 양도된 미합중국 출원 일련번호 제 188,258호(참고로 통합됨)에 기재되어 있다.
본 발명의 분석을 수행하는 장치는 제 1 도 및 제 2 도에 기술된다.
제 1 도는 유용한 ECL 장치를 도시하지만 본 발명의 방법은 장치(10)로 제한되지 않고, ECL 부분을 전기화학발광하도록 개시하기 위한 전기화학 에너지를 제공하기 위하여 작동전극 또는 다른 개시 표면을 포함하는 다른 형태의 ECL 장치에도 적용될 수 있다. 본 발명의 방법이 정적(static) 또는 병류(flow-through) 방식으로 수행될 수 있지만, 장치(10)는 병류셀을 포함하며, 이는 결합 분석 샘플을 포함하는 다양한 타입의 샘플에 대해 뚜렷한 이점을 제공한다.
장치(10)는 전기화학셀(2), 빛 감지/측정 장치(14)(유리하게 광다중 튜브(photomultiplier tube; PMT), 광다이오드, 전하 커플링된 장치, 광그래피 필름 또는 에멀젼 등일 수 있음), 및 펌프(16)를 포함하는데, 이는 유리하게 셀(12)로, 셀을 통해 그리고 셀로부터 유체를 이송하는 연동 펌프이다. 또는, 용적이송식 전공펌프(positive displacement pump)가 사용될 수 있다. 셔터 메카니즘(18)은 셀(12) 및 광다중튜브(PMT; 14) 사이에 제공되고, ECL 측정 기간동안 셀(12)로 광다중튜브(PMT; 14)를 노출시키기 위한 경유에만 열리도록 조정된다. 셔터 메카니즘은 예컨대 유지되는 동안 닫혀질 수 있다. 장치(10)에 포함되지만 제 1 도에 도시되지 않은 것은 ECL 측정동안 임의의 외부 빛으로부터 광다중튜브(14)를 차폐시키고 내부에 다양한 요소를 장착하기 위한 차광 하우징이다.
셀(12) 자체는 유입 튜브(22) 및 유출 튜브(24)가 통과되는 제 1 장착블록(20)을 포함하고, 유용하게 스테인레스강으로 구성될 수 있다. 장착 블록(20)은 제 1 외부표면(26) 및 셀(12)의 샘플-보유 부피(30)의 한쪽면을 규정하는 제 2 내부표면(28)을 가지는데, 셀(12)은 장치(10)가 대응하여 작동하는 동안 세척 및/또는 컨디셔닝 및/또는 측정 용액을 보유한다. 유입 및 유출 튜브(22),(24)는 외부표면(26)으로부터 내부표면(28)까지 장착블로(20)을 통해 통과하고 샘플-보유 부피(30)로 개방된다. 유리하게 스테인레스강으로 구성되는 제 2 장착 블록(32)은 또한 제 1 외부 표면(34) 및 제 2 내부 표면(36)을 가진다. 제 2 장착 블록(32)은 유리하게 테플론 또는 비-오염성 물질로 구성되는 환형 스페이서(38)에 의해 제 1 장착 블록(20)으로부터 분리된다. 따라서, 장착 블록(30)의 외부 표면(34)은 샘플-보유 부피(30)의 제 2 면의 일부분을 규정한다. 스페이서(38)는 내부 모서리(44)가 샘플-보유 부피(30)의 측면벽을 규정하는 중심 개구(42) 및 외부 부분(40)을 가진다. 외부 부분(40)은 어떠한 용액도 두개의 표면(28),(34) 사이에서 샘플-보유부피(30)로부터 나오지 못하도록 제 1 장착블록(20)의 내부 표면(28)을 제 2 장착블록(32)의 외부표면(34)으로 밀봉한다. 장착 블록(32)은 또한 중심개구(46)를 가져서, 그 개구에 윈도우(48)가 밀봉고정되어, 외부표면(34)의 연속으로 샘플-보유부피(30)의 제 2 측면의 나머지를 규정하도록 한다. 윈도우(48)는 ECL 부분에 의해 방출되는 전기 화학발광 빛의 파장에서 실질적으로 투명한 물질로 형성된다. 따라서, 윈도우(48)는 유리하게 유리, 플라스틱, 석영등으로 형성된다.
유입 튜브(22)는 샘플-보유 부피(30)와 스페이서(38)에 인접한 그것의 제 1 말단(50)에서 교차하고, 유출 튜브(24)는 스페이서(38)에 인접한 그의 제 2 말단(52)에서 샘플-보유부피(30)와 교차한다. 유입 튜브(22), 샘플-보유부피(30) 및 유출 튜브(24)의 결합은 셀(12)로, 셀을 통과하여, 셀로부터의 용액의 좁고 거의 박판형(laminar) 흐름을 위하여 연속 흐름 경로를 제공한다.
제 1 장착 블록(20)의 내부 표면(28)에 장착된 것은 작동 전극 시스템(54)이고, 이는 실시양태에서 제 1 및 제 2 작동 적극(56 및 58)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 단일 작동전극이 유리하게 제공될 수 있으며 또는 전극(56) 만이 작동전극일 수 있다. 작동전극(56, 58)은 관심있는 전기화학 및 ECL 반응이 일어날 수 있는 곳이다. 작동전극(56, 58)은 고체 전압계 전극이고, 따라서 유리하게 백금, 금, 탄소 또는 본 목적에 효과적인 다른 물질일 수 있다. 작동전극(56, 58) 각각에 접속된 선로접속기(60, 62)는 제 1 장착 블록(20)을 통해 빠져나간다.
접속기(60, 62)는 제 2 도에 도시된 바와 같이 전압 조절기(66)의 제 1 작동전극 말단(64)에 접속된다. 전압조절기(66)는 유리하게 작동전극(56, 58)으로 전압신호를 공급하고, 선택적으로 ECL 측정하는 동안 그들로부터 흐르는 전류를 측정하는 정전위(potentiostat)의 방법으로 작동한다. 또는, 접속기(60, 62)는 개별 작동에 대하여 전압조절기(66)의 말단을 분리하기 위해 접속될 수 있다.
