JPH04507194A - 化学発光組成物、化学発光法、及び分析的検定におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学発光組成物、化学発光法、及び分析的検定におけるその使用 ［発明の詳細な説明］ 本発明は、長時間持続的に発光し、がっ、高量子収量を有する発光組成物又は個 発光用組成物、発光又は副発光検定、特に発光分析方法及び発光免疫検定法、並 びに上記の検定を容易に行うために作られた診断キットに関する。

さらに、本発明は、アクリジン誘導体の検出及び定量、還元性化合物の検出及び 定量、微少容量試料のｐＨ測定、並びに免疫検定及びハイブリダイゼーション反 応の定量に関する。

放射線の検８に基づく分析方法は、科学の多くの分野で広範囲に用いられてきた 。これらの方法の中で最も一般的なものとしては、の放射性物質が検出され定量 されるが、これらのトレーサーの操作上の多くの危険並びに半減期に関連した制 限は無視できない。

同位元素の使用に伴う固有の欠点を回避するために、放射性同位されてきた。

発光は、化学反応によって生じる光の放出である。蛍光及び燐光（遅延蛍光）に 対して、化学発光は、分子の励起のための外部エネルギー励起源が必要ではない 。化学発光は、分子が電子励起状態におかれるエネルギー放出性の化学反応によ る光の発生と定義される。これらの励起分子の基底状態エネルギーレベルへの緩 和は、連続過程ではない：むしろ、安定レベルに達するまで、“°電子゛又は“ 光子”と呼ばれる小束のエネルギーが周囲に放出される。低エネルギー状態を励 起状態に転換するのに要するエネルギーが十分である場合（４０ｋｃａｌ／ｍｏ 　１〜７０ｋｃａｌ／ｍｏ　ｌ）には、可視スペクトルの光の放出とともに基底 状態エネルギーレベルへのさらなる緩和が起きる。

化学発光においては、エネルギーの増大及びその後の緩和は、主として酸化及び 酸素添加反応に伴って観察される。いくつかの化合物は、励起−重環状態形成時 に化学発光性になる。これらの励起状態が化学反応において生成される効率を、 これらの反応の“量子収量°゛又は“量子収率”と定義する。量子収量又は収率 は、発光分子数を反応分子数で割って得られる数値を指す。この比率が１に等し い場合、発光反応は最適である（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｔ、Ｐ、。

Ｋｒ１ｃｋａ、Ｌ、Ｊ、、Ｃｏｕｔｅｒ、Ｔ、Ｊ、Ｍ、ａｎｄＴｈｏｒｐｅ　Ｇ 、Ｈ，Ｇ、、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｉｔｓ　ｐｏ ｔｅｎｔｉａｌ　ｉｎ　ｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃ１ ｉｎｉｃＣ１１ｎｉｃａｌＣｈｅ　２５：１５３１．１９７９）、これは典型的 には、酵素が化学発光反応を触媒する、生体に見られる生物発光反応を伴う場合 である。典型的な例は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応である。その高量子 収量のため、この種の反応は詳細な研究の主題であったし、生化学及び臨床検定 において広（用いられている（ＤｅＬｕｃａ　Ｍ、ａｎｄ　ＭｃＥｌｒｏｙＷ、 Ｄ、、Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｏｗｉｃｋ 　Ｓ、Ｐ、ａｎｄ　Ｋａｐｌａｎ　Ｎ、Ｏ，。

ｅｄｓ、）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＶｏｌ、５７：３ ．　１９７８；Ｋｒ１ｃｋａ　Ｌ、Ｊ、ａｎｄＴｈｏｒｐｅ　Ｇ、Ｈ，Ｇ、、Ｃ ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔａｎｄ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｍｅ ｔｈｏｄｓ　１ｎａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｎａｌｙｓｔ ：１２７４．１９８３）。

い（つかの有機化合物は、酸化又は酸素添加により化学発光を生じることが知ら れている。最もよく知られた例の一つがルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒ ドロ−１，４−フタラジンジオン）である。酸化後、ルミノールは、一連の中間 物質を経て、緩和中に光を放出する励起アルファーアミノフタル酸ジ陰イオンに 変換する。

発光波長は４３０ｎｍであり、量子収量は約０．０１である。

面白いことに、ルミノール依存化学発光はホースラディツシュ（西洋わさび）ペ ルオキシダーゼにより触媒されることが判明した（Ａｒａｋａｗａ　Ｈ，、Ｍａ ｅｄａ　Ｍ、、ＴＳｕｊ　ｉ　Ａ。

ａｎｄ　Ｋａｍｂｅｇａｗａ　Ａ、、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｅ ｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆ　ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏ ｓｔｅｒｏｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　５ｕｌｆａｔｅ　ｕｓｉｎｇ　ｐｅｒｏｘｉ ｄａｓｅ　ａｓ　ｔｈｅｌａｂｅｌ、５ｔｅｒｏｉｄｓ　２８：４５３，１９８ １）、この酵素は、比色反応により通常検定される酵素免疫検定の標識としても しばしば用いられる（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ　Ｌ、Ａ、。

Ｈａｒｄｙ　Ｐ、Ｈ，Ｊｒ、、ＣｕｃｕＬｉｓ　Ｊ、Ｊ、ａｎｄＭｅｙｅｒ　Ｈ ，Ｇ、、Ｔｈｅ　ｕｎｌａｂｅｌｅｄ　ａｎｔｉｂ。

ｄｙ−ｅｎｚｙｍｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　５ｏｌｕｂｌ ｅ　ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｍｐｌｅｘ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓ ｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄ ａｓｅ）ａｎｄ　ｉｔｓ　ｕｓｅ　ｉｎ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　 ５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、１８： ３１５，１９７０）、ルミノール−過酸化水素反応に及ぼすその触媒作用を利用 して、化学発光によってホースラディツシュペルオキシダーゼを検出するための 試みがなされてきた。残念ながら、この方法で生じる化学発光は光量が低いのが 特徴であり、したがって日常的な分析用途には適さない。しかしながら、この種 の化学発光は、検定混合物中にある種の“増強剤（エンハンサ−）″分子を用い ることにより、少なくとも１００倍高くなり得ることが見出された。見出された 最初の増強剤はホタルルシフェリンであった。その後、その他のさらに強力な増 強剤、特に６−ヒドロキシベンゾチアゾール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェ ニルフェノール、及びｌ−ブロモ−２−ナフトールが見出された（Ｋｒｉｃｋａ 　Ｌ、Ｊ、、Ｔｈｏｒｐｅ　Ｇ、Ｈ，Ｇ、ａｎｄＷｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｔ、Ｐ、 Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｏｒ　ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ 　ａｓｓａｙ、欧州特許出願第１１６４５４号、１９８３）。これらの増強剤の 導入は、ルミノール及び過酸化水素を用いる増強化学発光免疫検定方法（標識と してペルオキシダーゼを用いる）の開発を最終的に導いた（欧州特許出願第８７ ９５９号）。この系は、Ａｍｅｒｓｈａｍにより“アマ−ライト（Ａｍｅｒ　ｌ 　ｉ　ｔｅ）”の商品名で広（市販されている。

この種の発光分析は、実施が容易であり結果が迅速に得られるけれども、ルミノ ールをベースとした分子は、その他の分子と結合させると、量子収量の実質的減 少を示す（Ｗｅｅｋｓ　１．ａｎｄＷｏｏｄｈｅａｄ　Ｊ、Ｓ、Ｃｈｅｍｉｌｕ ｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏａ ｓｓａｙ７：８２，１９８４；Ｗｅｅｋｓ　１．、Ｂｅｈｅｓｈｔｉｌ、、Ｍｃ Ｃａｐｒａ　Ｆ、ｅｔ　ａｌ、Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍｅｓｔｅｒｓ　ａｓ　ｈｉ ｇｈ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　１ａｂｅｌｓｉｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｃ１ １ｎ、Ｃｈｅｍ、２９：１４７４．１９８３）。この方法では、”アマ−ライト ”系の使用はホースラディツシュペルオキシダーゼの検出に限定される。

近年、発光検定の開発のためにアクリジンベースの分子の使用に関心が高まって いる。ルミノールベースの分子に対してアクリジンベースの分子は、化学発光反 応の性質の差異による量子収量のいかなる減少をも伴わずに、容易に蛋白質と結 合し得る（Ｗｅｅｋｓ　１．、Ｂｅｈｅｓｔｉ　１．、ＭｃＣａｐｒａＦ、ｅｔ 　ａｌ、Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ　ｅｓｔｅｒｓ　ａｓｈｉｇｈ　５ｐｅｃｉｆｉ ｃ　１ａｂｅｌｓ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎ。

ａｓｓａｙｓ、Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、２９　：１４７４゜１９８３）。アルカリ 性条件下では、典型的なアクリジン塩様ビス−Ｎ−メチル−アクリジンジ硝酸塩 （ルシゲニン）は、過酸化水素によって２分子のＮ−メチルアクリドンに酸化さ れ、このうちの１つは励起状態で生成される。この励起状態の緩和は、４７０ｎ ｍでの光の放出により達成される（Ａｌｉｅｎ　Ｒ，Ｃ，ＩｎＬｉｑｕｉｄ　Ｓ ｃｉ、ｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ＋Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃ ａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ。

ｐｍｅｎｔｓ、Ｖｏｌ、２．Ｐｅｎｇ　Ｃ，Ｔ、、Ｈｏｒｒｏｃｋｓ　Ｄ、Ｌ、 ａｎｄ　Ａｌｐｅｎ　Ｅ、Ｌ、、（Ｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ：３７：１９８０）。

同じ原理に基づいて、ジオキセタン中間物質を経る協奏的多重結合開裂に伴って 光を放出してＮ−メチルアクリドンの振動状態が励起された分子を生成するアク リジンベースのエステルが合成されてきた（ＭｃＣａｐｒａ　Ｆ、、Ｃｈｅｍｉ ｌｕｍＬｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｐｒ ｏｇ。

Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、８：２３１，１９７７）、光子の放出前に、励起生成分子が それによって元の物質から解離されることに留意することは重要である。この方 法では、エステルのアルコール部分の置換に関するいかなる構造的修飾も、最終 光放出に影響を及ぼさない（Ｗｅｅｋｓ　１．、Ｂｅｈｅｓｔｉ　１．、ＭｃＣ ａｐｒａＦ、ｅｔ　ａｌ、Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ　ｅｓｔｅｒｓ　ａｓｈｉｇｈ 　５ｐｅｃｉｆｉｃ　１ａｂｅｌｓ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎ。

ａｓｓａｙｓ、Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、２９　：１４７４゜１９８３）。

他の人々は、酵素を作用させると切断されて遊離ジオキセタン中間物質を生じる 安定なジオキセタン化合物を有する物質を合成している。この方法においては、 光放出の割合は、酵素作用に依っている（欧州特許比願第２５４０５１号）。

