CN112639475A - Dlbcl的预后指数中的胸苷激酶(tk-1) - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一项发现,即在测定侵袭性B细胞淋巴瘤(特别是弥漫性大B细胞淋巴瘤,DLBCL)患者的风险分层的预后指数(PI)的方法中,胸苷激酶1(TK‑1)是一种有价值的生物标志物;涉及TK‑1在这类PI中的用途;还涉及一种PI,其包括所述标志物TK‑1。
Description
技术领域
本发明涉及一项发现,即在测定侵袭性B细胞淋巴瘤(特别是弥漫性大B细胞淋巴瘤,DLBCL)患者的风险分层的预后指数(PI)的方法中,胸苷激酶1(TK-1)是一种有价值的生物标志物;涉及TK-1在这类PI中的使用;还涉及一种PI,其包括所述标志物TK-1。
背景技术
通常根据预后指数评分进行分层,将DLBCL患者分为不同的风险组。目前,有数个用于这类患者分层的预后指数(PI)(Wight等人,BloodReviews,2018)。NCCN指南包括下列预后指数:IPI、年龄调整的(ageadjusted)IPI、分期调整的IPI和NCCN-IPI。ESMO指南建议采用IPI和年龄调整的IPI。
标准国际预后指数(IPI)[Ziepert M.等人,Journal of Clinical Oncology:28/14(2010)2373]广泛用于临床以预测接受R-CHOP(利妥昔单抗联合CHOP化疗)治疗的DLBCL患者的预后。同样,美国国家综合癌症网络国际预后指数(NCCN-IPI)也得到了普遍应用[Zhou等人,Blood,123,6∶(2014)837]。
尽管DLBCL领域中用于测定的不同PI的参数有所不同,但已有共识,Ann Arbor分期、结外疾病状况及作为唯一生物标志物的乳酸脱氢酶(LDH)是上述各个PI的关键要素。
对于改善预后指数或评分的期望很高,原因是指数/评分越准确和可靠,患者分层效果越好。
因此,本公开的发明人的任务是研究是否有生物标志物可用于改善DLBCL患者的分层,例如通过测定预后指数或评分。
本公开通过提供如权利要求书中所定义的说明、实例和实施例,实现了这个目的。
已经发现,以下参数是测定DLBCL患者任何预后指数的关键:结外疾病状况、AnnArbor分期和胸苷激酶1水平。
还有一个惊人的发现是,生物标志物胸苷激酶1不仅能替代所研究PI中的标志物LDH,与PI中所用的其他参数组合时,还能改善这类PI,即改善患者分层。
发明内容
在一个实施例中,本公开涉及一种测定弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的预后指数(PI)的方法,该方法包括:a)至少测定以下参数:i)结外疾病状况,ii)Ann Arbor分期,iii)胸苷激酶1水平,其中不存在结外疾病的情况,评为0分,且存在淋巴结外疾病的情况,评为1分;其中Ann Arbor I期或II期,评为0分,且Ann Arbor III期或IV期,评为1分;并且其中胸苷激酶水平至多达到并包括截止点的情况,评为0分,且其中胸苷激酶水平高于截止点的情况,至少评为1分;和b)测定PI时,求取i)、ii)和iii)各项分值的总和。
本文还公开了TK-1水平的值在DLBCL患者预后指数以及DLBCL预后指数(PI)测定中的用途,其包括胸苷激酶1水平的值。
附图说明
本发明的某些方面同样借助附图进行了说明。
图1:免疫测定法数据的图形表示。该图左侧部分示出了箱线图(箱形图)。y轴(对数标度)上示出了浓度(单位:ng/ml)。该图右侧部分示出了曲线下面积(AUC)。(缩略语:Ctr=对照样品;DLBCL=来自弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的样品)。
图2:胸苷激酶(活性)测定法数据的图形表示。图2左侧部分:示出了箱线图(箱形图),y轴(对数标度)上示出了每毫升含量。此图右侧部分示出了曲线下面积(AUC)。(缩略语:Ctr=对照样品;DLBCL=来自弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的样品)。
图3:方法比较
具体实施方式
在一个实施例中,本公开涉及一种测定弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者预后指数(Pi)(也称风险评分或PI评分)的方法,该方法包括
a)至少测定以下参数:
i)结外疾病状况;ii)Ann Arbor分期;iii)胸苷激酶1的水平,
其中,不存在结外疾病的情况,评为0分,且存在结外疾病的情况,评为1分;
其中Ann Arbor I期或II期,评为0分,且Ann Arbor III期或IV期,评为1分;并且其中胸苷激酶水平至多达到并包括截止点,评为0分,且其中胸苷激酶水平高于截止点的情况,至少评为1分;以及
b)测定PI时,求取i)、ii)和iii)各项分值的总和。
在本说明书中,引用了大量文件,包括专利申请书和制造商手册。所述文件的公开内容,被认为与本发明的专利性无关,而是以全文引用的方式并入本文。更具体而言,所有参考文件的引用程度如同将每个单独的文件具体且单独地以引用方式并入本文。
人胸苷激酶1,(缩写:TK-1、hTK-1、hTK1或TK1),(ATP:胸苷5′-磷酸转移酶,EC2.7.1.21)是参与DNA前体合成的一种酶。人胸苷激酶1由诸如SEQ ID NO:1所示的234氨基酸组成。在人体组织内,TK-1以各种形式存在,如二聚体、四聚体以及高分子量的聚合物。所述形式似乎取决于以下因素:特定分子的存在,例如三磷酸腺苷(ATP)是否存在;hTK-1蛋白本身的浓度,蛋白类型(即,天然或重组TK 1);以及蛋白的位点/位置,即血清或细胞质中。
目标样品中胸苷激酶1的水平可通过适当的方式进行测定。这类测定在体外进行。在一个实施例中,对目标样品的胸苷激酶1水平进行体外测定。
在一个实施例中,TK-1水平是酶促活性水平。血清TK-1酶促活性可以用例如放射性底物1251-dUrd(TK-REA,DiaSorin Inc.)或非放射性底物TK-1活性检测试剂盒(TK检测试剂盒,DiaSorin Inc.)等进行测量。在一个实施例中,胸苷激酶1水平是胸苷激酶1的蛋白水平。
术语“截止点”涉及一个判定点,通常是一个数值和/或浓度。低于或等于截止点的数值将分到第一组,高于截止点的数值将分到第二组。有时会使用多于一个截止点。在这种情况下,低于或等于第一截止点的数值将分到第一组,高于第一截止点且至多达到并包括第二截止点的数值将分到第二组,高于第二截止点且至多达到并包括......
一个惊人的发现是,DLBCL患者的胸苷激酶1水平远远高于在取自健康个体的样品中测得的TK-1水平。在一个实施例中,在新诊断DLBCL患者的基准样品中测定截止点,其范围在新诊断DLBCL患者的25%百分位数至35%百分位数之间。
在一个实施例中,根据从健康对照组采集的样品,测定截止值。在一个实施例中,胸苷激酶截止水平是在健康个体中测得的TK-1水平的均值的4倍。
已经发现,可使用单一TK-1水平截止点并将患者分为两个组,即,胸苷激酶1水平至多达到并包括截止值的患者为一组,以及TK-1水平高于截止值的患者为一组。
在一个实施例中,本公开涉及一种如上所述的测定PI的方法,其中胸苷激酶1截止水平设为在健康个体中测得的TK-1水平的均值的4倍;其中胸苷激酶1水平至多达到并包括截止点的情况,评为0分;并且其中任何TK-1水平高于截止值点的情况,评为1分。
还已经发现,根据患者的TK-1水平将患者分为两组可能是有利的:具有低胸苷激酶1水平组,即患者的TK-1水平至多达到并包括截止值;中等水平组,即患者的TK-1水平高于截止点且至多达到并包括对应于在健康个体中测得的均值的20倍的值;以及高胸苷激酶水平组,即患者的TK-1水平高于在健康个体中测得的均值的20倍。
在一个实施例中,本公开涉及一种测定如上所述的PI的方法,其中胸苷激酶1截止水平设为在健康个体中测得的TK-1水平的均值的4倍;其中低胸苷激酶1水平,即TK-1水平至多达到并包括截止点,评为0分;中等胸苷激酶水平,即TK-1水平高于截止点且至多达到并包括对应于在健康个体中测得的均值的20倍,评为1分;高胸苷激酶水平,即TK-1水平高于在健康个体中测得的均值的20倍,评为2分。
已经发现,就蛋白浓度而言的TK-1水平(用尚未完全标准化的免疫测定法进行测定)与TK-1酶促活性水平(用市面上的DiaSorin酶促活性检测试剂盒进行测定)之间显示出极好的相关性(参见图3)。因此,还可以在酶促活性方面给定截止值(U/l)。
在一个实施例中,本公开涉及一种测定PI的方法,其中关于TK-1蛋白水平的截止点等于并包括18U/1的TK-1酶促活性。
在一个实施例中,本公开涉及一种测定PI的方法,其中蛋白水平的截止点等于并包括18U/1,并且其中TK-1水平高于18U/1且至多达到并等于88U/l的情况,评为1分,且TK-1水平高于88U/1的情况,评为2分。
已经发现,对于任何患者而言,特别是对于最近诊断患有DLBCL的患者而言,应该测量TK-1水平并将其与预定义的截止点进行比较。若新诊断的患者的测量值高于该预定义的截止点(二值化方法),可视为该患者的风险评分较高,更可能有不利的疾病预后。
还可以基于一组递增的截止点来定义多于两个风险组,例如在采用三分法的情况下,测定PI时,TK-1水平低的患者评分为0(风险)分;测定PI时,TK-1水平中等的患者评分为1(风险)分;测定PI时,TK-1水平高的患者评分为2(风险)分。根据患者的TK-1测量值将其分到一个风险组;风险评分越高,疾病预后越不利。
替代地,也可以基于预定义的适用转换函数(例如log2转换),将TK-1测量值直接转换为连续的风险评分。在一个实施例中,根据本公开所述的方法,基于经log2转换的TK-1测量值来测定PI。在一个实施例中,根据本公开所述的方法,基于TK-1测量值的连续风险评分来测定PI。所述任何分层或转换后的TK-1值均可添加至任何现有预后指数(无论是否替代LDH)。
