ES2285713T3 - Enzimoinmunoanalisis electroquimioluminiscente. - Google Patents
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Abstract
Un método para la detección y/o la medición cuantitativa de analito que comprende: (I) poner en contacto (i) un anticuerpo conjugado con enzima, específico para dicho analito, con (ii) dicho analito en presencia de un detector electroquimioluminiscente y un substrato enzimático, en el que dicha enzima convierte dicho substrato en un producto y en el que (a) una mezcla de dicho substrato y dicho detector electroquimioluminiscente o un conjugado de dicho substrato y dicho detector electroquimioluminiscente en la aplicación de energía eléctrica emite electroquimioluminiscencia y (b) una mezcla de dicho producto y dicho detector electroquimioluminiscente o un conjugado de dicho producto y dicho detector electroquimioluminiscente, en la aplicación de energía eléctrica emite electroquimioluminiscencia y la electroquimioluminiscencia emitida por (a) difiere de la emitida por (b); (II) aplicar energía eléctrica a dicho detector electroquimioluminiscente y (III) detectar o medir electroquimioluminiscencia como una señal de si o en qué cantidad está presente el analito en la muestra.
Description
Enzimoinmunoanálisis
electroquimioluminiscente.
La presente invención se refiere al desarrollo
de un enzimoinmunoanálisis basado en electroquimioluminiscencia
(ECL, por sus siglas en inglés) para la detección y la medición
cuantitativa de analitos. El inmunoanálisis está basado en un
procedimiento catalítico que emplea antianalitos conjugados de
-lactamasa que hidrolizan enzimáticamente substratos sustituidos
electroquimioluminiscentes, haciéndolos fuertemente
electroquimioluminiscentes. El inmunoanálisis es muy sensible y es
adecuado para la detección y el seguimiento de cualquier analito
para el que se pueda preparar un antianalito.
Existe un campo de aplicaciones siempre en
aumento para métodos rápidos, altamente específicos, sensibles y
precisos, para detectar y cuantificar sustancias químicas,
bioquímicas y biológicas, incluyendo enzimas tal como se pueden
encontrar en muestras biológicas. Debido a que la cantidad de un
analito particular de interés tal como una enzima en una muestra
biológica típica, es con frecuencia bastante pequeña, los
bioquímicos analíticos están ocupados en esfuerzos actuales para
mejorar características de realización de los análisis tales como
la sensibilidad.
Una propuesta para mejorar la sensibilidad de
los análisis ha implicado amplificar la señal producida por un
marcador detectable, asociada con el analito de interés. En este
aspecto, son de interés los marcadores luminiscentes. Se sabe que
dichos marcadores se pueden hacer luminiscentes por técnicas
fotoluminiscentes, quimioluminiscentes o
electroquimioluminiscentes. La "fotoluminiscencia" es el
procedimiento por el que un material presenta luminiscencia
posterior a la absorción por ese material de luz (alternativamente
denominado radiación electromagnética o emr (por sus siglas en
inglés)). La fluorescencia y la fosforescencia son dos tipos
diferentes de fotoluminiscencia. Los procedimientos
"quimioluminiscentes" suponen la creación de las especies
luminiscentes por una reacción química. La
"electroquimioluminiscencia" es el procedimiento por el que
una especie presenta luminiscencia cuando se expone esa especie a
energía electroquímica en un entorno químico circundante
apropiado.
La señal en cada una de estas tres técnicas
luminiscentes es capaz de una amplificación muy eficaz (es decir,
alto aumento) por el uso de instrumentos conocidos (por ej., un tubo
fotomultiplicador o pmt (por sus siglas en inglés)) que puede
responder sobre una base individual fotón a fotón. Sin embargo, la
manera en que se genera la especie luminiscente difiere mucho entre
los procesos fotoluminiscentes, quimioluminiscentes y
electroquimioluminiscentes. Además, estas diferencias en los
mecanismos responden a las ventajas sustanciales como herramienta
bioanalítica que presenta electroquimioluminiscencia comparado con
fotoluminiscencia y quimioluminiscencia. Algunas de las ventajas
posibles con la electroquimioluminiscencia incluyen: (1)
instrumentación menos cara, más simple; (2) marcadores no
peligrosos, estables y (3) características de realización de los
análisis aumentadas tales como límites de detección inferiores,
relaciones señal a ruido más altas y niveles de fondo
inferiores.
Como se indicó anteriormente, en el contexto de
técnicas de medición química bioanalítica, la
electroquimioluminiscencia goza de ventajas significativas sobre
tanto la fotoluminiscencia como la quimioluminiscencia. Además, se
han desarrollado e indicado en la bibliografía ciertas aplicaciones
de la ECL. Las patentes de EE.UU. Números 5.147.806, 5.068.808,
5.061.445, 5.296.191, 5.247.243, 5.221.605, 5.238.808 y 5.310.687
detallan ciertos métodos, aparatos, restos químicos, invenciones y
ventajas asociadas de la ECL.
Se describe un sistema de ECL particularmente
útil en un documento por Yang et al., Bio/Technology,
12, págs. 193-194 (Feb. 1.994). Véase también un
documento por Massey, Biomedical Products, Octubre 1.992 así
como las patentes de EE.UU. 5.235.808 y 5.310.687.
Los procedimientos de ECL se han demostrado para
muchas moléculas diferentes por diversos mecanismos diferentes. En
Blackburn et al., (1.991) Clin. Chem. 37/9, págs.
1.534-1.539, los inventores usaron la reacción ECL
del tris(bipiridil)rutenio (II),
Ru(bpy)_{3}^{2+} son compuestos solubles en agua,
muy estables, que se pueden modificar mediante enlaces químicos con
grupos reactivos en uno de los ligandos bipiridilo para formar
especies activadas con las que se marcan fácilmente proteínas,
haptenos y ácidos nucleicos.
Las beta-lactamasas que
hidrolizan los enlaces amido del anillo de -lactama de penicilinas y
cefalosporinas sensibles se distribuyen extensamente entre los
microorganismos y juegan un papel en la resistencia microbiana a
antibióticos de -lactama. Las beta-lactamasas
constituyen un grupo de enzimas relacionadas que se elaboran por un
gran número de especies bacterianas pero no por los tejidos de los
mamíferos y pueden variar en las especificidades de los substratos.
Véase en general Payne, D. J., J. Med. Micro (1.993) 39,
págs. 93-99; Coulton, S & Francois, 1.,
Prog. Med. Chem. (1.994) 31, 297-349;
Moellering, R. C., Jr., J. Antimicrob. Chemother. (1.993) 31
(Suppl. A), págs. 1-8 y Neu, H. C. Science
(1.992) 257, págs. 1.064-1.072.
\newpage
Existen en la actualidad diversos métodos para
la detección de -lactamasas microbianas. Siguen algunos ejemplos
representativos.
W. L. Baker, "Co-existence of
-lactamase and penicillin acylase in bacteria; detection and
quantitative determination of enzyme activities", J. Appl.
Bacteriol. (1.992) Vol. 73, Nº 1, págs. 14-22
describe un análisis reductor de cobre para la detección de
penicilatos y análisis de fluorescamina para detectar
concentraciones de ácido 6-aminopenicilánico cuando
se producen ambas sustancias por acción de las enzimas en un único
substrato.
