KR101851797B1 - 용액상 균질 검정 - Google Patents

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Abstract

모든 시약이 수용액에 가용성인 경우에 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내에서 분석물을 결정하기 위한 방법, 시약, 키트 및 시스템을 개시한다. 하나의 검정 방법은 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을, 분석물이 존재하는 경우에 활성화제가 그를 활성화시키는 화학발광 화합물과 함께 반응성 입체형태로 되는 조건 하에 처리하는 것을 포함한다. 샘플을 분석물에 관련되지 않은 신호를 감소시키는 물질로 또한 처리한다. 마지막으로, 샘플을 트리거 (trigger) 용액으로 처리하여, 활성화된 화학발광 화합물로부터 광을 생성시킨다. 시약은 표면 또는 다른 고상과 회합되지 않는다.

Description

용액상 균질 검정{SOLUTION PHASE HOMOGENEOUS ASSAYS}
특이적 결합 검정은 물질의 존재 또는 양을 검출하기 위한 시험 방법으로서, 특이적 결합 파트너간의 특이적 인식 및 결합을 기초로 한다. 면역검정은 항체가 특정 단백질 또는 화합물에 결합하는 특이적 결합 검정의 예이다. 이 예에서, 항체는 특이적 결합쌍 멤버의 멤버이다. 핵산 결합 검정은 상보성 핵산 가닥이 특이적 결합쌍인 또 다른 종류이다. 특이적 결합 검정은 질병 상태, 감염성 유기체 및 남용 약물의 정확한 검출을 가능하게 하는 광범위한 성장하는 기술 분야를 구성한다. 필요한 감도, 동적 범위, 견실성, 넓은 적용성 및 자동화 적합성을 갖는 검정 및 검정 방법을 고안하기 위해 많은 노력이 지난 수십 년에 걸쳐 경주되었다. 이들 방법은 넓게 두 개의 범주로 분류될 수 있다.
균질한 방법은 분석물-특이적 및 분석물 비-특이적 반응물 사이의 분리 단계를 필요로 하지 않으면서 검출가능한 신호를 조정하거나 생성하기 위해 분석물-특이적 결합 반응을 이용한다. 불균질 포맷은 분석물-결합된 및 유리된 (분석물에 결합되지 않은) 검출가능하게 표지된 특이적 결합 파트너의 물리적 분리에 의존한다. 분리는 일반적으로 몇몇 종류의 물리적 과정, 예를 들어 여과, 침강, 응집 또는 자성 분리를 이용할 수 있도록 중요 반응물이 몇몇 종류의 고체 기재에 고정될 것을 필요로 하고, 일반적으로 유리된 검출가능하게 표지된 특이적 결합 파트너를 제거하기 위한 세척 단계도 필요로 한다.
화학발광 신호를 생성하고 이를 분석물의 양에 관련시키는 것에 의존하는 검정 방법의 사용이 증가하고 있다. 상기 방법은 비교적 간단한 기구를 사용하여 수행할 수 있고, 양호한 검정 특징을 보일 수 있다. 특히, 검출을 위해 분석물에 대한 효소-표지된 특이적 결합 파트너 및 화학발광 효소 기질을 사용하는 방법이 널리 사용되고 있다. 통상적인 표지 효소는 알칼리성 포스파타제 및 양고추냉이 퍼옥시다제를 포함한다.
미국 특허 6,911,305에는 제1 필름 상의 증감제 (sensitizer) 또는 증감제-표지된 프로브에 결합된 폴리뉴클레오티드 분석물의 검출 방법이 개시되어 있다. 필름은 고정된 화학발광 전구체를 함유하는 제2 필름과 접촉된다. 샌드위치된 (sandwiched) 필름 내에서 증감제를 여기시키면, 제2 필름 상에 촉발가능한 (triggerable) 화학발광 화합물을 생성하기 위해 화학발광 전구체와 반응하는 일중항 산소가 생성된다. 촉발가능한 화학발광 화합물은 시약과 반응하여, 분석물을 검출하기 위해 제2 필름 상에 화학발광을 생성한다. 상기 방법은 반응물을 접촉하기 위해 특이적 결합 반응에 의존하지 않고; 오히려 제2 필름은 시약 전달 장치로서 기능한다.
미국 특허 6,406,913에는 분석물이 감광제 및 화학발광 화합물을 아주 근접하도록 만드는 조건 하에서 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 매질을 처리하는 것을 포함하는 검정 방법이 개시되어 있다. 감광제는 광원으로 조사될 때 일중항 산소를 생성하고; 일중항 산소는 용액을 통해 확산되고, 아주 근접할 때 화학발광 화합물을 활성화시킨다. 활성화된 화학발광 화합물은 이어서 광을 생성한다. 생성되는 광의 양은 매질 내의 분석물의 양과 관련된다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 감광제 또는 화학발광 화합물은 현탁가능 입자와 회합되고, 특이적 결합쌍 멤버가 여기에 결합된다.
미국 특허 출원 공개 US20070264664 및 US20070264665에는 특이적 결합 반응 때문에 반응성 입체형태가 되는 활성화제 화합물과 고정된 화학발광 화합물의 반응을 수반하는 특이적 결합쌍 검정을 수행하기 위한 검정 방법이 개시되어 있다. 과량의 결합되지 않은 화학발광 화합물 또는 활성화제의 분리 또는 제거가 필요하지 않다. 상기 검정 포맷은 선행 검정 기술에 비해 우수한 작동 편리성 및 자동화 적응성을 제공한다. 이러한 잇점에도 불구하고, 검정 설계 및 성능에 대한 추가의 개선이 분석 개발자의 목표가 되고 있다. 본 발명의 개시내용의 검정 방법은 감도가 개선된 간단한 검정 방법을 제공함으로써 상기 필요성을 해결한다.
<개요>
모든 시약이 수용액에 가용성인 경우에 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내에서 분석물을 결정하기 위한 방법, 시약, 키트 및 시스템을 개시한다. 하나의 검정 방법은 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을, 분석물이 존재하는 경우에 활성화제가 그를 활성화시키는 화학발광 화합물과 함께 반응성 입체형태로 되는 조건 하에 처리하는 것을 포함한다. 샘플은 분석물에 관련되지 않은 신호를 감소시키는 물질로 또한 처리한다. 마지막으로, 샘플을 트리거 (trigger) 용액으로 처리하여, 활성화된 화학발광 화합물로부터 광을 생성시킨다. 시약은 표면 또는 다른 고상과 회합되지 않는다.
<설명>
정의
알킬 - H 이외의 다른 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 1-20개의 탄소를 함유하는 분지쇄, 직쇄 또는 시클릭 탄화수소기. 본원에서 사용되는 저급 알킬은 8개 이하의 탄소를 함유하는 알킬기를 의미한다.
분석물 - 검정에서 검출되는 샘플 내의 물질. 분석물을 검출하기 위해 분석물에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 물질이 사용될 것이다. 분석물은 단백질, 펩티드, 항체, 또는 그에 대해 결합하는 항체가 제조될 수 있는 합텐일 수 있다. 분석물은 상보성 핵산 또는 올리고뉴클레오티드에 의해 결합되는 핵산 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 분석물은 특이적 결합쌍의 멤버를 형성하는 임의의 다른 물질일 수 있다. 다른 예시적인 종류의 분석물은 약물, 예를 들어 스테로이드, 호르몬, 단백질, 당단백질, 점액단백질, 핵단백질, 인단백질, 남용 약물, 비타민, 항균제, 항진균제, 항바이러스제, 퓨린, 항신생물제, 암페타민, 아제핀 화합물, 뉴클레오티드, 및 프로스타글란딘, 및 임의의 상기 약물의 대사산물, 살충제 및 살충제의 대사산물, 및 수용체를 포함한다. 또한, 분석물은 세포, 바이러스, 세균 및 진균을 포함한다.
활성화제 - 트리거 (trigger)의 존재 하에 화학발광이 생성되도록 화학발광 화합물의 활성화를 초래하는, 표지로도 언급될 수 있는 화합물.
활성화제-표지된 sbm 또는 활성화제-특이적 결합 멤버 접합체 - 적어도 다음을 연결된 입체형태로 포함하는 검정 혼합물 내의 반응물질: a) 분석물에 대한 특이적 결합 멤버 및 b) 화학발광 화합물의 활성화를 초래하는 활성화제 화합물 또는 표지.
항체 - 전체 면역글로불린 및 천연 및 조작된 단편을 포함한다.
아르알킬 - 아릴기로 치환된 알킬기. 그 예는 벤질, 벤지히드릴, 트리틸, 및 페닐에틸을 포함한다.
아릴 - H 이외의 다른 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있는 1 내지 5개의 카르보시클릭 방향족 고리를 함유하는 방향족 고리-함유 기.
생물학적 물질 - 예를 들어 전혈, 항응고처리된 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 동물 및 식물 세포, 세포 내용물, 바이러스, 및 진균을 포함한다.
화학발광 화합물 - 예를 들어 전자적으로 여기된 상태에서 형성된 또 다른 화합물로 전환됨으로써 광의 방출을 야기하는 반응을 겪는, 표지로도 언급될 수 있는 화합물. 여기된 상태는 일중항 또는 삼중항 여기된 상태일 수 있다. 여기된 상태는 기저 상태로 이완시에 직접 광을 방출할 수 있거나 또는 여기 에너지를 방출 에너지 수용자로 전달하여, 기저 상태로 복귀할 수 있다. 에너지 수용자는 이 과정에서 여기된 상태가 되고, 광을 방출한다.
화학발광-표지된 고정된 sbm - 적어도 다음을 연결된 입체형태로 포함하는 검정 혼합물 내의 반응물질: a) 분석물에 대한 특이적 결합 멤버, b) 활성화제 화합물 또는 표지, 및 c) 고상.
연결된 - 본원에서 사용되는 바와 같이, 2 이상의 화학물질 종 또는 지지체 물질이 예를 들어 하나 이상의 공유 결합에 의해 화학적으로 연결되거나, 또는 예를 들어 흡착, 이온 인력, 또는 특이적 결합 과정, 예를 들어 친화도 결합에 의해 수동적으로 부착됨을 나타낸다. 상기 종 또는 물질이 서로 연결될 때, 2 종류 이상의 연결이 수반될 수 있다.
용량 반응 - 샘플에서 결정되는 분석물의 양에 관련되는 검정 반응으로부터 신호, 예를 들어 화학발광 출력.
헤테로알킬 - 적어도 하나의 고리 또는 비-말단 사슬 탄소 원자가 N, O, 또는 S로부터 선택되는 헤테로원자로 교체된 알킬기.
헤테로아릴 - 1 내지 3개의 고리 탄소 원자가 N, O, 또는 S로부터 선택되는 헤테로원자로 교체된 아릴기. 예시적인 기는 피리딜, 피롤릴, 테에닐, 푸릴, 퀴놀릴 및 아크리디닐기를 포함한다.
샘플 - 분석에서 측정되는 분석물을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 혼합물. 분석물은 예를 들어 단백질, 펩티드, 핵산, 호르몬, 항체, 약물, 및 스테로이드를 포함한다. 본원의 방법에 사용될 수 있는 일반적인 샘플은 체액, 예를 들어 수집된 혈액 시료에서 통상 발견되는 항응고처리된 혈액일 수 있는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 정액, 타액, 세포 배양액, 조직 추출물 등을 포함한다. 다른 종류의 샘플은 용매, 해수, 산업용수 샘플, 음식 샘플 및 환경 샘플, 예를 들어 토양 또는 물, 식물 물질, 진핵생물, 세균, 플라스미드, 바이러스, 진균, 및 원핵생물에서 기원하는 세포를 포함한다.
sbp - 특이적 결합쌍 멤버 또는 특이적 결합 파트너는 또 다른 물질, 예를 들어 분석물에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 생물학적 분자를 포함하는 분자이다. 바람직하게는 분석물 상의 상이한 결합 부위를 갖는, 분석물에 대한 2개의 특이적 결합 파트너는 특이적 결합쌍으로 언급된다.
SSIA (선택적인 신호 억제제) - 비-특이적 신호 또는 배경 신호가 검정 반응 혼합물의 화학발광 생성 반응으로부터 발생한 분석물-특이적 신호보다 더 큰 양으로 감소되도록 본 발명의 개시내용의 검정 반응 혼합물에 제공되는 화합물.
고체 지지체 - 검정 성분이 고정되는 표면을 갖는, 크기가 적어도 1 마이크로미터인 물질. 물질은 입자, 미세입자, 나노입자, 금속 콜로이드, 섬유, 시트, 비드, 막, 필터 및 다른 지지체, 예를 들어 시험관, 마이크로웰, 칩, 유리 슬라이드, 및 마이크로어레이의 형태일 수 있다.
가용성, 용해도, 가용화하다 - 한 물질이 다른 물질에 균일하게 블렌딩하는 능력 또는 경향. 본 발명의 개시내용에서, 용해도 및 관련 용어는 일반적으로 액체 내의 고체, 예를 들어 수성 버퍼 내의 SSIA의 특성을 의미한다. 고체는 그의 결정 형태를 상실하고 용매 (예를 들어 액체) 내에 분자상 또는 이온상 용해 또는 분산되어 참용액을 형성하는 정도로 가용성이다. 이와 달리, 2상 시스템에서는, 한 상이 침전을 막도록 안정화되거나 또는 불안정화된, 물질 전체에 걸쳐 분포된 작은 입자 (미세입자 또는 콜로이드 크기 입자 포함)로 구성된다.
치환된 - 기 상의 적어도 하나의 수소 원자가 비-수소기로 대체됨을 의미한다. 치환된 기를 언급할 때, 분명하게 달리 표시되지 않으면 여러 치환점이 존재할 수 있음을 유의하여야 한다.
반응 용기 - 본 발명에 따른 분석의 샘플 및 다른 성분을 보유하는 용기 또는 장비. 예를 들어, 다양한 크기 및 형태의 시험관, 마이크로웰 플레이트가 포함된다.
본 발명의 개시내용은 균질 검정 방법, 특히 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너 및 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너 접합체 및 분석물의 결합 후에 분석물의 화학발광 검출을 사용하는 균질 검정 방법을 제공한다. 균질 검정 및 방법은 복합체에서 결합된 특이적 결합 파트너로부터 유리된 특이적 결합 파트너를 분리하지 않으면서 수행된다.
본 발명의 개시내용은 특이적 결합쌍 반응에 의해 물질의 존재, 위치, 또는 양을 검출하기 위한, 신속하고 간단한 검정 방법을 제공한다. 분석은 용액상 내의 제1 특이적 결합 파트너와 연결된 화학발광 화합물 ("화학발광-표지된 sbp"), 제2 특이적 결합 파트너에 접합된 활성화제 화합물 ("활성화제-표지된 sbp"), 선택적인 신호 억제제 ("SSIA"), 인핸서 및 트리거 용액의 사용을 필요로 한다.
다른 균질 검정과 달리, 본 발명의 개시내용의 기본적인 실시양태에서, 활성화제-표지된 sbp 및 화학발광-표지된 sbp를 포함하는 모든 반응물은 수용액에 가용성이다. 사실상, 본 발명의 개시내용의 분석은 고상을 필요로 하거나 이용하지 않는다. 또한, 본 발명의 검정 방법은 특수한 구성체, 즉 불활성화되거나 또는 단지 또 다른 성분과 복합체에서 결합된 후에 검출가능한 특정 신호를 생성할 수 있는 검출가능한 성분을 사용하여 설계되는 표지된 특이적 결합쌍 멤버를 필요로 하지 않는다는 점에서 다른 균질 검정 방법과 상이하다. 본 발명의 개시내용의 검정 시스템과 달리, 다른 균질 검정 시스템은 상기 특수한 성분을 필요로 하기 때문에 복잡하거나, 어렵거나 또는 고가이다. 본 발명의 분석은 검정 설계 및 개발에 대한 보다 간단하고, 보다 탄력적인 방법을 제공하고, 매우 다양한 분석물에 보다 쉽게 적용될 수 있다. 본 발명의 검정 방법은 복합체에 결합된 특이적 결합 파트너로부터 유리된 특이적 결합 파트너를 구분하기 위한 분리 단계 또는 과정을 이용하지 않는다는 점에서 통상적인 불균질 또는 분리-기반 검정 방법과 상이하다. 분리가 필요없는 본 발명의 검정 방법을 사용함으로써, 분석의 수행이 단순화되고, 검정 횟수가 감소되고, 자동화가 용이해진다.
본 발명의 개시내용의 검정 방법에서, 화학발광-표지된 sbp, 활성화제-표지된 sbp, 및 선택적인 신호 억제제 ("SSIA")는 샘플이 존재하는 수용액 내에서 함께 모이게 된다. 한 실시양태에서, sbp 멤버에 의해 인식되는 분석물이 샘플에 존재할 때, 화학발광-표지된 sbp 및 활성화제-표지된 sbp는 각각 분석물의 상이한 영역에 결합한다. 분석물에 관련된 특이적 신호가 생성되고, 검출은 트리거 용액의 첨가시에 개시된다. 또 다른 실시양태에서, 분석물의 화학발광-표지된 유사체가 경쟁적 검정 포맷에서 사용하기 위해 제공된다. 분석물 및 화학발광-표지된 유사체는 활성화제-표지된 sbp에 경쟁적으로 결합한다. 경쟁적 결합 검정의 한 실시양태에서 화학발광-표지된 유사체와 활성화제-표지된 sbp의 복합체가 예비형성되고, 분석물이 표지된 유사체를 교체하기 위해 첨가될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화학발광-표지된 유사체, 분석물, 및 활성화제-표지된 sbp는 결합 복합체의 예비형성 없이 함께 혼합될 수 있다. 분석물에 관련된 특이적 신호가 생성되고, 검출은 트리거 용액의 첨가시에 개시된다. 신호는 상기 검정 포맷에서 분석물 농도와 반비례 관계이다.
분석물에 대한 특이적 결합 파트너의 결합에 의해, 활성화제는 화학발광 화합물에 작용가능하게 근접하여 트리거 용액의 첨가시에 화학발광을 생성하는 반응을 효과적으로 활성화한다. 활성화제와 화학발광 화합물의 반응은 트리거 용액 처리에 의해 광을 생성하는 추가의 반응이 유발되도록 화학발광 화합물을 활성화하거나 변경한다. 작용가능한 근접은 화학발광 화합물 및 활성화제가 반응할 수 있기에 충분히 근접함 (물리적 접촉 포함)을 의미한다. 과량의 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너 및/또는 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너는 분석물 농도의 결정에 필요한 양으로 시스템에 제공될 수 있다. 과잉의 결합되지 않은 활성화제-표지된 sbp 및/또는 결합되지 않은 화학발광 접합체는 검정 시스템 내의 그의 존재 및 고상의 부재가 화학발광 검출 신호가 분석물의 양과 정확하게 상호관련되는 것을 억제하지 않기 때문에 트리거 용액의 첨가 및 검출 전에 제거되지 않는다. 결합되지 않은, 표지된 특이적 결합 파트너는 동일한 화학발광 검출 반응을 겪을 수 있고 반응물은 고상에 연결되지 않기 때문에, 신호와 분석물의 유용한 상호관계가 존재하지 않거나 있다 하여도 매우 제한된 상호관계만이 존재할 것으로 예상된다. 통상적인 지식에 따르면, 이러한 특징 때문에 분석은 통상적으로 실패할 것이다.
놀랍게도, 상기 문제는 본 발명의 방법에서 선택적인 신호 억제제를 사용함으로써 극복되었다. 본 발명의 방법에서, 고상에 연결되지 않은 용액 내의 반응물 및 제거되지 않은 과잉의 활성화제 및/또는 과잉의 화학발광 화합물의 존재는 민감한 특이적 분석물-농도 의존적 결합 검정을 수행하는 능력을 손상시키지 않는다. 이러한 발견은 예상되거나 예측가능한 것이 아니었다. 특히, 활성화제는 그가 반응하는 분자가 용액에 존재하지 않을 때 통상적으로 1초마다 수백 내지 수천 개의 반응성 전환을 유도하는 효소와 같은 촉매일 때, 결합된 활성화제가 넓은 범위의 분석물 농도에 걸쳐 용량 반응성 신호를 생산하기 위해 유리된 활성화제 반응과 유용하게 구분될 수 있을 것으로 예상되지 않을 것이다. 그러나, 본 발명자들은 특정 SSIA 화합물을 첨가하면 우수한 구분이 가능함으로 밝혀내었다. SSIA의 사용에 의해, 표지된 특이적 결합쌍 멤버와 분석물의 복합체로서의 반응성 입체형태에서 화학발광 표지와 활성화제 표지 사이의 반응에 의해 생성된 신호 대 존재하지만 상기 복합체에는 존재하지 않는 표지로부터의 신호의 비가 비약적으로 개선된다.
분석 감도를 개선하는데 있어서 SSIA의 기능은 도식 1을 참조하여 이해된다. 유리된 (예를 들어, 분석물에 결합되지 않은) 및 복합체화된 (예를 들어, 분석물에 결합된) 화학발광-표지된 sbp ("CLSBP") 및 활성화제-표지된 특이적 결합쌍 ("ALSBP")의 다수의 상이한 조합이, 트리거 용액이 첨가될 때 관찰된 화학발광 신호에 기여할 수 있다. 4개의 제안된 반응 도식을 아래 나열한다:
1 결합된-ALSBP + 결합된-CLSBP -> 특이적 신호
2 결합된-ALSBP + 유리-CLSBP -> 비-특이적 신호
3 유리-ALSBP + 결합된-CLSBP -> 비-특이적 신호
4 유리-ALSBP + 유리-CLSBP -> 비-특이적 신호
상기 도식에 제시된 바와 같이, 4개의 상이한 종류의 화학발광제-활성화제 쌍은 반응 혼합물에서 반응할 수 있지만; 단지 제1 종류만이 분석에서 분석물의 양과 관련될 수 있는 신호를 생성한다. SSIA는 반응 1의 신호의 양과 관련하여 반응 2-4로부터의 신호의 양을 선택적으로 억제하거나 저하시킴으로써 그의 놀라운 기능을 수행한다. 일부 실시양태에서, 이는 모든 4개의 반응을 감소시킴으로써 발생할 수 있지만, 2-4로부터의 신호를 비례적으로 훨씬 더 감소시킴으로써 발생할 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, 분석물 및 분석물에 대한 특이적 결합 파트너 (sbp)를 수반하는 특이적 결합 반응에 의해 샘플에서 관심있는 분석물을 분석하는 방법을 제공하고, 여기서 하나의 특이적 결합 파트너가 효소, 특히 퍼옥시다제 효소와 같은 촉매일 수 있는 활성화제 화합물로 표지된다. 분석물에 대한 또 다른 특이적 결합 파트너는 화학발광 화합물로 표지된다. 표지된 sbp 및 분석물의 결합은 표지된 복합체를 형성한다. 화학발광 화합물은 트리거 용액이 첨가될 때 활성화제에 의해 유도되는 화학발광 반응을 겪는다. 생성되는 화학발광은 샘플 내의 분석물의 양에 관련된다. 특이적 결합쌍 반응 및 화학발광 반응은 용액, 일반적으로 수용액에 용해된 모든 성분을 사용하여 수행된다. 유의하게, 표지된 특이적 결합 파트너는 표지된 sbp 모두가 분석물과 복합체를 형성하지는 않도록 샘플 내의 분석물의 양에 대해 과량으로 제공된다. 과잉의 표지된 sbp는 화학발광 반응에 참여할 수 있을지라도 반응 용액으로부터 제거되지 않는다. 복합체에 존재하지 않고 제거되지 않는 표지된 sbp의 반응성은, 분석물에 의해 매개되는 복합체 형성의 존재에 의한 것이 아닌, 허용될 수 없을 정도로 높은 신호가 생성되기 때문에 상기 균질 검정의 수행을 통상 억제한다. 많은 경우에, 유용한 용량-반응 관계가 유도될 수 없는 상당히 높은 "배경" 신호가 생성된다. 화학발광 신호 생성을 위해 필요한 모든 반응 성분이 결합 복합체에 및 유리된 또는 결합되지 않은 형태에 모두 존재할 때 균질한 비분리 검정을 수행할 수 있도록 하기 위해, 결합된 및 결합되지 않은 표지된 sbp를 구분하기 위한 물리적 분리 이외의 다른 일부 수단이 제공되어야 한다. 본 발명은 상기 문제에 대한 오랫동안 찾던 해결책을 제시하고, 모든 성분이 용액에 존재하고, 분리를 수행하지 않는 검정 방법을 제공한다. 공지의 균질 검정 방법과는 달리, 본 발명의 방법은 결합 복합체에 존재하지 않는다면 신호 생성 반응을 겪을 수 없는 특수 설계된 표지된 결합 파트너를 필요로 하거나 사용하지 않는다.