在一个实施例中,如本文所公开的测定预后指数的方法,即,该方法包括以下参数:结外疾病状况、Ann Arbor分期和胸苷激酶1水平;进一步包括参数年龄,其中在测定PI时,若年龄低于截止点,则评为0分,且若年龄高于截止点,则评为1分。
在一个实施例中,如本文所公开的测定预后指数的方法,即,该方法包括以下参数:结外疾病状况、Ann Arbor分期和胸苷激酶1水平;进一步包括参数ECOG体能状态,在测定PI时,其中若ECOG体能状态等于或小于1,则评为0分;其中若ECOG体能状态等于或大于2,则评为1分。
目前至少有四个不同但相关的DLBCL预后指数可用并且正被用于临床实践中,包括:国际预后指数(IPI)、年龄调整的IPI、修订的标准版国际预后指数(R-IPI)和美国国家综合癌症网络国际预后指数(NCCN-IPI)。
“预后指数”(PI)(也称风险评分或PI评分)提供一个数值。这类PI的数值例如通过求取这类PI的各个参数(组成部分)的测量值的总和而得到。在一个实施例中,根据本公开所述的测定PI的方法在计算机可读程序中实现。在一个实施例中,根据本公开所述的测定PI的方法实现于应用程序中。预后指数或PI评分可例如用于将患者分类/分层到不同的组。例如,所述小组可以是具有不同的疾病进展风险的小组。通常,大致分为三到四个小组;分别是低风险组、中风险组和高风险组;或者分别是低风险组、低风险组、中高风险组和高风险组。
DLBCL领域“原版的”国际预后指数(IPI)在1993年被Shipp MA和Harrington DP描述为“侵袭性非霍奇金淋巴瘤的预测模型”;参见The International Non-Hodgkin′sLymphoma Prognostic Factors Project;N.Engl.J.Med.1993;329(14):987-94。在本文中还描述了年龄调整的IPI,该指数将患者按年龄分组:年龄大于60岁;年龄至多达到和包括60岁。由此,在这里明确引入该参考文献的公开内容作为参考。
“原版的”国际预后指数(IPI)包括以下参数:年龄(大于60岁=1分)、ECOG体能状态(等于或大于2的情况=1分)、Ann Arbor分期(III期或IV期=1分)、LDH(高于ULN(正常值上限)=1分)和结外受侵部位(多于1个=1分)。根据IPI评分划分的风险组如下:低风险组(0至1分);中低风险组(2分);中高风险组(3分);以及高风险组(4或5分)。
年龄调整的IPI的最不复杂版本应用于年龄大于60岁的患者。该指数包括以下参数:Ann Arbor分期(III期或IV期=1分)、LDH(高于ULN=1分)和结外受侵部位(多于1个=1分)。确定四个风险组,即,低风险组(0分);中低风险组(1分);中高风险组(2分);以及高风险组(3分)。
在用于年龄至多达到和包括60岁的患者时,年龄调整的IPI也包括以下参数,但使用的评分略有不同:Ann Arbor分期(III期或IV期=1分)、LDH(高于ULN=1分)和结外受侵部位(多于1个=1分)。据此确定的四个风险组是:低风险组(0至1分);中低风险组(1至2分);中高风险组(2至3分);高风险组(4分)。
如本发明的发明人所发现的,TK-1既可用于取代IPI中的LDH,也可用于取代年龄调整的IPI中的LDH。
(修订版)国际预后指数(R-IPI)[Sehn等人,2007]广泛用于临床以预测接受R-CHOP方案(利妥昔单抗联合CHOP化疗方案)治疗的DLBCL患者的预后。该指数包括五个组成部分,所述组成部分的总和为最终风险评分(表1)。
表1:R-IPI预后指数的组成部分及阈值。
R-IPI组成部分 | 评分 |
年龄>60 | 1 |
ECOG体能状态>=2 | 1 |
乳酸脱氢酶(LDH)升高 | 1 |
Ann Arbor III至IV期 | 1 |
结外受侵部位数量>1 | 1 |
在一个实施例中,根据本发明中公开的测定PI的方法,即该方法包括以下参数:结外疾病状况;Ann Arbor分期;以及胸苷激酶1水平。该方法进一步包括参数年龄和参数AnnArbor分期,在测定PI时,其中若年龄小于或包括60岁,则评为0分,其中若年龄大于60岁,则评为1分;在测定PI时,其中若Ann Arbor分期等于或低于II期,则评为0分,并且其中若AnnArbor分期为III期或IV期,则评为1分。在该方法的一个实施例中,结外疾病是指在多于1个结外部位(包括骨髓)的疾病,若满足此条件,则在测定PI时,评为1分。在一个实施例中,本发明涉及一种改良的R-IPI,该指数包括表1所列的上述参数(组成部分),其中使用TK-1水平代替LDH水平。在所述改良的R-IPI的一个实施例中,胸苷激酶1截止水平设为在健康个体中测得的TK-1水平的均值的4倍,其中胸苷激酶1水平至多达到和包括截止点的情况,评为0分,且其中任何TK-1水平高于截止点的情况,评为1分。在所述改良的R-IPI的一个实施例中,胸苷激酶截止水平设为在健康个体中测得的TK-1水平的均值的4倍,并且低胸苷激酶水平,即TK-1水平至多达到并包括截止点,评为0分;中等胸苷激酶水平,即TK-1水平高于截止点且至多达到并包括对应于在健康个体中测得的均值的20倍的值,评为1分;以及高胸苷激酶水平,即TK-1水平高于在健康个体中测得的均值的20倍,评为2分。
若使用如上文所述的单一TK-1水平截止点,则“TK-1IPI”(IPI采用TK-1代替LDH)风险组仍保持已公布分组,即,低风险组(0至1分);中低风险组(2分);中高风险组(3分);高风险组(4或5分)。通过对TK-1水平测定值采用三分法,可进一步提高“TK-1IPI”(IPI采用TK-1代替LDH)的预后能力。对应的风险组是:低风险组(0分);中低风险组(1分);中高风险组(2至3分);高风险组(4至6分)。
若使用如上文所述的单一TK-1水平截止点,则“TK-1R-IPI”(R-IPI采用TK-1代替LDH)风险组仍保持已公布分组,即,低风险组(“优”;0分);中风险组(“良”;1至2分);高风险组(“差”;3至5分)。通过对TK-1水平测定值采用三分法,可进一步提高“TK-1R-IPI”(R-IPI采用TK-1代替LDH)的预后能力。对应的风险组是:低风险组(“优”;0分);中风险组(“良”;1至3分);高风险组(“差”;4至6分)。
美国国家综合癌症网络国际预后指数(NCCN-IPI)衍生自R-IPI,并包含以下风险组成部分(表2)。
表2:NCCN-IPI预后指数的组成部分及阈值。ULN=正常值上限
在一个实施例中,根据本发明中公开的测定PI的方法,即该方法包括以下参数:结外疾病状况;Ann Arbor分期;以及胸苷激酶1水平。该方法进一步包括参数年龄和参数ECOG体能状态,在测定PI时,其中若年龄小于和包括40岁,则评为0分,其中若年龄大于40岁且至多达到和包括60岁,则评为1分,其中若年龄大于60岁且至多达到和包括75岁,则评为2分,并且其中若年龄大于75岁,则评为3分;并且在测定PI时,其中若ECOG体能状态等于或小于1,则评为0分,并且其中若ECOG体能状态等于或大于2,则评为1分。在该方法的一个实施例中,结外疾病是指在选自骨髓、CNS、肝、胃肠道和肺的1个或多个部位的疾病,若符合该判定条件,则评为1分。在一个实施例中,本发明涉及一种改良的NCCN-IPI,该指数包括表2所列的上述参数(组成部分),其中使用TK-1水平代替LDH水平。在所述改良的NCCN-IPI的一个实施例中,胸苷激酶截止水平设为在健康个体中测得的TK-1水平的均值的4倍,并且低胸苷激酶水平,即TK-1水平至多达到并包括截止点,评为0分;中等胸苷激酶水平,即TK-1水平高于截止点且至多达到并包括对应于在健康个体中测得的均值的20倍的值,评为1分;以及高胸苷激酶水平,即TK-1水平高于在健康个体中测得的均值的20倍,评为2分。
“TK-1NCCN-IPI”(NCCN-IPI采用TK-1代替LDH)风险组仍保持已公布分组,即,低风险组(0至1分);中低风险组(2至3分);中高风险组(4至5分);高风险组(6分及以上)。
从表1和表2以及上文对“旧版”IPI的描述显而易见的共识是,Ann Arbor分期、结外疾病及作为唯一生物标志物的乳酸脱氢酶(LDH)是上述各个用于DLBCL的PI的关键要素。
可以看出,对于IPI、年龄调整的IPI、R-IPI和NCCN-IPI,乳酸脱氢酶(LDH)水平的值通常是采用正常值上限(ULN)来测定。LDH水平低于或等于ULN的情况,评为0分,并且LDH水平高于ULN的情况,至少评为1分。
按照https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5121694和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2809679(其公开内容通过引用被整体并入本文)中的描述进行Ann Arbor分期。
依照美国东部肿瘤协作组Oken MM,Creech RH,Tormey DC等人以及ECOG主席医学博士Robert Comis的定义和描述,测定ECOG(美国东部肿瘤协作组)体能状态(=“ECOG状态”)。美国东部肿瘤协作组的毒性及疗效标准。Am J Clin Oncol.1982Dec;5(6):649-55。
上述所有的DLBCL PI均采用相同的ECOG状态(ECOG体能状态)截止点,即在测定各个所述指数时,ECOG状态等于或大于2的情况,评为1分,而ECOG状态为0或1的情况,评为0分。同样适用于作为本文所公开方法的一部分或预后指数的ECOG状态。
普遍认为,“结外疾病”还是上述任意PI的又一个核心要素。在上文所详述的各个IPI中,关于结外疾病的定义略有不同。从本文给出的实例可明显看出,TK-1水平的值可用于并可结合上述任意PI使用。因此,在一个实施例中,本发明涉及一种测定PI的方法或涉及这类PI,其中结外疾病的定义选自多于1个结外受侵部位(包括骨髓)中的疾病或选自受侵部位为骨髓、CNS、肝、胃肠道、肺中的(1个或多个)的疾病。