전압조절기(66)의 정전위 작동은 또한 반대전극(68)을 통하여 수행되지만, 선택적으로 유리하게 기준전극(70)을 통해 수행된다. 실시양태에서, 장착블록(32)은 스테인레스강으로 만들어지고 반대전극(68)은 장착블록(32)의 노출된 표면(72, 74)에 있게 된다. 반대전극(72, 74) 및 작동전극(56, 58)은 화학반응을 에너지화하고 샘플내에서 전기화학발광을 개시하고 및/또는 셀(12)의 펴면을 세척하고 컨디셔닝하기 위한 에너지를 제공하는 샘플 보유 부피(30) 내에서 용액에 포텐셜을 부과하는 계면(interface)을 제공한다. 반대전극(72, 74)은 선로 접속기(72)에 의해 전압조절기(66)의 제 2 반대전극 말단(78)으로 접속된다.
기준전극(70)은 작동전극(56, 58)에 의해 적용되는 전압을 말하는 기준전압, 예컨대 기준에 대하여 +1.2 볼트인 기준전압을 제공한다. 기준전극(70)은 셀(12)로부터 간격을 둔 위치(80)에서 유출 튜브(24)내에 유리하게 위치하며, 선로 접속기(82)를 통해 전압조절기(66)의 제 3 기준전극 말단(84)으로 접속된다. 세가지 전극 방식에서, 전류는 기준전극(70)을 통해 흐르지 않는다. 기준전극(70)은 균형 잡혀지고 공지된 안정한 전압을 제공하기 위해 세가지 전극 작동 방식에서 사용될 수 있으므로, 유리하게 은/염화은(Ag/AgCl)으로 구성되거나 또는 포화된 칼로멜 전극(saturated calomel electrode; SCE)이 된다. 전압조절기(66)는 작동전극(56)과 반대/기준 전극으로서 전극(58)만을 사용하여 작동의 두가지 전극 작동방식으로 작동될 수 잇다. 이러한 두가지 전극 작동방식에서, 반대/기준 전극(58)은 전압조절기(66)상에서 정압 조절 말단(78 및 84)에 전기적으로 접속된다. 이 경우에, 전압 조절기(66)는 근본적으로 베터리로서 작동한다. 전압 조절기(66)은 작동전극 및 반대전극(56 및 58)에 전압 신호를 공급하고, 선택적으로 각각의 전극을 통하는 전류 흐름을 측정한다. 기준전극(70)은 선택적으로 백금, 금, 스테인레스 강 또는 다른 물질로 구성되는 소위 준-기준 전극일 수 있으며, 이는 덜 안정한 전압을 제공하거나, 접촉되는 용액에 대하여 측정가능하다. 두가지 및 세가지 전극 방식에서, 기준전극(70 또는 58)은 작동전극(56)에 적용된 전압이 측정되는 기준을 제공하는 것이 목적이다. 균형잡힌 전압기준은 현재 좀 더 유리한 것으로 간주된다. 정전위 작동에 있어서 전압조절기(66)는 작동전극(56, 58) 및 반대전극(72, 74)사이의 전류흐름을 측정하는 동안 기준전극(70)에 대하여 작동전극(56, 58)에서 주지의(known) 전압을 제공함에 의해 다양한 전극을 조절한다. 이러한 목적으로 정전위기가 잘 공지되어 있으며, 따라서 전압 조절기(66)의 내부구조는 상기 기능을 수행하고 본 발명 자체의 일부를 형성하지는 않는 임의의 통상적이고, 상업적으로 구입가능한 정전위기에 대응할 수 있다. 사실, 장치(10)는 선택적으로 내부 전압 조절기(66) 없이 구성될 수 있으며, 요구되는 전압신호를 전극(56, 58, 72, 74 및 70)에 제공하기 위하여 별도로 조절되는 외부 정전위기에 접속되도록 적용시킬 수 있다. 아래에 기술되는 특정 방식으로 적용되는 이들 전압신호는 작동전극(56, 58)의 표면에 대하여 반복가능한 초기 조건을 제공하고, 유리하게는 전체로서 셀(12)의 표면에 대하여 ECL 측정에서 매우 개선된 정확도를 주는데 기여하는 특징을 제공한다.
펌프(16)은 유리하게 유출튜브(24)예 위치하여, 샘플부피로부터 화살표 a의 방향으로 유입튜브(22)내로 용액을 당긴다. 용액은 유입튜브(22), 샘플-보유 부피(30) 및 유출튜브(24)를 통해 흘러서 기준전극(70)을 통과하여 화살표 b 방향으로 빠져나간다. 또는 펌프(16)는 유입튜브(22)에 위치하여 장치(10)을 통과하여 용액을 밀 수 있다. 유리하게, 유입튜브(22), 샘플-보유 부피(30) 및 유출튜브(24)를 통과하는 동일한 흐름 경로가 모든 용액 및 셀(12)을 통과하는 유체에 대하여 이용되는데, 각각의 유체는 앞선 유체를 셀(12) 밖으로 끌어냄에 있어 유체역학적 세정작용을 수행한다. 펌프(16)는 임의의 기간동안 셀(12)내에 특정용액을 보유하는 그것의 작동을 중단하도록 조절될 수 있다.
장치(10)의 병류(flow-through)구조는 작동전극에 가변전압이 가해지거나 또는 계속적으로 예비작동 포텐셜이 유지되도록 하면서, 작동전극(56, 58)(또는 반대전극 및 기준전극(72, 74, 70))을 공기에 노출시키지 않고 하나 이상의 용액에 계속적으로 노출되도록 한다. 공기에 대한 노출은 회로를 기준전극(70)에 개방하게 하며, 작동전극(56, 58)의 표면상태를 재생할 수 없게 하는 미지의 임의의 전압 변동(fluctuation)을 일으킨다. 병류구조는 전극 시스템(54)이 세척되고 컨디셔닝되는 초기단계 및 하나 이상의 측정 파형 또는 소사(掃射; sweeps)가 ECL을 개시하는 측정단계 사이의 신속한 변경을 허여한다.
본 발명은 또한 시약 조성물에 관한 것이다. 광범위하게, 시약 조성물은 본 발명의 분석 시스템의 일성분, 즉 (a) 전해질, (b) ECL 부분을 함유하는 라벨 화합물, (c) 입자, (d) 관심있는 분석물 또는 이의 유사물, (e) 관심있는 분석물 또는 그의 유사물의 결합 파트너, (f) (d) 또는 (e)와 반응할 수 잇는 반응 성분, (g) 환원제, 또는 (h) 전기화학 발광-반응 중진제일 수 있다. 시약들은 편의상 서로 결합될 수 있다. 즉 두가지 성분, 세가지 성분 및 그 이상의 다성분 화합물이 제조될 수 있는데, 이 때 성분들이 저장하는 동안 서로 반응하여 의도하는 분석에서 그들의 기능을 저해하여서는 아니된다. 바람직하게, 시약은 입자 및 한가지 이상의 다른 성분을 함유하는 두가지 성분 또는 다성분 혼합물이다.