본 발명에 의해 구현되는 검정 방법에서, 유리된, 결합되지 않은 표지된 sbp 멤버로부터 분석물과의 복합체에 결합된 표지된 sbp 멤버의 필요한 구분은 선택적인 신호 억제제 (SSIA)를 반응 용액에 제공함으로써 달성된다. 반응 용액에 대한 효과적인 양의 SSIA의 첨가는 결합된 표지된 sbp 멤버로부터의 신호 (신호)가 그의 부재시에 발행하는 것보다 유의하게 더 큰 정도로, 결합되지 않은 표지된 sbp 멤버로부터의 임의의 신호 기여를 포함하는 배경 신호를 초과하도록 만든다. 상기 신호 대 배경 관계의 개선이 달성될 때, 검출 감도의 보다 높은 수준을 포함하여 분석의 유용성이 증가한다.
한 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp 및 활성화제-표지된 sbp가 분석물의 존재로 인한 적어도 하나의 특이적 결합 반응을 통해 작용가능하게 근접하고, 결합된 활성화제-표지된 sbp는 분석물의 존재, 위치 또는 양을 검출하기 위한 트리거 용액의 첨가시에 화학발광을 생성하는 반응을 활성화하는 검정 방법, 특히 결합 검정 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 또한 분석물과 특이적으로 연결된 양을 훨씬 초과하는 양으로 존재하는 결합되지 않은 활성화제-표지된 sbp를 제거하지 않는다는 점에서 통상적인 시험 방법과 상이하다. 과잉의 결합되지 않은 활성화제 활성화제-표지된 sbp의 세척 또는 분리가 불필요하다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 또한 분석물과 특이적으로 연결된 양을 초과하는 양으로 존재하는 결합되지 않은 화학발광 접합체를 제거하지 않는다. 과잉의 결합되지 않은 화학발광 접합체의 세척 또는 분리가 불필요하다.
검정 성분, 즉 분석물을 함유하는 샘플, 활성화제-표지된 sbp, 화학발광-표지된 고정된 sbp, 선택적인 신호 억제제 및 트리거 용액은 세척 또는 분리를 수행하지 않으면서 순차적으로 시험 용기에 첨가되고, 발광을 판독할 수 있다. 한 실시양태에서, 마지막으로 첨가되는 트리거 용액 이외의 다른 검정 성분은 임의의 순서로 또는 조합되어 시험 용기에 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플 및 활성화제-표지된 sbp는 예비혼합되어, 트리거 용액의 도입 전에 화학발광-표지된 sbp가 존재하는 시험 용기에 첨가될 수 있다.
화학발광 기질 및 효소 표지된 접합체를 사용하는 통상적인 분석은 표지 효소의 양을 훨씬 초과하는 양의 화학발광 기질을 제공한다. 종종, 기질/효소의 몰비는 종종 10의 9제곱을 초과할 수 있다. 즉, 10억배 과량일 수 있다. 연속적인 효소적 전환을 위한 적절한 기질 공급을 보장하기 위해 상기 막대한 과량의 화학발광 화합물을 공급하는 것이 통상적인 분석에 필요하고 이러한 과정이 검정 방법에서 적절한 검출 감도를 보장하는 것으로 생각된다. 본 발명자들은 화학발광 화합물 대 활성화제의 비율을 10의 몇 제곱만큼 감소시키는 고도로 민감한 검정 방법을 고안하는 것이 가능함을 밝혀내었다. 이 점에 있어서, 본원에서 설명되는 이들 방법은 공지의 효소-연결 검정 방법과 근본적으로 상이하다.
상기 기재되고 아래에서 설명되는 예시적인 분석에서 제시되는 바와 같이 세척 및 분리 단계의 제거는 검정 프로토콜의 설계를 단순화할 기회를 제공한다. 작동 단계의 수 감소는 검정 시간, 불완전 세척에 의한 분석간 변동성 및 비용을 감소시킨다. 이와 동시에, 검정 수행을 자동화 및 소형화하는 능력이 향상되고, 자동화 및 소형화에 따른 모든 고유한 잇점을 갖는다.
본 발명의 방법에 따라 수행되는 분석은 관심있는 분석물에 특이적으로 결합하거나 포획하기 위한 특이적 결합 파트너 ("sbp")의 제공을 포함한다. 특이적 결합 파트너는 검출되는 분석물에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특이적 결합 파트너에는 그에 대해 직접 또는 간접적으로 부착된 화학발광 표지 화합물이 추가로 제공된다. 화학발광 표지는 아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이 많은 상이한 방식으로 제공될 수 있다. 각각의 변형 방법에서, 화학발광 표지는 "화학발광-표지된 sbp"의 수성 용해도를 유지하는 방식으로 특이적 결합 파트너와 직접 또는 간접적으로 안정하게 또는 비가역적으로 연결된다. "비가역적으로"는 화학발광 표지가 의도된 분석의 사용 조건 하에서 화학발광-표지된 sbp로부터 실질적으로 제거되지 않음을 의도한다. 표지가 사용 조건 하에서 화학발광-표지된 sbp 상에 안정하게 부착되어 유지된다면, 수동적 또는 비공유 부착도 고려된다.
검정은 분석물을 갖는 활성화제-표지된 sbp 및 분석물에 대한 특이적 결합 파트너에 연결된 화학발광-표지된 sbp를 제공하고, 성분들이 특이적 결합 복합체를 형성하도록 허용하는 것을 추가로 포함한다. 샘플, 화학발광-표지된 sbp, 및 활성화제-표지된 sbp는 별개로 임의의 순서로 또는 임의의 조합으로 순차적으로 또는 동시에 첨가될 수 있거나, 또는 예비혼합되어 조합물로서 첨가될 수 있다. 일반적으로, 분석물이 표지된 sbp 멤버에 결합하도록 허용하는 시간이 필요할 것이다. 이것은 결합 반응이 발생하도록 허용하는 선택적인 지연 시간에 의해 결합 성분이 순차적으로 첨가되는 일부 실시양태에서 달성될 수 있다.
결합 복합체가 형성된 후에, 트리거 용액이 분석물을 검출하기 위한 화학발광을 생성하기 위해 첨가되고, 화학발광이 검출된다. 일반적으로, 피크 광 강도 수준, 또는 광 강도는 고정된 시간 간격 동안 통합되거나, 또는 총 통합 광 강도가 측정된다. 생성되는 광의 양은 반응 용기에 담긴 샘플에 존재하는 분석물의 양과 관련된다. 광의 양은 일반적으로 공지된 방법에 따라 교정 곡선을 작성함으로써 분석물의 수치적인 양을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 트리거 용액의 첨가시에 광 방출이 신속하게 발생할 때, 적합한 주입기를 사용한 첨가에 대해 측정 개시 시간을 기계적으로 정하거나 또는 검출기에 이미 노출된 시험 장치를 사용하여 첨가를 수행하는 것이 바람직하다. 반응물의 최적량, 부피, 희석, 특이적 결합쌍 반응에 대한 인큐베이션 시간, 반응물의 농도 등은 특이적 결합 검정의 수행 방법에 대한 표준 논문을 참고로 하고 아래에서 상세하게 설명되는 구체적인 예를 지침으로 사용하여 통상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명의 방법 및 분석에 사용되는 sbp 멤버의 농도 또는 양은 분석물 농도, 요구되는 결합 속도/검정 시간, 접합체의 비용 및 이용가능성, sbp 멤버의 비특이적 결합 정도와 같은 요인에 따라 결정될 것이다. 대체로, sbp 멤버는 적어도 예상되는 최소 분석물 농도와 동일한 농도로, 보다 대체로는 적어도 예상되는 최고 분석물 농도 또는 그보다 높은 농도로 존재할 것이고, 비경쟁적 검정의 경우, 농도는 최고 분석물 농도의 10 - 106배이지만, 대체로 10-4 M 미만, 바람직하게는 10-6 M 미만, 종종 10-11 내지 10-7 M일 수 있다. sbp 멤버와 연결된 활성화제 또는 화학발광 화합물의 양은 대체로 sbp 멤버당 적어도 하나의 분자일 것이고, 102개만큼 많을 수 있다. 많은 실시양태에서, sbp 멤버와 연결된 활성화제 또는 화학발광 화합물의 양은 1 내지 20개의 분자이다. 활성화제 대 화학발광 화합물의 예 및 다른 비는 작용 실시예에 제공된다.
화학발광- 표지된 SBP
방법은 제1 특이적 결합 파트너와 연결된 화학발광 화합물 ("화학발광-표지된 sbp")의 사용을 필요로 한다. 본 발명의 개시내용의 검정 및 방법에서, 화학발광-표지된 sbp는 수용액에서 가용성이다. 본 발명의 개시내용의 검정 및 방법에서, 화학발광 표지 화합물은 다른 친화도 검정 및 방법에서 볼 수 있는 바와 같은 고체 표면, 예를 들어 입자, 다중웰 플레이트, 또는 막, 필터, 시험관, 딥스틱 (dipstick), 또는 피펫 팁 (tip)에 고정되지 않는다.
화학발광-표지된 sbp는 화학발광 표지 화합물 및 특이적 결합쌍의 멤버를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp는 하나 이상의 화학발광 표지 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp는 특이적 결합쌍의 멤버의 하나 이상의 카피를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학발광 표지 화합물은 특이적 결합쌍의 멤버의 하나 이상의 카피에 직접 연결된다. 다른 일부 실시양태에서, 하나 이상의 화학발광 표지 화합물은 특이적 결합쌍의 멤버의 하나의 카피에 직접 연결된다. 직접-표지된으로도 언급되는 직접적인 연결은 공유 결합 상호작용, 이온 결합 상호작용, 및 소수성 상호작용을 포함한다. 한 실시양태에서, 화학발광 표지는 분석물에 대한 특이적 결합 파트너에 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, 화학발광 표지 화합물은 특이적 결합쌍의 멤버의 하나 이상의 카피에 간접적으로 연결된다. 다른 일부 실시양태에서, 하나 이상의 화학발광 표지 화합물은 특이적 결합쌍의 멤버의 하나의 카피에 간접적으로 연결된다. 간접적인 연결은 화학발광 표지 화합물 및 특이적 결합쌍의 멤버 이외에 보조 물질을 포함한다.
보조 물질은 수용액에 가용성이다. 하나 이상의 보조 물질을 포함하는 화학발광-표지된 sbp는 수용액에 가용성이다.
다양한 실시양태에서, 보조 물질은 가용성 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘, 아비딘, 뉴트라비딘, 비오틴, 양이온화 BSA, fos, jun, 키홀 림펫 (keyhole limpet) 헤모시아닌 "KLH", 천연 또는 조작된 면역글로불린 및 그의 단편 또는 일부, 가용성 합성 덴드리머 (예를 들어, PAMAM), 가용성 합성 중합체 (예를 들어 폴리아크릴산 "PAA"), 가용성 천연 중합체 (예를 들어, 다당류, 예를 들어 관능화된 덱스트란, 아미노-덱스트란, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 및 이들의 임의의 조합), 리포좀, 미셀 (micelle), 및 베시클 (vesicle), 및 하나 이상의 가용성 합성 중합체, 가용성 천연 중합체, 및 가용성 단백질의 조합 (예를 들어, IgG/비오틴/스트렙타비딘/PAA)을 포함한다. 수용액에 가용성이고 하나 이상의 화학발광 표지 화합물 및/또는 sbp에 대한 부착을 위해 관능화될 수 있는 다른 보조 물질이 개시된 방법 및 분석에서 사용하기 위해 고려된다.
일부 실시양태에서, 화학발광 표지가 공유 연결되는 보조 물질은 단백질 또는 펩티드이다. 예시적인 가용성 단백질은 알부민, 아비딘, 스트렙타비딘, 아비딘, 알파-나선 단백질, fos, jun, 키홀 림펫 헤모시아닌 "KLH", 천연 또는 조작된 면역글로불린 및 그의 단편 또는 일부, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 보조 물질은 보편적인 항체, 예를 들어 IgG이고, 화학발광 표지는 분석물 특이적 포획 항체에 대한 그의 결합 친화도를 유지하는 방식으로 보편적인 항체에 공유 연결된다. 또 다른 화학발광-표지된 sbp 실시양태에서, 화학발광 화합물은 비오틴-스트렙타비딘 또는 비오틴-뉴트라비딘 연결을 통해 하나 이상의 sbp에 연결된다. 스트렙타비딘-비오틴, 또는 동등한 연결을 포함하는 화학발광-표지된 sbp는 예를 들어 비오틴 접합체로서 특이적 결합 파트너를 제공할 수 있고, 여기서 화학발광 화합물은 스트렙타비딘 접합체이다. 비오틴-스트렙타비딘 및 유사한 연결의 다른 배열이 일반적으로 공지되어 있다. 별법으로, 스트렙타비딘-비오틴, 또는 동등한 연결을 포함하는 화학발광-표지된 sbp는 하나 이상의 추가의 보조 물질에 대한 sbp 또는 화학발광 화합물의 부착을 위한 연결을 이용할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 화학발광 표지가 공유 연결되는 보조 물질은 합성 중합체이다. 화학발광 화합물을 연결하기 위해 중합체 보조물질을 사용하는 검정 포맷은 공유 연결에 의해, 비오틴-아비딘 접합체로서 또는 보편적인 포획 성분, 예를 들어 종 특이적 면역글로불린을 통한 간접적인 부착에 의해 분석물에 대해 특이적 결합 파트너를 연결할 수 있다.
선택된 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp는 다당류 또는 가용성 자가-조립형 단백질로부터 선택되는 보조 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp는 다당류, 예를 들어 아미노-덱스트란 또는 카르복실-덱스트란을 포함한다. 몇몇의 상기 실시양태에서, 다당류, 예를 들어 아미노-덱스트란 또는 카르복실-덱스트란의 평균 분자량은 10 kDa 내지 500 kDa, 다른 실시양태에서 25-150 kDa이다. 추가의 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp는 평균 분자량이 50-100 kDa 범위인 다당류, 예를 들어 아미노-덱스트란 또는 카르복실-덱스트란을 포함한다. 다른 추가의 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp는 평균 분자량이 70 kDa인 다당류, 예를 들어 아미노-덱스트란 또는 카르복실-덱스트란을 포함한다.
많은 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp의 평균 직경은 5 nm 내지 800 nm이다. 가용성 단백질, 또는 다른 가용성 천연 중합체 또는 가용성 합성 중합체, 또는 이들의 조합을 포함하는 선택된 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp의 평균 직경은 200 nm 내지 600 nm, 추가의 일부 실시양태에서 300 nm 내지 500 nm이다.
활성화제- 표지된 SBP
방법은 제1 특이적 결합 파트너와 연결된 활성화제 화합물 ("활성화제-표지된 sbp")의 사용을 필요로 한다.
본 발명의 개시내용의 검정 및 방법에서, 활성화제-표지된 sbp는 수용액에서 가용성이다. 본 발명의 개시내용의 검정 및 방법에서, 활성화제 화합물은 다른 친화도 검정 및 방법에서 볼 수 있는 바와 같은 고체 표면, 예를 들어 입자, 다중웰 플레이트, 또는 막, 필터, 시험관, 딥스틱, 또는 피펫 팁에 고정되지 않는다.
활성화제-표지된 sbp는 활성화제 표지 화합물 및 특이적 결합쌍의 멤버를 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화제-표지된 sbp는 하나 이상의 활성화제 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화제-표지된 sbp는 특이적 결합쌍의 멤버의 하나 이상의 카피를 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화제 화합물은 특이적 결합쌍의 멤버의 하나 이상의 카피에 직접 연결된다. 다른 일부 실시양태에서, 하나 이상의 활성화제 표지 화합물은 특이적 결합쌍의 멤버의 하나의 카피에 직접 연결된다. 직접-표지된으로도 언급되는 직접적인 연결은 공유 결합 상호작용, 이온 결합 상호작용, 및 소수성 상호작용을 포함한다. 한 실시양태에서, 활성화제 표지는 분석물에 대한 특이적 결합 파트너에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 활성화제 화합물은 특이적 결합쌍의 멤버의 하나 이상의 카피에 간접적으로 연결된다. 다른 일부 실시양태에서, 하나 이상의 활성화제 화합물은 특이적 결합쌍의 멤버의 하나의 카피에 간접적으로 연결된다. 간접적인 연결은 화학발광 표지 화합물 및 특이적 결합쌍의 멤버 이외에 하나 이상의 보조 물질을 포함한다.
보조 물질은 일반적으로 수용액에 가용성이다. 하나 이상의 보조 물질을 포함하는 활성화제-표지된 sbp는 수용액에 가용성이다. 다양한 실시양태에서, 보조 물질은 가용성 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘, 아비딘, 뉴트라비딘, 비오틴, 양이온화 BSA, fos, jun, 키홀 림펫 헤모시아닌 "KLH", 천연 또는 조작된 면역글로불린 및 그의 단편 또는 일부, 및 이들의 임의의 조합), 가용성 합성 덴드리머 (예를 들어, PAMAM), 가용성 합성 중합체 (예를 들어 폴리아크릴산 "PAA"), 가용성 천연 중합체 (예를 들어, 다당류, 예를 들어 덱스트란, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 및 이들의 임의의 조합), 리포좀, 미셀, 및 베시클, 및 하나 이상의 가용성 합성 중합체, 가용성 천연 중합체, 및 가용성 단백질의 조합 (예를 들어, IgG/비오틴/스트렙타비딘/PAA)을 포함한다. 수용액에 가용성이고 하나 이상의 활성화제 표지 화합물 및/또는 sbp에 대한 부착을 위해 관능화될 수 있는 다른 보조 물질이 개시된 방법 및 분석에서 사용하기 위해 고려된다.
일부 실시양태에서, 활성화제 표지가 공유 연결되는 보조 물질은 단백질 또는 펩티드이다. 예시적인 가용성 단백질은 알부민, 아비딘, 스트렙타비딘, 아비딘, 알파-나선 단백질, fos, jun, 키홀 림펫 헤모시아닌 "KLH", 천연 또는 조작된 면역글로불린 및 그의 단편 또는 일부, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 보조 물질은 보편적인 항체, 예를 들어 IgG이고, 활성화제 표지는 분석물 특이적 포획 항체에 대한 그의 결합 친화도를 유지하는 방식으로 보편적인 항체에 공유 연결된다. 또 다른 활성화제-표지된 sbp 실시양태에서, 활성화제 화합물은 비오틴-스트렙타비딘 연결을 통해 하나 이상의 sbp에 연결된다. 스트렙타비딘-비오틴, 또는 동등한 연결을 포함하는 활성화제-표지된 sbp는 예를 들어 비오틴 접합체로서 특이적 결합 파트너를 제공할 수 있고, 여기서 활성화제 화합물은 스트렙타비딘 접합체이다. 비오틴-스트렙타비딘 및 유사한 연결의 다른 배열이 일반적으로 공지되어 있다. 별법으로, 스트렙타비딘-비오틴, 또는 동등한 연결을 포함하는 활성화제-표지된 sbp는 하나 이상의 추가의 보조 물질에 대한 sbp 또는 활성화제 화합물의 부착을 위한 연결을 이용할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 활성화제 표지가 공유 연결되는 보조 물질은 합성 중합체이다. 활성화제 화합물을 연결하기 위해 중합체 보조물질을 사용하는 검정 포맷은 공유 연결, 비공유 연결에 의해, 또는 보편적인 포획 성분, 예를 들어 종 특이적 면역글로불린 또는 비오틴-아비딘 접합을 통한 간접적인 부착에 의해 분석물에 대해 특이적 결합 파트너를 연결할 수 있다.
선택된 실시양태에서, 활성화제-표지된 sbp는 다당류 또는 가용성 자가-조립형 단백질로부터 선택되는 보조 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화제-표지된 sbp는 다당류, 예를 들어 아미노-덱스트란 또는 카르복실-덱스트란을 포함한다. 몇몇의 상기 실시양태에서, 다당류, 예를 들어 아미노-덱스트란 또는 카르복실-덱스트란의 평균 분자량은 10 kDa 내지 500 kDa, 다른 실시양태에서 25-150 kDa이다. 추가의 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp는 평균 분자량이 50-100 kDa 범위인 다당류, 예를 들어 아미노-덱스트란 또는 카르복실-덱스트란을 포함한다. 다른 추가의 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp는 평균 분자량이 70 kDa인 다당류, 예를 들어 아미노-덱스트란 또는 카르복실-덱스트란을 포함한다.
대부분의 실시양태에서, 활성화제-표지된 sbp의 평균 분자량은 200 kDa 내지 3000 kDa이다. 일부 실시양태에서, 활성화제-표지된 특이적 결합쌍의 평균 분자량은 일반적으로 350 kDa 내지 1500 kDa이다.
활성화제 표지
활성화제 화합물은 활성화제-특이적 결합 파트너 접합체로도 언급될 수 있는 활성화제-표지된 sbp의 일부를 형성한다. 활성화제-표지된 sbp는 다음과 같은 이중 기능을 수행한다: 1) 직접 또는 매개하는 특이적 결합 파트너를 통해 특이적 결합 파트너 부분에 의한 분석물의 양에 비례한 특이적 결합 반응의 유발, 및 2) 활성화제 부분에 의한 화학발광 화합물의 활성화. 활성화제-표지된 sbp의 활성화제 부분은 트리거 용액의 존재 하에 화학발광이 생성되도록 화학발광 화합물의 활성화를 야기하는 화합물이다. 활성화제 표지로서 기능할 수 있는 화합물은 전이금속 염 및 착물 및 효소, 특히 전이금속-함유 효소, 가장 특히 퍼옥시다제 효소를 비롯하여 퍼옥시다제-유사 활성을 갖는 화합물을 포함한다. 활성화제 화합물에 유용한 전이금속은 원소주기율표의 3-12족의 금속, 특히 철, 구리, 코발트, 아연, 망간, 크롬, 및 바나듐을 포함한다.