アリールアクリジニウムエステルのＮ−スクシニミジルエステルへのカップリン グは、免疫学的活性の損失をほとんど伴わない抗体の標識のために首尾よ（用い られてきた（欧州特許出願第２６３６５７号）。本方法はそれ自体、Ｃ１ｂａ　 Ｃｏｒｎｉｎｇから“マジックライト（Ｍａｇｉｃ　Ｌｉｔｅ）”という商品名 で、現在市販中のいくつかの検定に適用される。

”アマ−ライト”系も“マジックライト”系も、主として、それらの系において は、励起時の発光がいつも短時間である：即ち、アクリジニウムエステル分子を 用いると“閃光”のみが生じ（“マジックライト”系）、ホースラディツシュペ ルオキシダーゼ触媒性ルミノール依存性化学発光（“アマ−ライト”系）のシグ ナルは。

増強剤の存在下でさえ、３０分間に亘って３０％まで減少する、という事実のた めに、日常的分析における広い用途は見出されなかった（Ｅｄｗａｒｄｓ　Ｊ、 Ｃ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ａｍｅｒｌｉｔｅｓｙｓｔｅｍ、Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎ：Ｐ ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ａ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ。

Ｍｉｎｓｔｅｒ　Ｌｏｖｅｌｌ、ＵＫ、１９８５．Ｔｈｅ　ＭｅｄＬｃｉｎｅ　 Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ。

Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　１８）。

最終的に、それらの特定の態様のために、両タイプの検定とも、シグナルの検出 に、ルミノメータ−のような特別な計器の使用を必要とする。

本発明は、一方では従来技術の化学発光系に固有の問題を克服し、他方で分析法 における広範囲の用途を提供する。

その−面において、本発明は光シグナルの放出が長時間持続し、高量子収量を有 する化学発光を提供する。

別の面において、本発明は、水性環境を少なくし、試料を少なくする利点を与え る化学発光組成物を提供する。

別の面において１本発明は、酵素を必要とせず、安定性及び貯蔵性の問題がない 化学発光組成物を提供する。

別の面において、本発明は、特に微少容量試料を用いて、ｐＨ変化を検出し、ｐ Ｈを測定し得る化学発光組成物を提供する。

別の面において、本発明は、種々の化学又は生化学的化合物の定量及び／又は定 性分析法を提供する。

別の面において、本発明は、特に微少容量試料を用いて、アクリジン誘導体を検 出及び定量し得る化学発光組成物を提供する。

別の面において、本発明は、特に微少容量試料を用いて、還元剤を検出及び定量 し得る化学発光組成物を提供する。

別の面において、本発明は、特に微少容量試料を用いて、免疫検定及びハイブリ ダイゼーション反応を定量し得る化学発光組成物を提供する。

別の面において、本発明は、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキ シダーゼ活性のような酵素活性を検出及び定量し得る化学発光組成物を提供する 。

別の面において１本発明は、光シグナルの検出に特別な計器を必要としない化学 発光検定の実施を可能にする化学発光組成物を提供する。

これらの目的は全て、以下のニ ー好ましくは水性である、アクリジン誘導体含有溶液；−水混和性アルコール； −ｐＨの適切な条件によって存在しても存在しな（でもよい還元剤（但し、ここ で、該アルコールは、化学発光反応中に形成されるかも知れない、アクリジン誘 導体由来のアルコール、アクリダノール及びアクリダノール由来のアルコールと は異なる。）を含有する均一なヒドロアルコール系化学発光組成物によって達成 された。

アクリジン誘導体は、水溶性又はアルコール可溶性であるか、あるいは均一なヒ ドロアルコール組成物に溶解し得る。

“化学発光組成物”という表現は、上記のすべての成分（すなわち、アクリジン 誘導体、水混和性アルコール及び、要すれば還元剤）を混合した場合に、これら の成分間の化学発光反応により光を放出し、この発光は、励起状態から基底状態 に緩和しゃすい中間体を生成するアクリジン誘導体から生じたと思われる、もの を意味する。

“均一なヒドロアルコール化学発光組成物”という表現は、該組成物がアルコー ル及び水性溶液を包含し、ここで、アルコールは、水性溶液中で水混和性であっ て、均質水性相を生じる、ことを意味する。

“水混和性アルコール”という表現は、アルコールが水溶性であるか、又は水溶 性でない場合でも、化学発光反応が起こるのに十分に安定な水中均一懸濁液を形 成しうることを意味する。

非水溶性アルコールの場合、水中アルコール懸濁液は、好ましくは化学発光反応 が持続するのに十分長い期間に亘って、化学発光が起きるのに十分に安定でなけ ればならない。水中アルコール懸濁液は、化学発光組成物の不安定性による発光 の妨害がないように、少なくとも発光と同じぐらいの長さの時間に亘って安定で あることがより好ましい。

用いるアルコールが水溶性でない場合、均質ヒドロアルコール溶液は、アルコー ルを含有する水性溶液を振盪することにより２例えば、音波振動を与えることに より得ることができる。

このような場合、均質ヒドロアルコール溶液の安定性は、乳化剤のような安定剤 によって、その安定剤がアクリジン誘導体の分子構造を、そして特に光放出を生 じる中間励起化合物を妨害しない限り、維持される。

アルコールは、第一、第二、又は第三脂肪族アルコール、複素環式アルコール、 あるいはポリアルコールである。

糖類はアルコールの定義から除外されるが、メルカプトアルコール類は含まれる 。

この形態では、本発明は、以下のニ ー光電子増倍管の前面位置での試薬の注入のために特別な計器を必要とせず、し たがって酵素結合免疫溶剤検定に現在用いられている程度にまで検定の複雑さを 低減するような、高量子収量の化学発光反応及び最適長時間持続性発光； −ラジオイムノアッセイを用いて通常得られるものと等しいか又はそれより良い 検定感度； が特徴である。

本発明の化学発光組成物は、約５０分間以上持続し、そして約１０日間持続し得 る発光を提供する。本発明の化学発光組成物に起因する光シグナルは、全発光期 間中に達成された最大値で実質的に一定なままである。

本発明の化学発光組成物の量子収量は、古典的化学発光反応に用いられるアクリ ジン誘導体の量子収量よりも高く、ｏ、ｏｏｓを越え、特に０゜０１を越え、さ らには０．０５を越える。

光シグナルの強度は、約１００から約６Ｘ１０’　（分当たりのカウント数（ｃ 、ｐ、ｍ、）で表す）まで変化する。

本発明の化学発光組成物は、 一水性相のｐＨが適切であって、化学発光反応が起こり得るという条件で、還元 剤の非存在下でアルコールを含有するか、又は、−還元剤の存在下でアルコール を含有する。

本発明の組成物が還元剤を含まない場合、水溶液のｐＨはアルコールそれ自体が 化学発光反応を引き起こすようなものでなければならない。水溶液のｐＨけ、塩 基を添加することによりアルコールが化学発光反応を引き起こすよう調節し得る 。

アクリジン誘導体の分子構造及び特に発光を生じる中間励起化合物を妨害しない 限り、塩基に関する制限はない。

化学発光組成物中に必要なアルコールの量は、アルコールの性質及び水溶液のｐ Ｈに依っており、ｐＨの減少関数であって、これはｐＨが高いほど必要なアルコ ールは少ないことを意味する。

水溶液のｐＨが、アルコールが化学発光反応を引き起こすのに適切でないような 場合には、還元剤が必要である。

本発明の組成物中に還元剤が存在する場合には、その還元剤は水溶液の一部であ る。

この場合、本発明の化学発光組成物は、以下のニー好ましくは水性である、アク リジン誘導体及び還元剤を含有する溶液； 一水混和性アルコール を包含すると定義される。

有益な態様によれば、本発明の化学発光組成物は、水溶液のｐＨがアルコールが それ自体で化学発光反応を引き起こし得るようなものである場合でさえ、アクリ ジン誘導体及びアルコールに加えて還元剤を包含する。このような組成物は感度 増大という利点を示す。

別の有益な態様によれば、本発明の化学発光組成物は、還元剤、アルコール、及 びアクリジン誘導体に加えて、ｐＨを増大するための塩基を包含する。このよう な組成物は、化学発光反応の感度を増大するという利点を示す。

本発明の化学発光組成物が関与し得る方法又は検定に依れば、水溶液のｐＨは、 還元剤を用いない場合は高ｐＨ範囲、あるいは還元剤を用いる場合は低ｐＨ範囲 であるのが有益である。

アクリジン誘導体の水溶液は、アクリジン誘導体が溶解される生物試料で構成さ れる。このような場合、水溶液のｐＨは、本発明の化学発光が還元剤を包含しな ければならないようなものである。

本発明に関与し得る生物学的試料としては、例えば：血液、脳を髄液、単個細胞 、唾液が挙げられる。

本発明の別の態様によれば、化学発光組成物は、水性緩衝液、例えば燐酸緩衝液 、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、ジェタノールアミン緩衝液、バルビタール緩衝液 等を包含する。

使用する適切な緩衝液は、アクリジン誘導体の分子構造、特に化学発光反応に関 与する中間化合物を妨害しないものである。

緩衝液はさらに、本発明の化学発光組成物が関与する検定又は方法を妨害しない ように適切でなければならない。

例えば、アルカリホスファターゼの酵素活性を検出及び定量するために化学発光 組成物を用いる場合は、燐酸緩衝液を使用しないのが適切である。

この水性緩衝液はそれ自体化学発光反応に欠くことのできないものではないが、 しかし本発明の化学発光組成物により生じる化学発光反応が関与する分析方法の ようないくつかの適用において有用である。

このような場合、緩衝液が存在すると、酵素の活性が最適なｐＨに制御できる。

本発明の化学発光組成物において、アクリジン誘導体は水溶性又はアルコール可 溶性であるか、あるいは均質ヒドロアルコール組成物に可溶性であって、励起状 態から基底状態に緩和しゃすい、そして反復して励起状態に戻りやすい中間分子 を生じることができなければならない。

例えば、アクリジン誘導体は、次式： （式中、２ｘ−又はＸ２−は負に荷電した対イオン（したがって上記の分子の正 電荷はＸの負電荷によって相殺される）、又は硝酸塩、硫酸塩、燐酸塩、塩素酸 塩の対イオンを表し：Ｒは１〜６個の炭素原子、特に１〜４個の炭素原子を有す る脂肪族鎖、特にＣＨ，を表わす） を有し、アクリジン誘導体が水溶性又はアルコール可溶性であるか、あるいは均 質ヒドロアルコール組成物に溶解し得る、そして好ましくは水溶性であるとすれ ば、フェニル環の少なくとも１つは場合により置換され、上記のアクリジン誘導 体は、好ましくはルシゲニンであるか、もしくは式： （式中、Ｒは上記と同様である）を有し、ここでアクリジン誘導体が水溶性又は アルコール可溶性であるか、あるいは均質ヒドロアルコール組成物に溶解し得る 、そして好ましくは水溶性であるとすれば、フェニル環の少なくとも１つは場合 により置換されているか。