본 발명은 또한 미립자를 기재로 하는 비분리 결합분석용 킷트(kit)에 관한 것이다. 킷트는 상술된 성분들 (a)-(h)의 하나 이상을 함유하는 용기를 포함하거나 또는 상기 성분들의 혼합물로 이루어지는 상술한 바와 같은 하나이상의 시약 조성물을 함유하는 용기를 포함할 수 잇는데, 이들은 모두 본 발명의 분석방법 및 시스템에서 사용하기 위한 것이다.
바람직한 히브리도마 스크리닝(hybridoma screening)용 킷트는 예컨대 하기 (1) 내지 (3)을 포함한다.
(1) 하기 [실시예]에서 보다 구체적으로 기술될 완충제,
(2) 농축형태의 라벨 호합물, 및
(3) 의도하는 분석시스템에서 관심있는 항원과 커플링될 수 있거나 또는 의도하는 분석 시스템에서 일성분과 커플링될 수 잇는 입자.
본 발명의 방법은 하기 [실시예]에 기술된다. 본 발명은 예시된 항원-항체 반응으로 제한되지 않으며 다른 결합반응, 예컨대 RNA-DNA 혼성 및 수용기-리간드 상호반응을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
[실시예]
[기계, 물질 및 방법]
(1) 기계
제 1 도 및 제 2 도에 기술된 세가지 전극을 이용하는 병류장치가 사용되었다.
작동전극-양쪽 Au 디스크
반대전극-스테인레스강 면판
기준전극-Ag/AgCl
테플론 가스킷(0.38 cm(0.15) 두께)
스테인레스강/플렉시글라스 면판
유입튜빙=0.11 cm(0.042) 내부 직경 폴리프로필렌
흡인 속도 2ml/분
정전위기: 옥스퍼드 (Oxford)
발광기:
버톨드 바이오르매트(Berthold Biolumat) LB 9500 T(광게수)
광다중튜브=하마마츄(Hamamatsu) R374 (낮은 수득율의 적색 감도 튜브)
광다중튜브 전압=+1350V
전류 및 광출력이 킵 조넨(Kipp Zonen) 기록기에 기록되었다.
(2) 물질
(a) TAG(태그 물질): 트리스(2,2'-비피리딜)-루테늄(2I)
(b) BioMag(R)(실험 1, 2, 4, 5, 6 및 7):
BioMag 4100, 흑색의 코팅된 자기 산화철 입자의 현탁액으로서 일차 아미노기를 제공. 아미노기는 지방(스테아린)으로 방해받지 않아서 생물학적 활성을 보유하는 리간드 또는 단백질이 공유적으로 부착되도록 한다. BioMag(R)은 미합중국 매사추세츠주 02138 캠프리지 무네이 스트리이트 61의 어드밴스드 마그네틱 이코포레이티드로부터 구입된다.
(c) (i) ECL 완충제(실험 1, 2 및 4):
100 mM 트리프로필아민(tripropylamine; TPA) 및 0.05% 트윈-20(비이온성 계면활성제)을 함유하는 pH 7.24의 75 mM 인산칼륨 완충제:
(ii) ECL 완충제 (실험 3):
100 mM 트리프로필아민(TPA), 0.1%-트리톤 X-100(비이온성 계면활성제) 및 0.05% 트윈-20(비이온성 계면활성제) 함유 pH 7.24의 75 mM 인산칼륨 완충제;
(iii) ECL 완충제(실험 5, 6 및 7);
150 mM 인산칼륨 용액
50 mM 트리프로필 아민
NaOH(50%)로 pH 7.5로 조절됨
0.05% 트리톤 X-100(상표) (비이온성 계면활성제)
0.05% 트윈-20(상표) (비이온성 계면활성제)
물을 첨가하여 2.0L로 만듦
(d) 폴리스티렌 라텍스 입자:
미합중국 일리노이주 60060 문델레인 오챠드 스트리이트 909의 펜덱스 레버러토리사로부터 구입된 5 w/v%의 펜덱스 카르복실화된 입자(Cat. No.31-010-1);
(e) 히브리도마 성장 매질(Hybridoma Growth Medial HGM):
미합중국 캘리포니아주 95695 우드랜드 스위트 8 원 하터 아비뉴의 제이 알 사이언티픽 인코포레이티드로부터 구입된 이스코브의 개질된 둘베코 매질(Iscove's Modified Dulbecco's Media; IMDM)의 희석되고 개질된 형태. 둘베코 알(Dulbecco, R.) 및 프리만 지(Freeman, G.)의 비루스학(Virology) 8, 398(1959); 스미스, 제이 디이(Smith, J. D.), 프리만 지, 보그트 엠(Vogt, M.) 및 돌베코 알의(1960) 비루스학(Virology) 12, 155; 조직 배양 표준 위원회, 시험관내 5 : 2, 93 및 이스코브, 엔엔(Iscove, N. N.) 및 멜커스 에프(Melchers, F)의 J. Experimental Medicine 147, 923을 보라. 100% 히브리도마 성장매질(HGM)은 200 ml IMDM(제이알 사이언트픽 롯트 C 077201), 40ml 송치 혈청(뱃치 67, HI), 2ml 5×10 -3M 2-머캅토에탄올(뱃치 39), 2 ml 카나미신 황산염(10,000 mg/ml, 롯트 13N2672), 4 ml HAT (10 -2M 하이포크산틴(Hypoxanthine), 4×10 -5M 아미노프테린(Aminopterin), 1.6×10 -3M 티미딘(Thymidine); 저장 GIBCO(상표)), 40 ml 1°MCM (Microphage Conditional Media) 일차 마이크로파아지 컨디셔닝 매질(11/7/86, 하비스트 4)을 포함한다. 5% 히브리도마 성장매질(HGM)을 제조하기 위해 완충용액으로 20 내 1부로 희석시킨다.
(3) 방법
(a) BioMag 코우팅(실험 1, 2, 5, 6, 7):
공지된 과정, 예컨대 친화 지지체를 제조하기 위해 사용되는 시약에 의해 단백질을 공유적으로 결합시키는 방법으로서, 고체상이 일차 아미노기로 종결됨을 조건으로 한다. 글루라르알데히드 과정은 웨스톤(Weston) 및 아브라머(Avramers) (Biochem. Biophy. Res. Comm. 45, 1574 (1971))에 주어진다
(b) 폴리스티렌 라텍스 코우팅(실험 3)
공지된 과정, 예컨대 입자 및 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)의 혼합, 항온처리, 원심분리 및 경사분리시킴.