화학발광 반응을 겪을 수 있는 퍼옥시다제 효소는 예를 들어 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제, 미엘로퍼옥시다제, 할로퍼옥시다제, 바나듐 브로모퍼옥시다제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 진균 퍼옥시다제, 리그닌 퍼옥시다제, 아르트로마이세스 라모수스 (Arthromyces ramosus)의 퍼옥시다제, 백색부후균 (white rot fungus)에서 생산된 Mn-의존성 퍼옥시다제, 및 대두 퍼옥시다제를 포함한다. 철 착물, 예를 들어 헴, 및 Mn-TPPS4를 비롯하여, 효소는 아니지만 퍼옥시다제-유사 활성을 갖는 다른 퍼옥시다제 모방 (mimetic) 화합물이 공지되어 있다 (Y.-X. Ci, et al., Mikrochem. J., 52:257-62 (1995)). 이들은 기질의 화학발광 산화를 촉매하고, 본원에서 사용되는 퍼옥시다제의 의미 범위 내에 포함되는 것으로 명백하게 간주된다.
일부 실시양태에서, 활성화제-표지된 sbp는 화학발광을 생성하는 방법에서 퍼옥시다제 및 생물학적 분자의 접합체 또는 복합체를 포함할 수 있고, 이때 유일한 조건은 접합체가 퍼옥시다제 또는 퍼옥시다제-유사 활성을 보인다는 것이다. 퍼옥시다제의 하나 이상의 분자에 접합될 수 있는 생물학적 분자는 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 항체, 항체 단편, 항체-DNA 키메라 (chimera), 항원, 합텐, 단백질, 펩티드, 렉틴, 아비딘, 스트렙타비딘 및 비오틴을 포함한다. 또한, 퍼옥시다제를 포함하거나 도입하는 복합체, 예를 들어 리포좀, 미셀, 베시클 및 생물학적 분자에 대한 부착을 위해 관능화된 중합체가 본 발명의 개시내용의 방법에 사용될 수 있다.
선택적인 신호 억제제 ( SSIA )
본 발명의 선택적인 신호 억제제는 유리된 및/또는 분석물-결합된 화학발광-표지된 sbp, 유리된 및/또는 분석물-결합된 활성화제-표지된 sbp, 인핸서 및 트리거 용액을 포함하는 검정 반응 혼합물에 포함될 때 분석물-결합된 표지된 sbp 멤버로부터 생성되는 신호가 SSIA의 부재 하에 발생하는 것보다 유의하게 더 큰 정도로 배경 신호를 초과하도록 하는 화합물이다.
하나 이상의 선택적인 신호 억제제는 10-6 M 내지 10-1 M, 종종 10-6 M 내지 10-2 M, 종종 10-5 M 내지 10-3 M, 때로 10-5 M 내지 10-4 M의 농도로 반응 방법에 존재한다. 일부 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 본 발명의 방법에 따른 반응에 5 x 10-6 M 내지 5 x 10-4 M로 존재한다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 본 발명의 방법에 따른 반응에 5 x 10-5 M 내지 5 x 10-4 M로 존재한다.
선택적인 신호 억제제는 반응 용액에 의도되는 것보다 높은 농도로 별개의 시약 또는 용액으로서 공급될 수 있다. 본 실시양태에서, 측정된 양의 표준 용액이 요구되는 반응 농도를 달성하기 위해 반응 용액 내에 첨가된다. 또 다른 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 하나 이상의 표지된 sbp 멤버를 함유하는 용액 내로 조합된다. 또 다른 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 트리거 용액의 성분으로서 제공된다.
선택적인 신호 억제제가 신호:배경 비를 개선하는 정도는 다른 인자 중에서 특히 화합물의 종류 및 사용되는 농도에 따라 상이할 것이다. 상기 정도는 분석이 선택적인 신호 억제제를 사용하여 수행되는 특정 분석물 농도에서의 분석의 신호:배경 비가 선택적인 신호 억제제의 부재 하에서 동일한 분석물 농도에서의 분석의 신호:배경 비와 비교되는 개선 인수 (factor)의 측면에서 이해될 수 있다. 개선 인수 > 1은 개선된 분석의 척도 및 선택적인 신호 억제제의 유익한 효과의 증거이다. 본 발명의 실시양태에서, 적어도 2, 예를 들어 적어도 5, 예를 들어 적어도 10, 또는 적어도 50의 개선 인수가 달성된다. 개선 인수가 분석물 농도의 함수로서 검정 내에서 상이할 수 있음을 하기 실시예를 참고로 하여 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 개선 인수는 분석물 농도가 증가함에 따라 증가할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 농도에 따른 개선 인수의 변화를 통해 보다 선형의 교정 곡선, 즉, 화학발광 강도 대 분석물 농도의 도면을 작성할 수 있다.
아래 표는 선택적인 신호 억제제로서 효과적으로 기능할 수 있는 화합물을 비제한적으로 나열한 것이다. 실시예에서 설명되는 검정 및 스크리닝 시험 방법의 통상적인 적용을 비롯하여 본 발명의 개시내용을 사용함으로써 명백하게 언급되지 않은 추가의 화합물을 찾을 수 있다.
Figure 112011074714212-pct00001
Figure 112011074714212-pct00002
다른 일부 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 디알킬히드록시아민으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 오르토- 또는 파라-관계로 배향된 적어도 2개의 히드록실기를 갖는 방향족 화합물로부터 선택된다. 예시적인 화합물을 표 2에 제시한다.
Figure 112011074714212-pct00003
다른 일부 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 오르토- 또는 파라-관계로 배향된 히드록실기 및 아미노기를 적어도 갖는 방향족 화합물로부터 선택된다. 예시적인 화합물을 표 3에 제시한다.
Figure 112011074714212-pct00004
또 다른 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 엔디올로도 알려진, C-C 이중 결합 상에 치환된 적어도 2개의 히드록실기를 갖는 화합물로부터 선택된다. 예시적인 화합물을 표 4에 제시한다.
Figure 112011074714212-pct00005
한 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 질소 헤테로시클릭 화합물로부터 선택된다. 예시적인 화합물을 표 5에 제시한다.
Figure 112011074714212-pct00006
한 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 퍼옥시드와 접촉시에 활성 SSIA로 전환될 수 있는 화합물로서 마스킹된 (masked) 형태로 공급된다. 적합한 마스킹된 SSIA 화합물은 예를 들어 히드록실- 또는 아미노-치환된 아릴보론산 화합물로부터 선택된다. 예시적인 화합물을 표 6에 제시한다.
Figure 112011074714212-pct00007
한 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제는 표 7에 제시된 화합물로부터 선택된다.
Figure 112011074714212-pct00008
다양한 실시양태에서, 하나 이상의 상기 선택적인 신호 억제제는 본 발명의 개시내용의 검정 방법, 검정 또는 키트에서 조합되어 사용된다. 일부 실시양태에서, 선택적인 신호 억제제의 수용액 내 용해도는 표준 용액의 10배이다. 표준 용액은 농축 용액의 일부가 트리거 용액의 첨가 후에 필요한 최종 농도를 제공하기 위해 반응 혼합물에 첨가되는 농축 수용액으로서 규정된다.
선택적인 신호 억제제의 표준 용액에 적합한 수용액은 하나 이상의 다음과 같은 추가의 성분을 포함한다: 염, 생물학적 버퍼, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 알콜, 예를 들어 에탄올, 메탄올, 글리콜, 및 세제. 일부 실시양태에서, 수용액은 Tris 완충 수용액, 25% 에탄올/75% Tris 완충 수용액, 25% 에탄올/75% 수성 Triton-X-1OO (1%), 10% 0.1 N NaOH/90% Tris 완충 수용액을 포함한다. Tris 완충 수용액의 일례는 TRIS 완충 염수, 계면활성제, <0.1% 아지드화나트륨, 및 0.1% 프로클린 (Proclin)® 300 (롬 앤 하스 (Rohm and Haas))로 이루어지고, 본원에서 버퍼 II로 언급되고, 베크만 쿨터, 인크. (Beckman Coulter, Inc., 미국 캘리포니아주 브레아)로부터 상업적으로 이용가능하다.
트리거 용액& 인핸서
트리거 용액은 화학발광에 필요한 여기 상태의 화합물을 생성하기 위해 필요한 반응물질을 제공한다. 반응물질은 화학발광 표지와 직접 반응함으로써 화학발광 반응을 수행하기 위해 필요한 것일 수 있다. 이는 상기 기능 대신에 또는 그에 추가로 활성화제 화합물의 작용을 촉진하기 위해 기능할 수 있다. 이것은 예를 들어 활성화제가 퍼옥시다제 효소일 때 적용될 것이다. 한 실시양태에서, 트리거 용액은 퍼옥시드 화합물을 포함한다. 퍼옥시드 성분은 퍼옥시다제와 반응할 수 있는 임의의 퍼옥시드 또는 알킬 히드로퍼옥시드이다. 예시적인 퍼옥시드는 과산화수소, 과산화우레아, 및 퍼보레이트 염을 포함한다. 트리거 용액에 사용되는 퍼옥시드의 농도는 일정 범위의 값, 일반적으로 약 10-8 M 내지 약 3 M, 보다 일반적으로는 약 10-3 M 내지 약 10-1 M 내에서 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 트리거 용액은 퍼옥시드 및 퍼옥시다제 활성을 갖는 활성화제의 촉매적 전환을 촉진하는 인핸서 화합물을 포함한다.
대표적인 실시양태는 활성화제로서의 퍼옥시다제 접합체, 분석물의 아크리단 표지된 특이적 결합 파트너 (여기서, 아크리단 표지는 아래에서 설명되는 바와 같이 특이적 결합 파트너를 아크리단 표지 화합물과 반응시킴으로써 제공됨), 및 과산화수소를 포함하는 트리거 용액을 사용한다. 퍼옥시드는 퍼옥시다제와 반응하여, 효소의 활성 부위에서 철의 산화 상태를 상이한 산화 상태로 변경하는 것으로 추정된다. 상기 변경된 상태의 효소는 인핸서 분자와 반응하여 효소의 촉매적 전환을 촉진한다. 인핸서 또는 효소로부터 형성된 반응성 종은 효소와 근접하여 유지되는 아크리단 표지와 반응한다. 화학발광 반응은 최종 반응 산물 및 광을 생성하기 위해 화학발광 화합물로부터 형성된 중간체와 퍼옥시드의 추가의 반응을 포함한다.
특정 인핸서 화합물의 트리거 용액 내로의 도입은 효소의 반응성을 촉진하거나 또는 배경 신호를 감소시키거나 또는 상기 두 기능을 모두 수행한다. 이들 인핸서에는 퍼옥시다제 반응을 향상시키는 것으로 알려진 페놀계 화합물 및 방향족 아민이 포함된다. 미국 특허 5,171,668에 개시된 바와 같은 페녹사진 또는 페노티아진 화합물과 인도페놀 또는 인도아닐린 화합물의 혼합물이 본 발명에서 인핸서로 사용될 수 있다. 또한, 치환된 히드록시벤족사졸, 2-히드록시-9-플루오레논, 및 미국 특허 5,206,149에 개시된 다음 화합물 I도 본 발명에서 인핸서로 사용될 수 있다.
<화학식 I>
Figure 112011074714212-pct00009
또한, 미국 특허 5,512,451에 개시된 치환된 및 비치환된 아릴보론산 화합물 및 그의 에스테르 및 무수물 유도체도 본 발명의 개시내용에 유용한 인핸서의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 예시적인 페놀계 인핸서는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: p-페닐페놀, p-요오도페놀, p-브로모페놀, p-히드록시신남산, p-이미다졸릴페놀, 아세트아미노펜, 2,4-디클로로페놀, 2-나프톨 및 6-브로모-2-나프톨.
또한, 상기 언급된 클래스로부터의 2 이상의 인핸서의 혼합물도 사용될 수 있다.
본 발명의 실행시에 유용한 추가의 인핸서는 히드록시벤조티아졸 화합물 및 하기 화학식 II 및 III의 페녹사진 및 페노티아진 화합물을 포함한다.
<화학식 II>
Figure 112011074714212-pct00010
<화학식 III>
Figure 112011074714212-pct00011
페녹사진 및 페노티아진 인핸서의 질소 원자 상에서 치환된 R기는 1-8개 탄소 원자의 알킬, 및 술포네이트 염 또는 카르복실레이트 염기로 치환된 1-8개 탄소 원자의 알킬을 포함한다. 예시적인 인핸서는 3-(N-페노티아지닐)-프로판술폰산 염, 3-(N-페녹사지닐)프로판술폰산 염, 4-(N-페녹사지닐)부탄술폰산 염, 5-(N-페녹사지닐)-펜탄산 염 및 N-메틸페녹사진 및 관련 상동체를 포함한다. 트리거 용액에 사용되는 인핸서의 농도는 일정 범위의 값, 일반적으로 약 10-5 M 내지 약 10-1 M, 보다 일반적으로는 약 10-4 M 내지 약 10-2 M 내에서 상이할 수 있다.
본 발명의 개시내용의 검출 반응은 일반적으로 수성 버퍼 내의 트리거 용액으로 수행된다. 적합한 버퍼는 화학발광 반응의 진행을 허용하는 환경을 유지할 수 있는 임의의 통상적으로 사용되는 버퍼를 포함한다. 일반적으로, 트리거 용액의 pH는 약 5 내지 약 10.5일 것이다. 예시적인 버퍼는 인산염, 보레이트, 아세테이트, 카르보네이트, 트리스(히드록시-메틸아미노)메탄[tris], 글라이신, 트리신, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 디에탄올아민 MOPS, HEPES, MES 등을 포함한다.
또한, 트리거 용액은 광 생성 반응의 발광 효율을 향상시키거나 또는 분석의 신호/노이즈 (noise) 비를 개선하기 위해 하나 이상의 세제 또는 중합체 계면활성제를 함유할 수 있다. 본 발명의 개시내용의 실시에 유용한 비이온성 계면활성제는 예를 들어 폴리옥시에틸렌화 알킬페놀, 폴리옥시에틸렌화 알콜, 폴리옥시에틸렌화 에테르 및 폴리옥시에틸렌화 소르비톨 에스테르를 포함한다. 단량체 양이온 계면활성제, 예를 들어 4급 암모늄 염 화합물, 예를 들어 CTAB 및 4급 포스포늄 염 화합물이 사용될 수 있다. 4급 암모늄 및 포스포늄 염기를 포함하는 것을 비롯한 중합체 양이온 계면활성제도 상기 목적을 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 트리거 용액은 수성 버퍼, 농도가 약 10-5 M 내지 약 1 M인 퍼옥시드, 및 농도가 약 10-5 M 내지 약 10-1 M인 인핸서를 포함하는 조성물이다. 조성물은 첨가제, 예를 들어 계면활성제, 금속 킬레이팅제, 및 미생물 오염을 방지하거나 최소화하기 위한 방부제를 임의로 함유할 수 있다. 트리거 용액의 pH는 일반적으로 pH 6.0 내지 pH 9.0이다. 일부 실시양태에서, pH는 pH 6.5 내지 pH 8.5이고, 추가의 실시양태에서 pH는 pH 7.0-8.0이다.
특이적 결합쌍
특이적 결합쌍 멤버 또는 특이적 결합 파트너 (sbp)는 본원에서 또 다른 물질에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 생물학적 분자를 포함하는 분자로서 규정된다. 특이적 결합쌍 멤버는 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 항체, 항체 단편, 항체-DNA 키메라, 항원, 합텐, 단백질, 펩티드, 렉틴, 아비딘, 스트렙타비딘 및 비오틴을 포함한다. 특이적 결합쌍의 각각의 특이적 결합쌍 멤버는 동일한 물질 (예를 들어 분석물)에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는다. 각각의 특이적 결합쌍 멤버는 적어도 분석물 상의 동일하거나 중복되는 결합 부위에 대해 경쟁하지 않지 않아야 한다는 점에서 특이적 결합쌍 내의 다른 특이적 결합쌍 멤버와 동일하지 않다. 예를 들어, 특이적 결합쌍이 2개의 항체로 이루어진 경우, 각각의 sbp 항체는 분석물 상의 상이한 비-경쟁 에피토프를 갖는다.
특이적 결합 물질은 비제한적으로 항체 및 항체 단편, 항원, 합텐 및 그의 동족 (cognate) 항체, 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘, 단백질 A 및 IgG, 상보성 핵산 또는 올리고뉴클레오티드, 렉틴 및 탄수화물을 포함한다.
상기 언급한 항원-항체, 합텐-항체 또는 항체-항체쌍 이외에, 특이적 결합쌍도 상보성 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 아비딘-비오틴, 스트렙타비딘-비오틴, 호르몬-수용체, 렉틴-탄수화물, IgG 단백질 A, 결합 단백질-수용체, 핵산-핵산 결합 단백질 및 핵산-항-핵산 항체를 포함할 수 있다. 약물 후보 스크리닝에 사용되는 수용체 분석은 본 발명의 방법의 또 다른 분야이다. 임의의 이들 결합쌍은 상기 기재된 3-성분 샌드위치 기술 또는 2-성분 경쟁적 기술에 의해 본 발명의 방법에 사용하기 위해 조정될 수 있다.
화학발광 화합물
본 발명의 개시내용의 실시에서 화학발광 표지로서 사용되는 화합물은 일반식 CL-L-RG로 표시되고, 여기서 CL은 화학발광 모이어티 (moiety)를 나타내고, L은 화학발광 모이어티와 반응성 기를 연결하는 연결 모이어티를 나타내고, RG는 또 다른 물질에 대한 커플링을 위한 반응성 기 모이어티를 나타낸다. 용어 "화학발광기" 및 "화학발광 모이어티"는 용어 "연결 모이어티" 및 "연결기"처럼 상호 교환가능하게 사용된다. 화학발광 모이어티 CL은 활성화제와 반응하여 활성화된 화합물로 전환되는 화합물을 포함한다. 트리거 용액과 활성화된 화합물의 반응은 전자적으로 여기된 상태의 화합물을 형성한다. 여기된 상태는 일중항 또는 삼중항 여기된 상태일 수 있다. 여기된 상태는 기저 상태로 이완시에 직접 광을 방출할 수 있거나 또는 여기 에너지를 방출 에너지 수용자로 전달하여, 기저 상태로 복귀할 수 있다. 에너지 수용자는 이 과정에서 여기된 상태가 되고, 광을 방출한다. CL 기, 활성화제 및 트리거 용액의 화학발광 반응이 신속하고, 매우 짧은 시간에 걸쳐 발생하는 것이 바람직하지만 필수적이지는 않고; 한 실시양태에서, 수초 내에 피크 강도에 도달한다.
개시내용의 한 실시양태에서, 화학발광 화합물은 활성화제 및 트리거 용액의 존재 하에 화학발광을 생성하기 위해 산화될 수 있다. 링커 (linker) 및 반응성 기의 도입에 의해 화학발광 표지로서 기능할 수 있는 화합물의 예시적인 종류는 방향족 시클릭 디아실히드라지드, 예를 들어 루미놀 및 구조적으로 관련된 시클릭 히드라지드, 예를 들어 이소루미놀, 아미노부틸에틸이소루미놀 (ABEI), 아미노헥실에틸이소루미놀 (AHEI), 7-디메틸아미노나프탈렌-1,2-디카르복실산 히드라지드, 고리-치환된 아미노프탈히드라지드, 안트라센-2,3-디카르복실산 히드라지드, 페난트렌-1,2-디카르복실산 히드라지드, 피렌디카르복실산 히드라지드, 5-히드록시프탈히드라지드, 6-히드록시프탈히드라지드, 및 미국 특허 5,420,275 (Masuya et al.) 및 미국 특허 5,324,835 (Yamaguchi)에 개시된 다른 프탈라진디온 유사체를 포함한다.
과산화수소 및 퍼옥시다제의 작용에 의해 화학발광을 생성하는 것으로 알려진 임의의 화합물은 본 발명의 개시내용에 사용되는 화학발광 표지 화합물의 화학발광 모이어티로서 기능할 것으로 고려된다. 다양한 구조적 종류의 많은 상기 화합물, 예를 들어 잔텐 염료, 예를 들어 플루오레세인, 에오신, 로다민 염료, 또는 로돌 염료, 방향족 아민 및 헤테로시클릭 아민이 이들 조건 하에서 화학발광을 생성하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 또 다른 예는 화합물 MCLA, 즉 2-메틸-6-(p-메톡시페닐)-3,7-디히드로이미다조[1,2-a]피라진-3-온이다. 또 다른 예는 인돌 아세트산이고, 또 다른 예는 이소부티르알데히드이고, 후자에는 일반적으로 가시광선의 출력을 증가시키기 위해 형광 에너지 수용자가 동반된다. 트리히드록시방향족 화합물인 피로갈롤, 플로로글루시놀 및 푸르푸로갈린은 개별적으로 또는 조합되어 개시내용의 화학발광 표지 화합물의 화학발광 모이어티로서 기능할 수 있는 화합물의 다른 예이다.
한 실시양태에서, 개시내용의 방법에 유용한 아크리단 케텐디티오아세탈 (AK)을 포함하는 일군의 화학발광 표지 화합물은 하기 화학식 IV의 아크리단 화합물을 포함한다.
<화학식 IV>
Figure 112011074714212-pct00012
상기 식에서,
기 R1-R11 중 적어도 하나는 화학식 -L-RG의 표지 치환체이고, 여기서 L은 결합 또는 또 다른 이가 또는 다가기일 수 있는 연결기이고, RG는 화학발광 표지 화합물이 또 다른 화합물에 결합될 수 있도록 하는 반응성 기이고, R1, R2 및 R3은 1 내지 50개의 비-수소 원자를 함유하는 유기기이고, R4-R11은 각각 수소 또는 비-간섭 치환체이다. 표지 치환체 -L-RG는 R1 또는 R2 중의 하나에 존재할 수 있지만, R3 또는 R4-R11 중의 하나 상의 치환체로서 존재할 수도 있다.
화학식 IV의 화합물 내의 기 R1 및 R2는 C, N, O, S, P, Si 및 광 생성을 허용하는 할로겐 원자로부터 선택되는 1 내지 약 50개의 비 수소 원자를 함유하는 임의의 유기기일 수 있다. 후자는 화학식 I의 화합물이 본 발명의 개시내용의 반응을 겪을 때, 여기된 상태의 생성 화합물이 생성되고 하나 이상의 화학발광 중간체의 생성을 수반할 수 있음을 의미한다. 여기된 상태의 생성물은 광을 직접 방출하거나 또는 여기 에너지를 에너지 전달을 통해 형광 수용자로 전달하여 광을 형광 수용자로부터 방출시킬 수 있다. 한 실시양태에서, R1 및 R2는 1-20개 탄소 원자의 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 알케닐, 치환된 또는 비치환된 알키닐, 치환된 또는 비치환된 아릴, 및 치환된 또는 비치환된 아르알킬기로부터 선택된다. R1 또는 R2가 치환된 기일 때, 이는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, 4급 암모늄기, 및 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있다. 한 실시양태에서, R1 또는 R2는 화학식 -L-RG의 표지 치환체로 치환되고, 여기서 L은 연결기이고, RG는 반응성 기이다.