如本文中所用,术语“样品”或“目标样品”或“测试样品”可互换使用。所述样品为体外样品,将在体外进行分析,不会再移回体内。在一个实施例中,目标样品在开始治疗前取自新诊断的DLBCL患者。样品的实例包括但不限于液体样品,诸如血液、血清、血浆、滑液、尿液、唾液和淋巴液;或固体样品,诸如组织提取物、软骨、骨头、滑膜和结缔组织。在一个实施例中,样品选自血液、血清、血浆、滑液和尿液。在一个实施例中,样品选自血液、血清和血浆。在一个实施例中,样品是血清或血浆。
本文中使用的术语“参考样品”是指分析方法与目标样品大致相同且其信息与目标样品的信息进行比较的样品。因此,参考样品提供一种标准,用于评估从目标样品获得的信息。参考样品可能取自健康或正常的组织、器官或个体,从而提供了组织、器官或个体健康状态的判断标准。在一个实施例中,用于测定TK-1水平的均值的参考样品取自健康个体。
如上文进一步所述,在一个实施例中用于测定预后指数的胸苷激酶水平是蛋白水平。对于熟悉该领域的人员,在其技能范围内有多种方法可用于测定蛋白水平。
在一个实施例中,用免疫测定法测定胸苷激酶的蛋白水平。任何类型的免疫测定法均可用于测量样品中的TK-1蛋白水平。可用于测量TK-1水平以备后续测定PI的免疫测定法的实例是酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)或基于发光检测、化学发光检测、电化学发光检测或荧光检测的免疫测定法。
市面上的一种免疫测定法是Arocell公司的基于微量滴定板规格的hTK-1测定法。
在一个实施例中,采用夹心法测定方式测定用于测定预后指数的TK-1水平。
在典型的夹心型测定法中,结合到固相载体或能结合到固相的第一抗体以及被可检测地标记的第二抗体各自与分析物结合于不同的非覆盖型表位。第一分析物特异性结合试剂(例如抗体)共价或被动结合到固体表面。固体表面通常是玻璃或聚合物,最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。该固相支持体的形式可以是小管、磁珠、微孔板托盘或其他适合于进行免疫测定法的任何表面。结合方法为本领域所公知,通常由交联共价结合或物理吸附组成,在制备测试样品时洗涤聚合物-抗体复合物。将待测样品的等分试样加到固相复合物,在适合条件下(例如,从室温至40℃,诸如25℃至37℃(含)之间)温育足够长的一段时间(例如2-40分钟或过夜(如果更方便的话)),以使第一抗体或捕获抗体与相应抗原结合。该温育期结束之后,可洗涤固相,其包括第一抗体或捕获抗体以及与其相结合的抗原,并用结合于该抗原上另一个表位的二级抗体或标记的抗体进行温育。第二抗体连接到报告物分子,该分子用于指示第二抗体与第一抗体-目标抗原复合物之间的结合。
极为通用的其他夹心测定法方式包括使用结合对的第一配偶体包被的固相载体,例如顺磁性链霉亲和素包被的微粒。将所述微粒与以下物质混合后温育:与结合对的第二配偶体结合的分析物特异性结合试剂(例如生物素化的抗体);疑似包含或包含分析物的样品,其中所述结合对的第二配偶体结合到所述分析物特异性结合试剂;第二分析物特异性结合试剂,该试剂可例如使用本文中所用的电化学发光标记可检测地标记)。如对本领域技术人员显而易见的那样,所述组分在适当条件下温育足够长的一段时间,以使标记的抗体(通过分析物)、与结合对的第二配偶体(结合)的分析物特异性结合试剂以及结合对的第一配偶体与固相微粒相结合。视情况而定,所述测定法可包含一个或多个洗涤步骤。
如对本领域技术人员显而易见的那样,可按任意需要的顺序使样品接触第一和第二抗体,即首先接触第一抗体,然后接触第二抗体;首先接触第二抗体,然后接触第一抗体;或同时接触第一和第二抗体。在充分的时间和条件下接触,以形成第一抗-hTK-1抗体/hTK-1/第二抗-hTK-1抗体复合物。
如本领域技术人员所容易理解的是,这仅仅是用于设定形成以下复合物的适合或充分的时间和条件的常规实验,即形成特异性抗-hTK-1抗体和hTK-1抗原/分析物的复合物(=抗-hTK-1抗体/hTK-1复合物),或形成二级复合物或夹心复合物,其包括hTK-1的第一抗体、hTK-1(分析物)和第二抗-hTK-1抗体复合物(=第一抗-hTK-1抗体/hTK-1/第二抗-hTK-1抗体复合物)。
可采用任何适当的方式对抗-hTK-1抗体/hTK-1复合物进行检测。本领域的技术人员充分熟悉所述方式/方法。
在用于测定hTK-1水平的免疫测定法中,通常hTK-1的至少一个抗体包括可检测的标记。
术语“可检测地标记的”包含可直接或间接检出的标记。
可直接检出的标记提供可检测的信号或它们与第二标记相互作用以修正第一或第二标记提供的可检测的信号,例如发生FRET(荧光共振能量转移)。标记诸如荧光染料及发光(包括化学发光和电化学发光)染料(Briggs等人,″Synthesis of FunctionalisedFluorescent Dyes and TheirCoupling to Amines and Amino Acids,″J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)提供了可检测的信号并且通常适用于标记。在一个实施例中,“可检测地标记的”指提供或诱导提供可检测的信号的标记,即分别指荧光标记、发光标记(例如化学发光标记或电化学发光标记)、放射性标记或基于金属螯合物的标记。
大量的可用标记(也称为染料)通常可分为以下类别,全部类别的总体及其每一个类别均表示如本公开所述的实施例:
(a)荧光染料
荧光染料例如,如Briggs等人所描述,″Synthesis ofFunctionalizedFluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids,″J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)。
荧光标记或荧光团包括稀土螯合物(铕螯合物);荧光素类型标记,包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素;罗丹明标记,包括TAMRA;丹磺酰;丽丝胺(Lissamine);花青;藻红蛋白;得克萨斯红(Texas Red);及其类似物。采用本文所公开的技术,可将荧光标记缀合至目标分子所包含的醛基。荧光染料和荧光标记试剂包括可从Invitrogen/MolecularProbes(Eugene,Oregon,USA)和Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Ill.)购得的这类荧光染料和试剂。
(b)发光染料
发光染料或标记还可进一步划分为以下子类别:化学发光染料和电化学发光染料。
不同类别的化学发光标记包括鲁米诺、吖啶类化合物、腔肠素和类似物、二氧杂环丁烷、基于过氧草酸的系统及其衍生物。对于免疫诊断程序,主要使用基于吖啶的标记(详细综述见Dodeigne C.等人,Talanta 51(2000)415-439)。
用作电化学发光标记的主要相关性标记分别是钌基和铱基电化学发光络合物。已经证明,电化学发光(ECL)作为高灵敏度和选择性方法在分析应用中非常有用。该方法使化学发光分析的分析优势(无背景光信号)和通过采用电极电位更方便地控制反应相结合。通常,钌络合物,特别是与TPA(三丙胺)在液相或液固界面再生的[Ru(Bpy)3]2+(发射出波长约620nm的光子)被用作ECL标记。
电化学发光(ECL)测定法提供了灵敏、精确地检测目标分析物的存在性和浓度的方法。所述技术采用的是可在适当化学环境下发生电化学地氧化或还原时被诱导发光的标记或其他反应物。所述电化学发光由施加在工作电极上的电压在特定时间以特定方式激发。标记所发出的光经测定后,可指示分析物的存在性或数量。为了更全面地描述这类ECL技术,本文引用了以下文献:美国专利号5,221,605、美国专利号5,591,581、美国专利号5,597,910,、PCT公布的申请WO90/05296、PCT公布的申请WO92/14139、PCT公布的申请WO90/05301、PCT公布的申请WO96/24690、PCT公布的申请US95/03190、PCT申请US97/16942、PCT公布的申请US96/06763、PCT公布的申请WO95/08644、PCT公布的申请WO96/06946、PCT公布的申请WO96/33411、PCT公布的申请WO87/06706、PCT公布的申请WO96/39534、PCT公布的申请WO96/41175、PCT公布的申请WO96/40978、PCT/US97/03653以及美国专利申请08/437,348(美国专利号5,679,519)。还引用了Knight等人1994年发表的ECL分析应用回顾(Analyst,1994,119:879-890)以及该文章所引用的文献。在一个实施例中,使用电化学发光标记实施根据本说明所述的方法。
最近,对铱基ECL标记已有描述(WO2012107419(A1))。
在一个实施例中,可直接检测的标记是化学发光或电化学发光标记。标记所发出的光经测量后,可直接或间接指示分析物的存在或数量。
(c)放射性标记使用放射性同位素(放射性核素),诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。
