JPH0648996B2 - 増幅発光分析 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術分野］ 本発明は、増幅発光分析(enhanced luminescent assay)
（特に免疫分析）に関し、さらにこの分析を使用する診
断用キットに関するものである。本発明に関する発光分
析は、化学発光反応（光を放出する化学反応）に基づく
ものである。発光は、放出された光を検出し或いは測定
することにより分析物の検出もしくは定量を行なうのに
充分な持続時間を一般に有する。本発明に関する化学発
光反応は、2,3-ジヒドロ-1,4-フタラジンジオン（ＤＰ
Ｄ）、特にルミノールもしくはイソルミノールと酸化
剤、特に過酸化水素と触媒、特にペルオキシダーゼ酵素
（これは酸化剤によるＤＰＤの酸化を触媒する）との反
応である。酸化は光の放出を伴う。

［従来技術の説明］ ＤＰＤの上記ペルオキシダーゼ触媒酸化を利用した発光
分析には幾つかの主たる型式があり、その最も一般的な
ものは、西洋ワサビペルオキシダーゼをリガンドに結合
させてこれを標識し、かつ発光反応を用いてこの標識を
検出しまたは定量する方法である。本発明は、専ら異な
る種類の分析、すなわち化学発光性化合物を直接使用し
てたとえば蛋白質、ホルモン、ハプテン、ステロイド、
核酸、代謝物、抗原および／または抗体のようなリガン
ドを標識する分析に関する。たとえばルミノールもしく
はイソルミノールのような化学発光性ＤＰＤを一般にリ
ガンドに結合させる。化学発光は、ペルオキシダーゼと
酸化剤とを反応結合体に添加して検出することができ
る。

発光分析の総説についてはＴ．Ｐ．ホワイトヘッド等に
よりクリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）
第25巻，第1531〜1546頁（1979）に記載されている。

試薬中に増幅剤(enhancer)、すなわち６−ヒドロキシベ
ンゾチアゾール（ＮＲＤＣ社に係るヨーロッパ特許第87
959Ｂ号）、限定した種類から選択されたフェノール
（ＮＲＤＣ社に係るヨーロッパ特許第116454Ｂ号または
米国特許第4,598,044号）或いは限定した種類から選択
された芳香族アミン〔ＮＲＤＣ社に係る英国特許出願第
2162946Ａ号またはヨーロッパ特許公開第219352Ａ号
（ミネソタ・マイニング・アンド・マニュファクチャリ
ング・カンパニー社）を含有させることによって、ペル
オキシダーゼにより触媒されるＤＰＤの化学発光酸化の
感度を増幅することができる。

ヨーロッパ特許出願公開第210449Ａ号（モレキュラ・ダ
イアグノスティックス・インコーポレーション社）にお
いては、アンモニアおよ水溶性有機アミン類が化学発光
反応の増幅剤であると主張されている。特定的に開示さ
れたアミン類は、たとえばスペルミン、スペルミジンお
よびブチレンジアミンのような脂肪族ポリアミン類、第
三アルキルアミン、ピリジン、アゾール、チアジン、ア
リールアミンおよびベンジルアミンである。しかしなが
ら、この特許の明細書には殆んど増幅作用(enhancemen
t)の証明が与えられていない。

これら従来の開示にも拘らず、これらはいずれもＤＰＤ
によるリガンドの直接的標識を用いる分析の増幅作用を
例示しておらず、したがってこの種の分析を高レベルの
光強度まで増幅させるアミン、及びＤＰＤ結合体を存在
させた場合にこれが存在しない場合よりも顕著に大きい
光強度を与えるようなアミンを見出すことが問題であっ
た。