기 R3은 기 내의 원자가를 충족하기 위해 필요한 H 원자의 필요한 수 이외에 C, N, O, S, P, Si 및 할로겐으로부터 선택되는 1 내지 50개의 비-수소 원자를 함유하는 유기기이다. 한 실시양태에서, R3은 1 내지 20개의 비-수소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 유기기는 1-20개 탄소 원자의 알킬, 치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 알케닐, 치환된 또는 비치환된 알키닐, 치환된 또는 비치환된 아릴, 및 치환된 또는 비치환된 아르알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, R3의 기는 치환된 또는 비치환된 C1-C4 알킬기, 페닐, 치환된 또는 비치환된 벤질기, 알콕시알킬, 카르복시알킬 및 알킬술폰산기를 포함한다. R3이 치환된 기일 때, 이는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, 및 4급 암모늄기, 및 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있다. 기 R3은 R7 또는 R8에 연결되어 5 또는 6원 고리를 완성할 수 있다. 한 실시양태에서, R3은 화학식 -L-RG의 표지 치환체로 치환된다.
화학식 IV의 화합물에서, 기 R4-R11은 각각 독립적으로 H 또는 여기된 상태의 생성물의 생성을 허용하는 치환기이고, 일반적으로 C, N, O, S, P, Si 및 할로겐으로부터 선택되는 1 내지 50개의 원자를 함유한다. 존재할 수 있는 대표적인 치환기는 비제한적으로 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴옥시, 할로겐, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르보알콕시, 카르복사미드, 시아노, 및 술포네이트기를 포함한다. 인접한 기의 쌍, 예를 들어, R4-R8 또는 R8-R6은 2개의 기가 부착되는 고리에 융합된 적어도 하나의 5 또는 6원 고리를 포함하는 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리계를 형성하기 위해 함께 연결될 수 있다. 상기 융합된 헤테로시클릭 고리는 N, O 또는 S 원자를 함유할 수 있고, 상기한 것과 같이 H 이외의 다른 고리 치환체를 함유할 수 있다. 기 R4-R11 중의 하나 이상은 화학식 -L-RG의 표지 치환체일 수 있다. 한 실시양태에서, R4-R11은 수소, 할로겐 및 알콕시기, 예를 들어 메톡시, 에톡시, t-부톡시 등으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 일군의 화합물에서 R8, R6, R9 또는 R10 중의 하나는 할로겐이고, R4-R11 중의 하나는 수소 원자이다.
치환기는 화합물의 특성을 변경하거나 합성의 편의성을 제공하기 위해 아크리단 고리 내의 선택된 고리 또는 사슬 위치에서 다양한 양으로 도입될 수 있다. 상기 특성은 예를 들어 화학발광량 수율, 효소와의 반응 속도, 최대 광 강도, 광 방출 기간, 광 방출의 파장 및 반응 매질 내의 용해도를 포함한다. 특이적 치환체 및 그의 효과는 하기 구체적인 실시예에서 예시되지만, 임의의 방식으로 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 합성 편의를 위해, 화학식 I의 화합물에서 바람직하게는 각각의 R4 내지 R11은 수소 원자이다.
또 다른 실시양태에서, 일군의 화합물은 R4 내지 R11이 각각 수소인 하기 화학식 V로 표시된다. 기 R1, R2 및 R3은 상기 규정된 바와 같다.
<화학식 V>
Figure 112011074714212-pct00013
화학식 IV 또는 V의 표지 화합물은 기 R1 또는 R2 상의 치환체로서 기 -L-RG를 갖는다. 한 실시양태에서, 표지 화합물은 하기 화학식 VI으로 표시된다.
<화학식 VI>
Figure 112011074714212-pct00014
대표적인 표지 화합물은 하기 구조를 갖는다. 추가의 예시적인 화합물 및 다른 분자 및 고체 표면에 대한 부착에서 그의 용도가 아래 구체적인 예에서 설명된다. 아래 제시된 구조는 화학식 CL-L-RG의 예시적인 화합물을 보여준다.
Figure 112011074714212-pct00015
상기 특이적 AK 화합물 및 상기 제시된 일반식 IV, V 및 VI의 화합물은 미국 특허 출원 공개 US2007/0172878에 개시된 방법을 포함하여 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 숙련된 유기 화학자에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 방법에서, N-치환된 및 임의로 고리-치환된 아크리단 고리 화합물은 강염기, 이어서 CS2와 반응하여 아크리단 디티오카르복실레이트를 형성한다. 디티오카르복실레이트는 R1로 지정된 치환체 중의 하나를 확립하기 위해 통상적인 방법에 의해 에스테르화된다. 생성되는 아크리단 디티오에스테르는 다시 비양성자성 용매 내의 강염기, 예를 들어 n-BuLi 또는 NaH로 탈양성자화되고, 이탈기 및 R2 모이어티를 함유하는 적합한 시약으로 S-알킬화된다. R2 모이어티가 적합한 반응성 기를 확립하기 위해 추가로 조작될 수 있음을 유기화학 분야의 당업자는 쉽게 이해할 것이다.
화학발광 모이어티의 또 다른 종류는 미국 특허 5,491,072; 5,523,212; 5,593,845; 및 6,030,803에 개시된 아크리단 에스테르, 티오에스테르 및 술폰아미드를 포함한다. 상기 종류의 화학발광 표지 화합물은 하기 화학식 VII의 화학발광 모이어티 CL을 갖고, 여기서 Z는 O, S 또는 NR11SO2Ar이고, R11은 알킬 또는 아릴이고, Ar은 아릴 또는 알킬-치환된 아릴이고, R1은 C1 -8 알킬, 할로-치환된 C1 -8 알킬, 아르알킬, 아릴, 또는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 아릴, 알콕시, 알콕시알킬, 할로겐, 카르보닐, 카르복실, 카르복사미드, 시아노, 트리플루오로메틸, 트리알킬암모늄, 니트로, 히드록시, 아미노 및 머캅토기로 치환된 아릴이고, R2는 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 및 아르알킬기로부터 선택되고, R3 -10은 각각 수소이거나 또는 1 또는 2개의 치환체는 알킬, 알콕시, 히드록시, 및 할로겐으로부터 선택되고, R3 -10의 나머지는 수소이다. 한 실시양태에서, R3 -10은 각각 수소이고, R1은 표지 치환체이다. 또 다른 실시양태에서, R3 -10 중의 하나는 표지 치환체이고, R3 -10의 나머지는 수소이다.
<화학식 VII>
Figure 112011074714212-pct00016
화학발광 모이어티의 또 다른 종류는 미국 특허 5,922,558; 6,696,569; 및 6,891,057에 개시된 헤테로시클릭 화합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 화합물은 그에 대해 엑소시클릭 이중 결합이 결합되고 그의 말단 탄소는 산소, 및 황 원자로부터 선택되는 2개의 원자로 치환된 질소, 산소 또는 황-함유 5원 또는 6원 고리 또는 다중 고리기를 포함하는 헤테로시클릭 고리를 포함한다
또 다른 실시양태에서, 화학발광 표지 화합물은 하기 화학식 VIII의 화학발광 아크리단 에놀 유도체를 포함하고, 여기서 R1은 1-20개의 탄소 원자의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 및 아르알킬기로부터 선택되고, 임의의 상기 기는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, 4급 암모늄기, 또는 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있고, X는 C1-C8 알킬, 아릴, 아르알킬기, 1-20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 아릴 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, 글리코실기 및 화학식 PO(OR')(OR")의 포스포릴기로부터 선택되고, 여기서 R' 및 R"는 독립적으로 C1-C8 알킬, 시아노알킬, 아릴 및 아르알킬기, 트리알킬실릴기, 알칼리 금속 양이온, 알칼리 토금속 양이온, 암모늄 및 트리알킬포스포늄 양이온으로부터 선택되고, Z는 O 및 S 원자로부터 선택되고, R6은 치환된 또는 비치환된 C1-C4 알킬, 페닐, 벤질, 알콕시알킬 및 카르복시알킬기로부터 선택되고, R7 -14는 각각 수소이거나 또는 1 또는 2개의 치환체는 알킬, 알콕시, 히드록시, 및 할로겐으로부터 선택되고, R7-14의 나머지는 수소이다. 한 실시양태에서, R7 -14는 각각 수소이고, R1은 표지 치환체이다. 또 다른 실시양태에서, R7 -14 중의 하나는 표지 치환체이고, R7 -14의 나머지는 수소이다.
<화학식 VIII>
Figure 112011074714212-pct00017
또 다른 실시양태에서, 화학발광 표지 화합물은 하기 화학식 IX의 화학발광 화합물을 포함하고, 여기서 R1은 1-20개의 탄소 원자의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 및 아르알킬기로부터 선택되고, 임의의 상기 기는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, 4급 암모늄기, 또는 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있고, X는 C1-C8 알킬, 아릴, 아르알킬기, 1-20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 아릴 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, 글리코실기 및 화학식 PO(OR')(OR")의 포스포릴기로부터 선택되고, 여기서 R' 및 R"는 독립적으로 C1-C8 알킬, 시아노알킬, 아릴 및 아르알킬기, 트리알킬실릴기, 알칼리 금속 양이온, 알칼리 토금속 양이온, 암모늄 및 트리알킬포스포늄 양이온으로부터 선택되고, Z1 및 Z2는 각각 O 및 S 원자로부터 선택되고, R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1-C8 알킬로부터 선택된다.
<화학식 IX>
Figure 112011074714212-pct00018
연결기 (L). 본 발명의 개시내용에서 사용되는 임의의 화학발광 화합물 내의 연결기는 결합, 원자, 이가기 및 다가기, 또는 원자의 직쇄, 또는 분지쇄일 수 있고, 그의 일부는 고리 구조의 일부일 수 있다. 치환체는 대체로 1 내지 약 50개의 비-수소 원자, 보다 대체로는 1 내지 약 30개의 비-수소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 사슬을 이루는 원자는 C, O, N, S, P, Si, B, 및 Se 원자로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 사슬을 이루는 원자는 C, O, N, P 및 S 원자로부터 선택된다. 사슬 내의 탄소 이외의 다른 원자의 수는 통상 0-10이다. 할로겐 원자는 사슬 또는 고리 상의 치환체로서 존재할 수 있다. 연결 치환체를 포함하는 일반적인 관능기는 알킬렌, 아릴렌, 알케닐렌, 에테르, 퍼옥시드, 케톤으로서의 카르보닐, 에스테르, 카르보네이트 에스테르, 티오에스테르, 또는 아미드기, 아민, 아미딘, 카르바메이트, 우레아, 이민, 이미드, 이미데이트, 카르보디이미드, 히드라지노, 디아조, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포네이트 에스테르, 티오에테르, 디술피드, 술폭시드, 술폰, 술포네이트 에스테르, 술페이트 에스테르, 및 티오우레아기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 기는 -CH2-, -O-, -S-, -NH-, -NR-, -SiO-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -SC(=O)-, -C(=O)S-, -NRC(=O)-, -NRC(=S)-, 또는 -C(=O)NR- 기 (여기서, R은 C1 -8 알킬임)로 끝나는 1-20개의 원자의 알킬렌 사슬이다. 또 다른 실시양태에서, 연결기는 -CH2-, -O-, -S-, -NH-, -NR-, -SiO-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -SC(=O)-, -C(=O)S-, -NRC(=O)-, -NRC(=S)-, 또는 -C(=O)NR- 기 (여기서, R은 C1 -8 알킬임)로 끝나는 3-30개의 원자의 폴리(알킬렌-옥시) 사슬이다.
반응성 기. 반응성 기 RG는 그의 존재가 공유 부착 또는 물리적 힘에 의한 또 다른 분자에 대한 결합을 용이하게 하는 원자 또는 기이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 화학발광 표지 화합물의 또 다른 화합물 또는 물질에 대한 부착은 예를 들어 반응성 기가 이탈기, 예를 들어 할로겐 원자 또는 토실레이트기이고 화학발광 표지 화합물이 친핵성 치환 반응에 의해 또 다른 화합물에 공유 부착될 때, 반응성 기로부터 하나 이상의 원자의 상실을 수반할 것이다.
한 실시양태에서, RG는 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르기이다. 당업자는 NHS 에스테르기를 포함하는 상기 표지 화합물로 표지되는 물질이 에스테르 C-O 결합을 분리하는 과정에서 물질 상의 모이어티, 일반적으로 아민기와 반응하여 N-히드록시숙신이미드를 방출하고 물질의 원자 (아민기의 경우 N)와 표지 화합물의 카르보닐 탄소 사이에 새로운 결합을 형성함을 쉽게 이해할 것이다. 또 다른 실시양태에서, RG는 히드라진 모이어티 -NHNH2이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 상기 기는 히드라지드 연결을 형성하기 위해 표지되는 물질 내의 카르보닐기와 반응한다.
다른 실시양태에서, 공유 결합 형성에 의한 화학발광 표지 화합물의 또 다른 화합물에 대한 부착은 마이클 (Michael) 부가와 같은 부가 반응에서 또는 반응성 기가 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트기일 때 발생하는 바와 같은 반응성 기 내의 결합의 재편성 (reorganization)을 수반할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 부착은 공유 결합 형성이 아니라, 반응성 기가 변경되지 않은 상태로 유지되는 물리적 힘을 수반할 것이다. 물리적 힘은 인력, 예를 들어 수소 결합, 정전기적 또는 이온 인력, 소수성 인력, 예를 들어 염기 적층 (base stacking), 및 특이적 친화도 상호작용, 예를 들어 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체 및 뉴클레오티드-뉴클레오티드 상호작용을 의미한다.
유기 및 생물학적 분자에 대한 표지의 화학적 결합을 위한 반응성 기는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: a) 아민 반응성 기: -N=C=S, -SO2Cl, -N=C=O, -SO2CH2CF3, b) 티올 반응성 기: -S-S-R; c) 카르복실산 반응성 기: -NH2, -OH, -SH, -NHNH2; d) 히드록실 반응성 기: -N=C=S, -N=C=O, -SO2Cl, -SO2CH2CF3; e) 알데히드/케톤 반응성 기: -NH2, -ONH2, -NHNH2; 및 f) 다른 반응성 기, 예를 들어, R-N3, R-C≡CH.
한 실시양태에서, 반응성 기는 OH, NH2, ONH2, NHNH2, COOH, SO2CH2CF3, N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시숙신이미드 에테르 및 말레이미드기를 포함한다.
2관능성 커플링 시약이 또한 표지를 중등도 반응성 기를 갖는 유기 및 생물학적 분자에 커플링하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [L.J. Kricka, Ligand-Binder Assays, Marcel Dekker, Inc., New York, 1985, pp. 18-20, Table 2.2] 및 [T.H Ji, "Bifunctional Reagents," Methods in Enzymology, 91, 580-609 (1983)] 참조). 다음과 같은 2가지 종류의 2관능성 시약이 존재한다: 최종 구조 내로 통합되는 시약, 및 2개의 반응물을 커플링하지는 않고 단지 커플링하기 위해 작용하는 것.
수용액
본 발명의 개시내용에 적합한 수용액은 일반적으로 50% 초과의 물을 함유하는 용액이다. 반응 혼합물, 샘플 희석, 교정기 (calibrator) 용액, 화학발광-표지된 sbp 용액, 활성화제-표지된 sbp 용액, 인핸서 용액, 및 트리거 용액, 또는 화학발광-표지된 sbp, 활성화제-표지된 sbp, 인핸서, 트리거, 샘플, 및/또는 선택적인 신호 억제제 중의 하나 이상의 농축 용액을 포함하는 본원에 기재된 수용액이 사용에 적합하다. 많은 실시양태에서, 수용액은 수성 버퍼 용액이다. 적합한 수성 버퍼는 분석물 용해도를 유지하고, 반응물질 용해도를 유지하고, 화학발광 반응의 진행을 허용하는 수용액 내의 환경을 유지할 수 있는 임의의 통상적으로 사용되는 버퍼를 포함한다. 예시적인 버퍼는 인산염, 보레이트, 아세테이트, 카르보네이트, 트리스(히드록시-메틸아미노)메탄 (tris), 글라이신, 트리신, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 디에탄올아민 MOPS, HEPES, MES 등을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 개시내용에 따라 사용하기 위한 수용액의 pH는 약 5 내지 약 10.5일 것이다.
적합한 수용액은 다음 추가의 성분 중의 하나 이상을 포함할 수 있다: 염, 생물학적 버퍼, 알콜, 예를 들어 에탄올, 메탄올, 글리콜, 및 세제. 일부 실시양태에서, 수용액은 Tris 완충 수용액, 예를 들어 버퍼 II (TRIS 완충 염수, 계면활성제, <0.1% 아지드화나트륨, 및 0.1% 프로클린® 300 (롬 앤 하스) (베크만 쿨터, 인크. (미국 캘리포니아주 브레아)로부터 상업적으로 이용가능)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 혈청을 모방하는 수용액을 이용한다. 하나의 상기 합성 매트릭스는 0.1% 프로클린® 300이 존재하는 20 mM PBS, 7% BSA (pH 7.5)이다. 합성 매트릭스는 비제한적으로 샘플 희석, 교정기 용액, 화학발광-표지된 sbp 용액, 활성화제-표지된 sbp 용액, 인핸서 용액, 및 트리거 용액에 대해 사용될 수 있다. 용어 "PBS"는 당업계에 공지된 바와 같은 관습적인 의미로 인산염 완충 염수를 지칭한다. 용어 "BSA"는 당업계에 공지된 바와 같은 관습적인 의미로 소 혈청 알부민을 지칭한다.
검정 포맷
검정 포맷은 화학발광-표지된 sbp의 화학발광 표지와 활성화제-표지된 sbp의 활성화제 표지 사이의 근접을 매개하기 위해 특이적 결합 작용을 필요로 한다.
또 다른 실시양태에서, 활성화제-분석물 유사체 접합체를 포함하는 분석물의 유사체가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 활성화제-분석물 접합체를 포함하는 표지된 분석물이 사용된다. 활성화제-분석물 유사체 접합체 또는 활성화제-분석물 접합체 및 분석물은 분석물에 대한 특이적 결합 파트너와 경쟁적으로 결합할 것이다. 상기 종류의 검정 방법에서 샘플 내의 분석물의 양과 화학발광 강도 사이에 음의 상관관계가 발생할 것임이 자명할 것이다.
면역검정을 통해 결합 항원 또는 다른 단백질 또는 다른 항체에 대한 항체를 통한 화학발광 표지의 부착 이외에, 본 발명의 방법은 상보성 핵산의 결합을 통해 핵산을 검출하기 위해 화학발광-표지된 핵산을 사용할 수 있다. 이와 관련된 사용은 상보성 파트너가 안정한 혼성화를 허용하는 충분한 길이를 갖는다는 유일한 기준인 핵산의 크기에 대해 특별히 제한되지 않는다. 핵산은 본원에서 사용되는 바와 같이 임의의 단일 또는 이중가닥일 수 있는 유전자 길이 핵산, 핵산의 보다 짧은 단편, 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 핵산을 특이적 결합 파트너로 사용하는 본원의 개시내용의 실행시에, 핵산은 분석물 핵산을 포획하기 위해 고체 지지체의 표면 상에 공유 부착되거나 또는 물리적으로 고정된다. 화학발광 표지는 포획 핵산에 부착될 수 있거나 또는 표지는 상기 설명한 바와 같이 포획 핵산에도 부착되는 보조 물질과 연결될 수 있다. 포획 핵산은 분석물 핵산의 서열 영역에 대한 전체 또는 실질적인 전체 서열 상보성을 가질 것이다. 실질적으로 상보성인 경우, 포획 핵산은 분석물과의 혼성화를 간섭하거나 억제하지 않는다면, 분석물에 상보성이 아닌 말단 돌출 (overhanging) 부분, 말단 루프 부분 또는 내부 루프 부분을 가질 수 있다. 또한, 돌출 또는 루프 잔기가 분석물 핵산 내에 존재하는 반대 상황도 발생할 수 있다. 포획 핵산, 분석물 핵산, 활성화제의 접합체, 및 제3 핵산은 혼성화가 허용된다. 제3 핵산은 포획 핵산에 상보성인 영역과 상이한 분석물 핵산의 서열 영역에 실질적으로 상보성이다. 포획 핵산 및 활성화제 접합체 핵산과 분석물의 혼성화는 연속하여 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 이 과정의 결과로서, 화학발광 표지는 활성화제를 지지체의 표면에 부착된 화학발광 표지 근처에 유도하는 특이적 혼성화 반응에 의해 활성화제와 함께 반응성 입체형태가 된다. 트리거 용액이 제공되고, 화학발광이 상기 기재된 바와 같이 검출된다.
또 다른 실시양태는 분석물과 활성화제의 접합체가 사용되는 변경을 포함한다. 분석물 핵산-활성화제 접합체 및 분석물 핵산은 분석물 핵산에 대한 특이적 결합 파트너와 경쟁적으로 결합할 것이다. 상기 종류의 검정 방법에서 샘플 내의 분석물의 양과 화학발광 강도 사이에 음의 상관관계가 발생할 것임이 자명할 것이다.
항체-기반 및 핵산-기반 시스템 이외에, 일반적으로 결합 검정의 당업자에게 공지된 다른 특이적 결합쌍이 본 발명의 개시내용에 따른 시험 방법의 기초로서 기능할 수 있다. 항체-합텐 쌍도 사용될 수 있다. 플루오레세인/항-플루오레세인, 디곡시게닌/항-디곡시게닌, 및 니트로페닐/항-니트로페닐 쌍이 예이다.
검출
본 발명의 방법에 의해 방출되는 광은 임의의 적합한 공지의 수단, 예를 들어 휘도계 (luminometer), x-선 필름, 고속 사진 필름, CCD 카메라, 섬광계수기, 화학 광량계에 의해 또는 시각에 의해 검출될 수 있다. 각각의 검출 수단은 상이한 스펙트럼 감도를 갖는다. 인간의 눈은 녹색광에 최적으로 민감하고, CCD 카메라는 적색광에 최대 감도를 보이고, UV 내지 청색광 또는 녹색광에 최대 반응을 보이는 X-선 필름이 이용가능하다. 검출 장치의 선택은 용도 및 비용, 편의성, 및 영구적인 기록의 필요 여부에 의해 결정된다. 광 방출 시간 경로가 빠른 실시양태에서, 검출 장치의 존재 하에 화학발광을 생성하는 촉발 반응을 수행하는 것이 유리하다. 일례로서, 검출 반응은 휘도계 내에 배치되거나 또는 시험관 또는 마이크로웰 플레이트를 수용하도록 개조된 하우징 내에서 CCD 카메라 앞에 배치된 시험관 또는 마이크로웰 플레이트에서 수행될 수 있다.