(c) 디곡신-소의 티로글로부린(thyroglobulin)의 제조:
프레이태그(Freytag) 일행의 Clin. Chem. 30/9 1494-1498(1984)에서 공개된 방법
(d) 단백질 및 디곡신에 대한 TAG의 결합:
예컨대 모출원 PCT/US87/00987에 기재된 알데히드 결합 또는 N-히드록시 숙신아미드 에스테르 결합을 사용하는 공지된 방법.
(4) ECL 측정 싸이클(세가지 전극셀 작동)
세척/컨디셔닝/샘플 측정:
이 자료를 얻기 위해 사용되는 전체 싸이클은 각각의 단계가 동일한 인가 전압 파형을 사용하는 6단계로 이루어졌다. 각 싸이클은 두번의 컨디셔닝 단계(용액이 흐름), 한번의 샘플 측정단계(측정용액이 흐르거나 정치됨), 두번의 세척단계 및 한번의 컨디셔닝 단계(컨디셔닝 용액이 흐름)를 가졌다. 각 단계는 전기화학 주기 동안 일정한 500 mV/초에서 아래의 인가전압 일소를 사용하였다:
+0.3V∼-0.7V∼+2.2V 및 +0.3V로 복귀.
샘플 부피는 1.0 ml 이었다.
[경쟁분석]
미립자를 기재로 하는 비분리 결합분석은 발광 강도조절 면역분석 경쟁 형식으로 사용될 수 있다. 라벨화합물에 결합된 물질은 첨가되는 관심있는 분석물이다. 결합 파트너는 입자에 결합되고 따라서 입자는 관심있는 분석물 또는 라벨링된 첨가된 관심있는 분석물과 특이적으로 결합될 수 있다. 관심있는 분석물 및 첨가된 분석물은 항원일 수 있다.
또는 결합 파트너는 관심있는 분석물의 일차 결합 파트너일 수 있다. 일차 결합파트너의 이차 결합파트너는 입자에 결합되므로 입자는 일차 결합파트너와 특이적으로 결합할 수 있다. 분석 혼합물은 관심있는 분석물, 라벨링되어 첨가된 관심있는 분석물 및 일차 결합 파트너를 포함한다. 관심있는 분석물 및 관심있는 첨가된 분석물은 항원일 수 있다.
관심있는 작은 분석물, 예컨대 테오필린은 [실시예 1]에서 처럼 측정될 수 있거나 관심있는 큰 분석물, 예컨대 인간의 IgG는 [실시예 2]에서 처럼 측정될 수 있다.
[실시예 1]
테오필린을 측정하기 위한 미립자-기재로 하는 비분리 경쟁 결합분석은 하기처럼 수행되었다.
시약:
(1) 테오필린 표준물: 0, 2.5, 5, 10, 20, 40 μg/ml;
(2) 테오필린 추적물질(100 nM) (TAG에 결합된 테오필린-8-부티르산);
(3) BioMag(R)(자기입자) 1 w/v% 현탁액에 공유결합된 항-테오필린 단일클론 항체;
(4) ECL 완충제.
일련의 튜브(12×75 mm 폴리프로필렌)를 장치하고 분석될 표준물에 따라 라벨링하였다. 각각의 튜브에 920 ㎕ ECL 완충제, 10㎕의 각각의 표준물 또는 샘플, 20㎕의 항-테오필린-BioMag(R)및 50㎕의 희석된 테오필린 추적물질을 첨가하였다. 튜브를 혼합시키고 10분 동안 실온에서 항온 처리시켰다.
전기 화학발광은 병류 ECL 기기에서 읽혀졌다. 결과는 하기와 같았다.
[실시예 2]
하기 성분을 가지는 인간의 IgG를 측정하기 위한 미립자-기재로 하는 비분리 결합분석물이 제조되었다:
(1) 인간의 IgG 표준물; 2, 20 및 200 ㎕/ml;
(2) BioMag(R)입자(1 w/v% 현탁액)에 공유 결합되는 산양 항-인간 IgG;
(3) ECL 완중제에서 저장물의 1/160까지 희석된 TAG-라벨링된 인간 IgG;
(4) ECL 완충제: 100 mM 트리프로필아민(TPA) 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 ph 7.24 인 75 mM 인산칼륨 완충제;
(5) 비특이 결합을 결정하기 위해 BioMag(R)(!% 현탁액)에 공유 결합된 산양 항-토끼 IgG.
일련의 튜브(12×75 mm 폴리스포필렌)를 장치하고 분석하기 위한 표준물에 따라 라벨링하였다. 각각의 튜브에 100㎕의 TAG-인간 IgG 및 100 ㎕의 각각의 인간 IgG 표준물(0-200 ㎕/ml)를 첨가하였다. 50 ㎕ 분량의 산양 항-인간 IgG-BioMag(R)및 750 ㎕ 분량의 ECL 완충제를 각각의 튜브에 첨가시키고 나서 와동시키고, 교반하면서 실온에서 20분간 항온 처리시켰다. 비특이결합(nonspecific binding; NSB) 연구를 위해, 항-인간 IgG 입자 대신 산양 항-토끼 IgG-BioMag(R)입자로 치환하였다.
ECL은 금 작동전극에서 보통의 병류 프로토콜에 의해 해독되었다.
결과는 하기와 같다:
[실시예 3]
생쥐의 IgG를 측정하기 위한 미립자-기재로 하는 비분리 결합 분석은 하기 성분을 가지고 수행되었다:
(1) 생쥐의 IgG 표준물; 4,20 및 200 ㎍/ml;
(2) 폴리스티렌 라텍스 입자(0.5 w/v% 현탁액)에 공유적으로 결합된 산양 항-생쥐 IgG;
(3) ECL 완충제에서 1/2600까지 희석된 TAG-라벨링된 생쥐 IgG;
(4) ECL 완충제;
(5) 비특이 결합 측정용 소혈청 알부민(BSA)-폴리스티렌 라텍스 입자(0.5% 현탁액).