もしくは式： （式中、Ｙ−は負に荷電した対イオン（したがって上記の分子の正電荷はＹの負 電荷によって相殺される）、例えばＦ　Ｓ　Ｏ、＋、ＮＯｘ−を表わし、 を表わす） を有し、ここでアクリジン誘導体が水溶性又はアルコール可溶性であるか、ある いは均質ヒドロアルコール組成物に溶解し得る、そして好ましくは水溶性である とすれば、フェニル環の少なくとも１つは場合により置換されるか、もしくは式 ：（式中、Ｒ＋は上記と同様である）を有し、ここでアクリジン誘導体が水溶性 又はアルコール可溶性であるか、あるいは均質ヒドロアルコール組成物に溶解し 得る、そして好ましくは水溶性であるとすれば、フェニル環の少なくとも１つは 置換されやすい、ものである。

ルシゲニンが、好ましいアクリジン誘導体である。

アルコールに関しては、好ましくはメルカプトアルコールとは異なる。

本発明の好ましい組成物においては、水混和性アルコールは、１〜６個の、好ま しくは１−〜４個の炭素原子を有する第一、第二、又は第三アルコール、特にメ タノール、エタノール、ｎ−プロパツール、インプロパツール、又はブタノール である。

メタノール、エタノール、又はプロパツールを用いる場合、アルコールは、好ま しくは水溶性であるとみなされ、一方ブタノールを用いる場合は、水混和性であ るとみなされる。

有益な水溶性アルコールは、ポリビニルアルコール、及びトリトン　ｘｌｏｏの 商標で市販されているアルコールである。

本発明の化学発光組成物が関与する方法によれば、水溶液のｐＨが約３の低さで ある場合はプロパツールが有益である。その結果、特にアルコールの容量が組成 物の総容量の９０％を示す場合には、還元剤を用いる必要はない。

本発明の化学発光組成物中の水溶液のｐＨの有益な範囲は、約０〜約１４、特に 約４〜約８、特に約６〜約７．６である。

このようなｐＨ範囲は、このような化学発光検定が関与し得る生物学的試料にお いて見出される。

還元剤は、アクリジン誘導体の分子構造、及び特に化学発光反応に関与する中間 化合物を妨害しないようなものでなければならない。

還元剤は、少な（とも０．２Ｖ、好ましくは少なくとも約０．３Ｖの酸化−還元 ポテンシャルを有するのが好ましい。

例えば、適切な還元剤はアスコルビン酸、マンノース、グルコース、ＮＡＤＨ又 はＮＡＤＰＨ，あるいはヒドロキノンである。

本発明の別の態様によれば、化学発光組成物は、アクリジン誘導体、要すれば還 元剤、要すれば塩基、及び要すれば緩衝液を含有する水性溶液に加えて、酵素を 包含する。

酵素はウレアーゼ、又はアルカリホスファターゼであり得る。

別の態様によれば、本発明の化学発光組成物は、酵素に加えて、酵素のための基 質を包含することができる。

別の態様によれば、本発明の化学発光組成物は、測定及び定量すべき成分と接触 させた場合にｐＨを増大し得る物質を含有することができる。

例えば、本発明の化学発光組成物は、アミノ酸と接触した場合に、ＮＨｓの遊離 により測定されるべきｐＨ増大物質になるニヒドリンを包含することができる。

本発明のこのような化学発光組成物は、種々の分析法に有用である。

本発明の化学発光組成物の異なる成分は、いかなる時も指定濃度で存在し得るか 、又はその場で（ｉｎ　５ｉｔｕ）その活性形態で生じ得る。

アクリジン誘導体の場合、カプセル封入が化学発光反応を妨害しないならば、例 えば高分子カプセル封入体のようなカプセル封入形態、例えばリポソーム、ニオ ソームからｉｎ　５ｉｔｕで遊離される。

アルコールの場合、アルコールは化学反応によって１ｎＳｉｔｕで生成されても よい。

還元剤の場合、水溶液のｐＨが７．８に達し、この値を超えて上がる場合に還元 剤となるヒドロキノンのようなｐＨ依存剤を用い得る。

本発明の有益な化学発光組成物を以下に示す；−アクリジン誘導体：約１０−４ 〜約１０−”　Ｍ／ｌ　、特に約１０−４〜約１０−’Ｍ／　１の濃度の約０． ０１％〜約９９．９９％（容積）、特に約１０％〜約９０％； −アルコール（市販の純粋アルコール）：約０．５％〜約９９．５％（容積）、 特に約１０％〜約９９．５％。これらのパーセンテージは全て容積で表わし、濃 度は本発明の化学発光組成物の総容積に対して表わす。

本発明の別の好ましい化学発光組成物は、以下のニーアクリジン誘導体：約１０ −４〜約１．０　”　Ｍ／　１の濃度範囲の約０．０１％〜約９９．９９％、特 に約ｌＯ％〜約９０％（容積）−アルコール（純粋アルコール）：約１０％〜約 ９９．５％（容積）、特に約１０％〜約９０％； 一還元剤：約ＬＯＯｎｇ／ｍ１〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度の約０．１％〜約９９ ．９％（容積） を包含する。

化学発光組成物の温度は中程度が好ましく、約り０℃〜約５０℃の範囲、好まし くは室温である。本発明の化学発光組成物の温度は、アルコールの蒸発を防ぐた めにその沸点を下回るのが好ましい。

本発明の化学発光組成物を調製するために、任意の順番に異なる成分を一緒に集 める。即ちアクリジン誘導体の（及び要すれば還元剤及び／又は要すれば塩基の ）水性溶液（好ましくは緩衝させた）、及びアルコールを、種々の成分の添加の いかなる好ましい順番を用いずに、−緒に混合する。

しかしながら、本発明の化学発光組成物を酵素反応を伴う検定に用いる場合には 、アルコールを溶液、好ましくは水性溶／（！（アクリジン誘導体、酵素、ある いは還元剤、及び緩衝液を含有）に添加するのが有利であって、その場合、酵素 反応は適切な所望の状態に達していたか、又はアルコールの存在が酵素反応を停 止させるために終了される。

本発明の化学発光組成物は、発光が以下の：１、還元剤及びアルコールが過剰に 存在する場合は、アクリジン誘導体の量； ２、アクリジン誘導体及びアルコールが過剰に存在する場合は、還元剤の量： ３、アクリジン誘導体及び還元剤が過剰に存在する場合は、アルコールの性質及 び濃度； ４、水性緩衝液のｐＨ に依存してなされるような条件下で用い得る。

本発明はさらに、化学発光反応が化学発光組成物に基づく発光又は測光検定に関 する。

本発明はさらに、還元剤の１度が一定である溶液、好ましくは水溶液中のアクリ ジン誘導体の濃度の測定方法に関するものであって、アルコールの濃度が一定で 、ｐＨが一定である場合は化学発光反応で生じる光の割合はアクリジン誘導体の 濃度の関数である。

アクリジン誘導体の定量的検出のために２本発明の化学発光組成物はアクリジン 誘導体に関してアルコールが過剰に存在するようでなければならず、還元剤が存 在する場合は、還元剤はアクリジン誘導体に関して過剰に存在する。

アクリジン誘導体に関して過剰のアルコールは、組成物の総容積に関して少なく とも９０％（容積）のアルコールが存在することを意味する。

アクリジン誘導体に関して過剰の還元剤は、少なくとも１ｍｇ／ｍ１の還元剤が 存在することを意味する。

アクリジンの定量的測定は、アルコールが化学発光組成物の総容積の約９９％の 容積を示し、アクリジンの水溶液（約１０１〜約１０−’Ｍの濃度範囲の）の容 積が化学発光組成物の総容積の約１％を示す場合に実施するのが有益である。

本発明の化学発光組成物が還元剤を含有する場合、それは化学発光組成物の総容 積の約１％の容積パーセンテージ（約１０μｇ／ｍ１〜約１ｍｇ／ｍｌの還元剤 の濃度範囲に対して）を示す。

組成物のｐＨが、例えば９を超える場合、アクリジンに関して過剰のアルコール は、アルコール／アクリジン容積比が約１０％７９０％〜約９９％／１％である ようなものであり得る。

組成物のｐＨが、例えば５〜７の範囲である場合、アクリジンに関して過剰のア ルコールは、アルコール／アクリジン容積比が約６０％／４０％〜約９９％／１ ％であるようなものであり得る。

アクリジンの定量は、測定すべき抗原又は抗体とアクリジン誘導体との適切なカ ップリングにより、抗原又は抗体の測定に有用である。

カプセル封入形態が化学発光反応を妨害しないとすれば、定置すべきアクリジン をポリマーのようなカプセル封入形態１例えばリポソーム又はニオソームに封入 するが、上記のカプセル封入形態はそれ自体、抗原又は抗体の、あるいは核酸配 列の定量のための標識として用いる。

本発明はさらに、アクリジン誘導体の濃度、アルコールの濃度及びｐＨを一定に 保った、水溶液に含有される還元剤の濃度の測定方法に関する。化学発光反応で 生じる光の割合は還元剤の濃度の関数である。

還元剤の定量的測定のために、本発明の化学発光組成物は、アクリジン誘導体が 還元剤に関して過剰に存在し、アルコールが還元剤に関して過剰に存在するよう なものでなければならない。

還元剤に関して過剰のアクリジン誘導体は、１０−”Ｍ〜１０−’Ｍの濃度範囲 のアクリジンが存在することを意味する。

還元剤に関して過剰のアルコールは、アルコールの性質によって少な（とも６０ ％（容積）のアルコールが存在することを意味する。

還元剤の定量のための、還元剤に関して過剰のアクリジン誘導体及び過剰のアル コールに対応する適切な組成物を以下に示すニー約１０−’Ｍの濃度の約１％（ 容積）のアクリジン誘導体；−約９０％（容積）のアルコール。

還元剤（約１ｐｇ／ｍ１〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の）の容積は、化学発光組 成物の総容積の約９％を示す。

化学発光相、好ましくは水性相の還元能力の変化に基づくアクリジン誘導体依存 性増強化学発光は、標識、又はそれ自体還元する又は化学反応によって還元する ようになる問題のあらゆる物質の検出及び定量に用い得る。

本発明はさらに、特に微小量の、例えば約１０μｍ未満の、特に約０．１ＡＬ１ 〜約１μｍの水溶液のｐＨ又はｐＨの変化の測定方法に関するが、この場合、ア クリジン誘導体の濃度は一定であり、アルコールの濃度は一定であり、そして還 元剤の濃度は一定であつる。化学発光反応で生じる光の割合はｐＨの関数である 。

本発明のこの態様において、ｐＨ変化は、化学量論的方法で又は時間依存的にｉ ｎ　５ｉｔｕに生じ得る。

本発明の好ましい態様によれば、生物試料のような水溶液のｐＨ増大を測定し得 る。

例えば、ｐＨは、一定量のｐＨ増大物質、例えば０Ｈ−１ＣＮ−のような塩基性 イオン、ポリ塩基性イオン、又はスペルミン、スペルミジン、及びカダベリンの ような非常に塩基性の分子を投入することによって増大し得る。この方法では、 ｐＨは化学量論的方法で増大する。