金属螯合物的配合物适合用作成像和治疗目的的标记,这是本领域所公知的(US2010/0111856;US 5,342,606;US 5,428,155;US 5,316,757;US 5,480,990;US 5,462,725;US 5,428,139;US 5,385,893;US 5,739,294;US 5,750,660;US 5,834,456;Hnatowich等人,J.Immunol.Methods 65(1983)147-157;Meares等人,Anal.Biochem.142(1984)68-78;Mirzadeh等人,Bioconjugate Chem.1(1990)59-65;Meares等人,J.Cancer(1990),增刊10∶21-26;Izard等人,Bioconjugate Chem.3(1992)346-350;Nikula等人,Nucl.Med.Biol.22(1995)387-90;Camera等人,Nucl.Med.Biol.20(1993)955-62;Kukis等人,J.Nucl.Med.39(1998)2105-2110;Verel等人,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670;Camera等人,J.Nucl.Med.21(1994)640-646;Ruegg等人,Cancer Res.50(1990)4221-4226;Verel等人,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670;Lee等人,Cancer Res.61(2001)4474-4482;Mitchell等人,J.Nucl.Med.44(2003)1105-1112;Kobayashi等人,Bioconjugate Chem.10(1999)103-111;Miederer等人,J.Nucl.Med.45(2004)129-137;DeNardo等人,ClinicalCancer Research 4(1998)2483-90;Blend等人,Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals 18(2003)355-363;Nikula等人,J.Nucl.Med.40(1999)166-76;Kobayashi等人,J.Nucl.Med.39(1998)829-36;Mardirossian等人,Nucl.Med.Biol.20(1993)65-74;Roselli等人,Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14(1999)209-20)。
实例部分使用的免疫测定法采用了一些新研发的抗体,此类抗体尚未公开使用,因此将在下文中进行更详细的描述。所用的抗体均与如SEQ IDNO:1所示的人胸苷激酶1(hTK-1)特异性地结合。
术语“特异性地结合”(本文中也称为“特异性地相互作用”),如本发明所述,指抗体仅特异性地结合hTK-1,但没有或基本上没有与不同的蛋白发生交叉反应,尤其是与诸如,例如胸苷激酶2(SEQ ID NO:5)具有类似结构的不同蛋白。
用于分析抗体特异性的相应方法在例如以下文献中有描述:Harlow&Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress以及Harlow&Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor LaboratoryPress。适用研究的非限制性实例是,例如采用结构上和/或功能上密切相关的分子进行的结合研究、阻断和竞争研究。这些研究可采用诸如以下方法开展,例如荧光激活细胞分选术(FACS)分析、流式细胞术滴定分析(FACS滴定)、表面等离子体共振技术(SPR,例如使用)、等温滴定量热法(ITC)、荧光滴定法或放射性标记配体结合测定法。进一步的方法包括,例如免疫印迹法(Western Blots)、ELISA(包括竞争ELISA)、RIA、ECL和IRMA测试。
在本发明范围内,术语“抗体”涉及完整的免疫球蛋白分子并涉及结合其片段的抗原,如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv。此外,该术语还涉及修饰的和/或改变的抗体分子,并涉及以重组或合成的方式生成/合成的抗体。术语“抗体”还包括双官能抗体、三官能抗体、完全人抗体(fully-humanantibodies)、嵌合抗体和抗体构建体,如单链Fv(scFv)或抗体融合蛋白。
如本文中所用的“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1(恒定区)和可变区组成。Fab分子的重链无法与另一个重链分子形成二硫键。“Fab′片段”包含一条完整的轻链及一条重链的一部分,该重链包含VH结构域和CH1结构域以及CH1与CH2结构域之间的区域,使得两个Fab′片段的两条重链之间可形成一个链间二硫键,从而形成F(ab′)2分子。“F(ab′)2片段”包含两条轻链和两条重链,该重链包含CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分,使得两条重链之间形成一个链间二硫键。因此,F(ab′)2片段由两个Fab’片段组成,这两个Fab′片段通过两条重链之间的二硫键结合在一起。
Fab/c片段同时包含Fc和Fab决定簇,其中“Fc”区包含两个重链片段,其包括抗体的CH2和CH3结构域。所述两个重链片段通过两个或多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用结合在一起。
“Fv区”包括重链和轻链的可变区,但缺少恒定区。在本发明范围内,“单链Fv”(也缩写为“scFv”)是具有抗体的VH和VL结构域的抗体片段,其中所述结构域存在于单个多肽链。通常,scFv多肽进一步在VH和VL结构域之间包括多肽接头,使得scFv能形成所需的抗原结合结构。所描述的用于产生单链抗体的技术,例如Pl ü ckthun在The PharmacologyofMonoclonal Antibodies(Rosenburg and Moore eds,Springer-Verlag,N.Y.113(1994),269-315)中的描述。
术语“嵌合抗体”指包括融合或嵌合化到另一个(人类或非人类,例如,小鼠、马、兔、狗、牛、鸡)物种的抗体区(例如,恒定区)的人类或非人类物种的可变区的抗体。
如上文所述,术语“抗体”还包含抗体构建体,诸如抗体融合蛋白,其中该抗体包括额外的结构域(除了本文中按特定氨基酸序列定义的结构域以外),例如用于分离和/或制备重组地产生的构建体。
可以产生抗体,使得该抗体为重组抗体,例如重组兔抗体,或异源杂合抗体,还包括如本发明所公开和定义的互补决定区(CDR)。
术语“重组抗体”包括以重组方式制备、表达、创造或分离的所有抗体。重组抗体是例如通过B细胞PCR获得的抗体;或从动物(例如,小鼠)身上分离的抗体,该动物是转人类免疫球蛋白基因的动物;使用通过转染进入宿主细胞的重组表达载体进行表达的抗体;从重组形成的人组合抗体库中分离出的抗体;或以参与人类免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列拼接的其他方式制备、表达、创造或分离的抗体。通过B细胞PCR获得的重组兔抗体具有源于兔种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如有)。即B细胞PCR的直接结果是抗体的结合相关片段,对技术人员而言完全没有问题,例如分析全长抗体、嵌合抗体或任何想要/需要的“抗体”。
已发现单克隆抗体MAB 6C6是用于通过免疫测定法测定TK-1蛋白水平的一种很有吸引力的工具。MAB 6C6的特征在于SEQ ID NO:3所示序列的重链可变结构域和SEQ ID NO:4所示序列的轻链可变结构域。如上文所述,在一个实施例中,用于测定TK-1水平的免疫测定法中采用的抗体或其抗原结合片段,例如,如实例部分所示,结合与包含SEQ ID NO:3所示序列的重链可变区(vHC)和SEQ ID NO:4所示序列的轻链可变区(vLC)的抗体相同的表位。
在用于测量TK-1的免疫测定法中,可采用任何结合与包含SEQ ID NO:3所示序列的重链可变区(vHC)和SEQ ID NO:4所示序列的轻链可变区(vLC)的抗体相同的表位的任何单克隆抗体或其抗原结合片段。所述抗体及具有相同结合特性的任何抗体例如可能是给定的特异性抗体的变体,以及例如可能包括氨基酸取代,或者也可能具有不同的vHC、或不同的vLC、或不同的vHC和vLC。
术语“取代”,如本发明所述,指某一个氨基酸被另一个氨基酸取代。因此,氨基酸的总数保持不变。术语“取代”显然不包含删除某个位置的氨基酸并在另一个位置引入一个(或多个)氨基酸的情况。取代,如本发明所述,可以是保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸取代。术语“保守性氨基酸取代”是本领域所公知的,指一个氨基酸被另一个具有相似结构和/或化学特性的氨基酸取代。所述相似性包括,例如在有关残基的极性、带电性、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性方面的相似性。所述氨基酸取代是保守性氨基酸取代,若以下一个基团的一个氨基酸被同一基团的另一个氨基酸取代:非极性(疏水)氨基酸,包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸;极性中性氨基酸,包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺;带正电(碱性)氨基酸,包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸;以及带负电(酸性)氨基酸,包括天冬氨酸和谷氨酸。
根据以下方程式,抗体的“结合亲和力”可测量靶抗原上的表位与抗体的结合位点之间的相互作用强度:
KD=kd/ka
其中:
KD=平衡解离常数[M]
kd=解离速率常数[s-1]
ka=结合速率常数[M-1s-1]
抗体的结合亲和力的进一步相关参数如下:
t/2=复合物解离半衰期=ln2/kd/60[min]
Rmax=分析物最大响应值[RU]
MR:摩尔比=分析物最大响应值(Rmax)比率
在一个实施例中,在用于PI测定的TK-1水平免疫检测时使用的hTK-1的单克隆抗体与hTK-1结合,在37℃的解离半衰期(t/2-diss)是10分钟或更长时间。
与hTK-1上的相同表位结合的抗体是与具有SEQ ID NO:3所示序列的重链可变结构域和SEQ ID NO:4所示序列的轻链可变结构域的抗体竞争结合hTK-1的抗体。