La patente de EE.UU. Nº 5.264.346 describe un
análisis colorimétrico para -lactamasa que presenta una variedad de
aplicaciones. El análisis está basado en la decoloración de un
cromóforo formado por oxidación de cualquiera de, el derivado
N-alquílico de p-fenilendiamina o el
3,3',5,5'-tetraalquilderivado de bencidina. La
decoloración se atribuye a la presencia de un producto de anillo de
-lactama abierto que resulta de la hidrólisis de la cefalosporina o
la penicilina. La decoloración con el producto de -lactama abierto
de penicilina requiere la presencia de un potenciador de la
decoloración tal como compuestos que contienen mercurio. No se
requiere el potenciador para la decoloración con el producto de
-lactama abierto de la cefalosporina.
La patente internacional WO
A-87/06706 describe un análisis basado en ECL en
que, entre otras cosas, un anticuerpo conjugado con enzima escinde
un substrato macromolecular en un producto (marcado con un resto
ECL). El producto se expone después a una fuente de energía para
inducir la emisión.
La patente de EE.UU. Nº 4.470.459 describe un
método rápido para la detección de la presencia de -lactamasa a
partir de fuentes microbianas que se basa en una conversión de
-lactamasa de un substrato de -lactama que invierte su capacidad de
fluorescer. Las -lactamas específicas mencionadas como que tienen
esta propiedad incluyen: ampicilina, cefalexina, amoxicilina,
cefadroxil y cefaloglicina. El cambio en la capacidad para
fluorescer se atribuye a la presencia de -lactamasa.
La patente internacional WO 84/03303 describe un
proceso de análisis microbiológico para identificar productores de
-lactamasa. El análisis depende de cambios en la acidez que afectan
a la fluorescencia del indicador tal como cumarina. Este cambio en
la acidez se atribuye al producto de conversión producido por la
presencia de la -lactamasa.
A. C. Peterson et al., "Evaluation of
four qualitative methods for detection of -lactamase production in
Staphylococcus and Micrococcus species", Eur. J. Clin.
Microbiol. Infect. Dis. (1.989), Vol. 8, Nº 11, págs.
962-7 presentan ciertos factores que se emplearon
en evaluar análisis cualitativos para -lactamasa.
Robert H. Yolken et al., "Rapid
diagnosis of infections caused by
-lactamase-producing bacteria by means of an enzime
radioisotopic assay", The Journal of Pediatrics., Vol. 97,
Nº 5 (Nov. 1.980) págs. 715-720 describen un
análisis radioisotópico enzimático, sensible, para la medición de
-lactamasa como un análisis rápido para la detección de infección
bacteriana. El protocolo del análisis implica una etapa de
incubación con muestra seguido por la etapa de separación en una
columna cargada positivamente tal como DEAE-Sephacel
previamente a la medición de la radioactividad de fracciones
eluidas. El producto penicilínico convertido de -lactamasa presenta
un grupo carboxilo adicional que asegura su unión más fuerte que la
penicilina a la columna cargada positivamente. Las diferencias en
radioactividad entre las fracciones eluidas y los valores originales
se atribuyen a la presencia de -lactamasa.
En inmunoanálisis generalmente, los anticuerpos
(referidos de manera equivalente en la presente memoria como
"antianalitos") se usan ara detectar analito. Comúnmente, un
antianalito se marca con una molécula que es detectable por, por
ejemplo, absorbancia, fluorescencia, luminiscencia o
electroquimioluminiscencia. Alternativamente, el anticuerpo se
puede marcar con una enzima que crea o destruye un compuesto con una
de estas características. Hay dos tipos principales de
enzimoinmunoanálisis, las técnicas de enzimoinmunoanálisis (ELISA) y
enzimoinmunoanálisis (EMIT). S. C. Anderson & S. Cockayne,
Clinical Chemistry: Concepts and Applications, W. B.
Saunders (1.993) Philadelphia, PA. En enzimoinmunoanálisis, el
proceso es catalítico de manera que se forman múltiples marcadores
detectables, dando la posibilidad de sensibilidad exaltada.
Convencionalmente se llevan a cabo
inmunoanálisis de electroquimioluminiscencia (ECL) con anticuerpo
conjugado al marcador, que generalmente es un derivado de
tris(bipiridil)rutenio (II) (abreviado como
Ru(bpy)_{3}^{2+}). G. Blackburn et al.
(1.991) Clin. Chem. 37, 1.534-1.539. En estos
análisis, cada anticuerpo presenta un número limitado de moléculas
de Ru(bpy)_{3}^{2+} en su superficie (por ejemplo,
6-8).
Ahora se han descubierto composiciones y métodos
para la preparación y usos de anticuerpos conjugados de -lactamasa
en inmunoanálisis basados en ECL. Por ejemplo, la enzima -lactamasa
puede hidrolizar eficazmente penicilinas sustituidas de
Ru(bpy)_{3}^{2+}. Las penicilinas, denominadas
Ru-Amp y Ru-APA, sólo presentan una
electroquimioluminiscencia muy débil, pero cuando se hidrolizan por
-lactamasa de acuerdo con la presente invención llegan a presentar
una electroquimioluminiscencia fuerte. La presencia de -lactamasa
por lo tanto se puede detectar con un alto nivel de sensibilidad en
un instrumento de ECL usando cualquiera de estos compuestos. A
diferencia de los inmunoanálisis ECL convencionales donde el
marcador Ru(bpy)_{3}^{2+} está unido directamente
al anticuerpo, en los inmunoanálisis ECL basados en enzimas de la
presente invención, el complejo de rutenio
electroquimioluminiscentemente activo se genera catalíticamente por
la enzima unida a la superficie del anticuerpo. Así, en vez de un
anticuerpo que permita unos pocos marcadores de rutenio
(típicamente 6-8) para generar luz, un complejo de
anticuerpo-enzima puede generar típicamente 2.000
marcadores de rutenio por segundo y podía generar tantos como 10.000
o más.
De acuerdo con la invención, se proporciona un
método para la detección y/o la medición cuantitativa de analito
que comprende:
- (I)
- poner en contacto (i) un reactivo de unión conjugado con enzima, específico para dicho analito con (ii) analito en presencia de un compuesto electroquimioluminiscente y un substrato enzimático, en el que dicha enzima convierte dicho substrato en un producto y en el que (a) una mezcla de substrato y compuesto electroquimioluminiscente o un conjugado de substrato y compuesto electroquimioluminiscente, emite electroquimioluminiscencia y (b) una mezcla de producto y compuesto electroquimioluminiscente o un conjugado de producto y compuesto electroquimioluminiscente emite electroquimioluminiscencia y la electroquimioluminiscencia emitida por (a) difiere de la emitida por (b);
- (II)
- aplicar energía eléctrica a dicho compuesto electroquimioluminiscente y
- (III)
- detectar o medir electroquimioluminiscencia como una señal de si o en qué cantidad está presente el analito en la muestra.
La invención también proporciona un estuche
para medir un analito en una muestra que comprende medir previamente
cantidades de reactivo de unión de conjugado con enzima, específico
para dicho analito y medir previamente cantidades de un compuesto
electroquimioluminiscente y un substrato enzimático y un patrón de
referencia en el que las cantidades medidas previamente son
suficientes para realizar una única medición de la muestra y en el
que dicha enzima convierte dicho substrato en un producto y en el
que (a) una mezcla de substrato y compuesto
electroquimioluminiscente o un conjugado de substrato y compuesto
electroquimioluminiscente emite electroquimioluminiscencia y (b) una
mezcla de producto y compuesto electroquimioluminiscente o un
conjugado de producto y compuesto electroquimioluminiscente emite
electroquimioluminiscencia y la electroquimioluminiscencia emitida
por (a) difiere de la emitida por (b).