용도
본 발명의 검정 방법은 많은 종류의 특이적 결합쌍 검정에서 유용성을 갖는다. 이 중에서 화학발광 효소 연결 면역검정, 예를 들어 ELISA가 주요한 분석이다. 다양한 검정 포맷 및 면역화학 단계를 수행하기 위한 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있고, 경쟁적 검정 및 샌드위치 검정을 모두 포함한다. 본 발명의 개시내용에 따른 면역검정에 의해 분석할 수 있는 물질의 종류는 단백질, 펩티드, 항체, 합텐, 약물, 스테로이드 및 일반적으로 면역검정 분야에 공지된 다른 물질을 포함한다.
본 발명의 개시내용의 방법은 핵산의 검출에도 유용하다. 한 실시양태에서, 방법은 효소-표지된 핵산 프로브를 사용한다. 예시적인 방법은 용액 혼성화 분석, 서던 블롯팅 (Southern blotting)에 의한 DNA 검출, 노던 (Northern) 블롯팅에 의한 RNA 검출, DNA 서열결정, DNA 핑거프린팅 (fingerprinting), 콜로니 혼성화 및 플라크 리프트 (plaque lift)를 포함하고, 이들의 수행은 당업자에게 잘 알려져 있다.
키트
본 발명의 개시내용은 또한 본 발명의 개시내용의 방법에 따라 검정을 수행하기 위한 키트의 제공을 고려한다.
본 발명의 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 화학발광-표지된 sbp, 활성화제-표지된 sbp, 선택적인 신호 억제제, 및 트리거 용액을 포함하는 검정 물질이 존재하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 검정 물질은 수용액에 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 검정 물질은 농축 수용액에 제공된다. 검정 물질의 농축 수용액은 각각의 검정 물질의 요구되는 최종 농도에 도달하도록 하는 부피로 반응 혼합물에 제공된다. 일부 실시양태에서, 추가의 수용액은 농축 수용액의 희석을 위해 제공된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 검정 물질은 동결건조된 또는 고체 형태로 제공된다. 상기 실시양태에서, 추가의 수용액이 동결건조된 또는 고체 검정 물질을 수용액 또는 수용액 농축물로 전환하기 위해 제공될 수 있다.
몇몇의 키트 실시양태에서, 각각의 검정 물질은 별개의 용기에 제공된다. 다른 키트 실시양태에서, 하나 이상의 검정 물질이 공통 용기에 제공된다. 또 다른 키트 실시양태에서, 하나 이상의 검정 물질은 각각의 웰이 검정 물질을 보유하는 여러 웰로 분할되는 공통 용기에 제공된다.
키트는 유리된 표지 화합물, 화학발광 표지된 특이적 결합 파트너, 또는 화학발광 표지된 보조 물질, 예를 들어 차단 단백질로서 화학발광 표지를 트리거 용액 및 사용 지시서와 함께 패키지 조합물로 포함할 수 있다. 또한, 키트는 임의로 활성화제 접합체, 분석물 교정기 및 대조군, 희석제 및 반응 버퍼 (화학발광 표지화가 사용자에 의해 수행되어야 할 경우)도 함유할 수 있다.
시스템
본 발명의 개시내용에 기재된 검정 방법은 시스템을 사용함으로써 신속한 수행을 위해 자동화될 수 있다. 본 발명의 개시내용의 검정을 수행하기 위한 시스템은 트리거 용액을 다른 반응물을 담은 반응 용기에 분취 및 전달하고, 생성되는 화학발광 신호를 판독하기 위한 유체 취급 능력을 요구한다. 그러한 시스템의 실시양태에서, 휘도계는 트리거 용액 주입의 시간 및 장소에서 반응 용기에 근접하게 위치한다. 바람직하게는, 휘도계 또는 다른 검출 장치를 포함하는 검출 시스템은 트리거 용액을 주입하는 유체 취급 시스템과 공동으로 작용한다. 추가로, 본 발명의 개시내용의 검정을 수행하기 위한 자동화된 시스템은 다른 반응물 및 샘플을 반응 용기에 분취 및 전달하기 위한 유체 취급 능력을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 검정 방법을 수행하기 위한 시스템은 샘플을 반응 혼합물에 전달하기 위한 유체 취급 시스템, 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너, 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너, 선택적인 신호 억제제를 반응 혼합물에 전달하기 위한 유체 취급 시스템, 및 화학발광 신호를 방출하기 위해 트리거 용액을 반응 혼합물에 전달하기 위한 유체 취급 시스템; 및 화학발광 신호를 검출하기 위한 검출 시스템을 포함하고, 여기서 트리거 용액의 전달을 위한 유체 취급 시스템은 트리거 유체 주입시 및 주입 후에 화학발광 신호 방출을 측정하기 위해 검출 시스템과 공동으로 작용한다. 이들 유체 취급 시스템은 시스템의 입체형태에 따라 동일한 시스템 또는 상이한 시스템일 수 있다.
변형된 DXI 800 기구는 본 발명의 개시내용의 검정 방법을 수행하기 위해 변형시켰다. 변형하지 않은 DXI 800 기구에 대한 추가의 설명은 본원에 참고로 포함된 문헌 [UniCel DXI User's Guide, ⓒ2007, 베크만 쿨터]에서 이용가능하다. 본원에 기재된 방법의 수행에 사용하기 위해, DXI® 800 면역검정 기구를 트리거 용액 주입 동안 및 직후에 반응 용기(로부터 약 19 mm)의 위치 가까이에 검출을 위해 배치된 광자 (photon)-계수 휘도계 (상업적으로 이용가능한 DXI 800 기구에 사용된 것과 동일한 모델)를 포함시킴으로써 변형시켰다.
DXI® 800 면역검정 내의 기질 전달 시스템을 이용하여 트리거 용액을 전달하였다. 본원에 기재된 방법에 따른 분석에 필요하지 않은 DXI® 800 면역검정 기구의 몇몇 추가의 성분, 예를 들어 통상적인 면역검정을 위해 필요하지만 본 발명의 방법에 사용되지 않는 분리 및 세척을 위해 사용되는 자석 및 흡인 시스템은 편의상 제거하였다. 변형된 DXI® 800 면역검정 기구는 반응 용기 취급, 시약의 피펫팅, 검출, 및 37℃에서 제공된 온도 제어를 자동화하는데 편의상 이용되었다. 다른 상업적으로 이용가능한 기구 장비는 기구가 트리거 용액을 반응 용기 내로 주입하고 화학발광 신호의 검출을 동시 또는 거의 동시 방식으로 시작할 수 있거나 시작하도록 변형될 수 있는 한, 본원에 기재된 검정 방법을 수행하기 위해 유사하게 이용될 수 있다. 화학발광 신호의 검출은 매우 짧은 지속시간, 수 밀리초, 예를 들어 광전증배관 (PMT)의 1 사이클의 것일 수 있거나, 수 초 동안 연장될 수 있다. 수집된 신호의 전부 또는 일부를 후속적인 데이타 분석에 사용할 수 있다.
화학발광 신호의 검출은 매우 짧은 지속시간, 수 밀리초, 예를 들어 광전증배관 (PMT)의 1 사이클의 것일 수 있거나, 수 초 동안 연장될 수 있다. 수집된 신호의 전부 또는 일부를 후속적인 데이타 분석에 사용할 수 있다. 예를 들어, 아래 기재된 전형적인 절차에서, 광 강도는 섬광에 집중하여 0.25 sec 동안 합산되고, 다른 절차에서, 광 강도는 5 sec 동안 합산되고, 여기서 처음 0.5 sec는 주입 전의 지연이다.
실시예
용어:
AHTL: N-아세틸 호모시스테인 락톤
AK: 아크리단
CKMB: 크레아틴 키나제 동종효소 (isoenzyme)
DMF: 디메틸 포름아미드
EDC: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드
HRP: 양고추냉이 퍼옥시다제
MS-PEG: 말단 메틸기를 갖는 아민-반응성 선형 폴리에틸렌 글리콜 중합체
Na2EDTA: 에틸렌 디아민 테트라아세트산의 나트륨염
NHS: N-히드록시숙신이미드
PEG: 폴리에틸렌 글리콜; 구체적으로 분자량 < 20,000 g/mol인 올리고머 또는 중합체
PEO: 폴리에틸렌 옥시드; 구체적으로 분자량 > 20,000 g/mol인 중합체
PMP: 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론
PSA: 전립선 특이적 항원
술포-SMCC: 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트
TBS: Tris-완충 염수
TnI: 트로포닌 I; cTnI은 심장 트로포닌 I이다.
Tris: 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올 (트리스-(히드록시메틸)아미노메탄으로도 알려짐)
Tween®-20: 폴리옥시에틸렌(20) 나트륨 모노라우레이트; 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스))로부터 상업적으로 이용가능함.
물질:
공지의 농도의 샘플: 아래 설명된 검정 및 검정 방법에서 사용하기 위한 공지의 농도의 샘플은 일반적으로 지정된 분석물의 정제된 단백질을 그 분석물이 없는 인간 혈청에 첨가함으로써 제조하였다. 예를 들어, 공지의 PSA 단백질의 PSA 샘플은 인간 정액으로부터의 PSA를 아래의 실시예에 제시된 표의 진술된 PSA 농도에 도달하도록 PSA가 없는 여성 혈청에 섞음으로써 제조하였다. 샘플은 사용 전에 저장되는 경우에 4℃에서 저장하거나 동결시키고 사용 전에 해동하였다. 공지의 농도의 샘플은 일반적으로 미지의 분석물 농도의 샘플 내의 분석물 농도를 결정하기 위해 검정 방법과 조합으로 표준 곡선의 생성을 위해 유용한 교정 세트에 대해 관습적인 바와 같이 제조하였다.
인핸서를 포함하는 트리거 용액: 아래 실시예 중 많은 것에서 사용된 수성 트리거 용액을 트리거 용액 A로서 칭한다. 트리거 용액 A는 약 3% 에탄올을 갖는, pH 8.0에서 25 mM Tris의 수성 버퍼 용액 중에 8 mM p-히드록시신남산, 1 mM Na2EDTA, 105 mM 과산화우레아, 및 0.2% Tween®-20을 함유한다. 모든 성분은 다양한 공급회사, 예를 들어 시그마 (Sigma, 미국 미주리주 세이트루이스)로부터 상업적으로 이용가능하다.
버퍼 II: (베크만 쿨터, 인크. (미국 캘리포니아주 브레아)로부터 상업적으로 이용가능한 TRIS 완충 염수, 계면활성제, <0.1% 아지드화나트륨, 및 0.1% 프로클린® 300 (롬 앤 하스)).
기구:
변형된 DxI® 800 면역검정 기구 (베크만 쿨터, 인크., 미국 캘리포니아주 브레아): 변형된 DXI® 800 기구를 사용하여, 주지되는 경우에 아래 일부 실시예에 기재된 검정 방법을 수행하였다. 본원에 기재된 방법을 수행하는데 사용하기 위해, DXI® 800 기구를 트리거 용액 주입 동안 및 직후에 반응 용기(로부터 약 19 mm)의 위치 가까이에 검출을 위해 배치된 광자-계수 휘도계 (상업적으로 이용가능한 DXI® 800 기구에서 사용된 것과 동일한 모델)를 포함시킴으로써 변형시켰다. DXI® 800 면역검정 내의 기질 전달 시스템을 이용하여 트리거 용액을 전달하였다. 본원에 기재된 방법에 따른 분석에 필요하지 않은 DXI® 800 면역검정 기구의 몇몇 추가의 성분, 예를 들어 통상적인 면역검정을 위해 필요하지만 본 발명의 방법에 사용되지 않는 분리 및 세척을 위해 사용되는 자석 및 흡인 시스템은 편의상 제거하였다. 변형된 DXI® 800 면역검정 기구는 반응 용기 취급, 시약의 피펫팅, 검출, 및 37℃에서 제공된 온도 제어를 자동화하는데 편의상 이용되었다. 다른 상업적으로 이용가능한 기구 장비는 기구가 트리거 용액을 반응 용기 내로 주입하고 화학발광 신호의 검출을 동시 또는 거의 동시 방식으로 시작할 수 있거나 시작하도록 변형될 수 있는 한 본원에 기재된 검정 방법을 수행하기 위해 유사하게 이용될 수 있다. 다른 예시적인 기구를 아래 나열한다. 화학발광 신호의 검출은 매우 짧은 지속시간, 수 밀리초, 예를 들어 광전증배관 (PMT)의 1 사이클의 것일 수 있거나, 수 초 동안 연장될 수 있다. 수집된 신호의 전부 또는 일부를 후속적인 데이타 분석에 사용할 수 있다.
루미노스캔 애센트 (Luminoskan Ascent)® 플레이트 휘도계 (써모 피셔 사이언티픽, 인크. (Thermo Fischer Scientific, Inc., 미국 매사추세츠주 월섬)). 변형되지 않음. 방법은 실온에서 수행함.
스펙트라맥스 (SpectraMax)® L 마이크로플레이트 휘도계 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일)). 변형되지 않음. 방법은 신속 판독 (fast read) 운동학 방식을 이용하여 실온에서 수행함.
실시예 1. SSIA 로서 유효성에 대한 화합물의 스크리닝
A. 균질한 PSA 면역검정에 의한 SSIA 의 스크리닝
본 실시예는 본 발명의 개시내용의 분석에서 SSIA로서 기능성에 대한 후보 화합물의 시험을 위해 사용되는 하나의 방법을 제공한다. 시험은 단백질 PSA의 모델 스크리닝 면역검정으로 수행하였다. 96-웰 미세적정 플레이트 포맷을 이용하여 시험을 실행하였다. 30 ㎕의 마우스 항-PSA-AK1 (66 ng), 30 ㎕의 마우스 항-PSA-HRP 접합체 (7.8 ng), 36 ㎕의 인간 여성 혈청, 및 24 ㎕의 PSA 교정기를 함유하는 용액을 각각의 웰 내로 피펫팅하였다. 플레이트를 37℃에서 10분 동안 인큐베이팅하였다. 시험 화합물의 5 ㎕ 분취액 (다양한 농도)을 각각의 웰에 첨가하였다. 그의 조성이 아래 나열된 트리거 용액의 100 ㎕ 용액의 첨가에 의해 화학발광을 촉발시켰다. 루미노스캔 애센트® 플레이트 휘도계 (써모 피셔 사이언티픽, 인크., 미국 매사추세츠주 월섬)를 이용하여 화학발광 섬광 (flash)을 트리거 용액의 첨가 후 5초 동안 통합하였다.
각각의 후보 화합물을 적어도 2개의 PSA 수준에서 시험하였다: 제로 및 129 ng PSA/mL (교정기 S5) 및/또는 2 ng PSA/mL (교정기 S2). 간략함을 위해, 각각의 후보 화합물의 하나의 대표적인 농도의 결과만을 제시한다. 화합물은 S5/S0이 대조군에 비해 개선되는 경우에 검정 성능을 개선하는데 효과적인 것으로 간주된다. 본 스크린에서 개선 인수가 적어도 2 (S5/S0 ≥ 약 20-30)인 것이 바람직하고, 개선 인수가 적어도 5 (S5/S0 ≥ 약 50)인 것이 보다 바람직하고, S5/S0 ≥ 100인 것이 더욱 더 바람직하다. 본 스크리닝 시험에서 SSIA로서 유효성을 보이는 많은 화합물이 밝혀졌고, 다른 것들은 무효하거나 제한된 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112011074714212-pct00019
Figure 112011074714212-pct00020
Figure 112011074714212-pct00021
B. 효과적인 선택적인 신호 억제제 ( SSIA )의 선택을 위한 모델 시스템
본 발명의 개시내용의 분석에서 선택적인 신호 억제제로서 기능하는 특징을 갖는 화합물을 스크리닝하고 선택하기 위해 모델 시스템을 또한 개발하고 사용하였다. 모델 시스템은 화학발광-표지된 sbp로서 스트렙타비딘 및 아크리단 케텐디티오아세탈 화학발광 표지 (AK1) 및 활성화제-표지된 특이적 결합쌍으로서 비오티닐화 HRP로 표지된 BSA (소 혈청 알부민)에 접합된 미세입자를 이용한다. 모델 시스템에서, 가변량의 Btn-HRP를 화학발광-표지된 특이적 결합쌍에 0, 1, 10, 100 및 250 ng/mL로 첨가한다. 추가의 비표지된 HRP를 각각의 반응 혼합물 내에 500 ng/mL 농도의 총 HRP에 도달하도록 첨가한다. 샘플을 모방하기 위해 활성화제-표지된 sbp와 조합된 비표지된 HRP를 화학발광-표지된 sbp 미세입자에 제공하였다. SSIA로서 평가하기 위한 화합물을 또한 첨가하였다. 이어서, 모델 시스템의 상기 반응 혼합물을 본 발명의 개시내용의 분석의 방식으로 트리거 용액의 첨가에 의해 촉발시킨다.
C. 모델 시스템을 위한 물질의 제조:
미세입자 상에 화학발광-표지된 sbp를 제조하기 위해, 소 혈청 알부민 (BSA)을 4X 몰 과량의 비오틴-LC-술포NHS (피어스 바이오테크놀로지 인크. (Pierce Biotechnology Inc., 미국 일리노이주 록포드))로 비오티닐화하였다. 결합되지 않은 반응물은 탈염 또는 투석을 통해 제거하였다. 이어서, 비오틴-BSA를 20 mM 인산나트륨 pH 7.2:DMSO 75:25 (v/v) 중에서 아크리단 케텐디티오아세탈 AK1의 NHS 에스테르 5X 몰 과량과 반응시킨 후, 동일한 버퍼 내에서 탈염시켰다. 이어서, 이중 표지된 (비오틴 및 AK1) BSA를 40℃에서 16-24 h 동안 미세입자 1 mg 당 약 20 ㎍ 표지된 BSA의 농도로 0.1 M 보레이트 버퍼 (pH 9.5) 중에서 토실 활성화된 M280 미세입자 (인비트로겐 코포레이션 (Invitrogen Corporation, 미국 캘리포니아주 칼스바드))와 커플링시켰다. 커플링 후에, 미세입자를 40℃에서 1 h 동안 0.2 M TRIS 염기, 2% SDS (pH ~11)로 스트리핑하였다. 스트리핑 과정을 1회 더 반복하였다. 이어서, 미세입자를 0.1% BSA/TRIS 완충 염수 (BSA/TBS) 버퍼에 현탁시키고, 스트렙타비딘 (SA)을 미세입자 1 mg 당 약 15 ㎍ SA로 첨가하였다. 스트렙타비딘을 미세입자와 45-50 min 동안 실온에서 혼합하였다. 이어서, 미세입자를 3회 세척하고 동일한 BSA/TBS 내에 현탁시켰다. 이들 미세입자의 로드는 미세입자 1 mg 당 5 ㎍의 비오티닐화 단백질이다.
HRP (로슈 다이아그노스틱스 (Roche Diagnostics, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 4X 몰 과량의 비오틴-LC-술포NHS (피어스 바이오테크놀로지 인크. (미국 일리노이주 록포드))로 비오티닐화하였다. 별법으로, 25X 몰 과량의 비오틴-PEO4-NHS를 사용할 수 있다. 결합되지 않은 반응물은 탈염 또는 투석을 통해 제거하였다.
평가를 위한 각각의 SSIA 화합물을 버퍼 II 내에 작업 강도 농도의 적어도 10X의 농도로 용해시켰다.
D. 모델 시스템을 사용하는 시험 절차
25 ㎕의 1 mg/ml의 이중-표지된 (비오틴 및 AK1) BSA M280 입자를 버퍼 II 내에서 45 ㎕의 작업 농도 SSIA와 혼합하였다. 15 ㎕의 버퍼 II를 첨가하여 분석 부피를 85 ㎕로 하였다. Btn-HRP:HRP를 상이한 비 (비오티닐화-HRP의 양은 0, 1, 10, 100 내지 250 ng/mL로 변하였다)로 함유하는 15 ㎕의 샘플을 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 min 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 100 ㎕의 트리거 용액을 첨가하고 광 강도를 기록하였다. 트리거 용액을 포함하는 반응 혼합물의 총 부피는 200 ㎕이고, 여기서 SSIA의 최종 농도는 100 μM이었다.
Figure 112011074714212-pct00022
Figure 112011074714212-pct00023
Figure 112011074714212-pct00024
본 발명의 개시내용의 분석에서 사용하기 위한 SSIA로서 효용성을 나타내는 화합물은 아스코르브산, 아스코르브산의 6-팔미테이트 및 5,6-이소프로필리덴 유도체, 2-아미노페놀, 4-아미노-3-히드록시벤조산, 4-클로로카테콜, 및 트롤록스 (토코페롤의 유도체)를 포함하고, 여기서 배경 신호의 감소는 S0 값을 대조군에 비교함으로써 나타내어지고, 신호 대 노이즈의 개선은 S1/S0 값의 증가에 의해 입증된다.
모델 시스템에서 SSIA로서 불충분한 유효성을 보인 화합물은 글루타티온, 시스테인, N-아세틸 시스테인, 리포산 (디술피드), peg화 토코페롤, 멜라토닌 (트립타민 유도체), TEMPOL (안정한 니트록시드), 니코틴산 히드라지드, 니코틴산, 레스베라트롤 및 2개의 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 용액이다. 알파 및 감마-토코페롤, 요산, 및 페룰산을 비롯한 제2군의 화합물은 75-88% 범위에서 S0 신호의 감소를 보이지만, 10 ng/mL Btn-HRP에서 제3 교정기 수준까지 S/S0의 증가를 보이지 않는다.
스크리닝 시험은 상기 설명된 바와 같이 변형된 DxI® 면역검정 시스템 (베크만 쿨터, 인크. 미국 캘리포니아주 브레아)을 사용하여 수행하였다.
실시예 2:
다음 실시예는 SSIA의 존재 및 부재 하에 모두, 고상의 부재 하에 분석물의 면역검정을 입증한다. 분석은 2개의 직접 표지된 항체를 포함하였고, 이들은 각각 분석물, 본 실시예에서 전립선 특이적 항원 (PSA)에 대해 특이적 결합 친화도를 갖는다. 하나의 항체 (편의상 "Ab1"로 지정함)는 AK11의 하나 이상의 분자, 일반적으로 2개의 분자에 공유 부착된다. 제2 항체 ("Ab2"로 지정함)는 HRP에 공유 결합된다. 물질의 제조, 분석의 성능 및 결과는 아래 설명된 바와 같았다.
A. Ab1 ~ AK 접합체의 제조
다음 실시예에서, 본원에서 AK1 (상기 제시됨)으로서 칭하는 아크리단 케텐디티오아세탈 화학발광 화합물의 NHS 에스테르는 전립선 특이적 항원 (PSA)의 항체에 공유 부착된다. 다음 방법이 또한 다른 항원의 화학발광 표지된 항체 또는 다른 아크리단 케텐디티오아세탈 화학발광 화합물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
AK1, 아민 반응성 아크리단 케텐디티오아세탈 화학발광 화합물은 DMSO 중에 10 mM로 제조하였다. PBS (pH 7.4) 중의 3 mg (6.6 mg/mL)의 모노클로날 PSA 항체에, 10배 몰 과량의 AK1을 첨가하고 암소에서 1시간 동안 주위 온도에서 인큐베이팅하였다. 생성물을 PBS (pH 7.4) 내에 평형화시킨 PD-10 탈염 컬럼 상으로 정제하였다. 생성물은 항체 상의 이용가능한 아미노기에서 파선으로 표시된 항체에 대한 결합을 갖는 아래 제시된, AK11 (AK1의 반응 생성물)에 공유 부착된 모노클로날 항-PSA를 함유하였다. 280 및 384 nm에서 흡광도를 사용하여, IgG 농도 및 AK11/IgG 비 (3 AK11:1 IgG)를 결정하였다.