在标准hTK-1结合分析中,可基于其与兔单克隆抗体MAB 6C6(即包含SEQ ID NO:3所示序列的重链可变结构域和SEQ ID NO:4所示序列的轻链可变结构域的抗体)竞争的能力来识别所述竞争抗体。例如,BIAcore分析、ELISA测定法或流式细胞术可用于证实与具有SEQ ID NO:3所示序列的重链可变结构域和SEQ ID NO:4所示序列的轻链可变结构域的单克隆抗体或其结合片段的竞争力。
测试抗体能够抑制兔单克隆抗体MAB 6C6与人TK-1的结合,这表明该测试抗体可与兔单克隆抗体MAB 6C6竞争,以与hTK-1上的相同表位结合,从而如同兔单克隆抗体MAB6C6一样与hTK-1上的相同表位结合。
如上文所述,几种不同的竞争测定法可用于识别一种抗体,该抗体与兔单克隆抗体MAB 6C6竞争其具有SEQ ID NO:3所示序列的重链可变结构域和SEQ ID NO:4所示序列的轻链可变结构域的结合片段。
在示例性的竞争测定法中,固定化hTK-1置于溶液中温育,溶液包括与hTK-1结合的第一标记抗体(例如,抗-hTK-1单克隆抗体或其具有SEQ ID NO:3所示序列的重链可变结构域和SEQ ID NO:4所示序列的轻链可变结构域的结合片段)以及第二未标记抗体,正在测试其与第一抗体竞争以结合到hTK-1的能力。该第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照,将固定化的hTK-1置于包含该第一标记抗体而非包含该第二未标记抗体的溶液中温育。在容许该第一抗体与hTK-1结合的条件下温育之后,去除过量未结合的抗体,并且测量与固定化hTK-1缔合的标记的量。如果相对于对照样品,测试样品中与固定化的hTK-1缔合的标记的量大幅减少,则表明该第二抗体在与该第一抗体竞争以结合到hTK-1。请参见,例如,Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual.Ch.14(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY,1988)。
抗体的结合特性,例如,抗-hTK-1抗体的结合特性最好通过基于生物传感器的实时分子相互作用测量来测定,如表面等离子体共振光谱术法,其同义词是Biacore技术。在Biacore系统中,还可以分析抗体与同一表位的竞争性结合(即与相同表位或覆盖型表位结合)。实验详情请参见实例3。在一个实施例中,在如实例部分所述的BIAcore仪器上完成竞争实验,用于表征与本文所确定的构象依赖性表位结合的抗体。
在现有技术中,通常对血清或血浆样品进行预处理,以生成hTK-1的高酶促活性四聚体形式。样品预处理及通过该预处理样品测量hTK-1是一种很有吸引力的方法,因为这种方法,例如,可实现与hTK-1酶促活性具备极好的相关性。
选择适当的预处理试剂完全在本领域技术人员的能力范围内。所述预处理试剂将至少包括还原剂,以将hTK-1低聚体转换为hTK-1四聚体。正如,例如Sharif等人(BMCBiochemistry(2012),13∶12)所述,很容易通过凝胶过滤实验评估该还原剂是否有效以及处理后的hTK-1主要以四聚体形式存在。技术人员使用以下几种不同的还原剂有风险,例如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)或二硫丁胺(DTBA)。另外,还要选择预处理试剂浓度,以使得无论是在温育适当时间后,还是在稀释步骤后,其都不会对用于测量hTK-1蛋白的抗体产生负面影响。若使用二硫丁胺(DTBA)作为还原剂,则样品预处理步骤(混合样品和预处理试剂)中的适当最终浓度范围是5mM以内。预稀释后,和/或加阻断DTT的试剂后,和/或通过用包含第一抗体的缓冲液进行稀释后,氧化形式的DTT浓度优选为等于或小于1.5mM。用这种方法,还原剂对所用的免疫试剂没有任何影响。
如上文所述,ATP使hTK-1的四聚体形式保持稳定。ATP的后一功能使其成为对例如预处理缓冲液有吸引力的添加剂。在一个实施例中,预处理缓冲液包括上述还原剂以及ATP。样品预处理步骤中的ATP浓度不应低于1.25mM。预处理步骤中的ATP浓度的适宜选择是在2mM至20mM的范围内。
从给出的实例显而易见,TK-1水平值在DLBCL患者预后指数测定中很实用。在一个实施例中,本公开涉及TK-1水平的值在测定DLBCL患者预后指数中的用途。
在一个实施例中,本公开涉及DLBCL的预后指数(PI),其包括胸苷激酶1水平的值,该值与上文所详述的三个PI中任一个的标准参数(组成部分)组合。
在一个实施例中,本发明涉及TK-1水平的值在测定所述预后指数中的用途,该值与DLBCL患者的预后指数的其他标准参数组合。在一个实施例中,本公开涉及TK-1在测定DLBCL患者的预后指数中的用途,其中TK-1水平的值与如IPI、年龄调整的IPI、R-IPI或NCCN-IPI中所用的其他参数组合。在一个实施例中,本公开涉及TK-1在测定DLBCL患者的预后指数中的用途,其中TK-1水平的值与如R-IPI或NCCN-IPI中所用的其他参数组合。
在一个实施例中,TK-1水平的值在下列条件下使用:TK-1水平的值用于取代此类PI中的LDH水平的值。
对于任何患者而言,特别是对于最近诊断患有DLBCL的患者而言,可测定TK-1水平并将其与预定义的截止点进行比较。若新诊断的患者的测量值高于该预定义的截止点,可视为该患者的风险评分较高,更可能有不利的疾病预后。
在一个实施例中,本公开涉及DLBCL的预后指数(PI),其包括胸苷激酶1水平的值。
在一个实施例中,本公开涉及DLBCL的预后指数(PI),其包括胸苷激酶1水平的值,其中所述PI选自IPI、年龄调整的IPI、R-IPI或NCCN-IPI。在一个实施例中,本发明涉及DLBCL的预后指数(PI),其包括胸苷激酶1水平的值,其中所述PI选自R-IPI或NCCN-IPI。
上述及其他实施例公开并包含于本发明的说明和实例中。关于根据本发明所采用的任一种方法、用途和化合物的更多相关文献,可通过使用例如电子设备等在公共图书馆和数据库中检索。例如,可利用互联网上的公共数据库“Medline”,例如在万维网(WorldWide Web)访问ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。万维网还有更多的数据库和地址可用,诸如ncbi.nlm.nih.gov/,fini.ch/biology/research_tools.html,tigr.org/,或infobiogen.fr/,都是本领域技术人员已知的,也可以用万维网中lycos.com下的地址访问。
除非另外定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。如有歧义,以本专利说明书(包括定义)为准。
本文中提供的所有氨基酸序列均从N末端残基开始并以C末端残基结束(N→C),如同本领域的惯用做法,本发明中用于识别氨基酸的一个字母或三个字母的代码缩写对应常用氨基酸。
考虑了以下实施例以及本说明书中描述的其他实施例。该实施例列表并非用于限制本发明,说明书中任何部分所适当支持的实施例均用于支持本申请中或后续诉讼或继续申请/分案申请过程中的权利要求。
1.第一实施例:一种测定弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者预后指数(PI)(也称风险评分或PI评分)的方法,该方法包括
a)至少测定以下参数:
i)结外疾病状况;ii)Ann Arbor分期;iii)胸苷激酶1的水平,
其中,不存在结外疾病的情况,评为0分,且存在结外疾病的情况,评为1分;
其中Ann Arbor I期或II期,评为0分,且Ann Arbor III期或IV期,评为1分;以及
其中胸苷激酶水平至多达到并包括截止点的情况,评为0分,且其中胸苷激酶水平高于截止点的情况,至少评为1分;以及
b)测定PI时,求取i)、ii)和iii)各项分值的总和。
2.根据实施例1所述的方法,其中胸苷激酶截止水平设为在健康个体中测得的TK-1水平的均值的4倍,其中胸苷激酶水平至多达到并包括截止点的情况,评为0分,以及其中TK-1水平高于截止点的情况,评为1分。
3.根据实施例1所述的方法,其中胸苷激酶截止水平设为在健康个体中测得的TK-1水平的均值的4倍,其中低胸苷激酶水平,即TK-1水平至多达到并包括截止点,评为0分;中等胸苷激酶水平,即TK-1水平高于截止点且至多达到并包括对应于在健康个体中测得的均值的20倍的值,评为1分;高胸苷激酶水平,即TK-1水平高于在健康个体中测得的均值的20倍,评为2分。
4.根据实施例1所述的方法,其中TK-1蛋白水平截止点等于并包括18U/l的TK-1酶促活性。
5.根据实施例1所述的方法,其中蛋白水平的截止点等于并包括18U/l,并且其中TK-1水平高于18U/l且至多达到并包括88U/l的情况,评为1分,以及TK-1水平高于88U/l的情况,评为2分。
6.根据实施例1至5所述的方法,其进一步包括参数年龄,其中在测定PI时,若年龄低于截止点,则评为0分,且若年龄高于截止点,则评为1分。
7.根据实施例6所述的方法,在测定PI时,其中若年龄小于并包括60岁,则评为0分,其中若年龄大于60岁,则评为1分。
8.根据实施例1至5所述的方法,其进一步包括参数ECOG体能状态,在测定PI时,其中若ECOG体能状态等于或小于1,则评为0分;其中若ECOG体能状态等于或大于2,则评为1分。
9.根据实施例1至5所述的方法,其进一步包括参数年龄和参数ECOG体能状态,在测定PI时,其中若年龄小于并包括60岁,则评为0分,其中若年龄大于60岁,则评为1分;在测定PI时,其中若ECOG体能状态等于或小于1,则评为0分,且其中若ECOG体能状态等于或大于2,则评为1分。
10.根据实施例1至5所述的方法,其进一步包括参数年龄和参数ECOG体能状态,在测定PI时,其中若年龄小于并包括40岁,则评为0分,其中若年龄大于40岁且至多达到并包括60岁,则评为1分,其中若年龄大于60岁且至多达到并包括75岁,则评为2分,并且其中若年龄大于75岁,则评为3分;并且在测定PI时,其中若ECOG体能状态等于或小于1,则评为0分,且其中若ECOG体能状态等于或大于2,则评为1分。