Los inmunoanálisis a base de ECL convencionales
emplean anticuerpos marcados de rutenio. En la presente invención,
se ha descubierto un inmunoanálisis en que el anticuerpo marcado de
rutenio se reemplaza con un anticuerpo marcado de enzima. La enzima
es -lactamasa. Se omiten tripropilamina (TPA) o reductores similares
de la disolución y, por ejemplo, en el caso de análisis
relacionados con infecciones, se usan en su lugar penicilinas
marcadas de rutenio. En presencia de anticuerpo marcado de
-lactamasa, los substratos marcados de rutenio se hidrolizan
catalíticamente, generando un enorme aumento en ECL. El análisis es
superior al uso de inmunoanálisis de anticuerpos marcados de
rutenio debido a que el rutenio activo de ECL generado por enzimas
es un proceso catalítico, que forma muchas moléculas activas
ECL.
Indicado en términos generales, la invención
considera un inmunoanálisis basado en electroquimioluminiscencia
para la detección de analitos. La invención emplea enzimas tales
como -lactamasas, proteasas u oxidorreductasas conjugadas a
anticuerpos y marcadores de ECL y substratos enzimáticos,
preferiblemente substratos sustituidos de marcadores de ECL tales
como antibióticos, péptidos y nicotinamida adenina dinucleótido
(NADH), sustituidos de marcadores de ECL, que proporcionan juntos
un complejo anticuerpo-enzima que puede generar
catalíticamente hasta cientos de marcadores activos de ECL por
segundo.
Fue principal para el uso de metodología
electroquimioluminiscente como sistema de medición para analitos el
reconocimiento de que la -lactamasa puede hidrolizar eficazmente
penicilinas sustituidas de Ru(bpy)_{3}^{2+}. Las
penicilinas, Ru-Amp y Ru-APA sólo
presentan una electroquimioluminiscencia muy débil pero cuando se
hidrolizan por -lactamasa llegan a presentan una
electroquimioluminiscencia fuerte.
Se pueden emplear diversos formatos de análisis
en la práctica de la invención como será evidente para los expertos
en la materia. Estos incluyen un análisis sándwich usando por
ejemplo perlas magnéticas u otro soporte sólido tal como fibras de
carbono, un análisis competitivo que usa antígeno conjugado a
-lactamasa libre, un análisis competitivo donde la -lactamasa es
una proteína recombinante que contiene un segmento que se une por
un anticuerpo que también se une al analito elegido en el que la
enzima está inactivada por unión de anticuerpo y ELISA donde la
-lactamasa es un in-
dicador en un anticuerpo secundario. The Immunoassay Handbook, D. Wild, Ed. (1.994) Stockton Press, Nueva York.
dicador en un anticuerpo secundario. The Immunoassay Handbook, D. Wild, Ed. (1.994) Stockton Press, Nueva York.
La Fig. 1 muestra la hidrólisis de
Ru-AMP y Ru-APA por -lactamasa.
La Fig. 2 muestra la síntesis de
Ru-AMP.
La Fig. 3 muestra la síntesis de
Ru-APA.
La Fig. 4 muestra el espectro de masas de la sal
hexafluorofosfato de amonio de Ru-APA.
La Fig. 5 muestra el espectro RMN de protón de
la sal hexafluorofosfato de amonio de Ru-APA.
La Fig. 6 muestra las estructuras de cinco
-lactamas específicas.
La Fig. 7 muestra la hidrólisis por NaOH o por
enzima -lactamasa de Ru-AMP (lado izquierdo) y de
Ru-APA (lado derecho).
\global\parskip0.900000\baselineskip
La Fig. 8 muestra la comparación de la ECL
medida para una serie de muestras diferentes.
La Fig. 9 muestra la comparación de la ECL
medida para una serie de muestras diferentes.
La Fig. 10 muestra el efecto de la concentración
de Ru-AMP no hidrolizado (círculos cerrados) e
hidrolizado (círculos abiertos) en la ECL medida.
La Fig. 11 muestra la comparación de la ECL
medida para una serie de muestras diferentes.
La Fig. 12 muestra el efecto de la concentración
de Ru-APA no hidrolizado (círculos cerrados) e
hidrolizados (círculos abiertos) en la ECL medida.
La Fig. 13 muestra la comparación de la ECL
medida para una serie de muestras diferentes.
La Fig. 14 ilustra un enzimoinmunoanálisis ECL.
Se inmovilizaron diversas concentraciones de un analito, hapteno
RT1, en una placa de 96 pozos. A la placa se añadió bien un
conjugado anticuerpo - enzima (anticuerpo anti-RT1
acoplado mediante enlaces covalentes a una enzima -lactamasa) (Línea
1) o anticuerpo no conjugado o enzima (Líneas 2-4).
Siguiendo al lavado para retirar las proteínas que no se unieron al
analito, se añadió el substrato -lactamasa, Pen G. Después de
incubación para permitir que cualquier -lactamasa en la placa
hidrolizara el Pen G., se retiraron las disoluciones, se mezclaron
con Ru(bpy)_{3}^{2+} y se leyó la ECL en un
Analizador de ECL. La línea 1 muestra los resultados con el
conjugado anticuerpo-enzima. Las líneas
2-4 muestran los resultados usando anticuerpo no
conjugado o enzima.
El método preferido para medir analito usando el
inmunoanálisis basado en electroquimioluminiscencia es por las
siguientes etapas secuenciales:
- 1.
- En una disolución que contiene analito, se incorpora un anticuerpo antianalito inmovilizado con perlas magnéticas con un conjugado de anticuerpo de antianalito de -lactamasa.
- 2.
- Después de permitir que los anticuerpos se unieran a analito para crear un "sándwich" anticuerpo-analito-anticuerpo, se inmovilizan las perlas con un imán, se lava mucho para retirar moléculas interferentes no de analito y conjugado de anticuerpo de antianalito de -lactamasa no unido.
- 3.
- Se añade substrato marcado ECL a perlas, se permite que reaccione la enzima, determinándose el tiempo de reacción óptimo por la concentración esperada del analito y retirando el sobrenadante sin perlas.
- 4.
- Se mide la electroquimioluminiscencia del sobrenadante y se compara con una curva patrón de concentración de substrato marcado ECL hidrolizado frente a electroquimioluminiscencia. La medición se puede llevar a cabo en un Analizador ORIGEN® siguiendo las instrucciones en el Manual del Operador del mismo, disponible de IGEN, Inc., 16.020 Industrial Drive, Gaithersburg. MD 20877 U.S.A.
De acuerdo con la invención, un detector de ECL
tal como Ru(bpy)_{3}^{2+} se sustituye en un
substrato tal como un antibiótico, péptido o NADH. También se
prepara un antianalito marcado de enzima usando -lactamasa. Cuando
se pone el substrato sustituido ECL en presencia del anticuerpo
marcado de -lactamasa, el substrato se hidroliza catalíticamente
formando el estado excitado del detector,
Ru(bpy)_{3}^{2+} en cantidades sustanciales. El
estado excitado decae al esta-
do fundamental por un mecanismo de fluorescencia normal, emitiendo un fotón con una longitud de onda de 620 nm.
do fundamental por un mecanismo de fluorescencia normal, emitiendo un fotón con una longitud de onda de 620 nm.