일련의 튜브(12×75 mm 폴리프로필렌)를 장치하고 분석될 표준물에 따라 라벨링 하였다. 각각의 튜브는 900 ㎕의 TAG-생쥐 IgG 용액 및 50㎕의 각각의 생쥐 IgG를 수용하였다. 산양-생쥐 IgG-라텍스 또는 소혈청 알부민(BSA)-라텍스 중 하나는 면역 반응을 개시하기 위해 튜브에 첨가시켰다. 튜브를 진탕없이 실온에서 25분동안 항온처리 시켰다.
ECL 현탁액은 보통의 병류 프로토콜에 따라 해독되었다. 결과는 하기와 같다:
[면역 측정 분석]
미립자-기재로 하는 비분리 결합분석은 면역 측정 형태에서 사용될 수 있다. 라벨 화합물에 결합된 물질은 관심있는 분석물의 결합파트너이다. 분석물 또는 그의 유사물은 입자의 표면에 결합되고 따라서 입자는 결합 파트너와 특이적으로 결합할 수 있다. 관심있는 분석물은 항원일 수 있다.
도는 결합 파트너는 관심있는 분석물의 일차 결합 파트너이다. 일차 결합파트너의 결합파트너는 라벨 화합물에 결합된 물질이다. 분석물 또는 그의 유사물은 입자의 표면에 결합되고 따라서 입자는 일차 결합파트너와 특이적으로 결합될 수 있다. 라벨 화합물에 결합된 이차 결합 파트너는 특이적으로 일차 결합파트너에 결합된다. 관심있는 분석물은 항원일 수 있다.
[실시예 4]
디곡신을 측정하기 위해 미립자를 기재로 하는 비분리 결합 분석물은 하기 성분으로 제조되었다:
(1) 디곡신 표준물: 1.0, 5.0, 10, 100 및 25ng/ml;
(2) BioMag(R)입자(w/v% 현탁액)에 공유 결합된 디곡신-소의 티로글로부린;
(3) ECL 완충제에서 1/150까지 희석된 TAG-라벨링된 항-디곡신 단일클론 항체;
(4) ECL 완충제;
(5) 비특이 결합 측정용 산양 항-토끼 IgG-BioMag(R)(1% 현탁액).
일련의 튜브(12×75 mm 폴리프로필렌)를 장치하고 분석할 표준물에 따라 라벨링하였다. 각각의 튜브는 100㎕의 각각의 디곡신 표준물 및 100 ㎕의 TAG-항-디곡신 접합체(conjugate)를 수용하였다. 튜브를 진탕하면서 실온에서 25분 동안 항온 처리하고 난 다음 디곡신-BTG-BioMag(R)또는 산양 항-토끼의 IgG-BioMag(R)50 ㎕를 첨가시키고, 진탕하면서 실온에서 10분 더 항온 처리시켰다. 부피를 1 ml로 조절하였고 ECL 현탁액은 보통의 병류 프로토콜에 따라 해독되었다.
결과는 하기와 같았다:
[샌드위치 분석]
미립자를 기재로 하는 비분리 결합 분석은 샌드위치 분석 형식으로 이용될 수 있다. 관심있는 분석물은 항원일 수 있다. 라벨화합물에 결합된 물질은 관심있는 분석물의 결합 파트너이다. 라벨 화합물에 결합되지 않은 결합 파트너는 또한 입자들의 표면에 결합되고 따라서 그들은 관심있는 분석물에 결합될 수 있다.
또는 결합 파트너는 관심있는 분석물의 일차 결합 파트너(binding partner; BP-1)일 수 있다. 일차 결합 파트너의 이차 결합 파트너는 라벨 화합물에 결합된 물질이다. 관심있는 분석물은 항원일 수 있다. 이차 결합 파트너에 의해 인지되지 않는 또 다른 일차 결합 파트너(BP-2)는 입자의 표면에 결합되고, 따라서 입자들은 관심있는 분석물에 결합될 수 있다. 입자 및 일차 결합 파트너(BP-1)는 항원에 특이적으로 결합될 수 있고 라벨 화합물에 결합된 이차 결합 파트너는 일차 결합 파트너(BP-1)에 특이적으로 결합될 수 있다.
또는 결합 파트너는 관심이 있는 분석물의 일차 결합 파트너(BP-1)일 수 있다. BP-1은 라벨 화합물에 결합된다. BP-1 과 다르고 관심있는 분석물과 결합하는 또 다른 일차 결합 파트너(BP-1')가 사용된다. 일차 결합 파트너(BP-1')의 이차 결합 파트너가 입자의 표면에 결합되고 따라서 입자들은 분석물, BP-1 및 BP-1'의 복합물과 결합될 수 있다.
[실시예 5]
생쥐의 IgG2a를 측정하기 위해 미립자를 기재로 하는 비분리 결합 분석물은 하기 성분을 가지고 제조되었다:
(1) 생쥐의 IgG2a 표준물; 히브리도마 성장 배지내의 10, 40, 160, 625, 2500, 10,000 및 50,000 ng/ml;
(2) BioMag(R)입자(1 w/v% 현탁액)에 공유결합된 산양 항-생쥐IgG(Fe 특이성);
(3) ECL 완충제내의 TAG-라벨링된 산양 항-생쥐 IgG(중사슬 및 경사슬 특이성);
(4) ECL 완충제;
(5) 비특이결합(NSB) 측정용 BioMag(R)입자(1 w/v% 현탁액)에 공유결합된 소혈청 알부민(BSA). 일련의 튜브(12×75 mm를 폴리프로필렌)를 장치하고 분석될 표준물에 따라 라벨링 하였다. 각각의 튜브내로 100 ㎕의 각각의 표준물, 500 ㎕의 TAG 산양 항-생쥐 시약, 300 ㎕의 ECL 분석 완충제, 및 100 ㎕의 각각의 BioMag(R)입자 시약을 합하였다. 튜브를 실온에서 15분동안 항온처리시켰다. 전기화학발광은 상기된 과정에 따라 해독되었다.
결과는 하기와 같았다;
변조
[히브리도마 스크리닝 분석]
미립자를 기재로 하는 비분리 결합분석은 히브리도마 스크리닝 분석 형식으로 사용될 수 있다. 관심있는 분석물은 특정 항원에 대항하도록 지시된 단일클론 항체이다. 라벨 화합물에 결합된 물질은 관심있는 분석물의 결합파트너이다. 항원 입자의 표면에 결합되고, 따라서 입자들은 분석물과 특이적으로 결합될 수 있다. 단일클론 항체는 입자에 특이적으로 결합되고 라벨 화합물에 결합된 결합 파트너는 단일 클론 항체에 특이적으로 결합된다.