11.一个实施例是TK-1水平的值在测定DLBCL患者预后指数中的用途。
12.根据实施例11所述的用途,其中TK-1水平的值与国际预后指数(IPI)、年龄调整的IPI(age adjusted IPI)、R-IPI或NCCN-IPI中所用的其他参数组合。
13.根据实施例11或12所述的用途,条件是TK-1水平的值用于取代这类PI中的LDH水平的值。
14.一个实施例是DLBCL的预后指数(PI),其包括胸苷激酶1水平的值。
15.根据实施例14所述的预后指数(PI),其中所述PI选自IPI、年龄调整的IPI、R-IPI或NCCN-IPI。
关于本说明书表征的实施例,特别是在权利要求书中,其用途是每项从属权利要求所提及的各个实施例均与所述从属权利要求所属的每项权利要求(独立权利要求或从属权利要求)的各个实施例进行组合。例如,若为列举了3个可选方案A、B和C的独立权利要求1、列举了3个可选方案D、E和F的从属权利要求2,以及列举了3个可选方案G、H和I并从属于权利要求1和2的从属权利要求3,除非另有特别说明,否则应理解说明书明确公开了对应于以下组合的实施例:A、D、G;A、D、H;A、D、I;A、E、G;A、E、H;A、E、I;A、F、G;A、F、H;A、F、I;B、D、G;B、D、H;B、D、I;B、E、G;B、E、H;B、E、I;B、F、G;B、F、H;B、F、I;C、D、G;C、D、H;C、D、I;C、E、G;C、E、H;C、E、I;C、F、G;C、F、H;C、F、I。
同样,在独立权利要求和/或从属权利要求未列举可选方案的情况下,应理解若从属权利要求向前引用了前述多项权利要求,则其包含的任意主题组合也视为被明确公开。例如,若为独立权利要求1、向前引用权利要求1的从属权利要求2以及向前引用权利要求2和1的从属权利要求3,则结果就是权利要求3和1的主题组合被明确、毫不含糊地公开,权利要求3、2和1的主题组合也是如此。如果进一步存在引用权利要求1至3中任一权利要求的从属权利要求4,则结果就是权利要求4和1的主题组合,权利要求4、21的主题组合,权利要求4、3、1的主题组合以及权利要求4、3、2、1的主题组合被明确、毫不含糊地公开。
上述考虑,在细节上作适当修改后,可适用于所有附加权利要求。举一个非限制性实例,鉴于权利要求结构,可以明确、毫不含糊地设想权利要求8、5、1的组合。同样适用于例如权利要求8、7、2等的组合。
以下实例将说明本发明:
实例1:材料和一般方法
蛋白质化学和标记技术
标准蛋白质化学和标记技术在例如Hermanson,G.″BioconjugateTechniques″3rdEdition(2013)Academic Press中提供。
生物信息学
生物信息学方法在例如Keith J.M.(ed.)″Bioinformatics″I卷和II卷、Methodsin Molecular Biology 1525卷和1526卷(2017)Springer以及Martin,A.C.R.&Allen,J.″Bioinformatics Toolsfor Analysis of Antibodies″(载于下书中:Dubel S.&ReichertJ.M.(eds.)″Handbook of Therapeutic Antibodies″Wiley-VCH(2014))等文献中提供。
电化学发光免疫测定法
免疫测定法及相关方法在例如Wild D.(ed.)″The ImmunoassayHandbook″4thEdition(2013)Elsevier中提供。作为电化学发光标记的钌络合物在例如Staffilani M.等人Inorg.Chem.42(2003)7789-7798中提供。通常,为了进行基于电化学发光(ECL)的免疫测定法,会使用Elecsys 2010分析仪或后继系统,例如罗氏分析仪(Roche DiagnosticsGmbH,位于德国曼海姆),诸如E170、cobas e 601模块、cobas e 602模块、cobas e 801模块和cobas e 411,以及专为这些分析仪设计的罗氏Elecsys测定法,各测定法应在标准条件下使用,除非另有说明。
实例2:抗-hTK-1抗体
hTK-1、克隆号6C6、重链:(SEQ ID NO:3)
hTK-1、克隆号6C6、轻链:(SEQ ID NO:4)
hTK-1、克隆号4H4、重链:(SEQ ID NO:7)
hTK-1、克隆号4H4、轻链:(SEQ ID NO:8)
hTK-1、克隆号23C11、重链:(SEQ ID NO:9)
hTK-1、克隆号23C11、轻链:(SEQ ID NO:10)
显而易见,本领域的技术人员很容易基于上文所公开的序列分析全长免疫球蛋白或其结合片段(如需)。
实例3:表位表征
如实例2所述,可生成四个不同的单克隆抗体,显示出它们成为免疫测定法发展中的实用抗体所需的结合特性。
第一次尝试表征由新生成抗体结合的表位时,采用了PepScan分析。进行该分析时,合成了多个合成肽,其每个肽由15个氨基酸组成,每个肽由1个氨基酸转变而来(1-15∶2-16等),横跨整个hTK-1序列(SEQ ID NO:1)。显微镜载玻片上发现了PepScan分析时合成的肽。阻断非特异性结合后,在显微镜载玻片上培养各种单抗(MAB)的细胞培养上清液。洗掉未结合的MAB,用辣根过氧化物酶(HR)标记的山羊抗兔IgG按常规方法检测结合的MAB。
通过实例2所述方法获得的四个MAB(抗体4H11)中,仅一个MAB真的与线性表位发生了反应。正如所示,该抗体结合的表位包含在跨越hTK-1的氨基酸残基211至230的序列中(SEQ ID NO:6)。
与对应于由hTK-1的氨基酸194至225(SEQ ID NO:2)组成的多肽的合成肽发生反应的多克隆抗体和单克隆抗体是现有技术中公知的,参见例如WO 2015/094106。这三个MAB,分别是4H4、6C6和2301,既未与由hTK-1的氨基酸194至225(SEQ ID NO:2)组成的多肽结合,又未显示出与PepScan分析中待测肽的显著结合。这表明所述三个MAB全部与hTK-1上的构象依赖性表位结合。这三个MAB从一开始就表现出非常好的进一步分析发展前景,因此额外研究了关于由这三个单抗所结合的表位的知识。
在25℃,在GE Healthcare Biacore 4000仪器上通过竞争实验进行了表位表征。Biacore Biotin Capture Kit Series S传感器(Cat.-No.28-9202-34)安装于仪器中,并按制造商说明书进行了流体力学处理和预处理。系统缓冲液是HBS-N(10mM HEPES,pH值7.4,150mM NaCl)。样品缓冲液是系统缓冲液。生物素捕获试剂,如制造商GE Healthcare所提供,在系统缓冲液中按1∶50稀释,以10μl/min的速度在流通池1、2、3和4上方注入60秒,以处理检测点1、2和4、5。检测点3作为参照。以30μl/min速度注入10nM生物素化的初级抗体,接触时间120秒,以处理全部四个流通池里的检测点1和5。检测点2和4作为对照。以30μl/min速度将10nM人重组胸苷激酶-1(hTK-1,罗氏,114kDa,四聚体)注入所有流通池,接触时间180秒,以处理检测点1、2和4、5。以30μl/min速度再次注入100nM非生物素化的初级抗体,以处理所有流通池上的检测点1、2和4、5,接触时间180秒,以阻断初级抗体剩余可及表位。以30ul/min速度将100nM二级抗体注入所有流通池,接触时间180秒,以处理检测点1、2和4、5。最终,使用制造商GE Healthcare提供的再生液,通过在所有流通池和所有检测点上方接触时间120秒的再生步骤,彻底去除传感器表面上形成的复合物。
通过这种方法研究了四个重组兔IgG单克隆抗体的hTK-1表位可及性特性:hTK-1的抗体4H11(与包含于氨基酸211至230(SEQ ID NO:6)的表位结合的抗体)和兔MAB 23C11、6C6和4H4。
每次样品注射之前及之后,设定了报告点。使用Biacore Evaluation V.1.1软件读出响应单元[RU]的报告点。
将非生物素化的初级抗体的第二结合响应信号(block Ab1[RU])加到生物素化的初级抗体初始捕获信号(bi-Ab1,[RU])。计算出摩尔比表位可及性MREA=Ab2[RU]/(bi-Ab1[RU]+block Ab1[RU])并将其用于估计在分析中所用各个抗体的表位可及性。
为了验证hTK分析物的四聚体状态,用公式MR=hTK[RU]/bi-Ab1[RU]*分子量bi-Ab1(150kDa)/分子量hTK(114kDa)计算了hTK结合信号与生物素化的初级抗体捕获水平的第二摩尔比。
例如,抗体4H11显示的结合化学计量(=摩尔比)抗体4H11/hTK-1MR为1∶1。在该生物传感器测定法中,单一四聚体hTK-1分子与单一抗体4H11分子结合。在所述的抗体中,仅抗体4H11显示出被用作阻断抗体时,形成了同源hTK-1复合物。因此,可采用两次使用抗体4H11的序列测定法方案进行夹心法测定法。对于兔单克隆抗体MAB 23C11、6C6和4H4,无法检出同源复合物形成。这表示MAB 23C11、6C6和4H4与相同表位区结合。抗体23C11、6C6和4H4形成夹心,抗体4H11作为二级抗体。根据该测定法,表现最佳的夹心配对是6C6作为生物素化的初级抗体,与抗体4H11形成复合物,其摩尔比MREA=0.4,表示hTK分析物上的表位可及性是40%。
从下表可明显看出,抗体4H11(与包含于SEQ ID NO:6的C端线性表位结合)能与23C11、6C6和4H4形成免疫复合物。另一方面,显然兔单克隆抗体MAB 23C11、6C6和4H4共享相同表位(请参见下表3)。
表3:表位可及性矩阵
图上示出了在溶液中将重组h-TK-1用作分析物的四个抗-hTK-1抗体的夹心形成。表里的数值0.0表示所用的第一抗体和第二抗体与相同的表位结合。等于或大于0.1的数值表示夹心形成,即使有中间阻断步骤,即研究的两个抗体与不同的表位结合。