Los compuestos orgánicos que son detectores ECL
incluyen, por ejemplo, rubreno y
9,10-difenilantraceno. Muchos compuestos
organometálicos son también detectores ECL y lo más preferiblemente
son compuestos que contienen Ru, tales como quelato de
tris-bipiridinrutenio II y compuestos que contienen
Os. Los detectores útiles en la invención descrita ahora se
describen en la patente de EE.UU. Nº 5.310.687, cuyos contenidos se
incorporan en la presente memoria por referencia.
Estos detectores son estables durante largos
periodos. Además, los detectores son seguros y relativamente
económicos. Dan una señal altamente característica y no tienen lugar
en la naturaleza. Las mediciones basadas en la luminiscencia de
tales detectores son sensibles, rápidas, reproducibles y utilizan
instrumentación simple. La señal se genera repetidamente por cada
molécula del detector, exaltando de ese modo la sensibilidad con
que se tienen que detectar. Los detectores
electroquimioluminiscentes preferidos de la presente invención se
refieren convenientemente en la presente memoria como
Ru(bpy)_{3}^{2+}. Se puede emplear diversas
cantidades de este detector o su equivalente. Estos detectores
también presentan la ventaja de que se pueden usar directamente en
una muestra biológica sin tratamiento previo de la muestra.
La energía necesaria para la formación del
estado excitado surge de la hidrólisis de -lactama o péptido o por
la reducción de NAD^{+} a NADH. El
Ru(bpy)_{3}^{2+} del estado excitado decae por un
mecanismo de fluorescencia normal, emitiendo un fotón a 620 nm.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La cuantificación del detector
Ru(bpy)_{3}^{2+} se puede automatizar fácilmente
con instrumentación relativamente no complicada. El corazón del
instrumento es la célula de flujo electroquímico que contiene los
electrodos de trabajo y los contraelectrodos para la iniciación de
la reacción ECL. Los dos electrodos se fabrican preferiblemente de
oro, pero se han usado otros materiales con diversos grados de
éxito. Se usa un potenciostato para aplicar formas de onda de
diversos voltajes a los electrodos y se usa un tubo
fotomultiplicador único (PMT, por sus siglas en inglés) para
detectar la luz emitida durante la reacción ECL. Se pone un
electrodo de referencia Ag/AgCl en el camino del fluido aguas abajo
desde la célula de flujo y se usa una bomba peristáltica para
extraer diversos fluidos por la célula de flujo. En una secuencia
típica, el fluido de análisis se extrae de un tubo de ensayo en la
célula de flujo y el detector se cuantifica por aplicación de un
voltaje en rampa a los electrodos y midiendo la luz emitida.
Después de la medición, se extrae una disolución de limpieza de pH
alto a la célula por un procedimiento de limpieza electroquímico.
Después se extrae una disolución acondicionadora en la célula y se
aplica una forma de onda de voltaje que deja las superficies de los
electrodos en un estado altamente reproducible, listas para el
siguiente ciclo de medición.
Se puede iniciar eficazmente la reacción ECL por
muchas formas de onda de voltaje diferentes. Las mediciones de la
corriente del electrodo de trabajo y la intensidad ECL se pueden
inducir, por ejemplo, por la aplicación de una onda triangular a
los electrodos. El voltaje aplicado como se muestra es realmente el
voltaje medido en el electrodo de referencia de Ag/AgCl e incluye
los efectos de una resistencia no compensada, significativa. Por
consiguiente, el voltaje real aplicado al electrodo de trabajo es
sustancialmente menor que el representado. La forma de onda
triangular aumenta de 565 a 2.800 milivoltios (mV) a una velocidad
de 750 milivoltios por segundo (mV/s) y después disminuye a la
misma velocidad a 1.000 mV. La oxidación de tanto el substrato de
-lactama como el Ru(bpy)_{3}^{2+} llega a ser
evidente cuando el voltaje aplicado alcanza 1.100 mV y produce una
luminiscencia. La intensidad de la luminiscencia aumenta con el
voltaje aplicado hasta que se agota el substrato en la superficie
del electrodo, dando como resultado intensidad disminuida. La
intensidad de la luminiscencia observada es suficientemente grande
para que se pueda medir fácilmente con fotomultiplicadores
convencionales operando bien en modos contador de fotones o de
corriente.
El método preferido para medir analito usando el
inmunoanálisis basado en electroquimioluminiscencia es por las
siguientes etapas secuenciales:
- 1.
- En una disolución que contiene analito, se incorpora un anticuerpo de antianalito inmovilizado con perlas magnéticas con un conjugado de anticuerpo de antianalito de -lactamasa.
- 2.
- Después de permitir que los anticuerpos se unan a analito para crear un "sándwich" anticuerpo-analito-anticuerpo, se inmovilizan las perlas con un imán, se lava mucho para retirar moléculas que interfieran de no analito y conjugado de anticuerpo de antianalito de lactamasa no unida.
- 3.
- Añadir substrato marcado ECL a perlas, permitir que reaccione la enzima, determinándose el tiempo de reacción óptimo por la concentración esperada del analito y retirando el sobrenadante, sin perlas.
- 4.
- Medir la electroquimioluminiscencia del sobrenadante y compararlo a una curva patrón de concentración de substrato marcado de ECL, hidrolizado, frente a electroquimioluminiscencia. La medición se puede llevar a cabo usando procedimientos establecidos en el Analizador ORIGEN®.
La muestra a la que se ha añadido la -lactama de
interés se pone después en una célula de medición para obtener una
lectura inicial. Típicamente la -lactama de interés se añade en
concentraciones entre 10 micromolar y 1,0 milimolar. El detector
electroquimioluminiscente está presente típicamente en
concentraciones 10^{-6} M (intervalo 1-15 \muM).
La célula que contiene la muestra se incuba después durante un
periodo de tiempo suficiente para asegurar que pueda tener lugar la
hidrólisis catalizada de -lactamasa si está presente la enzima.
Este periodo de tiempo varía típicamente entre 5 minutos y 2 horas.
Son posibles periodos de tiempo más largos y más cortos dependiendo
de la muestra y de las concentraciones de reactivo. Puesto que todo
eso está implicado son parámetros empíricos, sus valores se pueden
determinar usando técnicas convencionales.
Después de que tiene lugar la incubación, se
toma una segunda lectura. La diferencia en las lecturas, si hay
alguna, se correlaciona con la actividad de la -lactamasa presente
en la muestra. Véase la Figura 2 con respecto a esto.
De acuerdo con esto, el aparato y la metodología
adecuados para la realización del procedimiento de esta invención
incluyen, como se indicó anteriormente, los mostrados en las
patentes de EE.UU. Nos. 5.068.088, 5.061.455, 5.093.268 y 5.147.806
y 5.221.605. Además las moléculas electroquimioluminiscentes para
uso en el sistema de medición como detectores incluyen los ligandos
que contienen nitrógeno, heterocíclicos, aromáticos, bidentados, de
rutenio y osmio descritas en la patente de EE.UU. Nº 5.310.687.