［発明の要点］ 今回、或る種の飽和複素環式アミンがＤＰＤの化学発光
酸化を増幅することが見出された。これらのアミンは、
電子を容易に喪失して陽イオンを形成するという特徴を
有する。これらは、窒素に結合した水素原子が良好に遮
蔽されているか或いは立体障害を有する第三アミンまた
は第二アミンのいずれかである。より明確には、興味あ
るアミン類は一方もしくは両方の橋頭位に窒素原子を有
する飽和二環式化合物または2-位および6-位（窒素に隣
接する炭素原子）に４個の低級（Ｃ_1-4）アルキル基を
有するピペリジン環化合物である。本発明は、利用しう
るヘム基を有する触媒、好ましくはペルオキシダーゼ酵
素、特に好ましくはミクロペルオキシダーゼと酸化剤、
好ましくは過酸化水素と分析すべき物質に相関しうる分
子状残基であるリガンドに結合した化学発光性ＤＰＤと
の間で化学発光反応を生ぜしめ、かつ発生した化学発光
を検出しまたは測定することからなる発光分析もしくは
発光測定分析を提供し、反応をたとえば増幅剤としての
アミンの存在下に行なうことを特徴とする。さらに本発
明は、前記化学発光性ＤＰＤ結合体とペルオキシダーゼ
酵素とアミン増幅剤とからなることを特徴とする、この
分析を使用するためのキットをも包含する。

［好適具体例の説明］ アミン増幅剤は、環置換基を有することができ、或いは
既に置換されたピペリジンの場合には他の環置換基、好
ましくは低級（Ｃ_1-4）アルキル、ヒドロキシ、クロロ
そしくはブロモ基を有することができる。

本発明に使用するのに現在好適な増幅剤アミンは次の通
りである： 1,4-ジアザビシクロ〔2.2.2〕オクタン： （略称「ＤΛＢＣＯ」）、これは最良の増幅剤である。

キヌクリジン： 3-キヌクリジノール： 2,2,6,6-テトラメチルピペリジンおよびその環置換され
た誘導体、特に4-置換誘導体（ここで、Ａは置換基、好
ましくは4-ヒドロキシを示す）。

本発明の範囲に包含されない数種の他の立体障害アミン
は、良好な増幅作用を与えないことに興味が持たれる。
たとえば1,2-ビスモルホリノエタンは、ＤＰＤが存在し
てもしなくても高強度の発光を与えかつその差（増幅作
用）は比較的小さい。これに対し、1,6-ビスピペリジノ
ヘキサンおよびヘキサメチレンテトラミンは、中庸の増
幅作用と低強度の発光を与える。

ＤＰＤと酸化剤とペルオキシダーゼと増幅剤との濃度、
さらに反応温度およびpHは全て発光の強度および増幅作
用の程度に影響を及ぼしうる要因であり、最適結果を得
るには若干の調整が必要とされる。発光信号も、各試薬
を反応させる時間および発光の測定方法に依存する。

ＤＰＤに対する酸化剤および触媒の過剰量が大となる
程、最大強度までの光の発生が急速となる。一般に、そ
れぞれ10²〜10⁶の過剰モルが適当であるが、比較的低強
度の長時間放出が許容されうると考えられる場合にはよ
り低い濃度も使用することができる。

本発明は、上記分析または英国特許第2162946Ａ号に記
載された分析のいれにも用いうるが、特にＤＰＤが直接
的標識であるような分析に用いられる。この種の分析に
おいては、ＤＰＤ標識が慣用の分析である放射性標識も
しくは酵素にとって代る。この種のＤＰＤ標識分析は周
知である〔たとえばＧ．Ｊ．バーナード等，「Alternat
ive Immunoassays」、Ｗ．Ｐ．コリンズ編、ジョン・ウ
ィリー・アンド・サンズ社，英国，チャイチェスター在
（1984），第123〜152頁〕。この場合、ＤＰＤ、好まし
くはルミノールもしくはイソルミノール、を分析すべき
物質にある種の様式で係るたとえばハプテン、抗原もし
くは抗体のようなリガンドに共有結合させる必要があ
る。リガンドは分析すべき物質と同一であるか或いは分
析すべき物質と同等に挙動することができ、或いはその
結合相手とすることもできる。別の方法として、リガン
ドは分析すべき物質に対しより間接的に係ることもで
き、たとえば分析すべき物質が最初に受ける反応の生成
物とすることができる。

一般的に言って、ＥＬＩＳＡ法で知られる種類の分析を
本発明に用いることができる。これらは主としてサンド
イッチ分析、競合分析および置換分析を包含する。本発
明は、たとえばステロイドのようなハプテンの競合分析
および置換分析に対して特に有用である。通常の種類の
競合分析もしくは置換分析において、ＤＰＤ−リガンド
結合体は抗体上の有限数の結合部位に対する分析物（リ
ガンドと類似した或いは同じ構造を有する分析すべき物
質を含有する）と競合する。競合程度は、抗体に対する
結合体および分析物の相対的親和性、並びにその濃度に
依存する。結合体の濃度はＥＬＩＳＡと同様に調節しう
るが、典型的には、0.001〜1000y（ここでｙは分析物の
最大予想濃度である）、好ましくは0.02〜0.5ｙであ
る。