实例4:产生用于Elecsys免疫测定法实验的MAB缀合物
采用的是技术人员熟悉的程序。因此,认为不必再赘述实验细节。
简言之,进行了以下程序/步骤以获得用于免疫测定法捕获和检测方面的抗体缀合物。
将通过B细胞PCR生成的细胞(请参见上文)取得的细胞培养上清液(其中包含的重组抗体)用作起始物。
采用亲和层析法将组织培养上清液所含的重组抗体纯化为蛋白A。
使用胃蛋白酶将用作捕获抗体的抗体切断,获得F(ab′)2片段,采用亲和层析法和排阻色谱法(size-exclusion chromatography)进一步纯化F(ab′)2片段。然后,采用硫醇点击化学法将F(ab′)2片段还原为Fab′并位点特异性生物素化,从而获得单生物素化的Fab′片段。
使用sulfo-BPRu NHS酯(=CAS登记号482618-42-8,即本领域公知的钌酸盐(2-),双[[2,2′-联吡啶]-4,4′-二甲磺酸酯(2-)-κN1,κN1][1-[4-(4′-甲基[2,2′-联吡啶]-4-基-κN1,κN1)-1-丁酰氧基]-2,5-吡咯烷二酮]-,钠(1∶2),(OC-6-31))将用作检测抗体的抗体以化学方式缀合至sulfo-钌(WO2003/002974),采用排阻色谱法去除未结合的标记。
实例5:样品及hTK-1测量
5.1样品
研究了“黑白”组。一方面,来自50个(一些实验仅有49个仍可用)健康供体的血清样品已经用于各种测定法中对hTK-1的定量。另一方面,测定了来自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的48份样品(一些实验仅有47份仍可用)中的hTK-1。
5.2原型电化学发光免疫测定法
基于分别如实例3所述获得并如实例4所述纯化和缀合的兔单克隆抗体,确立了几种原型免疫测定法。
通常,原型电化学发光免疫测定法的建立利用了生物素化的捕获抗体(或与其片段结合的抗原)和钌络合物标记的检测抗体(或与其片段结合的抗原)。
大部分情况下,用常用的生物素化Fab′片段按照常规程序生成免疫测定法数据。在来自罗氏的E170分析仪上,以夹心测定法进行测量。用E170分析仪基于电化学发光进行信号检测。在该夹心测定法中,生物素缀合物(即捕获抗体)固定在链霉亲和素包被的磁珠表面。检测抗体具有作为信号结构部分的钌络合物阳离子。在分析物存在的情况下,显色钌络合物桥接至固相,在包含于El70分析仪测量元件的铂电极处被激发后发射波长620nm的光。信号以任意发光度单位输出。
例如,用掺有来自HEK细胞的重组hTK-1的校正标样以及上文所述人血清样品进行测量。
按如下步骤进行hTK-1实验测定法。将25μl的人血清样品或已掺加的校正标样与25μl的预处理试剂(含10mM DTBA)混合,温育9分钟;其后,再混合温育60μl的捕获抗体生物素缀合物和60μl的检测抗体钌标记缀合物9分钟,然后加入30μl链霉亲和素包被的顺磁性微粒。将最终混合物进一步温育9分钟。随后,照常检出了hTK-1(即通过上述实验中生成的电化学发光信号)。
下文提供了生物素化的6C6(用作Fab′-Bi)和钌化4H11(用作IgG)组合获得的结果。
校正结果如下表4所示。
表4:用免疫测定法原型测量hTK-1
表4示出了将不同量的重组hTK-1用作分析物在原型免疫测定法中获得的信号。进行了双重测量。
进行了箱线图计算,分析了受试者工作特性(ROC)曲线,并测定了曲线下面积(AUC)。对于原型免疫测定法,AUC是0.965。图1同时示出了具有hTK-1浓度测定值以及AUC的箱线图(箱形图)。
5.3DiaSorin TK-1活性测定
Thymidine Kinase检测试剂盒是DiaSorin产品,其采用改良的两步式竞争性化学发光免疫测定法(CLIA),用于人血清和乙二胺四乙酸(EDTA)血浆中TK的定量测定。用50份对照样品和48份来自DLBCL患者的样品,按照制造商说明书进行了Thymidine Kinase测定法。该分析利用了初始酶反应,反应时样品中的TK将AZT(3’-azido-3’-脱氧胸苷)转换为AZTMP(3’-azido-3’-脱氧胸苷单磷酸盐),随后进行了用于AZTMP定量测定的竞争性免疫测定法。转换为AZTMP的AZT量是判断样品中存在的TK量的依据。该测定法中,用100μL测定法缓冲液1、20μL测定法缓冲液2以及抗-AZTMP多克隆抗体包被的20μL顺磁性粒子温育50μL样品。兔抗山羊IgG,然后抗-AZTMP山羊多克隆抗体涂覆到固相。温育40分钟后,加入100μL的示踪剂(缀合至异鲁米诺衍生物的AZTMP类似物)。第一次温育过程中,AZTMP与固相结合。第二次温育时,示踪剂缀合物竞争结合溶液中的AZTMP。温育20分钟后,用一个洗涤周期去除未结合物质。然后加入起动试剂,闪光型化学发光反应开始。用光电倍增管按相对发光度单位(RLU)测量光信号,其与校正标样、对照样品或样品中的TK浓度成正比。
实例6:比较用活性测定法/免疫测定法测定的TK-1值
将一方面用Thymidine Kinase测定法测定的值与另一方面用原型免疫测定法测定的值进行了相互比较。考虑到一种测定法测量的是胸苷激酶活性,而另一种测量的是免疫反应性hTK-1的量,发现这两种不同的测定法惊人地高度相关(在0.95甚至更高的范围内,取决于采用的统计方法)。从图3也可非常明显看出所述不同的hTK-1测定法具有较好的相关性。
实例7:将TK-1值用作预后指数的关键要素
7.1分析方法
用药理学MAIN研究的样品对胸苷激酶1(TK-1)的预后能力进行了回顾性评估,研究对象是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者[Seymour等人,2014],用实例5.2中的原型B)测定法测量了仍可用的407份基线样品中的每一份的血清中TK-1浓度。该子集内的无进展生存期(PFS)事件发生率与总研究人群的PFS非常相似(均约为31%)。
为了公平地比较所有的多变量模型,创建了数据子集,仅纳入了可用所有相关数据点(TK-1测量和所有指数组成部分)的样品。这样,最终分析数据集包含370份样品,其中116份来自从开始接受R-CHOP治疗后三年内显示出PFS事件的患者。由于无事件随访时间超过三年的样品数量少,审查了带3年标记的样品。
为了评估TK-1预后值是否与已知临床和人口统计学风险因素无关,计算了用于上述三个预后指数中每一个的Cox比例风险模型,包括各个指数的风险组成部分加上经log2转换的TK-1。
7.2TK-1对R-IPI和NCCN-IPI的贡献
为了评估TK-1改善现有PFS预后风险评分的能力,可用经log2转换的TK-1值扩展指数组成部分,或用log2 TK-1值替代甲酸脱氢酶(FDH)组成部分。扩展和取代均通过创建Cox比例风险模型完成,其包括自变量等各个风险组成部分,并将原模型(R-IPI和NCCN-IPI)的c指数与TK-1扩展后模型的c指数进行比较(分别在有和没有LDH组成部分的情况下)。采用自助重采样方法评估各个组成部分的p值差异的显著性。
a)TK-1作为R-IPI中的协变量
下表5显示了TK-1对R-IPI的贡献的统计分析结果。
表5:包括根据表1的阈值二值化的R-IPI风险组成部分加上(经log2转换的)TK-1的多变量Cox比例风险模型同时提供了风险比及其各自的95%置信区间和p值
协变量 | 风险比(HR) | 95%CI HR | p值 |
IPI.年龄(bin) | 1.083 | 0.750-1.564 | 0.671 |
IPI.AnnArbor分期(bin) | 1.577 | 0.971-2.561 | 0.066 |
IPI.ECOG(bin) | 1.829 | 1.226-2.731 | 0.003 |
IPI.LDH(bin) | 0.912 | 0.582-1.429 | 0.688 |
IPI.结外位点(bin) | 1.183 | 0.785-1.784 | 0.422 |
TK-1(log2) | 1.307 | 1.127-1.516 | <0.001 |
合并了二进制R-IPI风险组成部分和(经log2转换的)TK-1的Cox比例风险模型明确显示出,TK-1给该模型增加了大量预后信息。风险比(HR)约为1.3,所有模型组成部分的最小p值<0.001(请参见表5)。风险比可解释为TK-1增加2倍与PFS事件风险增加1.3倍(即疾病进展或死亡)有关。
对于二分法的TK-1场景,TK-1浓度首先被分层为三个组(即低水平组、中等水平组和高水平组)。通过使logrank统计值最大化(即使Kaplan-Meier分析中的三条存活曲线之间的差异最大化)进行单变量设置来定义最佳截止点,同时确保每组至少有10份样品。本文中测定的范围是:
·TK-1低=0%-24%(0-0.7ng/ml)
·TK-1中等=24.1%-86%(0.71-3.5ng/ml)
·TK-1高=86.1%-100%(大于3.5ng/ml)
基于罗氏Elecsys TK-1浓度测量和Diasorin TK-1活性测量之间的方法比较,还可以用基于1ng/ml TK-1(罗氏)与25U/L TK-1(Diasorin)之间关系的U/L进一步表示上述范围。根据Diasorin报告,健康个体的活性均值为4.3U/L,该值作为截止点的相对参考:
·TK-1低=均值的0-4倍(0-18U/L)
·TK-1中等=均值的4-20倍(17.6-88U/L)
·TK-1高=大于均值的20倍(大于88U/L)
在多变量Cox模型中,采用三分法测定的TK-1值对预后能力有显著贡献,就TK-1水平而言,中等水平组对低水平组的p值为0.013,高水平组对低水平组的p值小于0.001(请参见表6)。对应的风险比为2.11和5.40,表示中等TK-1水平的患者经历PFS事件的风险是低TK-1水平患者的2.1倍;高TK-1水平患者的该风险甚至是低TK-1水平患者的5.4倍。
表6:多变量Cox比例风险模型,包括根据表1中的阈值二值化的R-IPI风险组成部分加上(采用三分法测定的)TK-1。同时提供了风险比及其各自的95%置信区间和p值。