Se pueden reunir estuches de reactivos que
contengan los materiales necesarios para la realización de los
análisis para facilitar la manipulación y estandarización
facilitada. Los materiales que se tienen que incluir en el estuche
pueden variar dependiendo del propósito final. Típicamente el
estuche incluiría el detector electroquimioluminiscente, los
tampones necesarios y patrones. Los patrones pueden ser reactivos
químicos o datos (empíricos) en forma impresa o electrónica
necesarios para la calibración necesaria para la realización del
análisis.
A pesar de la descripción detallada previa de la
presente invención, los solicitantes proporcionan a continuación
ejemplos específicos sólo para propósitos de ilustración y como
ayuda para el entendimiento de la invención. Los ejemplos son tanto
no limitantes como no exclusivos. De acuerdo con esto, el alcance de
la invención de los solicitantes como se explica en las
reivindicaciones adjuntas se tiene que determinar a la luz de las
explicaciones de la memoria descriptiva completa.
Se mezcló Ru(bpy)_{3}^{2+}-
éster NHS (15 mg) (IGEN, Inc., Rockville. MD. USA) en acetonitrilo
(250 \mul), con ácido 6-aminopenicilánico (12,4
mg) en bicarbonato de sodio 0,2 M, pH 8,0 (350 \mul) y se permitió
que la reacción transcurriera a temperatura ambiente, durante 2
horas (Figura 3). Se purificó Ru-APA con un sistema
HPLC Waters (Milford, MA, USA) equipado con una columna TSK
CM-5PW de Progel^{TM} (7,5 cm x 7,5 mm) (Supelco,
Inc., Bellefonte. PA. USA) usando un gradiente lineal de 20
minutos, 1,0 ml/minuto, de fosfato de sodio 20-100
mM, pH 7,0. Se cuantificó substrato espectrofotométricamente
midiendo la absorbancia del complejo de rutenio (el coeficiente de
extinción molar a 453 nm es 13.700 M^{-1}cm^{-1}).
Se mezcló Ru(bpy)_{3}^{2+}-
éster NHS (15,1) mg en acetonitrilo (250 \mul) con ampicilina
(29,1 mg) en bicarbonato de sodio 0,2 M, pH 8,0 (250 \mul) y se
permitió que la reacción transcurriera a temperatura ambiente,
durante 2 horas (Figura 2). Se purificó Ru-AMP
usando un sistema HPLC Waters (Milford, MA, USA) equipado con una
columna TSJ CM-5PW de Progel^{TM} (7,5 cm x 7,5
mm) (Supelco, Inc., Bellefonte, PA, USA) usando un gradiente lineal
de 15 minutos, 1,0 ml/min, de fosfato de sodio
20-180 mM, pH 7,0. Se cuantificó substrato
espectrofotométricamente por medición de la absorbancia del
complejo de rutenio (el coeficiente de extinción molar a 453 nm es
13.700 M^{-1}cm^{-1}). Siguiendo a la formación de la sal de
hexafluorofosfato de amonio, la estructura y la pureza de
Ru-AMP se confirmó por espectroscopía de masas y
RMN de protón (Figuras 4-5).
También pueden reaccionar otras -lactamas tales
como ácido 7-aminocefalosporánico, que presenten una
amina primaria en sus estructuras, con
Ru(bpy)_{3}^{2+}- éster NHS para formar
conjugados similares como se describió anteriormente. Las
condiciones de reacción y de purificación serán similares,
difiriendo algo potencialmente de formas resolubles para un experto
en la materia. La Figura 6 muestra la estructura de 5 -lactamas
específicas.
Se realizaron experimentos para comparar las
propiedades ECL de Ru-AMP (conjugado) con mezclas
de
Ru(bpy)_{3}^{2+} y ampicilina (no conjugadas). Las propiedades ECL se compararon tanto antes como después de hidrólisis con NaOH y enzimática (Figura 7).
Ru(bpy)_{3}^{2+} y ampicilina (no conjugadas). Las propiedades ECL se compararon tanto antes como después de hidrólisis con NaOH y enzimática (Figura 7).
Se encontró que Ru-AMP era un
substrato muy bueno de -lactamasa. La hidrólisis de
Ru-AMP (33 \muM) por -lactamasa I a partir de
Bacillus cereus (0,3 nM) se siguió espectrofotométricamente a
240 nm usando un espectrofotómetro Hitachi U3200 (Danbury, CT, USA)
a 25,0 C en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0. El análisis a tiempo
medio (t1/2) dio un k_{cat}/K_{m} para hidrólisis enzimática de
Ru-AMP de 3,9 x 10^{8}
min^{-1}M^{-1}_{.}
Las propiedades ECL de mezclas equimolares de
Ru(bpy)_{3}^{2+} y ampicilina (hidrolizadas o no
hidrolizadas) se compararon con la misma concentración del
conjugado de Ru-AMP (hidrolizado o no hidrolizado).
En experimentos separados, se hidrolizaron ampicilina y
Ru-AMP por bien NaOH 50 mM (hidrólisis básica) o
-lactama I 347 nM a partir de Bacillus cereus (hidrólisis
enzimática). Para la hidrólisis básica, se añadieron 50 \mul de
NaOH 5 M a 1,0 ml de disoluciones de agua desionizada que contenían
bien Ru-AMP 30,1 \muM o una mezcla de ampicilina
30 \muM y
Ru(bpy)_{3}^{2+} 30 \muM. Siguiendo a incubaciones de 30 minutos, se neutralizaron las disoluciones con 50 \mul de HCl 5 M. Para los experimentos de contrapartida no hidrolizados, se añadieron 50 \mul de H_{2}O 5 M a disoluciones de bien Ru-AMP 30,1 \muM o una mezcla que contenía ampicilina 30,0 \muM y Ru(bpy)_{3}^{2+} 30,0 \muM. Siguiendo a incubaciones de 30 minutos, se añadieron 50 \mul de NaCl 5M a estas disoluciones. Los resultados mostrados en la Figura 8 demuestran: (1) que la hidrólisis de la ampicilina bien por NaOH o -lactamasa causa un aumento en la ECL de las mezclas y (2) que el aumento en la ECL causado por la hidrólisis es espectacularmente mayor cuando el complejo de rutenio que emite luz está unido mediante enlaces covalentes a la ampicilina. Con hidrólisis básica, la ECL aumentó 1,5 veces cuando se hidrolizó ampicilina en una mezcla de ampicilina y Ru(bpy)_{3}^{2+}, mientras la ECL aumentó 5,2 veces cuando se hidrolizó Ru-AMP. Se obtuvieron resultados similares en hidrólisis enzimática: la ECL aumentó 2,1 veces cuando se hidrolizó ampicilina en una mezcla de ampicilina y Ru(bpy)_{3}^{2+}, mientras la ECL aumentó 9,8 veces en la hidrólisis de Ru-AMP. Los datos que establecen estas conclusiones se encuentran en la Figura 8, que muestra la electroquimioluminiscencia medida experimentalmente de (de izquierda a derecha):