유리하게, 단일클론 항체에 특이적으로 결합될 수 있는 라벨링 결합 파트너는 다클론 항체, 단일클론 항체, 단백질 A 또는 단백질 G 이다. 또한 라벨링된 결합 파트너는 비오틴-변형된 분석물 또는 결합 파트너에 결합가능한 아비딘일 수 있다.
또는, 결합 파트너는 관심있는 분석물의 일차 결합 파트너일 수 있다. 일차 결합 파트너의 결합 파트너는 라벨 화합물에 결합된 물질이다. 관심있는 분석물은 항원에 결합하는 단일클론 항체이다 항원은 입자의 표면에 결합되고, 따라서 입자들은 단일클론 항체와 특이적으로 결합될 수 있다. 단일클론 항체는 특이적으로 입자에 결합되고, 일차 결합 파트너는 단일클론 항체에 특이적으로 결합되고, 라벨 화합물에 결합된 이차 결합 파트너는 일차 결합파트너에 특이적으로 결합된다.
[실시예 6]
디곡신에 대한 단일클론 항체의 검출을 위하여 미립자를 기재로 하는 비분리 결합, 샌드위치 분석(히브리도마 스크리닝 분석 형식)이 하기처럼 수행되었다:
(1) TAG에 공유결합된 산양 항-생쥐 IgG;
(2) (a) 디곡신-소혈청 알부민(BSA) 및 (b) 특이항체 및 비특이 결합항체 각각을 검출하기 위해 BioMag(R)입자에 공유결합된 소혈청알부민(BSA);
(3) 단일클론 항-디곡신 항체를 함유하는 것으로 보이거나, 또는 비교용으로 히브리도마 배양 매질내 1-50 ㎍/ml 의 항체의 주지량을 함유하는 히브리도마 성장 매질 샘플;
(4) ECL 완충제
일련의 튜브(12×75 mm 폴리프로필렌)를 장치하고 디곡신에 대하여 주지량의 단일클론 항체를 함유하는 샘플 또는 샘플 수에 따라 라벨링 하였다. 각각의 튜브에 디곡신에 대한 항체를 함유하는 것으로 보이는 히브리도마 상등액 50 ㎕, BioMag(R)에 결합된 디곡신-BSA 50 ㎕ 및 희석된 산양 항-생쥐 IgG TAG(1 ㎕/ml) 100 ㎕를 첨가하고, ECL 완충제 800 ㎕를 첨가시킴으로써 부피를 1 ml로 조절하였다. 튜브를 와동시키고, 교반시키면서 실온에서 15분 동안 항온 처리시켰다. 비특이적 결합 연구를 위해, 소혈청 알부민(BSA)-BioMag(R)입자를 디곡신-BSA입자 대신 첨가시켰다. 현탁액의 전기 화학 발광은 병류 방식으로 측정되었다. 결과는 하기와 같았다.
[실시예 7]
인간 IgG에 개한 단일클론 항체의 검출을 위해 미립자를 기재로 하는 비분리 히드리도마 스크리닝 방법이 하기처럼 수행되었다:
시약:
(1) 티오메살(thiomersal) 및 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 0.1M PBS 내에 현탁된 BioMag(R)자기 입자(1%)에 공유결합된 인간 IgG;
(2) 사용하기 바로 전에 ECL 분석 완충제 내에 1 ㎕/ml로 희석된 TAG에 결합된 산양 항-생쥐 IgG;
(3) 인간의 IgG(0-12,000 ng/ml)에 대한 단일클론 항체의 다양한 양을 함유하는 히브리도마 배양 상등액;
(4) ECL 완충제;
(5) 비특이 결합 측정을 위해 BioMag(R)입자에 커플링된 산양 IgG
일련의 튜브(12×75 mm)를 장치하고 분석될 표준물에 따라 라벨링 하였다. 다양한 농도의 생쥐 항-인간 항체를 함유하는 히브리도마 상등액 100 ㎕; 고정된 인간 IgG를 가지는 BioMag(R)입자(1% 고체) 50 ㎕, 산양 항-생쥐-TAG(희석된) 100 ㎕ 및 ECL 완충제 750 ㎕를 첨가하였다. 비특이성 측정의 경우, 고정된 산양 IgG를 가지는 BioMag(R)입자 50㎕가 인간의 IgG 대신 사용되었다. 튜브를 혼합하고 15분 동안 실온에서 항온처리하고 전기화학 발광성을 상기와 같이 해독하였다. 하기 결과가 얻어졌다.
실시예에서 얻어진 데이터는 검정 곡선(calibration curves)이 분석물의 다양한 농도 범위에 걸쳐 그려질 수 있고, 민감성 분석이 실제 샘플의 정체 농도 범위에서 만들어질 수 있음을 보여준다.

Claims (46)

  1. 샘플 내에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (1) 하기 (a), (b) 및 (c)로 이루어지는 조성물을 형성하는 단계; (a) 관심있는 분석물을 포함하는 것으로 보이는 샘플, (b) (i) 첨가되는 관심있는 분석물 또는 상기 관심있는 분석물의 유사물, (ii) 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 결합 파트너, 및 (iii) (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응 성분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질(여기서 상기 물질들 중 하나는 발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된다), 및 (c) 상기 분석물; (b) (i), (ii) 또는 (iii)에 규정된 물질; 또는 상기 분석물 및 (b) (i), (ii) 또는 (iii)에서 규정된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 입자; (2) 상기 라벨 화합물을 전기화학에너지에 노출시킴으로써 전기화학발광하도록 유도하는 단계; 및 (3) 상기 조성물에 의해 방출되는 발광량을 측정하여 상기 샘플내 관심있는 분석물의 존재를 결정하는 단계로 구성되는 분석물의 검출 방법.