协变量 | 风险比(HR) | 95%CI HR | p值 |
IPI.年龄(bin) | 1.040 | 0.720-1.503 | 0.834 |
IPI.AnnArbor分期(bin) | 1.582 | 0.978-2.560 | 0.062 |
IPI.ECOG(bin) | 1.939 | 1.302-2.889 | 0.001 |
IPI.LDH(bin) | 0.813 | 0.522-1.268 | 0.362 |
IPI.ExtranodalSites(bin) | 1.163 | 0.771-1.753 | 0.471 |
TK-1.中等(bin) | 2.113 | 1.171-3.814 | 0.013 |
TK-1.高(bin) | 5.399 | 2.659-10.96 | <0.001 |
b)TK-1作为NCCN-IPI中的协变量
下表7显示了TK-1对NCCN-IPI的贡献的统计分析结果。
表7:多变量Cox比例风险模型,包括根据表2中的阈值二值化的NCCN-IPI风险组成部分加上(经log2转换的)TK-1。同时提供了风险比及其各自的95%置信区间和p值
协变量 | 风险比(HR) | 95%CI HR | p值 |
NCCN.年龄40-60(bin) | 1.978 | 0.962-4.064 | 0.064 |
NCCN.年龄60-75(bin) | 1.569 | 0.762-3.229 | 0.221 |
NCCN.年龄>75(bin) | 3.377 | 1.437-7.932 | 0.005 |
NCCN.LDH1-3(bin) | 0.967 | 0.612-1.527 | 0.886 |
NCCN.LDH>3(bin) | 1.557 | 0.708-3.424 | 0.271 |
NCCN.AnnArbor分期(bin) | 1.593 | 0.986-2.575 | 0.057 |
NCCN.结外疾病(bin) | 1.003 | 0.563-1.785 | 0.993 |
NCCN.ECOG(bin) | 1.795 | 1.201-2.682 | 0.004 |
TK-1(log2) | 1.248 | 1.056-1.476 | 0.009 |
合并了二进制NCCN-IPI风险组成部分和(经log2转换的)TK-1的多变量模型还显示出显著增加的TK-1预后值(p值=0.009,请参见表7)。风险比(HR)约为1.25,其仅略小于R-IPI模型中的值。
下表8显示了采用三分法测定的TK-1对NCCN-IPI的贡献的统计分析结果。
表8:包括根据表2的阈值二值化的NCCN-IPI风险组成部分加上(采用三分法的)TK-1的多变量Cox比例风险模型。同时提供了风险比及其各自的95%置信区间和p值。
合并了二进制NCCN-IPI风险组成部分和(采用三分法测定的)TK-1的模型显示出显著增加的TK-1预后值(中等水平组对低水平组:p值=0.011,高水平组对低水平组:p值<0.001;请参见表8)。对应的风险比分别是2.15和4.72,同样与R-IPI的该值非常相似。
7.3TK-1改善了R-IPI及NCCN-IPI的预后能力
广泛采用的风险模型预后能力测量依据是c指数,可将其视为生存期模型里的ROC曲线下面积(AUC)类似物。表9显示了为被研究预后指数(R-IPI和NCCN-IPI)算出的c指数以及TK-1扩展模型的c指数,在各自的二进制LDH组成部分存在和不存在的情况下。纳入TK-1后,上述指数改善了3.2%-4%,无论LDH是否存在(同样请参见表9)。大部分情况下,可将所述改善视为临床相关并具有显著的统计学意义,尽管该研究的目的并非显示c指数的显著改善(即基于自助抽样法(bootstrapping)的置信区间不包括0,除NCCN-IPI vs NCCN-IPI+TK-1(log2)w/o LDH和KPI+TK-1(log2)w/o LDH以外(请参见表10))。这明确显示了TK-1不仅改善了被研究的预后指数,甚至还有可能取代所述指数里的LDH。
表9:具有TK-1(+/-LDH)的多变量预后指数的c指数
多变量模型 | c指数 |
R-IPI | 0.626 |
R-IPI+TK-1(log2) | 0.661 |
R-IPI+TK-1(log2)w/o LDH | 0.660 |
R-IPI+TK-1(三分法) | 0.678 |
R-IPI+TK-1(三分法)w/o LDH | 0.674 |
NCCN-IPI | 0.639 |
NCCN-IPI+TK-1(log2) | 0.671 |
NCCN-IPI+TK-1(log2)w/o LDH | 0.670 |
NCCN-IPI+TK-1(三分法) | 0.686 |
NCCN-IPI+TK-1(三分法)w/o LDH | 0.686 |
表10:参考模型和包括TK-l(+/-LDH)的模型之间的c指数差异
表9和10中分别提供的数据,明确显示了在预测DLBCL患者的疾病预后时,TK-1可与现有预后指数结合使用,以显著改善临床评分。纳入TK-1后,的确改善了各个被研究的预后指数。
从表9和10还可明显看出,TK-1甚至有可能取代所述指数中的LDH,因为对于两个预后指数(R-IPI和KPI),若去除LDH,c值甚至略为改善,对于NCCN-IPI,若不纳入LDH,该值仅略差一点。
对于新诊断DLBCL患者,尤其在开始治疗前,应测量TK-1值并将其与预定义截止点进行比较。若新诊断患者的测量值高于该预定义截止点,可视为该患者的风险评分较高,更可能有不利的疾病预后。
Claims (15)
1.一种测定弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的预后指数(PI)(也称风险评分或PI评分)的方法,所述方法包括
a)至少测定以下参数:
i)结外疾病状况;ii)Ann Arbor分期;以及iii)胸苷激酶1的水平,
其中,不存在结外疾病的情况,评为0分,且存在结外疾病的情况,评为1分;
其中,Ann Arbor I期或II期,评为0分,且Ann Arbor III期或IV期,评为1分;以及
其中胸苷激酶水平至多达到并包括截止点的情况,评为0分,并且其中胸苷激酶水平高于截止点的情况,至少评为1分;以及
b)测定所述PI时,求取i)、ii)和iii)各项分值的总和。
2.根据权利要求1所述的方法,其中胸苷激酶截止水平设为在健康个体中测得的TK-1水平的均值的4倍,其中胸苷激酶水平至多达到和包括截止点的情况,评为0分,并且其中任何TK-1水平高于截止点的情况,评为1分。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述胸苷激酶截止水平设为在健康个体中测得的所述TK-1水平的均值的4倍,其中低胸苷激酶水平,即TK-1水平至多达到和包括截止点,评为0分;中等胸苷激酶水平,即TK-1水平高于截止点且至多达到和包括对应于在健康个体中测得的均值的20倍的值,评为1分;且高胸苷激酶水平,即TK-1水平高于在健康个体中测得的均值的20倍,评为2分。
4.根据权利要求1所述的方法,其中TK-1蛋白水平的截止点等于并包括18U/l的TK-1酶促活性。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述蛋白水平的截止点等于并包括18U/1,并且其中TK-1水平高于18U/l且至多达到和包括88U/l的情况,评为1分,以及TK-1水平高于88U/l的情况,评为2分。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其进一步包括参数年龄,其中在测定所述PI时,若所述年龄低于截止点,则评为0分,且若所述年龄高于截止点,则评为1分。
7.根据权利要求6所述的方法,在测定所述PI时,其中若所述年龄小于并包括60岁,则评为0分,且其中若所述年龄大于60岁,则评为1分。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其进一步包括参数ECOG体能状态,在测定所述PI时,其中若所述ECOG体能状态等于或小于1,则评为0分,并且其中若所述ECOG体能状态等于或大于2,则评为1分。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其进一步包括所述参数年龄和所述参数ECOG体能状态,在测定所述PI时,其中若所述年龄小于并包括60岁,则评为0分,且其中若所述年龄大于60岁,则评为1分;在测定所述PI时,其中若所述ECOG体能状态等于或小于1,则评为0分,并且其中若所述ECOG体能状态等于或大于2,则评为1分。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其进一步包括所述参数年龄和所述参数ECOG体能状态,在测定所述PI时,其中若所述年龄小于并包括40岁,则评为0分,其中若所述年龄大于40岁且至多达到并包括60岁,则评为1分,其中若所述年龄大于60岁且至多达到并包括75岁,则评为2分,并且其中若所述年龄大于75岁,则评为3分;并且在测定所述PI时,其中若所述ECOG体能状态等于或小于1,则评为0分,并且其中若所述ECOG体能状态等于或大于2,则评为1分。
11.TK-1水平的值在测定DLBCL患者预后指数中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途,其中所述TK-1水平的值与IPI、年龄调整的IPI、R-IPI或NCCN-IPI中所用的其他参数组合。
13.根据权利要求12或13所述的用途,条件是所述TK-1水平的值用于取代这类PI中LDH水平的值。
14.DLBCL的预后指数(PI),其包括胸苷激酶1水平的值。
15.根据权利要求14所述的预后指数(PI),其中所述PI选自IPI、年龄调整的IPI、R-IPI或NCCN-IPI。
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