ｐＨはさらに、例えばＮＨ，”イオンを生じるウレアーゼの添加といったような イオンを生じる酵素の添加に起因するような酵素反応によって増大し得る。

この方法では、ｐＨは時間依存的に増大する。

化学発光反応が、ウレアーゼがＮＨ，”イオンを生じる酵素反応の終了前に起き る場合には、ｐＨの増大は時間依存的反応である。

化学発光反応が、上記の酵素反応が一旦終了してから起きる場合には、ｐＨは時 間とは無関係に、即ち化学量論的に増大する。

酵素反応に起因するｐＨ増大を測定するためには、変化前の水溶液のｐＨ（初期 ｐＨ）は、ｐＨの増大に関与する酵素がその最大活性を有するｐＨであるのが有 益である。

例えば、ウレアーゼを用いる場合、初期ｐＨは、酢酸緩衝液では６．５、及び燐 酸緩衝液では７．５が有益である。

酵素反応から生成されないｐＨ増大物質に起因するｐＨ増大の測定に関しては、 初期ｐＨはいかなる値を何してもよい。しかし、このような場合、ｐＨ増大物質 を用いずに対照測定を実施する必要がある。

水溶液のｐＨ変化の測定は、ｐＨ増大物質の添加前に、化学発光反応が起こり得 ない状態で実施するのが有益である。

本発明によれば、水溶液のｐＨ減少も測定される。

少量の場合のｐＨ変化の測定は、例えば手術中の血清のような生物試料のｐＨ変 化を測定するために、臨床実験室及び外科部門で有用である。

本発明はさらに、アクリジン化合物の濃度及び水溶性化合物の濃度が一定であっ て、化学量論的又は時間依存的に予定のｐＨに達するか又はそれを超えると一定 量の還元剤が生成される工程に関する。

本発明は、ｐＨ増大物質、例えば塩基性又はポリ塩基性イオン。

あるいはこのようなイオンを生じる酵素、例えばＮＨ，”を生じるウレアーゼを アクリジン誘導体及びアルコールの溶液中に投入することから成るｐＨ増大物質 の定量方法に関する：発光の割合は、ｐＨ増大物質の関数である。

有利な態様によれば、アクリジン誘導体及びアルコールの溶液は、ｐＨ７，８で 還元剤になるヒドロキノンのような、確定ｐＨを超えると適切な還元特性を得や すい一定量の薬剤を含有する。

このような系を用いる利点は、測定されたｐＨが確定されたという条件で、あら ゆる発光を除外することである。

ｐＨ増大物質の測定は、製剤の品質管理のために、又はｐＨの予定の変動を起こ し得るあらゆる標識の検出のために、及び抗原、抗体、又は核酸配列の測定のた めに用い得る。

ウレアーゼの使用を伴う物質の測定のためには、カプセル封入形態が化学発光反 応を妨害しない場合は、ウレアーゼを例えばリポソーム又はニオソームのような 高分子カプセルのような、カプセル封入形態に封入し得る。上記のカプセルの封 入形態は、測定すべき物質のための標識として使用しやすいものである。

本発明はさらに、抗原又は抗体の定量方法に関し、本発明の化学発光組成物が関 与する。

このような方法は、ｐＨ増大物質と結合した定置すべき抗原、又はｐＨ増大物質 と結合した定置すべき抗体を含有する溶液を、有益には還元剤の存在下で、アク リジン誘導体及びアルコールの溶液中に投入することを包含する。生じる光の割 合は、抗原又は抗体の定量が検量線との比較から導き出される、ｐＨ増大物質の 関数である。

有利な態様によれば、アクリジン誘導体及びアルコールの溶液は、予定のｐＨを 超える還元特性を得やすい一定量の薬剤を含有する。

このような系を用いる利点は、測定されたｐＨが確定されたという条件で、あら ゆる発光を除外することである。

本発明の別の好ましい方法によれば、測定すべき抗原又は抗体は、ｐＨ依存性還 元系として作用し、検定のために用いる化学発光組成物はｐＨ増大物質を含有す る。

ｐＨ依存性還元系として作用するこのような抗原又は抗体としては、細菌、又は その他の真核細胞、又はその一部といったような抗原を捕獲する固定化抗体（例 えば固体支持体上に固定）が挙げられるが、これらはそれ自体、刺激されて還元 剤を生じ、したがってそれらを含有する水性相の還元能力に変化が認められる。

本発明の別の好ましい方法によれば、測定すべき抗原又は抗体はｐＨ依存性還元 系と結合し、検定のために用いる本発明の化学発光組成物はｐＨ増大系を含有す る。

本発明の別の有利な態様によれば、定量すべき抗原又は抗体は還元剤と結合し、 抗原又は抗体の定量は還元剤の定量に起因する。

本発明の別の好ましい方法によれば、定置すべき抗原又は抗体はアクリジン誘導 体と結合し得るし、抗原又は抗体の定量はアクリジン誘導体の定量に起因する。

本発明はさらに、ハイブリダイゼーション可能なプローブを、有益には還元剤、 特に上記のようなｐＨ依存性還元剤の存在下でｐＨ増大物質で、又は有益には還 元剤、特にｐＨ依存性還元剤の存在下で、ｐＨ増大物質で標識される抗体によっ て認識される基で標識する場合の、プローブと検出すべき核酸配列とのハイブリ ダイゼーション反応の定量に関する。

本発明はさらに、ニンヒドリンのようなｐＨ増大物質の測定に基づいた２本発明 の化学発光組成物に関与するアミノ酸の検出及び定量方法に関する。

ニンヒドリンは、アミノ酸に接触させた場合の、ＮＨ，の遊離によるｐＨ増大物 質である。

アミノ酸を検圧及び定量するための本発明に関連したこのような方法は、ニンヒ ドリンを、検出及び定置すべきアミノ酸を含有する本発明の化学発光組成物中に 添加することを包含する。検出及び定置すべきアミノ酸と反応したニンヒドリン の量を測定し、その後、検量線と比較してアミノ酸の量を検出及び定量し得る。

本発明はさらに、燐酸基を含有する基質におけるアルカリホスファターゼの測定 方法に関する。この場合、化学発光組成物は、アルコールの存在下で、好ましく は緩衝液及びマンノースに溶解したアクリジンをベースにした部分の溶液を包含 する。化学発光反応で生じる光の割合は、アルカリホスファターゼにより基質か ら解離される燐酸基の関数である。

アルカリホスファターゼの活性の測定のために本発明の化学発光組成物を用いる 場合、緩衝液は有益にはジェタノールアミン緩衝液であって、燐酸緩衝液ではな い。

燐酸基を含有する基質は、それがアクリジン誘導体、例えばＡＴＰ、１．２−グ リセロホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、β−グリセロホスフェ ート、ホスホクレアチン、インドリルホスフェートの分子構造を妨害しない限り において、燐酸基を含有するあらゆる成分である。

本発明のアルカリホスファターゼの測定のためのｐＨは、アルカリホスファター ゼがその最大活性を有する値が有益であって、有益には約９．８である。

本発明の化学発光組成物を用いるアルカリホスファターゼ活性の測定は、抗原又 は抗体の定量測定のために用い得る。その点に関しては、測定すべき抗原又は抗 体は酵素と結合し、これは基質と反応する。化学発光反応で生じる光の割合は分 子活性（ターンオーバー）の関数である。

抗原又は抗体の定量のために、カプセル封入形態が化学発光反応を妨害しない場 合は、アルカリホスファターゼを例えばリポソーム又はニオソームのような高分 子カプセルのような、カプセル封入形態に封入し得る。上記のカプセル封入形態 はそれ自体、抗原、抗体又は核酸配列の定量のための標識として用いられる。

別の態様では、定置すべき抗原又は抗体はアルカリホスファターゼと反応する燐 酸基を含有する物質と結合し得る。化学発光反応で生じる光の割合はアルカリホ スファターゼの作用によって分離される基質の燐酸基の関数である。

本発明の化学発光組成物を用いるアルカリホスファターゼの測定は、プローブと 検出すべき核酸配列とのハイブリダイゼーション反応の定量的及び定性的検圧の ために用い得る。

別の態様によれば、プローブをある標識で前標識し、上記の標識に対するアルカ リホスファター【標識抗体（モノクローン性又はポリクローン性）を、アルカリ ホスファターゼと燐酸基を含有する基質との間に起こる酵素反応に用い得る。化 学発光反応で生じる光の割合はアルカリホスファターゼによって分離される燐酸 基の関数である。

本発明はさらに、本発明の化学発光組成物が関与する検定を実施するのに必要な 成分を包含するキットに関する。

アクリジン誘導体の定量化のためには、本発明のキットは以下のものを包含する 。

−アルコール： 一要すれば緩衝液； 一還元剤； 一要すれば組成物のｐＨを一定値に調節するための塩基。

還元剤の定量のためには、本発明のキットは以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体； 一要すれば緩衝液； 一要すれば組成物のｐＨを一定値に調節するための塩基。

−アルコール。

ｐＨ変化の定量のためには、本発明のキットは以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体； 一要すれば緩衝液； 一要すれば還元剤； −アルコール。

ｐＨ増大物質の定量のためには、本発明のキットは以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体； 一要すれば緩衝液； 一要すれば還元剤； 一アルコール。

抗原又は抗体の定量のためには、本発明のキットは以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体； 一アルコール； 一要すれば緩衝液； 一測定すべき抗原又は抗体と結合しやすい還元剤、好ましくはｐＨ依存牲還元系 ニ ーｐＨ増大系、例えば酵素； 一要すれば酵素のための基質。

抗原または抗体の定量のための本発明の別のキットは、以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体； 一アルコールニ ー要すれば緩衝液； 一測定すべき抗原又は抗体と結合しやすい、酵素のようなｐＨ増大系、例えばウ レアーゼ； 一要すれば酵素のための基質； 一要すれば還元剤、好ましくはヒドロキノンのようなｐＨ依存性還元系。

核酸配列の定量のためには、本発明のキットは以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体； 一アルコール； 一要すれば緩衝液； −測定すべき核酸配列と結合しやすい還元剤、好ましくはｐＨ依存性還元系； −ｐＨ増大系、例えば酵素ニ ー要すれば酵素のための基質。

核酸配列の定員のための本発明の別のキットは、以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体ニ ーアルコール； 一要すれば緩衝液； 一測定すべき核酸配列と結合しやすい、酵素のよりなｐＨ増大系、例えばウレア ーゼ； 一要すれば酵素のための基質。

一要すれば還元剤、好ましくはヒドロキノンのようなｐＨ依存性還元系。

アミノ酸の定量のためには、本発明のキットは以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体ニ ーアルコールニ ー要すれば緩衝液； −ニンヒドリンのような、測定すべきアミノ酸と反応させる場合にｐ）Ｉ増大性 である基質； 一要すれば還元剤、好ましくはヒドロキノンのようなｐＨ依存性還元剤。