Figure 112011074714212-pct00025
B. Ab -2~ HRP 접합체의 제조
다음 대표적인 합성 절차에서, 효소 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)는 전립선 특이적 항원 (PSA)에 대한 항체에 공유 부착된다. 본원에 교시된 방법에 따라, 추가의 효소-표지된 항체를 제조할 수 있다.
C. HRP 의 활성화
10 mg의 HRP (로슈, 10-814-393-001)를 2.0 mL의 1xPBS (137 mM NaCl, 10 mM 인산염, 2.7 mM KCl, 및 7.4의 pH)에 용해시켰다. DMSO (25 ㎍/㎕) 중 30배 몰 과량의 술포-SMCC (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬)을 HRP 용액에 첨가하고, 암소에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 말레이미드 활성화된 HRP를 PBS (pH 7.4) 내에서 PD-10 탈염 컬럼 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)) 상에서 정제하였다. HRP 농도를 403 nm에서 2.275 mL/mg-cm의 소광 계수를 사용하여 분광광도법에 의해 결정하였다.
D. 항- PSA 모노클로날 항체 ( Ab2 )의 활성화
50배 몰 과량의 2-이미노티올란 (써모 피셔 사이언티픽, 뉴저지주 피스카타웨이)을 PBS (pH 7.4) 중의 모노클로날 PSA 항체에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 암소에서 반응시켰다. 모노클로날 PSA 항체 (Ab2로 지정됨)는 PSA 상의 결합 부위에서 실시예 2에서 Ab1과 상이하다. 티올화 항체는 PBS (pH 7.4) 내에서 PD-10 탈염 컬럼 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 정제하였다. 항체 농도를 280 nm에서 1.4 mL/mg-cm의 소광 계수를 이용하여 분광광도법에 의해 결정하였다.
E. Ab2 - HRP 접합체의 제조
5배 과량의 활성화된-HRP를 활성화된-Ab2 용액에 첨가하여 접합체 반응 혼합물을 생성하였다. 접합체 반응 혼합물을 회전자 상에서 실온에서 2시간 동안 암소에서 인큐베이팅하였다. 반응하지 않은 티올 및 말레이미드기는 접합체 반응 혼합물에 과량의 L-시스테인 및 요오도아세트아미드 (각각의 단계 15분)의 순차적인 첨가에 의해 차단하였다. 제1 단계에서, 과잉 (0.025X 반응 부피)의 50 mg/mL L-시스테인-HCl (PBS (pH 7.4) 중에 용해된)을 첨가하고 15분 인큐베이팅하였다. 제2 단계에서, 과잉 (0.04X 반응 부피)의 50 mg/mL 요오도아세트아미드 (PBS (pH 7.4) 중에 용해된)를 반응 혼합물에 50 mM 보레이트 (pH 8.5) (0.08X 반응 부피)와 함께 첨가하고, 추가로 15분 동안 주위 온도에서 차광하여 인큐베이팅하였다. 접합체를 PBS (pH 7.4) 내에 평형화시킨 수퍼덱스 (Superdex) 200 컬럼 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이, Part No. 17-5175-01) 상에서 정제하였다. 접합체를 함유하는 분획을 모으고, HRP/IgG 비를 A 및 B에 설명된 바와 같이 분광광도법에 의해 결정하였다. 계산된 HRP/IgG 비는 1.4이었다.
SSIA 와 함께 직접- 표지된 sbp 를 사용한 PSA 의 분석
Ab1-AK11 접합체를 PBS (pH 7.4) 중에 10 ㎍/ml에서 제공하였다. Ab2-HRP 접합체를 PBS (pH 7.4) 중에 0.25 ㎍/ml로 제공하였다. 제1 반응 용기에서, 25 ㎕의 Ab1-AK11 접합체, 탈이온수 중 600 μM 아스코르브산, 및 25 ㎕의 Ab2-HRP 접합체를 25 ㎕의 샘플에 첨가하고 15분 동안 인큐베이팅하였다. SSIA 부재시와 비교하기 위해, 제2 반응 용기에서, 25 ㎕의 Ab1-AK11 접합체, 25 ㎕의 물, 25 ㎕의 Ab2-HRP 접합체를 25 ㎕의 샘플에 첨가하고 15분 동안 인큐베이팅하였다.
인큐베이션 후에, 100 ㎕의 트리거 용액 A의 주입에 의해 각각의 반응 용기 내의 화학발광 반응을 개시하였다. 반응 용기 내로 트리거 용액의 주입과 동시에, 광자-계수 광전증배관 (PMT)을 포함하는 휘도계에 의해 화학발광 신호를 검출하였다. 신호 수집을 3.85초의 과정에 걸쳐 계속하고, 화학발광 신호 데이타를 컴퓨터에 저장하였다.
각각의 샘플을 상기 검정 방법에 따라 삼중으로 분석하였다. 반응 용기 내로 트리거 용액 도입의 출발로부터 125 밀리초에 시작하여 495 밀리초의 시간 간격 동안 각각의 분석된 샘플에 대해 수집한 RLU 데이타를 각각의 개별적인 실행에 대해 합하고, 각각의 샘플에 대해 삼중물에 걸쳐 평균하고, 표 13에 제시하였다. 신호 대 노이즈의 비 (S/S0)를 각각의 농도 값에서 계산하였다. 표 13의 데이타는 미지의 PSA 농도의 샘플의 분석을 위한 교정 곡선을 생성하기 위해 사용할 수 있다.
Figure 112011074714212-pct00026
다음 실시예는 SSIA의 존재 및 부재 하에 모두, 고상의 부재 하에 직접-표지된 항체를 사용한 분석물의 본 발명의 개시내용에 따른 면역검정을 입증하였다. 표 13에 제시된 결과로부터, SSIA를 갖지 않는 직접-표지된 항체 분석은 분석된 PSA 농도의 전체 범위에 걸쳐 (분석물) 용량 반응성이 아니다. 이와 반대로, 본 발명의 개시내용에 따른 SSIA를 포함한 직접-표지된 면역검정은 기능적이고, 제로 (대조군) 내지 모든 5개의 PSA 교정기 값의 용량 반응을 제공한다. 결과적으로, SSIA를 포함한 직접-표지된 면역검정은 다른 샘플 내에서 미지의 분석물 농도를 결정하기 위해 성공적으로 사용될 수 있다. 또한, SSIA의 첨가는 교정 범위 (PSA, ng/mL, 0 내지 101.6)에 걸쳐 신호 대 노이즈 비 (S/S0)를 개선한다.
실시예 3: PSA 에 대한 AB1 ~ AK1 , AB2 ~ HRP 접합체 분석
직접-표지된 화학발광-표지된 sbp 및 활성화제-표지된 sbp를 사용하는, PSA를 향한 분석을 아래 설명된 바와 같이 용액 내에서 수행하였다. 본 실험은 변하는 정제도의 접합된 시약을 사용한 결과를 추가로 연구하였다.
마우스 항-PSA (MxPSA) (111 ㎕, 9 mg/mL) 및 AK1 NHS 에스테르 (106 ㎕, 1 mg/mL DMF 원액)을 0.1 M 보레이트 (pH 8.25) 버퍼 (784 ㎕) 내에서 반응시켰다. 혼합물을 실온에서 90분 동안 혼합하였다. 100 ㎕의 반응 혼합물을 제거하고, 2.6 ㎕의 라이신 용액 (2 mg/mL)을 첨가하고 30분 동안 혼합하였다. 상기 반응 혼합물을 "정제되지 않은 접합체" 분석에서 사용하기 위해 PBS 버퍼 내에 희석하였다. 동일한 방식으로 제조한 접합체를 "정제된 접합체" 분석에서 사용하기 위해 당업계에 공지된 바와 같이 탈염 컬럼으로 정제하였다.
MxPSA-AK1 접합체 용액 (67 ng) 30 ㎕, 교정기 (0-129 ng/mL PSA) 24 ㎕, MxPSA-HRP 접합체 (7.8 ng) 30 ㎕, 및 혈청 36 ㎕을 백색 미세적정 플레이트의 웰 내로 피펫팅하였다. 플레이트를 10분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 5 ㎕의 아스코르브산 용액 (5.5 mM)을 첨가하였다. 플레이트를 주입 플레이트 휘도계 내에 넣었다. 100 ㎕의 트리거 용액 A를 휘도계에 의해 첨가하고, 화학발광 신호를 트리거 용액의 첨가로부터 5초 동안 판독하였다.
반응 혼합물 내의 PSA의 농도의 함수로서 "정제되지 않은" 및 "정제된" MxPSA-AK1 접합체의 반응에 대한 화학발광 신호의 강도 (상대 발광 단위, RLU)를 아래 표에 제공한다.
Figure 112011074714212-pct00027
표 14에 제시된 데이타는 로그-로그 플롯으로서 변환될 때, PSA의 로그 농도에 대한 화학발광 신호의 로그 강도가 단조성이고 (monotonic), MxPSA-AK1 접합체 시약의 정제 수준에 무관하게 [PSA] 범위 0.5 ng/mL 내지 129 ng/mL에서 대략 선형임을 보여주었다.
실시예 4: 경쟁적 면역검정
경쟁적 면역검정 반응에서 표지된 분석물과 조합으로 화학발광-표지된 포획 항체를 이용하는 분석물의 균질한 면역검정을 제공한다. 예시적인 분석물 시클릭 -AMP ("cAMP")를 HRP와 접합시켜 cAMP-HRP 시약을 제공하고, 이를 포획 항체-AK5 복합체를 형성하도록 AK5와 접합시킨 포획 항체 ("포획 Ab")에서 분석물 cAMP에 대해 경쟁시켰다. 따라서, 포획 항체-AK5-cAMP-HRP 복합체의 형성 및 본원에 기재된 바와 같은 트리거 용액의 첨가 시에, 포획 항체-AK5-cAMP-HRP 복합체가 형성되는 정도로 화학발광 (즉, "광")이 관찰될 수 있다. HRP와 접합되지 않은 분석물 (cAMP)는 포획 항체-AK1 복합체에 대해 경쟁하고, 트리거 용액의 첨가 시에 생성되는 포획 항체-AK5-cAMP 복합체는 화학발광을 제공하지 않는다 (즉, "광 없음"). 따라서, 분석물 cAMP는 포획 항체-AK5 복합체에 대해 경쟁하고, 그에 의해 포획 항체-AK1-cAMP-HRP 복합체로 인한 신호를 억제한다.
토끼 항 cAMP (이뮤노테크 (IMMUNOTECH, 마르세유) 0.1 mg (4.93 mg/mL 원액으로부터 20.3 ㎕)을 1.7 mL 원심분리 튜브 내에서 162 ㎕의 0.1 M 붕산나트륨 (pH 8.25) 버퍼에 첨가하였다. 17.6 ㎍의 AK5 (DMF의 1 mg/mL 원액으로부터 17.6 ㎕)를 첨가하였다. 빠른 볼텍스 혼합 후에, 튜브를 회전 진탕기 상에 1시간 동안 실온에서 놓았다. 3 mg/mL 원액으로부터 1.2 ㎕의 L-라이신을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 0.4% BSA 및 PBS 내에 (1:1) 희석시키고 4℃에서 저장하였다. cAMP-HRP를 문헌에 따라 제조하였다 (예를 들어, [J Immunological Methods, 1992, 155 31-40] 참조). cAMP는 시그마 (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 구입하였다. cAMP의 30 nM 원액을 PBS 내에서 제조하고, PBS 내에 추가로 희석하여 분석을 위한 샘플 교정기를 제조하였다. 표 15를 참조한다.
경쟁적 면역검정 프로토콜은 다음과 같았다. AK5 표지된 모노클로날 토끼 항 cAMP (0.275 ㎍/mL) (3 ㎕), HRP 표지된 cAMP (0.09375 ㎍/mL) (3 ㎕) 및 cAMP 교정기 (4 ㎕)를 백색 폴리스티렌 384 저부피 플레이트에 첨가하였다. 접합체 용액은 BSA 중의 0.2%이었다. 실온에서 30분 인큐베이션 후에, 1 ㎕의 2-아미노페놀 (0.6875 mM)을 첨가한 후, 트리거 용액 (10 ㎕)을 첨가하였다. 트리거 용액은 25 mM Tris (pH 8), 8 mM p-히드록시신남산, 1 mM EDTA, 0.2% Tween-20 및 0.1 M 우레아퍼옥시드를 함유하였다. 광 강도를 트리거의 주입 직후에 1초 동안 측정하였다 (스펙트로맥스 (Spectromax)). 반응물을 인큐베이션 동안 광에 노출시키지 않았고 진탕하지 않았다.
다음 표 15에 제시된 바와 같이, 교정기를 0.137 nM 내지 10000 nM 범위에서 사용하였다. 데이타를 표 15에 제공하고, 여기서 cAMP에 대한 IC50은 2.6 nM인 것으로 계산되었다. 데이타는 100 nM의 과잉으로 분석물 cAMP 수준을 사용하여 화학발광 신호의 완전 억제가 달성될 수 있음을 입증한다.
Figure 112011074714212-pct00028
실시예 5: 화학발광 표지, 비오티닐화 BSA , 뉴트라비딘 및 항체를 포함한 화학발광- 표지된 SBP 의 제조
본 실시예는 비오틴 및 스트렙타비딘의 비-공유 상호작용을 통한 자가-조립에 의해 형성된 "4량체" 스캐폴드 (scaffold) 또는 복합체를 설명한다. 본 실시예는 또한 4량체 스캐폴드를 사용하는 분석물에 대한 면역검정을 입증한다.
A. 화학발광 화합물 및 비오틴을 사용한 BSA 의 표지:
술포-NHS-LC-비오틴 (써모 사이언티릭, 미국 일리노이주 록포드) 및 AK1-NHS 에스테르 (루미겐 (Lumigen, 미국 미시건주 사우스필드))로 표지된 소 혈청 알부민 (BSA)을 BSA 1 몰당 7 몰의 AK1; BSA 1 몰당 3 몰의 비오틴의 몰비로 혼합하고, 혼합물을 실시예 17에 설명된 바와 같이 PD-10 탈염 컬럼 상에서 정제하였다.
B. 뉴트라비딘 - IgG 접합체의 제조
티올화 항-PSA 모노클로날 항체를 실시예 2에 설명된 바와 같이 제조하였다.
3배 몰 과량의 말레이미드-활성화된 뉴트라비딘 (써모 사이언티픽)을 티올화 모노클로날 항-PSA 용액 (5 mg)에 첨가하고, 회전자 상에서 실온에서 1시간 동안 암소에서 인큐베이팅하였다. 반응하지 않은 티올 및 말레이미드기는 접합체 반응 혼합물에 L-시스테인 및 요오도아세트아미드 (각각의 단계 15분)의 순차적인 첨가에 의해 차단하였다. 접합체는 PBS (pH 7.4) 내에 평형화시킨 수퍼덱스® 200 컬럼 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 정제하여, 반응하지 않은 뉴트라비딘을 제거하였다. 접합체를 함유하는 HPLC 분획을 모으고 4량체 스캐폴드 복합체의 제조에 사용하였다.
C. 뉴트라비딘 접합된 IgG 및 표지된 BSA 를 함유하는 스캐폴드 복합체의 제조
상기 설명된 바와 같은 3배 몰 과량의 표지된 BSA를 뉴트라비딘-접합된 IgG에 첨가하고, 30분 동안 주위 온도에서 복합체를 형성시켰다. 최종 생성물을 상기 설명된 바와 같은 HPLC에 의해 정제하고, 생성물을 추가로 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
D. 4량체 스캐폴드를 사용한 PSA 면역검정
PSA에 대한 면역검정을 실질적으로 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 동일한 부피 (각각 25 ㎕)의 4량체 스캐폴드, HRP 접합체, 600 μM 아스코르브산 및 PSA 샘플을 반응 용기 내에서 조합하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 반응 용기 내로 100 ㎕의 트리거 용액 A의 주입에 의해 화학발광 반응을 개시하였다. 주입과 동시에, 화학발광 신호를 광전증배관 (PMT)을 포함하는 휘도계에 의해 275 밀리초의 과정에 걸쳐 검출하고, 데이타를 컴퓨터에 저장하였다.
표 16에 제공된 PSA 농도에 도달하도록 공지의 PSA 농도의 샘플을 이전에 설명된 바와 같이 제조하였다. 이어서, 샘플을 상기 설명된 바와 같이 분석하고, 미지의 PSA 농도의 샘플의 분석을 위해 교정 곡선을 생성하기 위해 데이타를 사용하였다.
Figure 112011074714212-pct00029
실시예 6. 화학발광- 표지된 보조, 비오티닐화 항체 및 자가-조립된 스트렙타비딘 - IgG 중합체의 제조
본 실시예에서, AK1-표지된 스트렙타비딘을 비오티닐화 항체와 혼합하여, 자가-조립에 의해 중합체를 형성하였다. 이들 자가-조립된 스트렙타비딘/비오틴-IgG 중합체는 분석물의 면역검정을 위한 스캐폴드로서 사용할 수 있다.
A. AK1 - 표지된 스트렙타비딘의 제조
AK1 (루미겐, 미국 미시건주 사우스필드)을 무수 DMSO 내에 30 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 6 몰 당량을 50 mM NaCl을 함유하는 물 중에 제조된 스트렙타비딘 (스트렙타비딘-플러스®, 프로자임 (Prozyme, 미국 캘리포니아주 샌레안드로))의 10.1 mg/mL 용액에 첨가하였다. 암소에서 60분 동안 반응을 진행시키고, 후속적으로 PBS (pH 7.2) 내에 평형화시킨 세파덱스 (Sephadex)® G-25 컬럼 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. AK11:단백질 몰비는 다음 식을 이용하여 UV 분광법에 의해 결정하였다:
[AK11] = A384/11,380 cm-1 M-1
[스트렙타비딘]=(A280-(A384/(A384/A280 AK1)))/176,000 cm-1 M-1
제2 식을 사용하여 280 nm에서 AK1의 흡광도에 대해 교정하였다. 이들 조건 하에, 스트렙타비딘 당 4.3 AK1의 AK11:스트렙타비딘 몰비를 달성하였고, 수율은 94%이었다.
AK11 - 표지된 항- cTnI 모노클로날 항체의 제조
AK-1 표지된 항체를 실시예 2에 설명된 바와 같이 제조하되, 단, IgG에 대해 15배 몰 과량의 AK-1을 사용하여 직접 표지된 IgG를 제조하였다.
B. 비오티닐화 항- cTnI 모노클로날 항체의 제조
10배 몰 과량의 NHS-LC-비오틴 (써모 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드)을 항-cTnI 모노클로날 항체에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 비오티닐화 항체를 PBS (pH 7.2) 내에서 투석에 의해 정제하였다. 비오틴:항체 몰비는 시판 비오틴 정량 키트 (써모 사이언티픽)를 사용하여 결정할 때 4.9이었다.
C. 자가-조립된 중합체 스캐폴드의 제조
2 몰 당량의 비오티닐화 cTnI 항체를 1 몰 당량의 AK11-표지된 스트렙타비딘에 첨가함으로써 자가-조립된 중합체를 제조하였다. 혼합물을 주위 온도에서 암소에서 90분 동안 인큐베이팅하여 복합체를 형성시켰다. 반응 혼합물은 실시예 3에 설명된 바와 같이 수퍼덱스® 200 컬럼 상에서 정제하였다. 고분자량 (800 kDa ->1.5 MDa) 접합체에 상응하는 HPLC 분획을 모으고 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
D. cTnI 에 대한 면역검정
cTnI에 대한 면역검정을 다음과 같이 수행하였다. 각각 25 ㎕의 자가-조립된 중합체 스캐폴드, 또는 대조군으로서 직접 표지된 항체, HRP 접합체, 600 μM 아스코르브산 및 샘플을 반응 용기 내에서 혼합하고, 15분 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 반응 용기 내로 100 ㎕의 트리거 용액 A의 주입에 의해 화학발광 반응을 개시하였다. 반응 용기 내로 트리거 용액의 주입과 동시에, 275 밀리초의 과정에 걸쳐 광자-계수 광전증배관 (PMT)을 포함하는 휘도계에 의해 화학발광 신호를 검출하고, 데이타를 컴퓨터에 저장하였다.
표 17에 지시된 cTnI 농도에 도달하도록 공지량의 천연 cTnI을 정상 인간 혈청에 첨가함으로써 공지의 농도의 cTnI 샘플을 제조하였다. 각각의 샘플을 상기 (및 PSA의 면역검정에 대해 실시예 4에) 기재된 방법에 따라 삼중으로 분석하였다. 주어진 시간 간격에 걸쳐 각각의 분석된 샘플에 대해 수집한 RLU 데이타를 각각의 개별적인 실행에 대해 합하고, 각각의 샘플에 대해 삼중물에 걸쳐 평균하였다. 신호 대 노이즈의 비를 각각의 공지의 농도에서 샘플에 대해 결정하였다.
Figure 112011074714212-pct00030
표 17의 데이타는 두 검정 포맷에 대해 0 내지 190 ng/ml의 분석물 TnI 농도의 면역검정에 대한 성공적인 용량 반응을 설명하였다. 실시예 6의 결과는 또한 아크리단으로 직접-표지된 항체에 비해 자가-조립된 스트렙타비딘/비오틴-IgG (항체) 중합체를 사용하는 분석에 대해 신호 강도의 증가 (평균 RLU에 의해 제시됨) 및 신호 대 노이즈 (S/S0)의 개선을 보여주었다.
실시예 7: 화학발광 표지, KLH , 및 스트렙타비딘 -비오틴- 커플링된 항체를 포함하는 화학발광- 표지된 SBP 의 제조
본 실시예는 큰 중합체 스캐폴드의 제조에서 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)의 사용을 입증한다. 말레이미드-활성화된 KLH를 항체와 접합시키고, AK1로 표지하여 스캐폴드를 형성하였다. 본 실시예는 또한 분석물에 대한 면역검정에서 그러한 스캐폴드의 사용을 입증한다.
A. cTnI 모노클로날 항체의 티올화
50 mM N-아세틸 호모시스테인 락톤 (AHTL) (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스)을 pH 9.0에서 항체에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 반응시킴으로써 모노클로날 항-cTnI를 티올화하였다. 티올화 항체는 실시예 2에 설명된 바와 같이 PD-10 탈염 컬럼을 이용하여 정제하였다.