ＤＰＤ標識をこの種の分子に結合させる任意の公知方法
を使用することができる。具体例として、後記実施例に
用いた２種の結合体はエストラジオール／イソルミノー
ルおよびエストロン-3-グルクロナイド／イソルミノー
ルであって、それぞれ下式(5)および(6)を有する： 好適ＤＰＤは英国特許第2162946Ａ号明細書に記載され
たようなものであるが、これらは、ＤＰＤを直接的標識
のために使用すべき場合は、架橋性アームをハプテンな
どに結合させうる基を備えねばならないことが了解され
よう。好適であるルミノールおよびイソルミノールは環
置換基としてアミノ基を有し、これにより架橋性アーム
は式(7)： 〔式中、Ｒは非立体障害性有機基、好ましくはＣ_1-4ア
ルキル基であり、かつｎは２〜６、好ましくは４〜６で
ある〕 のように結合することができる。ＤＰＤの離間したアミ
ン基は、たとえばステロイドのようなリガンドに存在す
るカルボニル基或いはここに導入されたカルボニル基に
アミド結合を介して結合することができる。イソルミノ
ールがルミノールよりも好適である。

好適酸化剤は過酸化水素であるが、化学発光反応の増幅
に関与する公知の酸化剤も使用することができる。その
具体例はt-ブチル−ヒドロペルオキシドである。過硼酸
イオンも使用することができる。他方、たとえば過硫酸
カリウムのような化学発光ＤＰＤ反応において、有効で
なく或いは効果が低いことが知られている酸化剤を避け
ねばならないことは勿論である。

好ましくは、触媒はペルオキシダーゼ酵素、特に好まし
くはミクロペルオキシダーゼである。たとえばヘマチン
もしくはヘモグロビンのような他のヘム含有分子もペル
オキシダーゼの代りに使用することができる。

発光反応は分析過程の生成物に対して行なわれる。たと
えば慣用の不均一系においては、標識が抗原−抗体結合
の結果結合した担体材料を洗浄して、溶液中に存在する
残留標識を除去する。次いで、標識、この場合ＤＰＤ、
を発光反応の開始により検出しまたは定量する。各反応
体は任意の順序で添加しうるが、酸化剤もしくは触媒を
最後に添加することにより、できるだけ不要の反応を最
小化することが好ましい。

発光反応は水媒体中にて中性(pH7)から強アリカリ性(pH
13.8)に至る任意のpHで行ないうるが、極めて高いpHで
は若干のＤＰＤが分解すると思われるので、しばしば1
2.5を越えないことが最良である。pH9もしくはそれ以
上、特に９〜10.5の範囲のpHが最良の結果を与える。

発光反応は15〜30℃の範囲の全ての室温範囲で良好に生
ずる。本発明における格別の利点は、充分な光強度を生
ぜしめるため結合しているリガンドからＤＰＤを分離さ
せる必要がないことである。したがって、従来技術によ
る約60℃までの加熱操作は省略することができる。

本発明による分析の主たる用途は臨床実験である。この
種の実験には、所与の分析手順に用いる材料を分析キッ
トの形態で入手するのが一般的である。ＤＰＤ結合体、
アミン増幅剤および触媒の他に、キットはさらに酸化剤
をも含有するが、多くの場合この材料は別途に供給する
ことができる。

好ましくは、触媒と酸化剤と増幅剤と化学発光性ＤＰＤ
はそれぞれ、本発明の分析に使用するのに好適なものと
して上記したような物質の一種である。本発明による分
析キットにおいて、化学発光性ＤＰＤは適当なリガン
ド、たとえば分析すべき物質に対する抗体に結合され
る。好ましくは、キットはＤＰＤとハプテン、抗原もし
くは抗体との結合体、ＤＰＤの酸化に対する触媒および
アミン増幅剤とを含み、これらをそれぞれ別々の容器に
含有させる。