抗原の定量のためには、本発明のキットは以下のものを包含する−アクリジン誘 導体； −アルコール； 一要すれば緩衝液； 一測定すべき抗原に対するポリクローナル、好ましくはモノクローナル抗体； 一ウレアーゼと結合しやすい、測定すべき抗原に対する抗体を検出するための手 段。その手段は、例えばウレアーゼと結合する、測定すべき抗原に対する抗体に 対する抗体であるニーウレアーゼのための基質。

抗原又は抗体を定量するための本発明のキットは、以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体； 一還元剤、好ましくはマンノースニ ー要すれば緩衝液； 一測定すべき抗原又は抗体と結合しゃすいアルカリホスファターゼ。

抗原を定量するための本発明の有益なキットは、以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体； 一アルコール； 一還元剤、好ましくはマンノース； −できれば緩衝液； 一アルカリホスファターゼと結合する、測定すべき抗原に対する抗体； −ｐ−ニトロフェニルホスフェートのようなアルカリホスファターゼのための基 質。

核酸配列を定量するための本発明の有益なキットは、以下のものを包含するニ ーアクリジン誘導体； 一アルコール； 一要すれば緩衝液； 一還元剤、好ましくはマンノース； −前標識ブローブ、例えばジゴキシゲニン前標識プローブ；−アルカリホスファ ターゼと結合しゃすい、プローブの標識に対して向けられる抗体。その抗体は、 例えばアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体である； −ｐ−ニトロフェニルホスフェートのようなアルカリホスファターゼのための基 質。

本発明は特に、体液及び細胞上澄み液のような試験媒質中に存在するあらゆる抗 原（又は抗体）の検圧及び定量のためのキットであって、以下のものを包含する キットに関するニー測定すべき抗原（又は抗体）と免疫学的複合体を形成しゃす い抗体（又は抗原）の固定のための手段；−ｐＨ増大物質、あるいはウレアーゼ のようなｐＨ増大酵素又はアルカリホスファターゼのような燐酸生成酵素と複合 体を形成するモノクローナル又はポリクローナル抗体。その抗体は測定すべき抗 原（又は抗体）と特異的結合を形成しゃすい；一本発明の化学発光組成物。

本発明は、体液及び細胞上澄み液のような試験媒質中に存在するあらゆる抗原（ 又は抗体）の検出及び定量するための有益なキットであって、下のものを包含す るキットに関するニー蛋白質（測定すべき物質が抗原である場合は抗体、測定す べき物質が抗体である場合は抗原）が共有的又は非共有的に結合した固体支持体 、好ましくはマイクロウェル、プラスチックルミノメータ−バイアル、又は蛋白 質結合膜。その蛋白質は試験媒質中の測定すべき抗原（又は抗体）と免疫学的複 合体を形成し得る；−ｐＨ増大物質、あるいはウレアーゼのようなｐＨ増大酵素 又はアルカリホスファターゼのような燐酸生成酵素と複合体を形成するモノクロ ーナル又はポリクローナル抗体。その抗体は測定すべき抗原（又は抗体）と特異 的結合を形成しゃすい；一本発明の化学発光組成物。

本発明はさらに、試験媒質中の特定の標的核酸配列を検出及び定量するためのキ ットであって、一つ又はそれ以上の容器内に以下のものを包含するキットに関す るニ ー検出すべき標的核酸配列中に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズし得 る一次一本鎖ヌクレオチドプローブ。その−次ブローブは固定手段に固定される 。

一標的核酸配列中に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る二次化学 的又は酵素的標識ヌクレオチドプローブ。その二次プローブは固定手段に固定さ れた一次ブローブとハイブリダイズで一二次ブローブの標識を検８するための手 段。その手段はウレアーゼ又はアルカリホスファターゼ、あるいはアクリジン添 加リポソームと結合するニ 一本発明の化学発光組成物。

本発明はさらに、試験媒質中の特定の標的核酸配列を検圧及び定量するためのキ ットであって、一つ又はそれ以上の容器内に以下のものを包含するキットに関す るニ ー検８すべき標的核酸配列とハイブリダイズし得る一本鎖ヌクレオチド配列を包 含する一次ポリヌクレオチドブローブ。その−次ブローブは好ましくはストリッ プ、マイクロタイタープレート、又はプラスチックルミノメータ−バイアルの形 態の固体支持体に固定される； 一標的核酸配列中に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズできる二次化学 的又は酵素的標識ヌクレオチドプローブ（例えばビオチン、ジゴキシゲニンで標 識化）、その二次プローブは固体支持体に固定された一次ブローブとハイブリダ イズできない；−上記の標識と結合し得る蛋白質又はその他の任意の物質、その 蛋白質又はその他の任意の物質は、例えばアビジン又は抗ジゴキシゲニン抗体で あって、ウレアーゼ又はアルカリホスファターゼ、あるいはアクリジン添加担体 と結合する。

一本発明の適切な化学発光組成物。

本発明の種々の態様を以下の実施例によって説明するが、それらは本発明を限定 するものではない。

大施丘 実施例Ｉ：化学発光放出時間の延長： 本発明の長期残存性化学発光は、図１に示すように生じ得る。この図では、発光 シグナル（一致モード（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｍｏｄｅ）でのｃ、ｐ、ｍ、） の強度を時間（分）に対してプロットする。

水性溶液は、以下の混合物から調製したニー１０μｌの燐酸緩衝食塩水； 一１００ｇ１の還元剤（濃度：　１０ｍｇ／ｍｌ）；　−１０ｕｌのジェタノー ルアミン溶液；及び 一１０μｍのアクリジン塩（濃度：　１０−’Ｍ／ｌ　）。

この水溶液に、８８０μｌのアルコールを添加し、５０分間に亘って化学発光を 記録した。

実施例エエ；微小量のアクリジン化合物の検出：アルカリ条件下、そして過剰の アルコールの存在下で、極少量のアクリジンエステルを検出し得る。これは図２ に説明されているが、この図では、相対光強度単位の対数として表されるシグナ ル発光の強度を、ルシゲニンの濃度の負の対数に対してプロットする。

ルシゲニンの連続希釈液を蒸留水中に調製した。各希釈液から。

１０μｌを適切なバイアル中にピペットで移した。次に、蒸留水に溶解した１０ μｍのＯ，ＯＩＭ　ＮａＣＮ溶液を添加した。９８０μｌのアルコールを加える ことによって反応を開始させた。図に示すように、１０−１７Ｍのルシゲニン濃 度により、゛°一致モード°゛で測定した場合（即ち、２つの光電子増倍管に関 して１２ナノ秒の検出期間）、バックグラウンドレベルを十分に上回る化学発光 計数を生じる。

実施例ｒｒｒ：少反応容量の感受性ｐＨ測定値：本発明によれば、歩容量の試料 を用いて１割合に簡単に高域受佐ｐＨ測定値をめることができる。

１０１Ｍ　ルシゲニンの溶液を、３．０１〜４．１９の表示ｐＨの範囲のｐＨで 、緩衝溶液中に調製した。１００μｍの各ルシゲニン溶液に９００μｍのｎ−プ ロピルアルコールを添加し、化学発光反応を測定して、”一致モード”で１分当 りの計数として表わした。発光強度をｐＨに対してプロットした図３の結果は、 これらの条件下では、１ｐＨ単位のｐＨ間隔がほとんど４Ｘ１０’　ｃｐｍのス パンを生じ得ることを示す。図４は、８．３９〜９．２９というより高いｐＨ範 囲における同様の結果を示す。

実施例工■：ウレアーゼ結合抗体を用いた微小量の抗原の検出：ウレアーゼは、 尿素の溶液からアンモニアを遊離する酵素である。その結果生じる緩衝液のｐＨ の増大は、本発明の化学発光反応によって検出し得る。これを説明するために、 Ｏ，ＳＵのウレアーゼ（５Ｕ／ｍｇ）の異なる希釈液を１０−”Ｍルシゲニン及 び０．　１％（ｖ　／　ｖ　）ヒドロキノンを含有するｐＨ７，４の燐酸緩衝溶 液１０ｍ１に溶解した。６００μｌの各希釈液に１０ＬＬｌの尿素（蒸留水中に ０．　５ｍ　ｇ／ｍ　ｌ　）を添加し、その混合液を３７℃で３０分間インキュ ベートした。４００μｍのエチルアルコールを添加して化学発光を誘発した。図 ５（一致モードのｃｐｍで表わされる光シグナルの強度は、単位／３で表わされ るウレアーゼの希釈液に対してプロットする）に示すように、０．１μＵより少 ないウレアーゼが３０分の反応時間内に容易に検出される。

この反応は、好適なモノクローナル又はポリクローナル抗体がその抗原を認識す るのに有用である場合に、任意の抗原を検出するために用い得る。これらの抗原 検出抗体は標準的結合法を用いてウレアーゼと結合し得るか、°あるいはこれら の抗体は１ｍ的手法によってウレアーゼと結合した二次種特異的抗体により検出 し得る。

このような標識抗体は市販されている。抗原の定量化は、酵素結合イムノソルベ ント検定において、抗原としてヒト腫瘍壊死因子（ＨｕＴＮＦ）を用いて説明さ れる。ウサギ抗ＨｕＴＮＦでコートしたマイクロウェルに、燐酸緩衝食塩水、０ ．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０の溶液中 で調製した２００μｌのＨｕ、　Ｔ　Ｎ　Ｆの連続希釈液を添加した（２．５μ ｇ／ｍ１〜２５０フェムトグラム／　ｍ　１の範囲で）。３７℃で２時間インキ ュベートした後、マイクロウェルプレートを洗浄し、最適結合を示すように試験 されたマウスモノクローナル抗ＨｕＴＮＦ溶液２００μｍを各ウェルに添加した 。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを再び洗浄し、次いで２００ μｍのウレアーゼ結合ヤギ抗マウスＩ　ｇＧ　（４０ｎｇ）と共にインキュベー トした。インキュベーシヨンは３７℃でさらに１時間続けた。最終洗浄後、各ウ ェルに２００μｍのウレアーゼ基質溶ｌ夜（ＳｅｒａＬａｂｓ）を充填した。３ ７℃で１時間インキュベーシヨンした後、１００μｌの反応混合液をピペットで ルミネセンスバイアル（ＬＫＢ）に移した。各バイアルに５０μ工の１０１Ｍル シゲニンｐＨ５，２を添加し、８５０μｍのエチルアルコールの添加によってル ミネセンスを開始した。図６（一致モードのｃｐｍで表わされる光シグナルの強 度は、フェムトグラム／ｍｌ、ｐｇ／ｍｌ、及びｎｇ／ｍｌで表わされるＴＮＦ の濃度に対してプロットする）は。