Ru(bpy)_{3}^{2+} 30 \muM. Siguiendo a incubaciones de 30 minutos, se neutralizaron las disoluciones con 50 \mul de HCl 5 M. Para los experimentos de contrapartida no hidrolizados, se añadieron 50 \mul de H_{2}O 5 M a disoluciones de bien Ru-AMP 30,1 \muM o una mezcla que contenía ampicilina 30,0 \muM y Ru(bpy)_{3}^{2+} 30,0 \muM. Siguiendo a incubaciones de 30 minutos, se añadieron 50 \mul de NaCl 5M a estas disoluciones. Los resultados mostrados en la Figura 8 demuestran: (1) que la hidrólisis de la ampicilina bien por NaOH o -lactamasa causa un aumento en la ECL de las mezclas y (2) que el aumento en la ECL causado por la hidrólisis es espectacularmente mayor cuando el complejo de rutenio que emite luz está unido mediante enlaces covalentes a la ampicilina. Con hidrólisis básica, la ECL aumentó 1,5 veces cuando se hidrolizó ampicilina en una mezcla de ampicilina y Ru(bpy)_{3}^{2+}, mientras la ECL aumentó 5,2 veces cuando se hidrolizó Ru-AMP. Se obtuvieron resultados similares en hidrólisis enzimática: la ECL aumentó 2,1 veces cuando se hidrolizó ampicilina en una mezcla de ampicilina y Ru(bpy)_{3}^{2+}, mientras la ECL aumentó 9,8 veces en la hidrólisis de Ru-AMP. Los datos que establecen estas conclusiones se encuentran en la Figura 8, que muestra la electroquimioluminiscencia medida experimentalmente de (de izquierda a derecha):
\vskip1.000000\baselineskip
Ru(bpy)_{3}^{2+} sólo;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
ampicicilina no hidrolizada;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
NaOH-ampicilina hidrolizada;
Ru-AMP no hidrolizado;
NaOH-Ru-AMP
hidrolizado;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
ampicilina no hidrolizada;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
-lactamasa-ampicilina hidrolizada;
Ru-AMP no hidrolizado y
-lactamasa-Ru-AMP
hidrolizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Este trabajo se confirmó en un segundo
experimento usando hidrólisis enzimática que difiere en que el
tiempo de incubación con enzima se prolongó de 30 a 60 minutos
(Figura 9). Aquí, la hidrólisis enzimática causó un aumento de 2,5
veces en ECL cuando se conjugaron ampicilina y
Ru(bpy)_{3}^{2+} y un aumento de 11,1 veces en
ECL cuando se hidrolizó el conjugado de Ru-AMP. Los
datos que establecen estas conclusiones se encuentran en la Figura
9, que muestra la luminiscencia medida experimentalmente de (de
izquierda a derecha):
\vskip1.000000\baselineskip
Ru(bpy)_{3}^{2+} sólo;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
ampicicilina no hidrolizada;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
lactamasa-ampicilina hidrolizada;
Ru-AMP no hidrolizado y
-lactamasa-Ru-AMP
hidrolizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que la conjugación de
Ru(bpy)_{3}^{2+} causó efectos intramoleculares
que aumentan espectacularmente la luminiscencia medida
experimentalmente cuando se hidroliza el anillo de -lactama.
La Figura 10 muestra que se pueden detectar por
hidrólisis concentraciones bajas de Ru-AMP. Se
encontró que el límite de detección inferior era 50 nM (464 cuentas
ECL relativas para Ru-AMP hidrolizado frente a una
lectura de instrumento media de -152 cuentas relativas para
Ru-AMP no hidrolizado). Esto se compara
favorablemente al límite inferior para la detección de hidrólisis
de ampicilina (no conjugada) que fue 5.000 nM.
Se pensaba que Ru-APA podía
presentar diferentes propiedades ECL (antes y después de la
hidrólisis) de las de Ru-AMP. Las diferencias
serían una consecuencia de las diferencias estructurales entre APA y
AMP, especialmente la diferencia en la distancia entre el anillo de
-lactama y el grupo amino primario usado para conjugar
Ru(bpy)_{3}^{2+} - éster NHS (Figura 7). En
Ru-AMP, el anillo de -lactama tiene tres longitudes
de enlace más lejos del grupo amino que en Ru-APA.
Específicamente, la hidrólisis de Ru-APA (u otros
conjugados de -lactama) se puede detectar más o menos sensiblemente
por ECL que la hidrólisis de Ru-AMP.
Las propiedades ECL del conjugado de
Ru-APA se compararon con las de las mezclas de
Ru(bpy)_{3}^{2+} no conjugado y
6-APA. Se compararon las propiedades ECL antes y
después de la hidrólisis con NaOH y enzimática. Los datos se
compararon después con los resultados de experimentos similares con
Ru-AMP descritos en el Ejemplo 2.
Se encontró que Ru-APA era un
substrato muy bueno de -lactamasa. La hidrólisis de
Ru-APA (23 \muM) por -lactamasa I a partir de
Bacillus cereus (0,6 nM) se siguió espectrofotométricamente a
240 nm usando un espectrofotómetro Hitachi U3200 (Danbury, CT, USA)
a 25,0 C en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0. El análisis a tiempo
medio (t1/2) dio un k_{cat}/K_{m} para hidrólisis enzimática de
Ru-APA de 9,8 x 10^{7} min^{-1}M^{-1}.
Las propiedades ECL de mezclas equimolares de
Ru(bpy)_{3}^{2+} y ampicilina (hidrolizadas o no
hidrolizadas) se compararon con la misma concentración del
conjugado de Ru-APA (hidrolizado o no hidrolizado).
En experimentos separados, se hidrolizaron 6-APA y
Ru-APA por bien NaOH 50 mM (hidrólisis básica) o
-lactamasa I 3,8 \muM a partir de Bacillus cereus
(hidrólisis enzimática).
Para hidrólisis básica, se añadieron 50 ml de
NaOH 5 M a 1,0 ml de disoluciones de agua desionizada que contenían
bien Ru-APA 23,0 \muM o una mezcla de APA 23,0
\muM y Ru(bpy)_{3}^{2+} 23,0 \muM. Siguiendo a
incubaciones de 30 minutos, las disoluciones se neutralizaron con
50 \mul de HCl 5 M. Para experimentos de contrapartida no
hidrolizados, se añadieron 50 \mul de H_{2}O 5 M a disoluciones
de bien Ru-APA 23,0 \muM o una mezcla de APA 23,0
\muM y Ru(bpy)_{3}^{2+} 23,0 \muM. Siguiendo a
incubaciones de 60 minutos, se añadieron 50 \mul de NaCl 5 M a
estas disoluciones. Los resultados mostrados en la Figura 11
demuestran: (1) que la hidrólisis de 6-APA
(conjugado o no conjugado) por bien NaOH o -lactamasa causa un
aumento en la ECL y (2) que el aumento en la ECL causado por la
hidrólisis es espectacularmente mayor cuando el complejo de rutenio
que emite luz está acoplado mediante enlaces covalentes a
6-APA. Con hidrólisis básica, la ECL aumentó 1,9
veces cuando se hidrolizó 6-APA (no conjugado) en
una mezcla de 6-APA y
Ru(bpy)_{3}^{2+} mientras la ECL aumentó 13,2
veces cuando se hidrolizó Ru-APA (conjugado).