必要に応じ、分析キットはそれぞれ既知量の分析すべき
物質を含有する１種もしくはそれ以上の標準溶液および
／または好適緩衝溶液の１種もしくはそれ以上および／
または酸化剤をも含有することができる。便宜的には、
分析キットは、さらに分析を実施する過程で発する光を
測定するために使用される装置と組合せて使用するのに
適した反応容器をも含むことができる。さらに、各試薬
の充分な混合を確保するのに使用する混合装置を分析キ
ットに含ませることもできる。

以下の実施例により本発明を説明する。

実施例 １ 下記の実験において、式(5)のエストラジオール−イソ
ルミノール結合体の化学発光を測定した。これらの実験
は、エストラジオールを標識するための、並びに患者の
体液試料中の遊離エストラジオールと標識されたエスト
ラジオールとが所定量の不溶性の抗エストラジオールに
対して競合し、かつ固相に結合した標識の量を測定する
ような競合分析または置換分析を行なうためのイソルミ
ノールの使用の代表例である。試料中の遊離エストラジ
オールの量は、固相上で測定される標識の量に反比例す
る。

次の溶液の混合物を蒸留水（２回蒸留）中で調製して実
験を行なった。

エストラジオール−イソルミノール結合体(1ng／ml）：
100μｌ 英国，ドルセット，プーレ在，シグマ・ケミカル・カン
パニー社からのミクロペルオキシダーゼ（20μｇ／m
l）：100μｌ 過酸化水素(0.3%w/v、すなわち3mg／ml）：100μｌ 増幅剤として試験される添加剤（25mg／ml）：100μｌ 最後にミクロペルオキシダーゼを分析チューブ内の他の
成分の混合物に添加した。混合物のpHを測定した。これ
は結合体の非存在により大して影響されなかった。ＬＫ
Ｂ−ワラック1250型ルミノメータで発光を測定した。培
養時間を設けず、かつ最大ピーク高での発光強度を記録
した。それらの結果を第１表に示す。

増幅剤として試験した添加剤と組合せてルミノール標識
の効果を比較するため、一連の「バックグランド」試験
を行なった。これらの試験においては、結合体を省略
し、各成分はペルオキシダーゼと過酸化水素とアミン増
幅剤とで構成し、400mlに調製した。結合体とペルオキ
シダーゼと過酸化水素と増幅剤（それぞれ100μｌ）と
が全て存在する「増幅剤を用いたときの信号」試験と
「バックグランド試験」との比較はこの分析の有用性を
示した。

増幅剤の代りに100μｌの蒸留水（２回蒸留）を用いた
他の試験において、信号は極めて低く、すなわち、2.93
であった（増幅剤を用いないときの信号は、各反応体を
発光測定前に培養することにより改善することもできた
が、培養に伴う遅延は必らずしも望ましくない）。

試験した全てのアミンは良好な増幅作用を与えたことが
判るであろう。

増幅剤を用いないときの信号は、各反応体を発光測定前
に培養させることにより改善しうるが、培養に伴う遅延
は必らずしも望ましくない。

実施例 ２ この実施例は、遊離ルミノールとミクロペルオキシダー
ゼと過酸化水素とのＤＡＢＣＯによる反応の増幅作用を
示している。これは特に実施例１におけると同様の分析
の代表例であって、遊離ルミノールと結合ルミノールと
が化学発光反応に関与する発光能において同様に挙動す
る（定量的差を有する）ことが知られていることを考慮
した。

容量400μｌの溶液を、特別に蒸留した水を用いて調製
した。使用した各試薬の濃度および容量は次の通りであ
る： Ｈ_２Ｏ_２／ミクロペルオキシダーゼ並びに、１mg／mlの
ルミノール溶液の10^-3，10^-9および10^-11希釈物からの
発光を、ＤＡＢＣＯの存在下およ非存在下で測定した。
50mg／mlのＤＡＢＣＯを用いた典型的な結果を下記第２
表に示す。ＤＡＢＣＯの添加はpHをそれぞれ3.1から10.
8，10.7および10.6まで上昇させた。