５０フ工ムトグラム／ｍｌのＴＮＦが測定されることを示す。

実施例■：アルカリホスファターゼ活性の測定：アルカリホスファターゼの最適 ｐＨ（即ちｐＨ９，８）で、燐酸の放出によりアルコールの存在下でルシゲニン 及びマンノースの緩衝溶液を用いて、酵素活性を測定し得る。アルカリホスファ ターゼ酵素が種特異性抗体と結合する場合、反応は抗原特異性モノクローナル又 はポリクローナル抗体が酵素と結合し得る。あるいは酵素結合種特異性抗体と反 応し得るのに有用であるとすれば、任意の抗原を検出及び定量するのに用い得る 。

これは、ｐＨ９，８でジェタノールアミン緩衝液中に等モル量のｐ−ニトロフェ ノール及びｐ−ニトロフェノールホスフェートの連続希釈液を作り、これから１ ０μｍを、１００ＬＬＬのマンノース溶液（蒸留水中に１０ｍｇ／ｍｌ）及び蒸 留水に溶解した１０μｍの１０−’Ｍルシゲニンを含有する混合液に添加するこ とによって例証される。８８０μｍのエタノールを添加することにより、化学発 光を誘発する。図７（４０５ｎｍでの吸光度をジェタノールアミン緩衝液中に溶 解したｐ−ニトロフェノールの希釈液に対してプロットする）に示すように、酵 素反応の程度は、ｐ−ニトロフェノールの遊離の結果としての４０５ｎｍでの光 学的密度測定（比色反応）を用いて追跡し得るが、しかしルミネセンスの計数（ ｃｐｍ）は検出の感度をかなり増大する（図８゜一致モードのｃｐｍの対数で表 わされる光シグナルの強度は、ｐ−ニトロフェノールの濃度の負の対数に対して プロットする）。

実施例ｖ工；アミノ酸の検出及び定量：本発明によれば、化学発光はｐＨ変化を 検８するために用い得る。ｐＨ増大化合物が化学量論的反応の結果として生じる 場合、あらゆるこのような反応は、この反応が化学発光を消さないとすれば、定 量し得る。この原理の一般例は、ニンヒドリンとアミノ酸の反応がＮＨ，の遊離 を引き起こす、ニンヒドリン反応を用いるアミノ酸の定量に見畠される。

図９（一致モードのＣｐｍの対数で表わされる光シグナルの強度は、グリシンの 濃度（Ｍ／　１　）の負の対数に対してプロットする）は、塩水中に溶解した１ ００μｍのグリシンの連続希釈液と１００μｍの１０−”Ｍルシゲニン、１０μ ｌの０．１％（Ｖ／Ｗ）ヒドロキノン溶液、７８０μｌのエタノール、及び１０ μｌの１％（Ｖ／Ｗ）ニンヒドリン溶液とを混合することによって生じる化学発 光の結果である。図に示すように、１０−”　Ｍグリシンの濃度は依然として、 バックグラウンドレベルを十分上回るシグナルを生じる。

実施例ＶｒＩ：ＤＮＡハイブリダイゼーション検定：本発明によれば、化学発光 は、化学発光シグナルを得るために上記の方法を用いるハイブリダイゼーション の定量的及び定性的検出のための道具としても用い得る。これは、図１０に説ｏ ｎｏｒｒｈｏｅａ、ｅＤＮＡをニトロセルロース紙ストリップに塗布する。スト リップを乾燥し、８０℃で２時間真空中焼き付けて、メーカーが用意したプロト コールに従って、ジゴキシゲニン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ） で前標識化した非常に特異的なりＮＡプローブとハイブリダイズさせた。３ＸＳ ＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０ ．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）　ドデシル硫 酸ナトリウム、及び０．５％ブロッキング試薬中で６５℃で１６時間ハイブリダ イゼーションした後、フィルターを１．５ＸＳＳＣ又は３ＸＳＳＣで繰り返し洗 浄し、供給元が明記しているようにアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニ ン抗体を用いてインキュベートした。結合及び洗浄後、室温で１２時間、ジェタ ノールアミン緩衝液、ｐＨ９，８に溶解した１、　ｍ　ｇ　／　ｍｌのｐ−ｐ− 二トロフェニルホスフェートの存在下で酵素反応を進行させた。異なるフィルタ ーの各々のインキュベーション混合液のアリコートをｉｏｏμｍマンノース（１ ０ｍｇ／ｍｌの濃度の）及び１０μｌの１０−’Ｍルシゲニンの溶液中にピペッ トで移した。

８８０μｍのエチルアルコールを添加後、異なる時間に化学発光を測定した。図 １０（一致モードのｃｐｍの対数で表わされる光シグナルの強度を、異なる濃度 のＤＮＡに関するアルコールの添加後の時間の関数としてプロットする）の結果 は、安定したシグナルが生じ、フィルター当り１０フエムトグラムのＤＮＡの量 がこれらの環境下では検出されることを示す。

実施例ＶＩＩＩ：リポソーム内に含有されるアクリジン化合物の検出： クロロホルム（ＣＨＣｌ、）中に４ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン （ＤＰＰＣ）を溶解することによって、ルシゲニン含有リポソームを調製した。

ＣＨＣｌ、蒸発（Ｎ、空気中で１時間）後、６００μｍのルシゲニン溶液（燐酸 緩衝液中に１３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７，４）を添加した。次に、その溶液を、ＤＰ ＰＣの転移温度を上回る温度で、３２Ｗ（段階的なマイクロチップを有するＢｒ ａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｆｉｅｒ）で４×７分音波破砕した。

次に、０．８ｍｇのＤＰＰＣを含有する十分に音波破砕した溶液を、２５Ｘ１ｃ ｍカラムを用いてセファロース　６Ｂで分離した。

操作中、２つの分画が分離されたが、その一方はリポソーム中に封入されたルシ ゲニンを含有した。さらに、この分画は遊離ルシゲニンを含有しないことが確定 された。

次に、リポソーム含有分画の連続希釈液（１／１０〜１／１０７）を生理食塩水 、ｐＨ９中に作った。

ｉｏμｍのトリトン　Ｘ−１００（’０．０１％）を１００μｍのリポソーム懸 濁液に添加後、９００μｌのエタノールを加えて、化学発光（一致モードのｃｐ ｍ）を記録した。

最大ピークの高さく一致モードの対数Ｃｐｍで表わされる）を、以下の表１に示 す： 表１ リポソーム分画希釈　一致モードの対数ｃｐｍ１／１０　’　６．４６ 実施例ＩＸ：還元化合物の検出及び定量：本発明によれば、化学発光は還元化合 物を検出するために用い得る。図１１では、アスコルビン酸塩の濃度を、蒸留水 に溶解した０、１ｍＭルシゲニン１５０μｍと燐酸緩衝食塩水に特定濃度にした がって溶解した１００μｍのアスコルビン酸塩及び７５０ｔｉＬのエタノールと を混合することによつて得られた光シグナルの強度（ｃｐｍ）に対してプロット する。図に示すように、反応混合液中の１０フエムトグラムのアスコルビン酸塩 が容易に検出される。

実施例Ｘ：ルシゲニンーＢＣＩＰ化学発光によるアルカリホスファターゼの検出 ： 仔つシ腸アルカリホスファターゼ（Ｃ工Ｐ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を０．０ １％アルブミンを含有する２％ジェタノールアミン緩衝液（ＤＥＡ）、ｐＨ９， ４１で希釈した。この酵素製剤がら出発して、さらに１／１０の段階希釈液を同 一緩衝液中に作った（１１５０００〜１１５ＸＩＯ”）。

ルシゲニンを、先ず２％ジェタノールアミン緩衝液ｐＨ９，４１中に１０−”Ｍ の濃度で溶解して、さらに同一緩衝液で１０−’Ｍに希釈した。

その後、ＢＣＩＰで示されるブロモクロロインドリルホスフェート（ナトリウム 塩）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）５０ｍｇを１ｍｌの２％ＤＥＡ緩衝液、ｐＨ９， ４１に溶解した。この溶液のうち３５０μｌをルシゲニン（１０−’Ｍ）含有Ｄ 　”Ｅ　、Ａ緩衝液に添加した。

ＣＩＰの二次希釈溶液シリーズを、７％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（Ｍ Ｗ　８０，０００）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する２％ＤＥＡ緩衝液ｐＨ９，４ １中に調製し、ＮａＯＨを添加してｐＨ９，４１に修正した。最後に、０．０１ ％の最終濃度でアルブミンを添加した。

各酵素希釈液から、２５０μｍをピペットでルミネセンスバイアル（総作働容量 １ｍｌ　（ＬＫＢ１２５１）。シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ　 Ｌ、５７５Ｃ）Ｏ）中に配置）中に移した。

化学発光は、１２秒の間隔で、ＤＥＡ＋に、溶・解（した２５０μｍのルシゲニ ンーＢＣＩＩＰ溶液先の試料に添加すること・□によって１．１開始した。次に 、゛°一致モードーで３０分間、ルミネセンスを記録１した。

得られた計数を表２に示す。

ここでは、ルミネセンス試料中の酵素の最終濃度をＤ　Ｅ　、Ａ及びＤＥＡ＋Ｐ ＶＡで得られた対数ｃｐｍと一緒に示す、これらの。ｐｍを、自動的にバックグ ラウンドを差し引く分光光度計（Ｐｙｅ　Ｌｌｎｉｃａｍ）で読み取る場合に、 ３０分後のＤＥＡ緩衝液中のＢＣＩＰ反応の光学的密度（ＯＤ）と比較する。酵 素の最終濃度は、化学発光検定の場合と同じであった。

表２に示すように、ＰＶＡ−補充化学発光系を用いて、アルカリホスファターゼ 検出能力の１．０００〜ｔｏ、ｏｏｏ＋＝の増大が得られた。

表２ ＣＩＰ　Ｐ　Ｖ　Ａを含まない　ＰＶＡ含有　ＢＣＩＰのｏＤ対数ｃｐｍ　ｔ４ 数。ｐｍ　６２０ｎｍコ、５００，０００　ａｔｔｏｍｏｌａ　６　ｆｉ　１ｏ 、５７ｓｎ・ｔｔ、ａｍｏｌｅ　：アトモル（１０−１６モル）実施例Ｘ工：比 較例： 本発明の組成物を用いて得られた化学発光、並びにアルコールを含有しない従来 技術の組成物によって得られた化学発光を比較した。

１）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｏｔｏｂｉ。

１ｏｇｙ、１９７５．Ｖｏｌ、２２．ｐ、２０３−２１１．ＴｏｔｔｅｒＪ、Ｒ ，に記載の組成物に由来する組成物を用いて得られる化学発光。

使用する組成物は以下の２つのもの、即ちそれぞれａ）及びｂ）である： ａ）２００μｍの蒸留水； １００μｍのＮａＯＨ（以下の表３に記載のようなモル濃度）； ｂ）１００ｕｌの蒸留水； １００μｌのフルクトース（１０“２Ｍ）：１００μｍのＮａＯＨ（以下の表３ に記載のようなモル濃度）； １００ｕｌのルシゲニン（２Ｘ　１０−’Ｍ）　。