  2. 샘플 내에서 관심있는 분석물을 검출 및 정량하는 방법으로서, (1) 하기 (a), (b) 및 (c)로 이루어지는 조성물을 형성하는 단계; (a) 관심있는 분석물을 포함하거나 포함하지 않는 샘플, (b) (i) 첨가되는 관심있는 분석물 또는 상기 관심있는 분석물의 유사물, (ii) 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 결합 파트너, 및 (iii) (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응 성분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 주지량의 물질(여기서 상기 물질들 중 하나는 발광하도록 유도될 수 있는 라벨 화합물에 결합된다), 및 (c) 상기 분석물; (b) (i), (ii) 또는 (iii)에 규정된 물질; 또는 상기 분석물 및 (b) (i), (ii) 또는 (iii)에서 규정된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 주지량의 입자; (2) 상기 라벨 화합물을 전기화학에너지에 노출시킴으로써 전기화학발광하도록 유도하는 단계; 및 (3) 검정 표준 물질의 발광과 상기 조성물에 의해 방출되는 발광을 비교하는 단계들로 구성되는 분석물의 검출 및 정량 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, (b)에 기술된 상기 물질은 상기 관심있는 분석물의 일차 결합파트너 및 상기 라벨 화합물에 결합된 이차 결합파트너로 이루어지는 분석물의 검출방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 입자는 (a) 0.01 ㎕-200 ㎕의 지름을 갖는 미립자물질 및 (b) 상기 분석물; (b) (i), (ii) 또는 (iii)에 규정된 물질; 또는 상기 분석물 및 (b) (i), (ii) 또는 (iii)에서 규정된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 표면성분으로 구성되는 분석물의 검출방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 미립자 물질은 가교결합된 전분, 덱스트란, 셀룰로오스, 단백질, 유기 중합체, 스티렌/부타디엔 공중합체 또는 하크릴로니트릴/부타디엔/스티렌 공중합체와 같은 스티렌 공중합체, 비닐아세틸아크릴레이트 공중합체, 염화비닐/아크릴레이트 공중합체, 불활성 무기입자, 이산화크롬, 산화철, 실리카, 실리카 혼합물, 단백질 함유 물질, 재조합 단백질 및 이들 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 분석물의 검출방법.
  6. 제 2 항에 있어서 상기 입자가 (a) 0.01 ㎕-200 ㎕의 지름을 갖는 미립자 물질 및 (b) 상기 분석물; (b) (i), (ii) 또는 (iii)에 규정된 물질; 또는 상기분석물 및 (b) (i), (ii) 또는 (iii)에서 규정된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 표면 성분으로 구성되는 분석물의 검출 및 정량방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 미립자 물질이 가교결합된 전분, 덱스트란, 셀룰로오스, 단백질, 유기 중합체, 아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리부타디엔, 불활성 무기입자, 이산화크롬, 산화철, 실리카, 실리카 혼합물, 단백질 함유 물질, 재조합 단백질 및 이들 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 분석물의 검출 및 정량방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 물질이 상기 관심있는 분석물의 결합 파트너이고, 상기 입자는 상기 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고, 상기입자 및 결합파트너가 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 잇는 분석물의 검출 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 단일클론 항체이고 상기 입자 및 결합 파트너가 모두 상기 단일클론 항체와 특이적으로 결합할수 있으며, 분석하는 동안 상기 단일클론 항체가 상기 입자에 특이적으로 결합되고, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 결합파트너가 상기 단일클론 항체에 특이적으로 결합되는 분석물의 검출방법.
  11. 제 3 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 단일클론 항체이고, 상기 입자 및 일차 결합파트너 모두가 상기 단일클론 항체와 특이적으로 결합할 수 있으며, 분석하는 동안 상기 단일클론 항체가 상기 입자에 특이적으로 결합되고, 상기 일차 결합 파트너는 상기 단일클론 항체에 특이적으로 결합되며, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 이차 결합파트너가 상기 일차 결합파트너에 특이적으로 결합되는 분석물의 검출방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 물질이 상기 관심있는 분석물의 결합 파트너이고, 상기 입자는 상기 결합파트너와 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고, 상기 입자의 표면은 항원 또는 항원의 유사물을 함유하고, 상기 결합파트너는 항원 또는 그 유사물에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출방법.
  14. 제 3 항에 있어서, 상기 입자가 상기 일차 결합파트너에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 이차 결합파트너가 상기 일차 결합파트너에 특이적으로 결합하는 분석물의 검출방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고, 상기 입자가 항원 또는 항원의 유사물을 함유하고, 상기 일차 결합파트너가 항원 또는 그 유사물에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 물질이 첨가되는 관심있는 분석물이 고, 상기 입자가 상기 관심있는 분석물 또는 상기 첨가되는 관심있는 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고 상기 입자가 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 분석 혼합물이 첨가되는 관심있는 분석물 및 상기 관심있는 분석물의 결합파트너를 포함하고, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 물질이 첨가되는 관심있는 분석물이고, 상기 입자는 상기 결합파트너와 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물 및 상기 첨가되는 관심있는 분석물이 항원이고, 상기 결합 파트너가 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 입자가 상기 결합파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출방법.
  20. 제 3 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고, 상기 입자 및 일차 결합파트너가 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 이차 결합파트너가 상기 일차 결합파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출방법.
  21. 동종 또는 이종으로(homogeneously or heterogeneously) 전기화학 발광현상의 측정 및 특이 결합반응에 기초하여 분석물을 분석하는 방법으로서, (a) 하기 (i), (ii)을 포함하는 분석혼합물을 형성하는 단계 (i) 결합성질을 갖는 관심있는 분석물을 함유하는 샘플, (ii) 분석 혼합물의 하나의 성분에 특이적으로 결합할 수 있는 표면을 갖는 다수의 입자, 및 (iii) 전기화학 발광성질을 갖는 화학적 부분을 포함하고 결합성질을 갖는 라벨 물질; (b) 상기 분석 혼합물을 항온처리하여 결합시키는 단계; (c) 상기 라벨 물질을 전기화학에너지에 노출시킴으로써 발광하도록 유도하는 단계; 및 (d) 상기 분석 혼합물에 의해 방출되는 전기발광을 측정하고, 상기 측정장치를 검정 표준물질과 상호 연관시켜 상기 샘플내에서 관심있는 분석물의 존재여부 또는 양을 결정하는 단계로 구성되는 분석방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 분석 혼합물은 또한 전기화학발광을 용이하게 하기 위해 채택된 전기 전도 매체를 포함하는 분석방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 (b) 단계 다음에 상기 입자가 상기 분석혼합물로부터 분리되는 분석방법.
  24. 제 21 항에 있어서, 상기 (a) 내지 (d) 단계로 필수적으로 구성되는 동종으로 분석물을 분석하는 방법.
  25. 제 21 항에 있어서, 상기 입자는 상기 분석혼합물 내에 현탁된 분석방법.