次のように結論された： (1) ＤＡＢＣＯはミクロペルオキシダーゼ／ルミノー
ル／Ｈ_２Ｏ_２反応からの発光を増幅した（５〜75倍以
上）。

(2) ＤＡＢＣＯはルミノールの非存在下でミクロペル
オキシダーゼ／Ｈ_２Ｏ_２反応からの発光を僅かに増大さ
せた（20倍以上）。

(3) ＤＡＢＣＯによって増幅されたＭＰ／ルミノール
／Ｈ_２Ｏ_２反応からの発光の速度は迅速かつ閃光的であ
ったが、開始後に僅かに遅延した。

(4) ＤＡＢＣＯは相乗的にルミノールと反応すると思
われる。

実施例 ３ この実施例は、エストラジオールの代謝物である尿エス
トロン-3-グルクロニド（Ｅ_１-3-Ｇ）を測定するための
分析例を示している。この分析は、試験管内の上首尾の
妊娠処置に必須である排卵時期を予測するため、女性に
おける小胞発現を測定するのに有用である。二重一抗体
固相競合免疫分析を用いた。第二抗体、すなわちロバ抗
−ウサギＩｇＧをポリスチレンチューブの壁部に吸着し
た。イソルミノール標識した結合体（Ｅ_１-3-Ｇ−アミ
ノヘキシル−エチル−イソルミノール）と一次抗体（ウ
サギ抗−Ｅ_１-3-Ｇ−ＢＳＡ）とを尿試料と共に培養し
た。液相を除去しかつチューブを充分洗浄した後、チュ
ーブに結合したイソルミノールの量を分析し、その際Ｄ
ＡＢＣＯおよびミクロペルオキシダーゼの水酸化ナトリ
ウム溶液を添加しかつ生じた化学発光を測定した。

試 薬 標準Ｅ_１-3-Ｇはクートールド・インスティチュート・
オブ・バイオケミストリー〔ロンドン，ミドルセックス
・ホスピタル・メデカル・スクール〕のＷ．クールソン
博士により寄贈された。ＤＡＢＣＯ、ミクロペルオキシ
ダーゼ（ＭＰ11）、牛血清アルブミン（ＢＳＡフラクシ
ョンＶ）およびセファロース−プロテインＡはシグマ・
ケミカル・カンパニー・リミテッド社〔英国，ドルセッ
ト、プーレ在〕から購入した。Ｅ_１-3-Ｇ-6-牛血清アル
ブミンに対するポリクローナル抗血清（ウサギ）はバー
ミンガム・ホスピタル・フォー・ウーマン〔英国，バー
ミンガム在〕のＷ．バット博士により寄贈された。ロバ
抗−ウサギ抗血清のＩｇＧフラクションは、プロテイン
Ａ−セファロースＣＬ−4Bに対する親和性クロマトグラ
フィーにより調製した。他の試薬は全て、ＢＤＨ（ロン
ドン）リミテッド社〔英国，ロンドン，エンフィール
ド、ベアード・ロード在〕から入手した。

分析緩衝液は、0.1Ｍ燐酸塩緩衝液とした：すなわち0.1
％のゼラチンと0.9%の塩化ナトリウムとを含有する１
の蒸留水（２回蒸留）に溶解した2.5ｇのオルト燐酸二
水素ナトリウム・２Ｈ_２Ｏ＋11.9gのオルト燐酸水素二
ナトリウム（pH7.4)。ミクロペルオキシダーゼを燐酸塩
緩衝液に溶解し、かつ保存溶液(1mg／ml）を４℃にて保
存した。処理溶液は20μｇ／ml（１：50、v/v）とし
た。さらに、バルビタール緩衝液を次のように調製し
た：0.1%のＢＳＡと0.9%の塩化ナトリウムとを含有す
る。１の蒸留水（２回蒸留）に溶解した14.4gのナト
リウムバルビタール（pH8.6)。酸化剤溶液は、100μｌ
の30%w/v過酸化水素溶液を10mlの蒸留水（２回蒸留）に
添加して調製した。

化学発光性標識結合体の調製 式(7)の6-〔Ｎ-4-アミノヘキシル）−Ｎ−エチル〕アミ
ノ-2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオン（ＡＨＥＩ）
を、従来報告されている方法で合成した。Ｅ_１-3-Ｇに
対するＡＨＥＩの結合およびこの生成物の精製は、エス
トリオール-16-α−グルクロニド−ＡＢＥＩ結合体に関
しＦ．コーエン等により記載された方法〔ステロイド
（Steroids)第36巻，第405〜419頁（1980）〕と同様に
行った。