Similarmente con hidrólisis enzimática, la ECL aumentó 1,4 veces
cuando se hidrolizó 6-APA (no conjugado) en una
mezcla de 6-APA y Ru(bpy)_{3}^{2+}
mientras la ECL aumentó 31,8 veces cuando se hidrolizó
Ru-APA (conjugado). Los datos que establecen estas
conclusiones se encuentran en la Figura 11, que muestra la
luminiscencia medida experimentalmente de (de izquierda a
derecha):
\vskip1.000000\baselineskip
Ru(bpy)_{3}^{2+} sólo;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
6-APA no hidrolizado;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
NaOH-6-APA hidrolizado;
Ru-APA no hidrolizado;
NaOH-Ru-APA
hidrolizado;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
6-APA no hidrolizado;
Ru(bpy)_{3}^{2+} más
-lactamasa-6-APA hidrolizado;
Ru-APA no hidrolizado y
-lactamasa-APA hidrolizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Este trabajo demuestra claramente que la
conjugación del 6-APA y el complejo de rutenio
electroquimioluminiscente da como resultado efectos
intramoleculares que aumentan la electroquimioluminiscencia cuando
se hidroliza el anillo de -lactama. Además, la comparación con los
resultados descritos en el Ejemplo 2 para el conjugado de
ampicilina muestra que la hidrólisis de Ru-APA da
como resultado una señal electroquimioluminiscente mucho mayor que
la hidrólisis de Ru-AMP. Debido a que el átomo de
rutenio está más próximo al anillo de -lactama en
Ru-APA que en Ru-AMP, estos
resultados indican que puede haber un efecto crítico de la distancia
entre el complejo de rutenio y el anillo de -lactama. Otros
conjugados de lactama - Ru(bpy)_{3}^{2+} aún no
ensayados- pueden dar un cambio incluso más espectacular en la
electroquimioluminiscencia en la hidrólisis de -lactama.
La Figura 12 muestra que se puede detectar la
hidrólisis de concentraciones muy bajas de Ru-APA,
por ECL. Más específicamente, la Figura 12 muestra el efecto de la
concentración de Ru-APA no hidrolizado (círculos
cerrados) e hidrolizado (círculos abiertos) en la
electroquimioluminiscencia medida experimentalmente. Se encontró
que el límite de detección inferior era 50 nM (una lectura del
instrumento de -33 cuentas ECL relativas para
Ru-APA hidrolizado frente a una media de -648
cuentas ECL relativas para Ru-APA no hidrolizado
(conjugado)). Esto se compara favorablemente con el límite inferior
para la detección de la hidrólisis de ampicilina (no conjugada) que
fue 50 \muM (en presencia de Ru(bpy)_{3}^{2+} 10
\muM).
Se realizó un experimento para cuantificar la
ventaja de conjugar una -lactama al marcador ECL,
Ru(bpy)_{3}^{2+}. El aumento en ECL en la
hidrólisis de Ru-APA 10 \muM se comparó con una
curva patrón de ECL en que se hidrolizaron diversas concentraciones
de 6-APA (no conjugado) en presencia de
Ru(bpy)_{3}^{2+} 10 \muM. Por extrapolación de
la curva patrón de 6-APA, los resultados (Figura 13)
demuestran que el cambio de ECL en la hidrólisis de
Ru-APA 10 \muM (conjugado) es equivalente al
cambio de ECL en la hidrólisis de 6-APA 1.250 \muM
(no conjugado) en presencia de Ru(bpy)_{3}^{2+}
10 \muM. Esto demuestra que la conjugación de
Ru(bpy)_{3}^{2+} y 6-APA da como
resultado un aumento de 125 veces en el cambio de ECL visto durante
la hidrólisis de 6-APA. Los datos que establecen
estas conclusiones se encuentran en la Figura 13, que muestra una
comparación de efectos de electroquimioluminiscencia de
Ru-APA (conjugado) a
Ru(bpy)_{3}^{2+} más 6-APA (no
conjugado). Los triángulos representan la
electroquimioluminiscencia de Ru-APA no hidrolizado
10 \muM (triángulos abiertos) e hidrolizados (triángulos
cerrados). Los círculos representan los efectos
electroquimioluminiscentes de 6-APA no hidrolizado
(círculos cerrados) e hidrolizado (círculos abiertos)
(0-1.000 \muM) en presencia de
Ru(bpy)_{3}^{2+} 10 \muM. La extrapolación en
la Figura 13 indica que el cambio en la electroquimioluminiscencia
en la hidrólisis de Ru-APA 10 \muM es equivalente
al cambio de la electroquimioluminiscencia en la hidrólisis de
6-APA libre 1.250 \muM en presencia de
Ru(bpy)_{3}^{2+} 10 \muM.
Se han preparado previamente conjugados de
Anticuerpo-Lactamasa (Yolken et al., J.
Immunol. Meth. 73 (1.984) 109-123; Svensson et
al., Bioconj. Chem. 5 (1.994) 262-267). Se
preparan normalmente conjugados usando agentes de reticulación
bifuncionales comercialmente disponibles tales como
Sulfo-SMCC
(4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato
de sulfosuccinimidilo) que se usó en la presente memoria. Se han
establecido y también se podían usar otros métodos de unión
mediante enlaces covalentes de dos proteínas. Cualquier método es
satisfactorio mientras el anticuerpo y la enzima permanezcan
biológicamente activos después de la conjugación.
Se disolvió -lactamasa (3,7 mg) en 0,500 ml de
disolución salina tamponada de fosfato (PBS, por sus siglas en
inglés). Se disolvió sulfo-SMCC (5 mg) en 1,500 ml
de PBS. Se mezclaron las disoluciones de -lactamasa y
Sulfo-SMCC y se permitió que reaccionaran durante 45
min, a temperatura ambiente.
Un anticuerpo monoclonal producido contra el
hapteno RT1 (5 mg) se intercambió en tampón en PBS usando un
concentrador Centricon 30 (Amicon). Se disolvió ditiotreitol (DTT, 5
mg) en PBS, después se mezcló con el anticuerpo
anti-RT1 para dar un volumen total de 1,300 ml. La
mezcla se incubó durante 30 min, a temperatura ambiente, para
permitir que el DTT redujera los enlaces disulfuro de RT1.
Las proteínas en las dos mezclas de reacción
descritas anteriormente se desalaron usando columnas Sephadex
G-25M PD-10 (Pharmacia) que se
habían equilibrado previamente con PBS. Las proteínas recuperadas se
cuantificaron espectrofotométricamente a 280 nm. Se encontró que
los rendimientos eran 1,0 mg de -lactamasa y 3,1 mg de anticuerpo.
Las disoluciones de proteínas se mezclaron después dando una
relación molar 1,5:1,0 de -lactamasa a anticuerpo. La disolución de
proteínas se rotó a 4 C, durante 22 h, para permitir que se formara
el conjugado de enzima -
anticuerpo. Siguiendo a la reacción, la mezcla se cromatografió en una columna Sephacryl S-300 (Pharmacia). Se obtuvieron tres picos de proteínas principales. Debido a que la separación cromatográfica fue por tamaño, se esperaba que el primer pico que eluyera de la columna fuera el conjugado de enzima-anticuerpo.
anticuerpo. Siguiendo a la reacción, la mezcla se cromatografió en una columna Sephacryl S-300 (Pharmacia). Se obtuvieron tres picos de proteínas principales. Debido a que la separación cromatográfica fue por tamaño, se esperaba que el primer pico que eluyera de la columna fuera el conjugado de enzima-anticuerpo.