化学発光の結果（ｃｐｍの対数で表わされる）を表３に示す。表中ニ ー最初のカラムはＮａＯＨのモル濃度に相当する；−二番目のカラムは上記の組 成物（ａ）を用いて得られたｃｐｍの対数を示す；そして 一三番目のカラムは上記の組成物（ｂ）を用いて得られたｃｐｍの対数を示す。

表３ ２）本発明の以下の２つの組成物、即ちそれぞれＣ）及びｄ）を用いて得られた 化学発光： ｃ）１００μｌの蒸留水７ １００ｔＬｌのＮａＯＨ（以下の表４に記載のようなモル濃度）； １００μｍのエタノール（ＥｔＯＨ）；１００μｍのルシゲニン（２ｘＬＯ−’ Ｍ）。

ｄ）１００μｌのフルクトース（１０−”Ｍ）；１００μｍのＮａＯＨ（以下の 表４に記載のようなモル濃度）； １００μｌのエタノール（Ｅ　ｔ　ＯＨ）　；１００μｍのルシゲニン（２ｘｌ Ｏ−’Ｍ）。

化学発光の結果（ｃｐｍの対数で表わされる）を表４に示す０表中： −最初のカラムはＮａＯＨのモル濃度に相当する；−二番目のカラムは上記の組 成物（Ｃ）を用いて得られた。ｐｍの対数を示す：そして ｍ＝番目のカラムは上記の組成物（ｄ）を用いて得られた。ｐｍの対数を示す。

表４ 給凰ユニ表３及び４に示すように、フルクトースを用いた場合、フルクトースが 存在しない場合に比べて、化学発光の量子収量が実質的に高くなることを、この 系は明示する。事実上、本発明の組成物は、Ｔｏｔｔｅｒ　Ｊ、Ｒ，（Ｐｈｏｔ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９７５．Ｖｏｌ、 ２２゜ｐ、２０３−２１１）が記載した組成物より実質的に大きな量子収量のも のである。

３）以下に記載する従来技術の組成物：ｌ、２．３．４．５．６．７．８．９及 び１０； 並びに以下に記載する本発明の組成物：１’、２°、３″、４°、５゛％６°、 ７°、８°、９°及び１０゛を用いて得られる化学発光。

従来技術の組成物： １：１００ｊＬｌ（７）ＮａＯＨ１０−’Ｍ　＋１ＯＯｕｌ（７）フルクト−４ １０−”Ｍ　＋１００ｕｌ（７）蒸留水　＋１００μｍのルシゲニン　１０１Ｍ ： ２；１に同じ。１ｏｏｕｌの代わりに２００ｔＬｌの蒸留水が存在する； ３：１に同じ。１００μｍの代わりに３００μｍの蒸留水が存在する； ４：１に同じ。１００μｌの代わりに４００μｍの蒸留水が存在する； ５：１に同じ。１００μｍの代わりに５００μｍの蒸留水が存在する； ６：ｌに同じ、１００μｍの代わりに６ｏ○μｍの蒸留水が存在する； ７：１に同じ。１００μｍの代わりに７００ｕｌの蒸留水が存在する； ８：１に同じ。１００μｌの代わりに８ｏｏμｌの蒸留水が存在する； ９：ｌに同じ。１００ＬＬｌの代わりに９ｏｏμｍの蒸留水が存在する； １０：ｌに同じ。１００Ｉｉｌ（７）代わりに１０００ｕｌの蒸留水が存在する 。

本発明の組成物： １°　：　ｌｏｏμｌのＮａＯＨ１０−’Ｍ　＋１００μｌのフルクトース　１ ０−”Ｍ　＋１００μｍのＥｔＯＨ＋１ＯＯＬＬｌのルシゲニン　１０−３Ｍ。

２°　：ｌ゛に同じ。１００μｍの代わりに２００μｍの蒸留水が存在する； ３゛　：１°に同じ。１００μｍの代わりに３００μｍの蒸留水が存在する； ４°　：１゛に同じ。１００μｍの代わりに４００μｌの蒸留水が存在する； ５°　：１°に同じ。１００ＬＬＬの代わりに５００μｌの蒸留水が存在する； ６゛　：１°に同じ。１００μｌの代わりに６００μｍの蒸留水が存在する； ７°　；１゛に同じ。１００μｍの代わりに７００μｌの蒸留水が存在する； ８’：１’に同じ。１００μｍの代わりに８００μｌの蒸留水が存在する； ９゛　：１°に同じ。１００μｌの代わりに９００μｌの蒸留水が存在する； １０°　：１°に同じ。１００μｍの代わりに１０００μｌの蒸留水が存在する 。

その結果を表５に要約する。表中ニ ー最初のカラムは上記のような組成物を示す；−二番目のカラムは、化学発光反 応開始時に得られたＣｐｍを示すニ ｍ＝番目のカラムは、反応開始後１０時間目に得られたＱｐｍを示す； 一四番目のカラムは、反応開始後２４時間目に得られたｃｐｍを示す； 一三番目のカラムは、反応開始後９６時時間和得られたＣｐｍを示す。

表５ 稙坦ｌ：表５の結果は、本発明の組成物の効能を明示するが、これには水混和性 アルコールの使用が含まれる０本発明の組成物による量子収量の実質的改良及び 化学発光継続期間の延長が示されているが、これは従来は観察されたことがなか った。

４）以下に記載する従来技術の組成物１．２．３．４．５．６．７．８．９．１ ０．１１．１２．１３．１４．１５及び１６、並びに以下に記載する本発明の組 成物：１’、２°、３°、４゛、５゛、６°、７’　、８°、９°、１０’、ｌ ｌ’、１２°、１３°、１４’　、１５’及び１６゛を用いて得られる化学発光 。

従来技術の組成物：１．３．５．７．９．１１．１３及び１５は以下のものであ るニ ー１００μｍの蒸留水； 一１００μｌのＮａＯＨ（以下の表６に記載のようなモル濃度）−１００ｕｌの Ｈ２Ｏニ ー１００μｌのルシゲニン（１０−’Ｍ）。

従来技術の組成物２．４．６．８．１０，１２．１４及び１６は、それぞれ組成 物１．３．５．７．９．１１，１３及び１５に対応するが、この場合１００μｍ 蒸留水を１００ＬＬｌフルクトース１０−”Ｍに置き換える。

本発明の組成物１°、３’　、５’　、７”、９”、１１’、１３゜及び１５° は以下のものであるニ ー１００μｍの蒸留水ニ ー１００μｍのＮａＯＨ（以下の表６に記載のようなモル濃度・）−１００μｌ のＥｔＯＨ； 一１００μｌのルシゲニン（１０−’Ｍ）。

本発明の組成物２゛、４°、６’、８’、１０’、１２’。

１４°及び１６゛は、それぞれ上記の組成物１°、３°、５°。

７゛、９°、１１’、１３’及び１５’に対応するが、この場合１００μｌの蒸 留水を１００１Ｌｌフルクトース　１０１Ｍに置き換える。

本発明の開始６０分後に得られた化学発光結果を表６に示す二表６ ■＝結論ｌ及び２に前記したように、量子収量の増大、及び６０分以上もの時間 に亘って長く残存する化学発光はともに、本発明の組成物を用いて立証される。

基礎組成物及び還元剤の作用は、過酸化水素を−予め用いなくても１発光に明ら がな増大効果を及ぼす。

図２ ｐＨ 図３ ｐＨ 図４ ウレアーゼ（ＵＮＩＴＳ／３） 図５ ＴＮＦ、ｉ１度（ブレーティング） 図６ 分光光度計によるｐ−二トロフェノールの検出図７ グリシンの検出 図９ ＬＯＧ　Ｃ，Ｐ、Ｍ、　ｌＮＣ０ＩＮＣｒＤＥＮＣＥＲ，Ｌ、Ｕ。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）　匡平成４年　１月１ ３日