試料の採取およ希釈 24時間にわたって排出された全尿の試料を、健康な妊娠
していない女性志願者から、その完全な月経周期の期間
中に毎日採取した。尿の全容量を毎日の採取につき記録
した。

抗体被覆チューブ ロバ抗−ウサギＩｇＧを被覆用緩衝液にて適当に希釈し
た（過剰）。各ポリスチレン分析チューブ（ルマキュベ
ット）〔ラボラトリー・インペックス・リミテッド社，
英国，ミドルセックスＴＷ１４ＪＦ，トイッケンハム，
ライオンロード，インペックス・ハウス在〕に前記希釈
液300μｌを添加した。４℃にて１晩培養した後、被覆
用緩衝液を吸引廃棄し、かつ400μｌの分析緩衝液を各
チューブに添加した。22℃にて30分間培養した後、これ
らチューブを４℃にて必要とされるまで貯蔵した。これ
らの条件下で貯蔵した場合、被覆チューブは数ケ月にわ
たり完全に安定であった。

免疫分析法 20μｌの尿または20μｌの標準（０〜1120nmol／の範
囲の分析緩衝液）を第二抗体被覆チューブに２回繰返し
添加した。200μｌのＥ_１-3-Ｇ−ＡＨＥＩ（1ng；約10
0,000カウント／10sec.）および100μｌの適当に希釈し
たポリクローナル抗−Ｅ_１-3-Ｇ抗血清（１：10,000v/
v)を添加し、更にこの混合物を22℃にて30分間培養し
た。次いで、チューブの内容物を吸引除去した。500μ
ｌの分析緩衝液を各チューブに添加し、次いで吸引除去
した。この洗浄工程を２回繰返した。

次いで各チューブに、25g／の濃度でＤＡＢＣＯを含
有する0.2M水酸化ナトリウム溶液200μｌを添加し、次
いで100μｌのミクロペルオキシダーゼ希釈液を添加し
た。最終混合物のpHは13.1であった。次いでチューブを
ルミノメータ（ビオルマット；ラボラトリー・インペッ
クス・リミテッド社）に入れた。100μｌの0.3%w/v過酸
化水素溶液を自動ディスペンサにより急速注入して化学
発光反応を開始させた。ペルオキシダーゼを添加した後
に信号を10秒間にわたり積算しかつその数値を記録し
た。

第３表に示した結果は、分析用の検量曲線を作成すべく
得たものである。Ｅ_１-3-Ｇの８種の濃度を用いた。

実施例 ４ この実施例はエストロン-3-グルクロニド（Ｅ_１-3-Ｇ）
に関する他の分析を示し、ここで発光反応は異なるpHで
行ない、かつ試薬を60℃にて１時間培養し、発光の測定
前に標識を分離させる慣用のイソルミノール標識分析と
比較した。

試 薬 用いた試験は、ポリクローナル抗体の代りにＥ_１-3-Ｇ
に対するモノクローナル抗体を用いた以外は実施例３と
同様にした。

ポリスチレンチューブに抗−Ｅ_１-3-Ｇを付着させるべ
く用いた被覆用緩衝液は0.1M炭酸塩緩衝液(pH10)とし
た。分析緩衝液は１ｇ／のゼラチンを含有する燐酸塩
緩衝塩水（ＰＢＳＧ）(0.1M,pH7.4)とした。ミクロペル
オキシダーゼ（ＭＰ-11)を0.05M燐酸塩緩衝液に溶解さ
せて１mg／mlＰＢＳの保存溶液を調製した。2.6μＭ酵
素（１：50希釈）の処理溶液を分析に用いた。酸化剤で
ある過酸化水素は0.3%w/vとした(100μｌ）。

方 法 Ｅ_１-3-Ｇに対するモノクローナル抗血清(1mg／ml）を
被覆用緩衝液にて500倍希釈し、かつ300μｌを抜取って
各チューブに添加した。４℃にて１晩培養した後、各チ
ューブを吸引しかつ400μｌの分析緩衝液(0.1M，pH7.4)
ＰＢＳＧを添加した。これらのチューブを再び室温にて
30分間培養した後に吸引した。