Se puede llevar a cabo un inmunoanálisis ECL
usando un conjugado de -lactamasa-anticuerpo bien
con una mezcla no conjugada de Ru(bpy)_{3}^{2+} y
un antibiótico de -lactama (tal como APA o Pen G) o preferiblemente
con un conjugado de
Ru(bpy)_{3}^{2+}-lactama (tal como
Ru-APA). Se prefiere usar un sistema de substrato
ECL conjugado debido a que la hidrólisis de substratos marcados de
Ru(bpy)_{3}^{2+} se detecta mucho más
sensiblemente por ECL que las mezclas del substrato y
Ru(bpy)_{3}^{2+} y el substrato -lactamasa, Pen
G.
En la presente memoria, se ensayó un
enzimoinmunoanálisis ECL usando un conjugado de
anticuerpo-enzima (anticuerpo
anti-RT1 unido a -lactamasa como se describe en el
Ejemplo 4). La presencia del analito se indicó por la porción
-lactamasa del conjugado, que hidrolizó la penicilina, Pen G, que a
su vez causó que Ru(bpy)_{3}^{2+} emitiera luz
por electroquimioluminiscencia. El análisis se llevó a cabo en una
placa de 96 pozos y se midió ECL por transferencia de los
contenidos de los pozos en tubos de ensayo que se leyeron en un
Analizador ORIGEN®.
El analito (el hapteno de RT1 conjugado a
Albúmina de Suero Bovino (BSA, por sus siglas en inglés)) se incubó
durante 2 horas, a 37 C, en una placa de 96 pozos a 0; 0,2; 2,0 y
10,0 \mug/ml para permitir que se adhiriera a la placa. La placa
se lavó después tres veces con PBS. A cada pozo se añadieron después
200 \mul de BSA al 3% en PBS y la placa se incubó durante
aproximadamente 1 hora, a 37C. A cada pozo se añadieron 50 \mul
de fracciones cromatográficas del Ejemplo 4. Se sospecha que las
fracciones del primer pico de proteínas que eluye es el conjugado
de anticuerpo-enzima mientras se sospecha que las
fracciones de los últimos picos de proteínas que eluyen son bien
anticuerpo libre o enzima libre, ninguno de los cuales debería dar
una señal ECL en este experimento. La placa se incubó durante la
noche, a 4 C, para permitir que el conjugado de anticuerpo - enzima
se uniera al analito. La placa se lavó después tres veces con PBS
que contenía Tween al 0,05%. A cada pozo se añadieron 75 \mul de
Pen G 10 mM y la placa se incubó durante 30 minutos, a temperatura
ambiente, para permitir que cualquier -lactamasa presente
hidrolizara el Pen G. Siguiendo al periodo de incubación, se
transfirieron 25 \mul de cada pozo a tubos de ensayo. A cada tubo
se añadieron 25 \mul de Ru(bpy)_{3}^{2+} 120
\muM y 250 \mul de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0. Se leyó
después la ECL de las mezclas en un Analizador ORIGEN®.
Los resultados del enzimoinmunoanálisis ECL se
muestran en la Figura 14. La proteína usada en la Línea 1 fue el
conjugado de anticuerpo-enzima esperado. Como se
puede ver en la Figura 14, las cuentas ECL en la Línea 1 aumentan
con la concentración de analito creciente. Esto indica que el
conjugado de anticuerpo-enzima unido al analito y
Pen G hidrolizado a una forma que fomenta la ECL de
Ru(bpy)_{3}^{2+}. Incluso fue detectable la
concentración más baja de analito ensayada, 0,2 \mug/ml. Las otras
líneas (2-4) muestran otras fracciones
cromatográficas que representan presumiblemente anticuerpo libre y
enzima libre. Estas líneas, que se pueden considerar experimentos
de control muestran poco aumento en ECL con concentraciones
crecientes de analito. En resumen, el conjugado de
anticuerpo-enzima se usó en un enzimoinmunoanálisis
para detectar sensiblemente un analito usando una mezcla no
conjugada de Pen G y Ru(bpy)_{3}^{2+}. Debido a
que el substrato conjugado de Ru(bpy)_{3}^{2+}
-lactama es mucho más sensible en la detección de la hidrólisis de
-lactama por ECL que una mezcla de
Ru(bpy)_{3}^{2+} y -lactama, los resultados
descritos en la presente memoria se pueden mejorar probablemente
enormemente usando un substrato conjugado.
Claims (10)
1. Un método para la detección y/o la medición
cuantitativa de analito que comprende:
(I) poner en contacto (i) un anticuerpo
conjugado con enzima, específico para dicho analito, con (ii) dicho
analito en presencia de un detector electroquimioluminiscente y un
substrato enzimático, en el que dicha enzima convierte dicho
substrato en un producto y en el que (a) una mezcla de dicho
substrato y dicho detector electroquimioluminiscente o un conjugado
de dicho substrato y dicho detector electroquimioluminiscente en la
aplicación de energía eléctrica emite electroquimioluminiscencia y
(b) una mezcla de dicho producto y dicho detector
electroquimioluminiscente o un conjugado de dicho producto y dicho
detector electroquimioluminiscente, en la aplicación de energía
eléctrica emite electroquimioluminiscencia y la
electroquimioluminiscencia emitida por (a) difiere de la emitida por
(b);
(II) aplicar energía eléctrica a dicho detector
electroquimioluminiscente y
(III) detectar o medir
electroquimioluminiscencia como una señal de si o en qué cantidad
está presente el analito en la muestra.
2. El método según la reivindicación 1, en el
que la enzima es \beta-lactamasa, proteasa o una
oxidorreductasa.
3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en
el que el substrato es un antibiótico, un péptido o nicotinamida
adenina dinucleótido.
4. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el detector (ECL)
electroquimioluminiscente y el substrato enzimático están
conjugados.
5. El método según la reivindicación 4, en el
que el detector ECL se selecciona del grupo que consiste en:
rubreno, 9,10-difenilantraceno, compuestos que
contienen rutenio y compuestos que contienen osmio.
6. El método según la reivindicación 4, en el
que el detector ECL es quelato de trisbipiridina rutenio II.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que la mezcla de
substrato y detector ECL es débilmente electroquimioluminiscente y
la mezcla de producto y detector ECL es fuertemente
electroquimioluminiscente.
8. Un estuche para medir un analito en una
muestra que comprende cantidades medidas previamente de anticuerpo
conjugado con enzima, específico para dicho analito y cantidades
medidas previamente de un detector electroquimioluminiscente y un
substrato enzimático y un patrón de referencia en el que las
cantidades medidas previamente son suficientes para realizar una
única medición de la muestra y en el que dicha enzima convierte
dicho substrato en un producto y en el que (a) una mezcla de dicho
substrato y dicho detector electroquimioluminiscente o un conjugado
de dicho substrato o dicho detector electroquimioluminiscente en la
aplicación de energía eléctrica emite electroquimioluminiscencia y
(b) una mezcla de dicho producto y dicho detector
electroquimioluminiscente o un conjugado de dicho producto y dicho
detector electroquimioluminiscente, en la aplicación de energía
eléctrica emite electroquimioluminiscencia y la
electroquimioluminiscencia emitida por (a) difiere de la emitida por
(b).
9. El estuche según la reivindicación 8, en el
que el detector electroquimioluminiscente y el substrato enzimático
están conjugados.
10. El estuche según las reivindicaciones 8 ó
9, en el que la mezcla de substrato y detector ECL es débilmente
electroquimioluminiscente y la mezcla de producto y detector ECL es
fuertemente electroquimioluminiscente.
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