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の： −水溶性又はアルコール可溶性であるか、あるいは均質ヒドロアルコール組成物 中に溶解し得るアクリジン誘導体を含有する溶液、好ましくは水性溶液； −水溶性であるか、あるいは化学発光反応を起こさせるに十分安定である懸濁液 を水中に生成する水混和性のアルコール（ただし、ここで、このアルコールはア クリジン誘導体由来のアルコールとは異なり、アクリダノールとは異なり、そし て化学発光反応中に生成されるかもしれないアクリダノール誘導体に由来するア ルコールとは異なる）； −適切なｐＨ条件によっては存在又は非存在である還元剤を含有する均質ヒドロ アルコール系化学発光組成物。
2. ２．水混和性アルコールが、糖類を除外しそしてメルカプトアルコール類を含む 、第一、第二、第三脂肪族、又は第一、第二、第三芳香族アルコール、あるいは 第一、第二、第三複素環式アルコールである請求の範囲第１項に記載の均質ヒド ロアルコール化学発光組成物。
3. ３．アルコールがメルカプトアルコールとは異なる請求の範囲第１項又は２項に 記載の均質ヒドロアルコール系化学発光組成物。
4. ４．以下の： −好ましくは水性溶液であるアクリジン誘導体の溶液；−水混和性アルコール； −アルコールが化学発光反応を引き起こし得るような溶液のｐＨを含む請求の範 囲第１〜３項のいずれか一項に記載の化学発光組成物。
5. ５．以下の： −好ましくは水性溶液であるアクリジン誘導体の溶液：−水混和性アルコール； −アルコールが化学発光反応を引き起こし得る値に、溶液のｐＨが調節されるよ うな塩基 を含有する請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載の化学発光組成物。
6. ６．以下の： −好ましくは水性溶液であるアクリジン誘導体及び還元剤の溶液；−水溶性アル コール； −要すれば塩基 を包含する請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載の化学発光組成物。
7. ７．水性緩衝液を含有する請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に記載の化学発 光組成物。
8. ８．ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、又はペルオキシダーゼのような酵素 を含有する請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載の化学発光組成物。
9. ９．アクリジン誘導体が、次式： ▲数式、化学式、表等があります▼２Ｘ−又はＸ２−（式中、２Ｘ−又ばＸ２− は負に荷電した対イオン、例えば硝酸塩、硫酸塩、燐酸塩、塩素酸塩対イオンを 表わし；Ｒは１〜６個の炭素原子、特に１〜４個の炭素原子を有する脂肪族鎖、 特にＣＨ３を表わす） を有し、ここで、このアクリジン誘導体が水溶性又はアルコール可溶性であるか 、あるいは均質ヒドロアルコール組成物に溶解し得る、そして好ましくは水溶性 であるという条件で、フェニル環の少なくとも１つが要すれば置換され、上記の アクリジン誘導体は、好ましくはルシゲニンであるか、もしくは式：▲数式、化 学式、表等があります▼ （式中、Ｒは上記と同様である）を有し、ここで、このアクリジン誘導体が水溶 性又はアルコール可溶性であるか、あるいは均質ヒドロアルコール組成物に溶解 し得る、そして好ましくは水溶性であるという条件で、フェニル環の少なくとも １つが要すれば置換されている請求の範囲第１〜８項のいずれか一項に記載の化 学発光組成物。
10. １０．アクリジン誘導体が次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｙ−は負に荷電した対イオン、例えばＦＳＯ３−、ＮＯ３−を表わし、 Ｒ１は ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数 式、化学式、表等があります▼を表わす） を有し、ここで、このアクリジン誘導体が水溶性又はアルコール可溶性であるか 、あるいは均質ヒドロアルコール組成物に溶解し得る、そして好ましくは水溶性 であるという条件で、フェニル環の少なくとも１つが要すれば置換されていても よく、もしくは式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１は上記と同じ意味を有する）を有し、ここで、このアクリジン誘導 体が水溶性又はアルコール可溶性であるか、あるいは均質ヒドロアルコール組成 物に溶解し得る、そして好ましくは水溶性であるという条件で、フェニル環の少 なくとも１つが要すれば置換されていてもよい請求の範囲第１〜８項のいずれか 一項に記載の化学発光組成物。
11. １１．アルコールが１〜６個の炭素原子、特に１〜４個の炭素原子を有する水溶 性の第一、第二、又は第三アルコール、特にメタノール、エタノール、ｎ−プロ パノール、イソプロパノール、又はブタノールである請求の範囲第１〜１０項の いずれか一項に記載の化学発光組成物。
12. １２．還元剤がその場で（ｉｎ　ｓｉｔｕ）生成される請求の範囲第１、２、３ 及び５〜１１項のいずれか一項に記載の化学発光組成物。
13. １３．還元剤が少なくとも０．３Ｖの酸化還元ポテンシャルを有し、アクリジン 誘導体の分子構造、特に化学発光反応に関与する中間化合物を妨害しないもので あって、例えばアスコルビン酸、マンノース、グルコース、ＮＡＤＨ又はＮＡＤ ＰＨ、あるいはヒドロキノンである請求の範囲第１、２、３及び５〜１２項のい ずれか一項に記載の化学発光組成物。
14. １４．緩衝液が燐酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、ジエタノールアミン緩 衝液、バルビタール緩衝液、クエン酸緩衝液である請求の範囲第１〜１３項のい ずれか一項に記載の化学発光組成物。
15. １５．以下の： −アクリジン誘導体：約１０−４〜約１０−１０Ｍ／１、特に約１０−４〜約１ ０−６Ｍ／１の濃度範囲のもの約０．０１％〜約９９．９９％（容積）、特に約 １０％〜約９９％；−アルコール：約０．５％〜約９９．９％、特に約１０％〜 約９０（これらのパーセンテージは全て総容積に帯する容積で表わす）； −ｐＨは約４〜約８、特に約６〜約７．６であるである請求の範囲第１〜１４項 のいずれか一項に記載の化学発光組成物。
16. １６．化学発光反応が請求の範囲第１〜１５項のいずれか一項に記載の化学発光 組成物に基づく発光又は測発光検定。
17. １７．還元剤の濃度が一定であり、アルコールの濃度が一定であり、ｐＨが一定 であり、化学発光反応で生じる光の割合がアクリジン誘導体濃度の関数である、 請求の範囲第１６項の検定による水性溶液中のアクリジン誘導体の濃度の測定方 法。
18. １８．アクリジン誘導体の濃度、アルコールの濃度が一定であり、及びｐＨが一 定であり、化学発光反応で生じる光の割合が還元剤濃度の関数である請求の範囲 第１６項に記載の検定による水性溶液中の還元剤の濃度の測定方法。
19. １９．アクリジン誘導体の濃度が一定であり、アルコールの濃度が一定であり、 そして還元剤の濃度が一定であり、化学発光反応で生じる光の割合がｐＨの関数 である請求の範囲第１６項に記載の検定による微量の、例えば１０μ１未満の、 特に約０．１μ１〜約１μ１の溶質の水性溶液のｐＨの測定方法。
20. ２０．ｐＨを化学量論的方法又は時間依存的方法でｉｎｓｉｔｕに引き起こす請 求の範囲第１９項に記載の方法。
21. ２１．アクリジン化合物の濃度及び水溶性化合物の濃度が一定であり、化学量論 的又は時間依存的に予定のｐＨに達するか又はそれを超える場合に一定量の還元 剤が生成される請求の範囲第１６項に記載の方法。
22. ２２．ｐＨ増大物質、例えば塩基性又はポリ塩基性イオン、あるいはこのような イオンを生じるような酵素、例えばＮＨ４＋を生じるウレアーゼをアクリジン誘 導体及びアルコールの溶液中に入れることを包含し、生じる光の割合がｐＨ増大 物質の関数である請求の範囲第１６項に記載のｐＨ増大物質の定量方法。
23. ２３．ｐＨ増大物質と結合する定量すべき抗原を含有する、又はｐＨ増大物質と 結合する定量すべき抗体を含有する溶液を、有益には還元剤の存在下でアクリジ ン誘導体及びアルコールの溶液中に入れることを包含し、生じる光の割合が抗原 又は抗体の定量化が検量線との比較によって導き出すことができるｐＨ増大物質 の関数である請求の範囲第１６項に記載の抗原又は抗体の定量方法。
24. ２４．化学発光組成物がアルコールの存在下でルシゲニン及びマンノースの緩衝 溶液を包含し、化学発光反応で生じる光の割合が基質に及ぼすアルカリホスファ ターゼの作用によって分離される燐酸塩（ホスフェート）基の関数である請求の 範囲第１６項に記載の燐酸を含有する基質に及ぼすアルカリホスフェート活性の 測定方法。
25. ２５．測定すべき抗原又は抗体が、燐酸塩基を含む基質、例えばＡＴＰ、１，２ −グリセロホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、インドリルホスフ ェートと反応しているアルカリホスファターゼと結合し、化学発光反応で生じる 光の割合が、基質に及ぼすアルカリホスファターゼの作用により遊離する燐酸塩 基の関数であるか、又は測定すべき抗原又は抗体が、燐酸塩基を含む基質、例え ばＡＴＰ、１，２−グリセロホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、 β−グリセロホスフェート、ホスホクレアチンと結合し、化学発光反応で生じる 光の割合が基質に及ぼすアルカリホスファターゼの作用により遊離する燐酸塩基 の関数である請求の範囲第１６項に記載の検定における抗原又は抗体の測定方法 。
26. ２６．プローブをある標識で前標識し、上記の標識に対するアルカリホスファタ ーゼ標識抗体（モノクローン性又はポリクローン性）を、アルカリホスファター ゼと燐酸塩基を含有する基質との間に起こる酵素反応に用いる、そして化学発光 反応で生じる光の割合がアルカリホスファターゼによって遊離する燐酸塩基の関 数である請求の範囲第１６項に記載の検定に関与するプローブと検出すべき核酸 とのハイブリダイゼーション反応の定量的及び定性的検出の測定方法。
27. ２７．ニンヒドリンを、検出及び定量すべきアミノ酸を含有する本発明の化学発 光組成物中に添加し、検出及び定量すべきアミノ酸と反応したニンヒドリンの量 を測定し、その後検量線との比較によって、検出及び定量すべきアミノ酸の量を 測定することを包含する請求の範囲第１６項に記載の検定によるアミノ酸の検出 及び定量方法。
28. ２８．体液及び細胞上澄み液のような試験媒質中に存在する抗原（又は抗体）の 検出及び定量のためのキットであって、以下の：−測定すべき抗原（又は抗体） と免疫学的複合体を形成しやすい抗体（又は抗原）の固定のための手段；−ｐＨ 増大物質、あるいはウレアーゼのようなｐＨ増大酵素又はアルカリホスファター ゼのような燐酸生成酵素と複合体を形成するモノクローナル又はポリクローナル 抗体であって、測定すべき抗原（又は抗体）と特異的結合を形成しやすい抗体； −請求の範囲第１〜１５項のいずれか一項に記載の化学発光組成物 を包含するキット。
29. ２９．体液及び細胞上澄み液のような試験媒質中に存在する抗原（又は抗体）の 検出及び定量のためのキットであって、以下の：−蛋白質（測定すべき物質が抗 原である場合は抗体、測定すべき物質が抗体である場合は抗原）が共有的に又は 非共有的に結合した固体支持体、好ましくはマイクロウェル、プラスチックルミ ノメーターバイアル又は蛋白質結合膜であって、その蛋白質は試験媒質中の測定 すべき抗原（又は抗体）と免疫学的複合体を形成し得る；−ｐＨ増大物質、ある いはウレアーゼのようなｐＨ増大酵素又はアルカリ性ホスファターゼのような燐 酸塩生成酵素と複合体を形成し、測定すべき抗原（又は抗体）と特異的結合を形 成しやすいモノクローナル又はポリクローナル抗体； −請求の範囲第１〜１５項のいずれか一項に記載の化学発光組成物 を包含するキット。
30. ３０．試験媒質中の特定の標的核酸配列を検出及び定量するためのキットであっ て、一つ又はそれ以上の容器内に以下の：−検出すべき標的核酸配列中に存在す るヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る第１の一本鎖ヌクレオチドプローブ （ここで、この第１のプローブは固定手段に固定される）−標的核酸配列中に存 在するヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る第２の化学的もしくは酵素的に 標識されたヌクレオチドプローブ（ここで、この第２のプローブは固定手段に固 定された第１のプローブとハイブリダイズできない）−この第２のプローブの標 識を検出するための手段。その手段はウレアーゼ又はアルカリホスファターゼ、 あるいはルシゲニン添加リポソームと結合する； −請求の範囲第１〜１５項のいずれか一項に記載の化学発光組成物 を包含するキット。
31. ３１．試験媒質中の特定の標的核酸配列を検出及び定量するためのキットであっ て、一つ又はそれ以上の容器内に以下の：−検出すべき標的核酸配列とハイブリ ダイズし得る一本鎖ヌクレオチド配列を包含する第１のポリヌクレオチドプロー ブ（ここで、この第１のプローブは好ましくはストリップ、マイクロタイタープ レート、又はプラスチックルミノメーターバイアルの形態の固体支持体に固定さ れる） −標的核酸配列中に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズできる第２の化 学的もしくは酵素的に標識されたヌクレオチドプローブ（例えばビオチン、ジゴ キシゲニンで標識化）（ここで、この第２のプローブは固体支持体に固定された 第１のプローブとハイブリダイズできない） −上記の標識と結合し得る蛋白質又はその他の任意の物質（ここで、この蛋白質 又はその他の任意の物質は、例えばアビジン又は抗ジゴキシゲニン抗体であって 、ウレアーゼ又はアルカリホスファターゼ、あるいはアクリジン添加リポソーム と結合する）−請求の範囲第１〜１５項のいずれか一項に記載の適切な化学発光 組成物。