B. KLH 스캐폴드의 제조 및 표지
3.4 mg의 티올화 항-cTnI를 10 mg의 말레이미드-활성화된 KLH (생성물 # 77605, 써모 사이언티픽)에 첨가하고, 생성되는 용액을 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 항체-KLH 접합체를 표지하기 위해, 0.7 mL DMSO 내에 용해시킨 0.9 mg의 AK1-NHS 에스테르를 용액에 첨가하고 15분 동안 반응시켰다. 이어서, 접합체를 30 kDa MWCO Ultracell 원심분리 농축기 (밀리포어 (Millipore, 미국 매사추세츠주 빌레리카))를 사용하여 버퍼 교환 (20 mM 인산염, 1 mM EDTA)에 의해 정제하였다.
C. 큰 단백질 KLH 스캐폴드를 사용한 면역검정
큰 단백질 KLH 스캐폴드를 사용하는 cTnI에 대한 면역검정을 실시예 6에 설명된 바와 같이 수행하였다. 공지의 cTnI 농도의 샘플을 실시예 6에 설명된 바와 같이 제조하였다. 간단히 설명하면, 동일한 부피 (25 ㎕)의 10 ㎍/mL (IgG 농도로 표준화됨)의 KLH 스캐폴드, 1 ㎍/mL HRP 접합체, 물 중 600 mM 아스코르브산 및 샘플을 반응 용기 내에서 함께 혼합하였다. 혼합물을 100 ㎕의 트리거 용액 A (즉, 트리거 용액)과 함께 인큐베이팅하여 화학발광 반응을 개시하였다. 화학발광 반응의 개시 후에, 샘플을 신속 판독 운동학 방식으로 스펙트라맥스® L 마이크로플레이트 휘도계 상에서 판독하고, 약 0.12 내지 0.21초의 시간에 걸쳐 화학발광 신호를 기록하였다. 면역검정의 결과를 표 18에 제시한다.
Figure 112011074714212-pct00031
실시예 8: 화학발광 표지, 스트렙타비딘 미세입자 및 비오티닐화 항체를 포함하는 화학발광- 표지된 SBP 의 제조
본 실시예는 탈용매에 의해 AK1-표지된 스트렙타비딘으로부터 단백질 미세입자의 제조를 설명한다. 비오티닐화 항체로 커플링한 후, 스트렙타비딘 입자를 면역검정을 위한 스캐폴드로서 사용할 수 있다.
A. 단백질 미세입자의 제조
AK1-표지된 스트렙타비딘을 실시예 6에 설명된 바와 같이 제조하였다. 9.8 mg (2 mL)의 AK1-표지된 스트렙타비딘을 4 mL 유리 반응 바이알에 첨가하고, 테플론 (Teflon) 교반 막대를 사용하여 350 rpm의 일정 속도로 교반하였다. 이어서, 2.8 mL의 무수 에탄올 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스)을 2 mL/분의 속도로 용액이 혼탁해질 때까지 적가하였다. 이어서, 12 ㎕의 5% 글루타르알데히드 용액 (시그마-알드리치; 증류수 중에 1:10로 희석시킴)을 반응물에 첨가하고, 추가로 60분 동안 혼합하여 탈용매에 의해 형성된 입자의 스트렙타비딘 서브유닛을 가교결합시켰다. 글루타르알데히드의 몰량은 9.8 mg의 스트렙타비딘 내에 존재하는 라이신 잔기의 수와 동일하였다. 이어서, 12 ㎕의 수성 0.832 M 에탄올아민 용액 (시그마-알드리치)을 첨가하여 반응을 켄칭시킨 후, 2.8 ㎕의 20% 수성 Tween®-20 용액을 첨가하여 입자를 안정화하였다.
입자를 Slide-A-Lyzer 투석 카세트 (써모 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드)에 넣고, 4℃에서 0.01% Tween-20을 함유하는 PBS (pH 7.4)에 대해 투석하였다. 투석 버퍼 (1 L)를 24시간 기간에 걸쳐 2회 교환하여 반응 부산물을 제거하였다. 이어서, 시판 비신코니닉산 (bicinchoninic acid; BCA) 단백질 검정 키트 (생성물 # 23227, 써모 사이언티픽)을 사용하여 입자 용액의 스트렙타비딘 농도를 측정하였다. SA-21 스트렙타비딘 (E280=3.2cm-1mg/mL-1)을 사용하여 공지의 농도에서 표준물을 제조하고, 입자의 단백질 농도를 표준 또는 교정 곡선으로부터 계산하였다.
정제된 입자를 델사™나노 제타 포텐셜 앤드 서브미크론 (Delsa™Nano Zeta Potential and Submicron) 입자 크기 분석기 (베크만 쿨터)를 사용하는 광자 상관 분광법에 의해 분석하고, 평균 직경이 약 4 마이크로미터인 것으로 밝혀졌다. 본원에 기재된 조건 (입자를 탈용매시키기 위해 사용된 용매의 부피, 반응 pH 등)을 변화시킴으로써, 요구되는 입자 크기 (~200 nm 내지 4 ㎛)를 달성할 수 있다.
B. 스트렙타비딘 입자를 사용하는 cTnI 에 대한 검정
AK1-표지된 스트렙타비딘 입자를 입자 1 mg 당 0.23 mg IgG의 비에서 pH 7.4에서 PBS 내에서 비오티닐화 항-cTnI 항체로 코팅하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 부드럽게 진탕하면서 인큐베이팅하여, 비오티닐화 IgG와 스트렙타비딘 입자를 복합체화시켰다. 이어서, 입자를 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 임의의 결합되지 않은 IgG를 함유하는 상등액을 제거하였다. 입자 펠렛을 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS (pH 7.4) 내에 100 ㎍/mL 스트렙타비딘의 최종 농도로 재현탁시켰다.
0.15 ㎍/mL의 농도에서 항-cTnI 항체로 코팅한 50 ㎍/mL의 스트렙타비딘 입자, 양고추냉이 퍼옥시다제 접합체, 375 μM 아스코르브산 및 1 mg/mL IgG (BCI item 270904)를 함유하는 혼합물을 분석 희석제 내에 제조하였다. 70 ㎕의 HRP 접합체/입자 혼합물 및 30 ㎕의 각각의 샘플을 반응 용기에 첨가함으로써 검정을 수행하였다. 공지량의 천연 cTnI (시팩 (Scipac; 영국 시팅본))을 정상 인간 혈청에 섞음으로써 공지의 cTnI 농도의 샘플을 제조하고, 샘플 농도는 AccuTnI 검정 (베크만 쿨터)으로부터 생성된 용량 값으로부터 부여되었다. 실온에서 15분 인큐베이션 후에, 샘플을 신속 운동학 판독 방식으로 스펙트라맥스® L 마이크로플레이트 휘도계 (엠디에스 어낼리티컬 테크놀로지스 (MDS Analytical Technologies)) 상에서 판독하였다. 화학발광 반응을 개시하기 위해, 동일한 부피의 트리거 용액 A를 350 ㎕/sec의 속도로 주입하면서, 화학발광 신호를 모니터링하였다. SoftMax Pro 소프트웨어를 이용하여 데이타를 분석하였다. 값을 화학발광의 개시 후 30 ms에 시작하여 20개의 데이타 점의 합으로서 보고하고 (10 ms 통합 시간), 표 19에 제시한다.
Figure 112011074714212-pct00032
실시예 9: 덱스트란 스캐폴드 및 SSIA 를 포함하는 화학발광- 표지된 SBP 를 사용하는 PSA의 분석을 위한 검정 성분 농도의 변동
다음 실시예는 화학발광 화합물 및 항체로 직접 표지된 가용성 덱스트란 스캐폴드를 포함하는 화학발광-표지된 sbp를 이용하는 분석물의 면역검정을 입증한다.
본 실시예에서, PSA에 대한 모노클로날 항체의 특이적 결합쌍의 하나의 멤버는 아래 실시예 10에 설명된 바와 같이 AK1과 커플링된 덱스트란 분자에 접합되지만, 단, 항체는 티올화되고, AK11-표지된 및 말레이미드-활성화된 덱스트란에 공유 연결된다. 항-PSA-덱스트란 접합체는 아래의 표에 지시된 바와 같이 수용액 내에 10 ㎍/ml, 2.5 ㎍/ml 또는 0.5 ㎍/ml로 제공된다. 제2 모노클로날 PSA 항체를 상기 기재된 바와 같이 HRP에 접합시키고, 아래의 표에 지시된 바와 같이 수용액 내에 0.5 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 또는 0.03 ㎍/ml로 제공하였다.
25 ㎕의 샘플을 각각의 2개의 반응 용기에 넣음으로써 검정을 수행하였다. 제1 반응 용기 내의 샘플에, 25 ㎕의 Ab1 용액, 25 ㎕의 물, 25 ㎕의 Ab2 용액을 첨가하고 15분 동안 인큐베이팅하였다. 제2 반응 용기에서, 25 ㎕의 Ab1 용액, 200 또는 500 μM의 농도 (아래의 표에 지시된 바와 같이)의 탈이온수 중 아스코르브산 (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스), 및 25 ㎕의 Ab2 용액을 25 ㎕의 샘플에 첨가하고 15분 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 100 ㎕의 트리거 용액 A의 주입에 의해 각각의 반응 용기 내의 화학발광 반응을 개시하였다. 반응 용기 내로 트리거 용액의 주입과 동시에, 광자-계수 광전증배관 (PMT)을 포함하는 휘도계에 의해 3.85초의 과정에 걸쳐 화학발광 신호를 검출하고, 데이타를 컴퓨터에 저장하였다.
각각의 샘플을 상기 검정 방법에 따라 삼중으로 분석하였다. 반응 용기 내로 트리거 용액 도입의 출발로부터 82.5 밀리초에 시작하여 495 밀리초의 시간 간격 동안 각각의 분석된 샘플에 대해 수집한 RLU 데이타를 각각의 개별적인 실행에 대해 합하고, 각각의 샘플에 대해 삼중물에 걸쳐 평균하고, 표 20에 제시하였다. 신호 대 노이즈의 비 (S/S0)를 각각의 농도 값에서 계산하였다. 표 20의 데이타는 미지의 PSA 농도의 샘플의 분석을 위한 교정 곡선을 생성하기 위해 사용할 수 있다.
공지의 농도의 샘플을 앞서 설명된 바와 같이 제조하였다. 각각의 샘플을 상기 방법에 따라 삼중으로 분석하였다.
Figure 112011074714212-pct00033
이들 다음 입증 검정에서는 선행 실시예와 유사한 반응물을 이용한다. PSA에 대한 특이적 결합쌍의 하나의 멤버는 AK1과 커플링된 덱스트란 분자에 접합되고, 아래의 표에 지시된 바와 같이 수용액 내에 10 ㎍/ml, 2.5 ㎍/ml 또는 0.5 ㎍/ml로 제공된다. 제2 모노클로날 PSA 항체는 상기 기재된 바와 같이 HRP에 접합되고, 아래의 표에 지시된 바와 같이 수용액 내에 0.5 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 또는 0.03 ㎍/ml로 제공하였다.
각각의 샘플을 다음 방법에 따라 삼중으로 분석하였다.
25 ㎕의 샘플을 반응 용기에 넣은 후, 25 ㎕의 Ab1 용액, 아래의 표에 지시된 바와 같이 200 또는 500 μM의 농도에서 물 중 아스코르브산, 및 25 ㎕의 Ab2 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 생성함으로써 검정을 수행하였다. 혼합은 단지 각각의 반응물질의 전달에 이어 15분 인큐베이션에 의한 것이었다. 인큐베이션 후에, 100 ㎕의 트리거 용액 A의 주입에 의해 각각의 반응 용기에서 화학발광 반응을 개시하고, 반응에 의해 생성된 광을 광자-계수 휘도계에 의해 3.85초 동안 검출하고, RLU 데이타를 컴퓨터에 저장하였다.
반응 용기 내로 트리거 용액 도입의 출발로부터 125 밀리초에 시작하여 495 밀리초의 시간 간격 동안 각각의 분석된 샘플에 대해 수집한 RLU 데이타를 각각의 개별적인 실행에 대해 합하고, 각각의 샘플에 대해 3개의 복제물에 걸쳐 평균하고, 표 21-23에 제시하였다. 신호 대 노이즈의 비 (S/S0) 및 %CV를 각각의 농도 값에서 계산하였다. 표의 데이타는 물질 및 본 실시예의 지도를 이용하여 PSA 농도의 결정을 위한 샘플의 분석을 위한 교정 곡선을 생성하기 위해 사용할 수 있다.
실시예 9의 결과는 성공적인 면역검정이 변하는 화학발광-표지된 sbp, 활성화제-표지된 sbp, 및 SSIA 농도 및 상이한 비의 이들 반응물임을 입증하였다. 실시예 9의 방법은 표준 방법에 따른 PSA 농도의 결정을 위한 교정 곡선의 생성을 포함하는, 미지의 샘플 내에서 분석물 농도의 결정에서 사용하기에 위해 적합하다.
Figure 112011074714212-pct00034
Figure 112011074714212-pct00035
Figure 112011074714212-pct00036
실시예 10: 화학발광 표지, 덱스트란 - 스트렙타비딘 스캐폴드 , 및 비오틴- 커플링된 항체를 포함하는 화학발광- 표지된 SBP 의 제조, 및 다양한 SSIA 를 사용한 TnI , CKMB 또는 미오글로빈에 대한 분석에서의 용도.
A. 화학발광 화합물 및 아민 및 술프히드릴 반응성 헤테로2관능성 가교결합제 를 사용한 아미노-변형된 덱스트란의 표지:
5.2 mg의 NHS-(PEO)8-말레이미드 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬) 및 22.1 mg AK1, 아크리단 케텐디티오아세탈-NHS 에스테르, 암모늄염을 DMSO 내에 30 mg/mL로 용해시키고, 조합하고, 폴리프로필렌 반응 용기 내에서 PBS (pH 7.2) 내에 14 mg/mL로 용해된 35 mg의 70 kDa 폴리아미노덱스트란 (헬릭스 리서치 (Helix Research), 생성물 # 1209; 70 몰 NH2/몰 덱스트란)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 45분 동안 주위 온도에서 차광하여 인큐베이팅하였다. 폴리아미노덱스트란 상의 반응하지 않은 아미노기는 접합체를 10 ㎕의 MS(PEG)8 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬)와 함께 추가로 10분 동안 주위 온도에서 암소에서 인큐베이팅함으로써 차단하였다. 활성화된 덱스트란을 마이크로원심분리 (14K x g, 1 min)에 의해 청정화하고, 제조자의 지시에 따라 1 mM EDTA를 함유하는 PBS (pH 7.2) 내에 평형화시킨 세파덱스 G-25 컬럼 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 정제하였다.
B. 스트렙타비딘의 티올화 :
50배 몰 과량 (5.63 mg)의 2-이미노티올란 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬)을 45 mg (10 mg/mL)의 스트렙타비딘-플러스® (프로자임, 미국 캘리포니아주 헤이워드)에 첨가하였다. PBS (pH 7.4) (1 mL)를 혼합물에 첨가하여 반응물의 pH를 7.0으로 증가시켰다. 혼합물을 주위 온도에서 45분 동안 암소에서 인큐베이팅하였다. 티올화 스트렙타비딘을 제조자의 지시에 따라 1 mM EDTA를 함유하는 PBS (pH 7.2) 내에 평형화시킨 세파덱스® G-25 컬럼 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 정제하였다.
C. 티올화 스트렙타비딘의 AK - 유도체화된 및 말레이미드 -활성화된 덱스트란에 대한 접합.
이어서, 활성화된 덱스트란 (A) 및 티올화 스트렙타비딘 (B)을 조합하고 주위 온도에서 차광하여 철야 반응시켰다. 반응하지 않은 말레이미드 및 티올기를 후속적으로 2-단계 공정으로 차단하였다. 제1 단계에서, 과잉 (0.025X 반응 부피)의 50 mg/mL L-시스테인-HCl (PBS (pH 7.4) 중에 용해된)을 접합체에 첨가하고, 15분 동안 인큐베이팅하였다. 제2 단계에서, 과잉 (0.04X 반응 부피)의 50 mg/mL 요오도아세트아미드 (PBS (pH 7.4) 중에 용해된)를 반응 혼합물에 50 mM 보레이트 (pH 8.5) (0.08X 반응 부피)와 함께 첨가하고, 추가로 15분 동안 주위 온도에서 차광하여 인큐베이팅하였다.
D. 스트렙타비딘 ~ 덱스트란 ~ AK1 접합체의 정제
접합체를 마이크로원심분리 (14 K x g, 2 min)에 의해 청정화하고, 길슨 (Gilson) FC 203B 분획 수집기에 커플링된 바이너리 구배 (Binary Gradient) 125 펌프 및 다이오드 (Diode) 어레이 168 검출기를 갖는 시스템 골드 (System Gold)® HPLC 시스템 (베크만 쿨터, 인크., 미국 캘리포니아주 브레아) 상에서 PBS (pH 7.4) 내에 평형화시킨 수퍼덱스® 200 컬럼 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 정제하였다. 프로그래밍된 유속은 1 mL/min이었다 (샘플 주입 루프 부피 - 1 mL; 분획화 - 1 mL/분획). 접합 후에 용출하는 소량의 반응하지 않은 스트렙타비딘을 배제하기 위해 접합체 분획을 조심스럽게 모았다. 모은 접합체 내의 스트렙타비딘의 농도를 표준물로서 소정의 농도의 스트렙타비딘 플러스®을 사용하는 BCA 단백질 검정 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬)으로 결정하였다. AK1의 농도를 분광광도법에 의해 결정하였다 (E384=13.6 mg-1mL-1). 접합체 풀 (pool)의 계산된 스트렙타비딘 농도 및 AK:스트렙타비딘 몰비는 각각 1.47 mg/mL 및 18:1이었다.
E. xPSA 모노클로날 항체의 비오티닐화.
DMSO 내에 2 mg/mL로 용해된 6배 몰 과량의 NHS-(PEO)4-비오틴 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬)을 6 mg의 MxPSA 항체 (PBS (pH 7.4) 중의 7.6 mg/mL)에 첨가함으로써 비오티닐화 PSA 항체를 제조하였다. 주위 온도에서 60 min 인큐베이션 후에, 비오티닐화 항체를 제조자의 지시에 따라 PBS (pH 7.4) 내에 평형화시킨 세파덱스 G-25 컬럼 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 정제하였다.
F. 비오티닐화 항체의 스트렙타비딘 ~ 덱스트란 ~ AK 접합체에 대한 커플링
커플링은 스트렙타비딘~덱스트란~AK 접합체 (1.47 ㎍/mL)를 희석제 (100 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.2% Tween®-20, 0.1 mM EDTA, 1% BSA) 내의 비오티닐화 항-PSA 모노클로날 (2 ㎍/mL)과 함께 30분 동안 인큐베이팅함으로써 수행하였다. 이것은 2:1 몰비의 스트렙타비딘:비오티닐화 항체에 상응한다.
G. 덱스트란 스캐폴드 화학발광- 표지된 sbp 및 SSIA 를 사용하는 TnI , CKMB 또는 미오글로빈에 대한 검정
본 실시예는 트로포닌 I, CKMB 또는 미오글로빈과 같은 분석물을 검출하기 위한 검정 방법을 입증한다. 각각의 분석에 대해, 사용된 특이적 결합쌍은 모노클로날 항체의 쌍이고, 여기서 각각의 항체는 명시된 분석물 상의 상이한 항원 부위에 특이적이다. 각각의 분석에 대해, 제1 항체는 비오티닐화되고, 실시예 5에 상기 기재된 것과 유사한 방법으로 제조된 덱스트란-AK1-스트렙타비딘 스캐폴드 ("Ab 스캐폴드")에 접합시키고 수용액 내에 0.5 ㎍/ml 또는 2 ㎍/ml로 제공한다. 각각의 분석에 대한 제2 항체는 상기 기재된 바와 같이 HRP와 접합되고 ("HRP 접합체"), 수용액 내에 0.25 ㎍/ml 또는 1 ㎍/ml로 제공된다 (100 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.0), 0.2% Tween20, 0.1 mM EDTA, 1% BSA).
Ab 스캐폴드 25 ㎕, 물 중 600 μM 아스코르브산 25 ㎕, 샘플 25 ㎕ 및 HRP 접합체 25 ㎕을 반응 용기에 첨가함으로써 각각의 검정을 수행하였다. 반응 혼합물을 15 min 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 반응 용기를 휘도계에 의한 검출을 위해 배치한 후, 100 ㎕의 트리거 용액 A를 첨가하고 수 초의 시간에 걸쳐 광 강도를 기록하였다. 대략 피크 신호 상에 중심이 있는 302.5 밀리초의 경과 시간에 상응하는 휘도계에 의해 수집된 데이타를 합하고, 샘플당 3회 실행에 걸쳐 평균하고, 표 24-26에 제시하였다. 신호 대 노이즈를 각각의 샘플에 대해 계산하였다.
본 실시예의 결과는 다른 분석물에 대한 본 발명의 분석의 적용을 입증한다. 또한, 본 실시예는 화학발광-표지된 sbp, 활성화제-표지된 sbp 및 SSIA에 대한 상이한 농도 및 비의 반응물을 이용하는 분석을 성공적으로 입증한다. 실시예 7의 방법은 표준 방법에 따른 TnI, CKMB 또는 미오글로빈 농도의 결정을 위한 교정 곡선의 생성을 포함하는, 미지의 샘플 내에서 분석물 농도의 결정에 사용하기 위해 적합하다.
Figure 112011074714212-pct00037
Figure 112011074714212-pct00038
Figure 112011074714212-pct00039
분석은 상기 설명된 바와 같이 변형된 DxI® (베크만 쿨터) 자동화된 면역검정 기구를 사용하여 수행하였다.
H. TnI 분석에서 다양한 SSIA 를 이용하는 검정
5개의 상이한 SSIA의 다수 농도 수준을 본 발명의 개시내용에 따른 TnI 검정 시스템의 문맥에서 입증하였다. 아스코르브산, 트롤록스, 페녹사진, 3-아미노티로신 및 2-아미노페놀 (모두 시그마-알드리치로부터 이용가능함)의 농축된 원액 용액을 탈이온수 중에 100 mM로 제조하였다.
반응 튜브 내에, pH 8.0에서 완충 수용액 (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.2% Tween-20 및 1% BSA) 중의 0.5 ㎍/mL의 TnI M6 항체-HRP 접합체 400 ㎕, 또한 pH 8.0에서 완충 수용액 중의 2 ㎍/mL Ab의 AK1~Dex70/31~스트렙타비딘 (분획 1) 2:1 SA/Ab 400 ㎕, 및 공지의 농도에서 TnI 분석물을 함유하는 교정기 표준 용액 400 ㎕. 1개의 튜브를 각각의 교정기 농도에 대해 제조하였다. Ab-HRP 접합체, 스캐폴드 및 표준물의 예비혼합된 용액 75 ㎕을 옥타펫 (octapet)에 의해 Corning/Sostar 96-웰 폴리프로필렌 미세적정 플레이트 (백색, 코닝 (Corning) Cat. #3355)의 각각의 웰로 전달하고, 38-49분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 2 mM, 1 mM 또는 0.5 mM의 농축 용액으로서 각각의 항산화제 25 ㎕을 리피터 (repeater) 피펫을 사용하여 플레이트 웰 내로 피펫팅하였다. 플레이트를 10초 동안 회전시켜 혼합하고, 5 내지 33분 동안 인큐베이팅하였다. 검출은 스펙트라맥스 L 주입 플레이트 휘도계를 사용하여 수행하였다. 기준선 판독치를 취한 후, 100 ㎕의 트리거 용액 A를 각각의 웰로 주입하고, 화학발광 신호를 판독하였다.