40〜０ng／mlＰＢＳＧの範囲のＥ_１-3-Ｇの標準を作成
した。100ng／mlの濃度におけるＥ_１-3-Ｇ−ＡＨＥＩの
保存溶液をＰＢＳＧで100倍希釈した。100μｌのＥ_１-3
-Ｇ−ＡＨＥＩ希釈液と100μｌの種々の濃度のＥ_１-3-
Ｇ標準とを被覆チューブに添加することにより、競合分
析を開始した。この混合物を室温で１時間培養し、次い
でこれらチューブを吸引しかつ蒸留水（２回蒸留）で３
回洗浄した。

この時点で３種の異なるモル濃度の１種におけるＮａＯ
Ｈ中のＤＡＢＣＯの10mg／ml溶液100μｌを、ミクロペ
ルオキシダーゼと共に各チューブに添加し、かつ100μ
ｌの過酸化水素を添加して化学発光を開始した。

比較の目的で、ＤＡＢＣＯの代りに水酸化ナトリウム(2
M)を用いた実験を行なった。これらチューブを洗浄した
後、水酸化ナトリウム(300μｌ）を添加しかつチューブ
をさらに60℃にて１時間培養した。チューブを室温まで
冷却した後、ミクロペルオキシダーゼと過酸化水素とを
前記と同様に添加した。実施例３におけると同様のルミ
ノメータで光を測定し、かつ発生した光信号を10秒間に
わたり積算した。

その結果を下記第４表に示す。水酸化ナトリウムの２Ｍ
濃度において、40ng／mlと０標準との信号の差は約32,0
00mV/sであり、これは60℃にて加熱する従来技術の方法
による37,000mV／ｓの差とほぼ同程度であることが判る
であろう。

ＮＳＢ（非特異性結合）を未被覆の チューブ＋Ｅ_１-3-Ｇ−ＡＨＥＩ(100μｌ）＋40ng／ml
Ｅ_１-3-Ｇ(100μｌ）から得た。

実施例 ５ シクロペルオキシダーゼの代りに、蒸留水（２回蒸留）
で１：50希釈したヘマチンの１mg／ml 0.2M ＮａＯＨ
溶液100μｌを用い、かつ濃度10mgおよび20mg／mlのＤ
ＡＢＣＯ溶液を用いた以外は実施例４の手順を繰返し
た。

ヘマチンは良好な増幅作用をもたらし、すなわちゼロＥ
_１-3-Ｇに対する光カウント数は、7,090から69,970mV/s
まで上昇し、かつ40ng／mlのＥ_１-3-Ｇについては7,380
から38,520mV／ｓまで上昇した。

ヘマチンを触媒として用いることにより、良好な検量曲
線が得られた、その結果を第５表に要約して示す。ＤＡ
ＢＣＯを用いずかつ2M ＮａＯＨ中にて60℃でチューブ
を１時間培養する従来技術の方法は、検量曲線を与えな
かった。これは恐らくイソルミノール標識をＡＨＥＩか
ら分離させる際に使用するための触媒としてヘマチンが
鋭敏過ぎるためである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デイビドソン，ロバート・ステイーブン イギリス国、レスター・エル・イー・５・ ６・キユー・ビー、アツピンハム・ロー ド・496

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】利用しうるヘム基を有する触媒と酸化剤と
   分析すべき物質に相関しうる分子状残基に結合した化学
   発光性ジヒドロフタラジンジオン（ＤＰＤ）との間にて
   化学発光反応を生ぜしめ、発生した化学発光を検出しま
   たは測定することからなる発光分析もしくは発光測定分
   析において、一方または両方の橋頭位に窒素原子を有す
   る飽和二環式化合物または２−位および６−位に４個の
   Ｃ_1-4アルキル基を有するピペリジン環化合物からなる
   増幅剤の存在下に前記反応を行うことを特徴とする発光
   分析もしくは発光測定分析。
2. 【請求項２】別々の容器にて、 (1) 利用しうるヘム基を有する触媒 (2) 酸化剤、および (3) 分子状残基に結合した化学発光性ジヒドロフタラ
   ジンジオン（ＤＰＤ） を含む発光分析もしくは発光測定分析を実施するキット
   において、一方または両方の橋頭位に窒素原子を有する
   飽和二環式化合物または２−位および６−位に４個のＣ
   _1-4アルキル基を有するピペリジン環化合物からなる増
   幅剤をさらに含むことを特徴とするキット。