  26. (a) 전해질, (b) ECL 부분을 함유하는 라벨 화합물, (c) 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 (e) (c) 또는 (d)와 반응할 수 있는 반응 성분, (f) 환원제, 및 (g) 전기 화학발광-반응 증진제 (단, 시약 조성물에 함유된 두가지 성분은 저장하는 동안 서로 반응하여 의도하는 분석에서 그 기능을 방해하여서는 안된다.)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분 및 입자로 구성되는, 미립자를 기재로 하는 결합분석 시약용 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 (a)-(g)로 구성된 군으로부터 선택된 세가지 성분들로 구성되는 시약용 조성물.
  28. 샘플내 관심있는 분석물을 검출하기 위한 분석시약으로서, (a) (i) 관심있는 분석물 또는 이의 유사물, (ii) 상기 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 결합파트너, 및 (iii) (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응성분으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질(여기서 상기 물질들 중 하나는 전기화학발광하도록 유도될 수 있는 화학적 부분을 갖는 라벨 화합물에 결합된다.), 및 (b) 분석물; (a) (i), (ii) 또는 (iii)에서 규정된 물질; 또는 분석물 및 (a) (i), (ii) 또는 (iii)에서 규정된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 현탁된 입자(단, 상기 시약의 성분들은 저항하는 동안 서로 반응하여 의도하는 분석에서 그 기능을 방해하지 아니하여야 한다.)로 구성되는 분석시약.
  29. 제 28 항에 있어서, 전해질을 더 포함하는 분석시약.
  30. (a) 전해질, (b) 전기 화학발광 성질을 갖는 화학적 부분을 포함하며 결합성질을 갖는 라벨 물질, 및 (c) 관심있는 분석물을 함유하는 샘플 또는 상기 라벨물질에 결합할 수 있는 표면을 갖는 다수의 입자로 구성되는, 전기화학 발광현상의 측정 및 결합반응에 기초한 분석용 분석시약.
  31. 미립자를 기재로 하는 결합분석용 시약을 포함하는 용기로 이루어지는 키트(kit)로서, (1) (a) 전해질, (b) ECL 부분을 함유하는 라벨 화합물, (c) 관심있는 분석물 또는 이의 유사물, (d) 상기 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 결합 파트너, (e) (c) 또는 (d)와 반응할 수 있는 반응 성분, (f) 환원제, 및 (g) 전기화학발광-반응 증진제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시약 및 입자, 또는 (2) 상기 성분들 (a)-(g)로부터 선택된 성분들을 함유하고, 하나 이상의 입자를 함유하는 하나 이상의 시약(단, 혼합된 시약의 둘 이상의 성분은 의도하는 분석에서 시약의 기능을 방해할 정도로 저장조건하에 서로 반응하지 않는다.)을 포함하는 용기로 구성되는 키트.
  32. 전기화학 발광현상에 기초한 샘플내 관심있는 분석물을 검출 또는 정량하기 위한 시스템으로서, (a) 샘플, (b) (i) 첨가되는 관심있는 분석물 또는 관심있는 분석물의 유사물, (ii) 상기 관심있는 분석물 또는 그 유사물의 결합 파트너, 및 (iii) (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는 반응성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질(여기서 상기 물질들 중 하나는 전기화학 발광하도록 유도될 수 있는 화학적 부분을 갖는 라벨 화합물에 결합된다.), (c) 분석물; (b) (i), (ii) 또는 (iii)에서 규정된 물질; 또는 분석물 및 (b) (i), (ii) 또는 (iii)에서 규정된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 입자; (d) 상기 라벨 화합물이 발광하도록 유도하기 위한 수단; 및 (e) 시스템에 의해 방출된 발광을 측정하여 상기 샘플내 상기 관심있는 분석물의 존재 또는 양을 결정하는 수단으로 구성되는 시스템.
  33. 제 2 항에 있어서, (b)에 기술된 물질이 상기 관심있는 분석물의 일차 결합파트너 및 라벨 화합물에 결합된 이차 결합파트너로 이루어지는 분석물의 검출 및 정량방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 단일클론 항체이고 상기 입자 및 일차 결합파트너 모두가 단일클론 항체와 특이적으로 결합할 수 있으며, 분석하는 동안 단일클론 항체가 입자에 특이적으로 결합되고 상기 일차 결합파트너가 단일클론 항체에 특이적으로 결합되며, 상기 라벨 화합물에 결합된 이차 결합파트너가 상기 일차 결합파트너에 특이적으로 결합되는 분석물의 검출 및 정량방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 상기 입자가 상기 일차 결합파트너에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 이차 결합파트너가 일차 결합파트너에 특이적으로 결합하는 분석물의 검출 및 정량방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고, 상기입자가 항원 또는 항원의 유사물을 함유하고, 상기 일차 결합파트너가 항원 및 그 유사물에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량방법.
  37. 제 33 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고, 상기 입자 및 일차 결합파트너가 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 이차 결합파트너가 상기 일차 결합파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량방법.
  38. 제 2 항에 있어서, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 물질이 상기 관심있는 분석물의 결합파트너이고, 상기 입자는 상기 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고, 상기 입자 및 결합파트너가 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량방법.
  40. 제 38 항에 있어서, 상기 관심있는 분걱물이 단일클론 항체이고, 상기 입자 및 결합파트너 모두가 단일클론 항체에 특이적으로 결합할 수 있으며, 분석하는 동안 단일클론 항체가 상기 입자에 특이적으로 결합되고, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 결합파트너가 단일클론 항체에 특이적으로 결합되는 분석물의 검출 및 정량방법.
  41. 제 2 항에 있어서, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 물질이 상기 관심있는 분석물의 결합파트너이고, 상기 입자가 상기 결합파트너와 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고, 상기 입자의 표면이 항원 또는 항원의 유사물을 함유하고, 상기 결합파트너가 항원 또는 그 유사물에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량방법.
  43. 제 2 항에 있어서 , 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 물질이 첨가되는 관심있는 분석물이고, 상기 입자가 상기 관심있는 분석물 또는 상기 첨가되는 관심있는 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 항원이고 상기 입자가 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 관심있는 분석물 및 상기 첨가되는 관심있는 분석물이 항원이고, 상기 결합 파트너가 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 입자가 상기 결합파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량방법.
  46. 제 2 항에 있어서, 분석 혼합물이 첨가되는 관심있는 분석물 및 관심있는 분석물의 결합파트너를 함유하고, 상기 라벨 화합물에 결합된 상기 물질이 첨가되는 관심있는 분석물이고, 상기 입자가 상기 결합파트너와 특이적으로 결합할 수 있는 분석물의 검출 및 정량방법.
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