Figure 112011074714212-pct00040
결론: 상기 대표적인 TnI 용액상 검정 포맷에서 시험된 모든 SSIA는 신호 대 노이즈를 개선하는데 효과적으로 거동한다.
실시예 11: 화학발광 표지, PAA 스캐폴드 , 및 스트렙타비딘 -비오틴- 커플링된 항체를 포함하는 화학발광- 표지된 SBP 의 제조
본 실시예는 스트렙타비딘에 커플링되고 비오티닐화 항체에 접합된 폴리(아크릴산) 백본을 갖는 스캐폴드의 형성을 설명한다. 본 실시예는 또한 PAA 스캐폴드를 사용하는 분석물에 대한 면역검정을 설명한다.
A. 화학발광 화합물 및 비오틴을 사용한 폴리아크릴산 ( PAA )의 표지:
2 mg의 폴리아크릴산 (PAA) 나트륨염 (폴리사이언시즈 (Polysciences, 미국 펜실배니아주 워링턴))을 100 mM MES (pH 6.0) 0.4 mL 내에 용해시켰다. 50 몰 당량 (20 mg)의 EDC (써모 사이언티픽) 및 6 mg의 N-히드록시술포숙신이미드 (써모 사이언티픽)을 탈이온수에 용해시키고 PAA 용액에 첨가하면서, 카르복실레이트기를 활성화시키기 위해 혼합하였다. 20분의 활성화 후에, 무수 DMSO 내에 제조된 50 몰 당량 (0.843 mg)의 비오틴- PEG4-히드라지드 (써모 사이언티픽), 및 50 몰 당량 (1.01 mg)의 AK1-히드라지드를 PAA 용액에 첨가하고 혼합하면서 실온에서 철야 반응시켰다. 표지된 PAA를 10 kDa MWCO 원심분리 농축기 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카)를 사용하여 PBS (pH 7.2) 내에서 버퍼 교환에 의해 정제하고, 5회 교환 후에 PBS 중에 원래의 부피로 회복하였다. 비오틴- 및 AK1-표지된 PAA를 PAA-B로 지정하였다.
B. 스트렙타비딘을 사용한 표지된 PAA 의 커플링
비오틴- 및 AK1-표지된 PAA (PAA-B)의 0.75 mg/mL 용액을 PBS (pH 7.4) 내에 제조하였다. 100 ㎕의 PAA-B를 2:1 몰비의 스트렙타비딘 대 PAA에 상응하는, 스트렙타비딘 (프로자임, 미국 캘리포니아주 헤이워드) 10 mg/mL 용액 13.75 ㎕과 혼합하고, 혼합물을 4℃에서 철야 인큐베이팅하였다.
C. 최종 스캐폴드를 형성하기 위해 스트렙타비딘 - PAA 접합체에 대한 비오티닐 화 항체의 커플링
항체를 선행 실시예에 입증된 바와 같이 비오티닐화하였다. PAA 스캐폴드는 스트렙타비딘-PAA-B 접합체를 비오티닐화 항-cTnI와 함께 4℃에서 철야 인큐베이팅함으로써 스트렙타비딘-PAA-B 접합체를 항체에 커플링하여 형성하였다. 스트렙타비딘:항체의 몰비는 1:1 내지 1:4로 변하였다.
D. PAA 스캐폴드를 사용하는 TnI 에 대한 면역검정
PAA 스캐폴드는 실시예 6에 설명된 바와 같이 cTnI와 같은 분석물을 검출하기 위한 검정 방법에서 유용하다. TnI에 대한 제1 항체를 상기 기재된 바와 같이 제조된 PAA-AK1-스트렙타비딘 스캐폴드에 접합시키고 수용액 내에 2 ㎍/mL로 제공한다. 이어서, 실시예 2에 설명된 바와 같이 제2 항체를 HRP에 접합시키고, 수용액 내에 0.5 ㎍/mL로 제공하였다.
면역검정을 실시예 17에 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 동일한 부피의 PAA 스캐폴드, HRP 접합체, 물 중 600 μM 아스코르브산 및 분석물 샘플을 96-웰 미세적정 플레이트 내에서 함께 혼합하였다.
실시예 6에 설명된 바와 같이 공지량의 천연 심장 트로포닌 I (시팩; 영국 시팅본)을 정상 인간 혈청에 첨가함으로써 cTnI 샘플을 제조하였다. 간단히 설명하면, 공지의 농도의 TnI를 정상 인간 혈청 내로 섞고, 상기 기재된 분석에 따라 분석하였다. 데이타를 사용하여 미지의 농도에서 TnI의 분석을 위한 교정 곡선을 생성하였다.
Figure 112011074714212-pct00041
b: 출력 (SA:PAA의 몰비)는 표준물로서 스트렙타비딘을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 분석으로부터 계산하였다.
실시예 12: 화학발광- 표지된 SBP , PAA 스캐폴드 , 및 티올화 항체의 제조
본 실시예는 EDC 화학을 이용하여 AK1 및 말레이미드로 표지되고 티올-말레이미드 반응을 통해 모노클로날 항-TnI (284) 항체에 접합된 PAA 스캐폴드의 제조를 설명한다. 본 실시예는 또한 PAA 스캐폴드를 사용하는 분석물에 대한 면역검정을 입증한다.
A. 화학발광 화합물 및 헤테로2관능성 가교결합제를 사용한 PAA 의 표지
AK1- 및 말레이미드-표지된 PAA (분자량 약 225,000)를 실시예 11에 설명된 바와 같이 제조하되, 무수 DMSO 내에 제조된 20 몰 당량의 (N-[k-말레이미도운데카논산]히드라지드) (써모 사이언티픽) 및 20 몰 당량의 AK2를 PAA 용액에 첨가하고, 혼합하면서 실온에서 1시간 반응시켰다. 표지된 PAA를 10 kDa MWCO Slide-A-Lyzer® 투석 카세트 (써모 사이언티픽)을 사용하여 PBS (pH 7.2)에 대해 투석에 의해 정제하였다. PAA의 최종 농도는 1.4 mg/ml이고, 투석 동안 중합체의 손실이 없는 것으로 가정하였다.
B. 모노클로날 항- TnI (284) 항체의 티올화
모노클로날 항-TnI (284) 항체를 사용 전에 100 mM MES (pH 6.0) 버퍼에 대해 투석하였다. 트라우트 (Traut) 시약 (2-이미노티올란·HCl) (써모 사이언티픽)을 탈이온수에 2 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 3.2 mg/mL의 농도의 항체 6.4 mg을 2.36 ㎕의 2-이미노티올란 (항체 1 당량 당 10 몰 당량)과 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 티올화된 항체를 1 mM EDTA를 함유하는, PBS (pH 7.2)로 평형화시킨 PD-10 탈염 컬럼 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 이용하여 정제하였다.
C. 티올화 항체의 AK1 - 및 말레이미드 - 표지된 PAA 에 대한 커플링
1.4 mg/ml의 농도의 AK1- 및 말레이미드-표지된 PAA 용액 105 ㎕을 PAA 1 당량 당 6 당량의 항체에 상응하는 3.8 mg/mL의 농도의 티올화 모노클로날 항-TnI (284) 항체 0.6 mg와 즉시 혼합하였다. 반응을 4℃에서 수행하고, 반응 생성물을 크기 배제 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 피크의 개별적인 HPLC 분획 (표 29에서 Fr3, Fr4 및 Fr5로 지정함)을 면역검정으로 평가하였다.
D. PAA 스캐폴드를 사용한 모노클로날 항- TnI 항체에 대한 면역검정
AK1- 및 말레이미드-표지된 PAA 스캐폴드를 사용하는 모노클로날 항-TnI에 대한 면역검정을 실시예 20에 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 동일한 부피의 AK1- 및 말레이미드-표지된 PAA 스캐폴드, HRP 접합체, 물 중 600 μM 아스코르브산 및 샘플을 반응 용기 내에서 30분 동안 함께 혼합하였다. 혼합물을 100 ㎕의 트리거 용액 A, 즉, 트리거 용액과 함께 인큐베이팅하여 화학발광 반응을 개시하였다. 개시 후에, 샘플을 신속 판독 운동학 방식으로 스펙트라맥스® L 마이크로플레이트 휘도계 상에서 판독하고, 약 0.12 내지 0.21초의 시간에 걸쳐 화학발광 신호를 기록하였다. 각각의 샘플에 대해, 트리거 용액 첨가에 의한 개시 전에 5개의 기준선 판독치를 수집하였다. 표 29에 보고된 값은 다수 데이타 점의 합이다.
Figure 112011074714212-pct00042
실시예 13: 화학발광 표지, 자가-조립형 중합체, 및 스트렙타비딘 -비오틴- 커플링된 항체를 포함하는 화학발광- 표지된 SBP 의 제조
다음 실시예에서, AK1-표지된 스트렙타비딘을 비오티닐화 폴리아크릴산 (PAA)과 혼합하고, 자가-조립에 의해 중합체 복합체가 형성되었다. 이들 자가-조립형 중합체는 분석물의 면역검정을 위해 스캐폴드 물질로서 기능을 한다.
A. 비오티닐화 PAA 의 제조
AK1-표지된 스트렙타비딘 및 비오티닐화 모노클로날 cTnI 284 항체를 실시예 6에 설명된 방법에 따라 제조하였다.
200 mg의 225 kDa 폴리(아크릴산) 나트륨염을 70 mL의 100 mM MES (pH 6.0)에 용해시켰다. 카르복실레이트기를 활성화시키기 위해, 2 g의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염 및 0.9 g의 N-히드록시술포숙신이미드를 10 mL의 탈이온수에 용해시키고, 혼합하면서 PAA 용액에 첨가하였다. 20분 활성화 후에, 무수 DMSO 내에 2.25 mg/mL의 농도로 제조된 45 mg의 비오틴-PEG4-히드라지드를 PAA 용액에 첨가하고, 실온에서 철야 혼합하였다. 이어서, 비오티닐화 PAA를 탈이온수에 대해 광범하게 투석시켜 반응 부산물을 제거하였다. 투석 후에, 비오티닐화 중합체를 진공 하에 SpeedVac® 농축기에서 건조시키고 (Thermo/Savant), 건조된 중합체 (110 mg)를 PBS (pH 7.2) 내에 2 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 비오틴:PAA 몰비 (25 비오틴:PAA)는 시판 HABA 검정 키트 (써모 사이언티픽)를 사용하여 결정하였다.
실시예 14: PAA 를 사용한 화학발광 표지, 자가-조립형 중합체를 포함하는 화학발광-표 지된 SBP 의 제조
본 실시예에서, 비오티닐화 폴리아크릴산 (PAA)을 사용하여 실시예 6에 설명된 바와 같이 자가-조립에 의해 형성된 중합체 복합체에 대한 중합체화 반응을 종결하고, 형성 후에 중합체를 안정화하였다. 간단히 설명하면, 비오티닐화 항체를 최적화된 몰비에서 AK1-표지된 스트렙타비딘 (이전에 설명된 바와 같이)과 조립하였다. 이어서, 비오티닐화 폴리아크릴산 (PAA)을 첨가하여 자가-조립된 중합체를 안정화하였다.
A. 자가-조립된 중합체의 제조
2.66 mg/mL의 농도의 비오티닐화 IgG를 실시예 7에 설명된 바와 같이 제조된 0.584 mg/mL의 농도의 AK1-표지된 스트렙타비딘과 혼합하였다. 0.25 내지 1.25의 다양한 비의 비오티닐화 IgG:AK1-표지된 스트렙타비딘 및 혼합물을 4℃에서 철야 인큐베이팅하여 자가-조립시켰다.
B. 하이브리드 구성체의 제조
자가-조립된 구성체를 동일한 부피로 나누고, 비오티닐화 PAA를 0 내지 1의 PAA:스트렙타비딘의 다양한 몰비에서 첨가하였다. 반응을 4℃에서 수행하고, 철야 인큐베이팅하여 안정한 하이브리드 PAA 구성체를 형성하였다.
C. PAA 하이브리드 스캐폴드를 사용한 면역검정
PAA 하이브리드 스캐폴드를 사용하는 모노클로날 항-TnI에 대한 면역검정을 실시예 11에 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 동일한 부피의 PAA 스캐폴드, HRP 접합체, 물 중 600 mM 아스코르브산 및 샘플을 반응 용기 내에서 함께 혼합하였다. 혼합물을 트리거 용액 A, 즉, 트리거 용액과 함께 인큐베이팅하여 화학발광 반응을 개시하였다. 화학발광 반응의 개시 후에, 샘플을 신속 판독 운동학 방식으로 스펙트라맥스® L 마이크로플레이트 휘도계 상에서 판독하고, 약 0.12 내지 0.21초의 시간에 걸쳐 화학발광 신호를 기록하였다. 면역검정의 결과를 표 30A-30E에 제시한다.
<표 30A>
Figure 112011074714212-pct00043
<표 30B>
Figure 112011074714212-pct00044
<표 30C>
Figure 112011074714212-pct00045
<표 30D>
Figure 112011074714212-pct00046
<표 30E>
Figure 112011074714212-pct00047
실시예 15: 화학발광 표지, 중합체 HRP 접합체 및 스트렙타비딘 -비오틴- 커플링된 항체를 포함하는 화학발광- 표지된 SBP 의 제조
본 실시예는 IgG 및 효소 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)의 중합체성 접합체의 제조 및 용액상 면역검정을 위한 스캐폴드 물질로서 그의 용도를 입증한다.
A. HRP - IgG 접합체의 제조
효소의 과요오드 산화를 위해, HRP를 물 내에 10 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕의 새로 제조된 0.088 M 과요오드산나트륨을 HRP에 4℃에서 교반하면서 첨가하고, 적절한 시간 (즉, 20 내지 40분) 동안 반응시켰다. 에틸렌 글리콜과 같은 디올의 첨가에 의해 산화 반응을 켄칭시키고, 추가로 20분 동안 4℃에서 인큐베이팅하였다. 산화된 효소를 PD10 컬럼 상에서 탈염시키고, 적절한 반응 버퍼, 예를 들어 PBS 내로 용출시켜 과잉의 산화 및 켄칭 반응물로부터 효소를 분리하였다.
산화된 HRP와 IgG의 접합체를 환원 아민화에 의해 제조하였다. IgG를 산화된 HRP와 1:1 부피비 및 1:4-15 IgG 대 HRP의 몰비로 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 철야 반응시켰다. 10 ㎕의 5 M 붕수소화물 (borohydride)을 첨가하고 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 생성물을 과잉의 환원 시약을 제거하기 위해 탈염에 의해 투석 또는 분리하였다. 이어서, 접합체를 SE HPLC 컬럼 상에 적용하고 분자량 450 내지 1500 KDa의 접합체를 수집함으로써 생성물을 분리하였다. HRP:IgG 비를 평가하고, 접합체를 표준 스펙트라맥스® 용액상 SPARCL 면역검정으로 시험하였다.
특이적 분석물, 예를 들어 심장 트로포닌 I (cTnI)에 대한 면역검정을 아래 설명된 바와 같이 접합체 A, B 또는 C를 사용하여 실시예 11에 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 동일한 부피의 IgG (33 ㎍/mL), HRP 접합체 A, B 또는 C (5 mg/mL), 물 중 500 μM 아스코르브산, 및 샘플을 96-웰 미세적정 플레이트에서 함께 혼합하였다. 혼합물을 트리거 용액 A, 즉, 트리거 용액과 함께 인큐베이팅하여 화학발광 반응을 개시하였다. 이들 분석을 위해, cTnI 모노클로날 항체 M06을 1-10 mg/mL의 최종 농도로 100 mM 중탄산염 버퍼 (pH 9.6) 내로 탈염시켰다. 표 31은 중합체 HRP 접합체 A, B 또는 C를 사용하는 cTnI에 대한 면역검정 결과를 보여준다. 이들 접합체를 실질적으로 아래 설명된 바와 같이 제조하였다:
B. 산화된 HRP 에 접합시키기 위한 모노클로날 cTnI 항체의 제조
산화된 HRP와의 접합 전에, cTnI 모노클로날 항체를 PBS (pH 7.2) (접합체 A&B) 또는 탄산나트륨 (pH 9.6) (접합체 C) 내로 버퍼-교환하였다.
C. 접합체 A 및 B: HRP 의 산화
HRP를 물 내에 5 mg/mL로 용해시켰다. 8.74 mg/mL의 농도 (0.088 M)의 새로 제조된 과요오드산나트륨 100 ㎕을 4℃에서 교반하면서 HRP 1 ml에 첨가하였다. 혼합물을 적절한 시간 동안 반응시켰다. 접합체 A에 대해, 반응 시간은 약 20분이고, 접합체 B에 대해 약 40분이었다. 각각의 5 mg의 HRP에 대해, 17 ㎕의 에틸렌 글리콜을 첨가하고, 추가로 20분 동안 4℃에서 인큐베이팅하여 산화 반응을 켄칭시켰다.
1.0 mL의 산화된 효소를 PBS (pH 7.2) 내에 평형화시킨 PD10 컬럼 상에서 탈염시켜 과잉의 산화 및 켄칭 시약을 제거하였다.
D. IgG 와의 접합
접합체 A 및 B에 대해, 2.5 mg의 산화된 HRP를 0.4695 mL (2.5 mg)의 IgG와 반응시켰다. 접합체를 철야 반응시켰다. 10 ㎕의 4 mg/mL 붕수소화칼륨을 새로 제조하고 이 용액 10 ㎕를 반응 혼합물 1 ml에 첨가하였다. 느리게 연속하여 뒤집으면서 실온에서 30분 동안 반응을 진행시켰다. 이어서, 생성물 혼합물을 PBS 내로 탈염에 의해 분리하여, 과잉의 환원 시약을 제거하였다. 탈염 절차 후에 IgG의 농도는 접합체 A 및 B에 대해 4.26 mg/mL이었다. 접합 및 환원 후에, 접합체를 SE HPLC 컬럼 상에 적용하고 분자량 450 내지 1500 KDa의 접합체를 수집함으로써 생성물을 분리하였다. HRP:IgG 비를 앞서 설명된 바와 같이 평가하였다.
E. 접합체 C: HRP 의 산화
HRP를 물 내에 5 mg/mL로 용해시켰다. 8.74 mg/mL (0.088 M)의 농도에서 새로 제조된 과요오드산나트륨 100 ㎕을 4℃에서 교반하면서 HRP 1 ml에 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 반응시켰다. 각각 5 mg의 HRP에 대해 17 ㎕의 에틸렌 글리콜을 첨가하여 산화 반응을 켄칭시키고, 혼합물을 추가로 20분 동안 4℃에서 인큐베이팅하였다.
1.0 mL의 산화된 효소를 PD10 컬럼 상에서 적절한 반응 버퍼, 예를 들어 1 mM 아세테이트 버퍼 (pH 4.5) 내로 탈염시켜, 과잉의 산화 및 켄칭 반응물 또는 시약으로부터 효소를 분리하였다.
D. IgG 와의 접합
산화된 HRP를 환원 아민화에 의해 IgG와 접합시켰다. IgG를 산화된 HRP와 1:1 부피비로 1:4-15의 IgG:HRP 몰비에서 혼합하고, 실온에서 2시간 내지 철야 반응시켰다. 조합 반응 직전에, 100 ㎕의 100 mM 카르보네이트 버퍼 (pH 9.6)을 1 mL의 산화된 HRP에 첨가하였다. 1 mL의 IgG를 산화된 HRP와 1:1 부피비로 1:4 HRP의 근사 IgG:HRP 몰비로 혼합하고, 최소 2시간 동안 반응시켰다. 형성된 접합체 중간체를 20 ㎕의 새로 제조된 4 mg/mL 붕수소화칼륨의 첨가에 의해 환원시켰다. 느리게 연속하여 뒤집으면서 30분 동안 실온에서 환원을 진행시켰다. 과잉의 환원 시약을 제거하기 위해 PBS 내로 탈염시킴으로써 혼합물을 분리하였다.
접합 및 환원 이후, 접합체를 SE HPLC 컬럼에 적용하고 분자량 450 내지 1500 KDa의 접합체를 수집함으로써 생성물을 분리하였다. HRP:IgG 비를 앞서 설명된 바와 같이 평가하였다.
Figure 112011074714212-pct00048
본 명세서에서 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 당업계의 기술 수준을 표시하고, 그 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 포함한다.
상기 기재된 다양한 실시양태는 단지 예시로서 제공되고, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당업자는 다음의 청구항에 기재되는 본 발명의 진정한 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 본원에 예시되고 설명되는 실시양태 및 출원을 따르지 않으면서 본 발명에 대해 이루어질 수 있는 다양한 변형 및 변화를 쉽게 알 것이다.

Claims (27)

  1. 샘플,
    화학발광-표지된 특이적 결합 파트너,
    활성화제 표지가 화학발광 표지의 활성화를 초래하는, 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너, 및
    선택적인 신호 억제제
    를 임의의 순서로 또는 동시에 첨가함으로써 수용액 내에 반응 혼합물을 형성하고, 여기서 모든 성분은 수용액에 가용성이고, 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너 및 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너는 샘플에 존재하는 분석물에 결합하여 결합 복합체를 형성하는 것인 단계; 및
    반응 혼합물에 트리거 용액을 첨가하고, 여기서 트리거 용액은 반응 혼합물 내의 분석물-결합된 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너 및 분석물-결합된 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너의 양에 상호관련된 검출가능한 화학발광 신호를 방출하는 것인 단계
    를 포함하고,
    상기 선택적인 신호 억제제가
    Figure 112017084511427-pct00049

    Figure 112017084511427-pct00050

    아스코르브산 또는 그의 염, 및 트롤록스(TROLOX)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너가 특이적 결합쌍 멤버에 직접 또는 간접적으로 연결된 화학발광 표지 화합물을 포함하고, 상기 화학발광 표지가 아크리단 케텐디티오아세탈 화합물, 아크리단 에스테르, 아크리단 티오에스테르, 아크리단 술폰아미드, 및 하기 화학식 VIII의 아크리단 에놀 유도체로부터 선택되는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
    <화학식 VIII>
    Figure 112017084511427-pct00051

    상기 식에서,
    (R1은 1-20개의 탄소 원자의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 및 아르알킬기로부터 선택되고, 임의의 상기 기는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, 4급 암모늄기, 및 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있고,
    X는 C1-C8 알킬, 아릴, 아르알킬기, 1-20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 아릴 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, 글리코실기 및 화학식 PO(OR')(OR")의 포스포릴기로부터 선택되고, 여기서 R' 및 R"는 독립적으로 C1-C8 알킬, 시아노알킬, 아릴 및 아르알킬기, 트리알킬실릴기, 알칼리 금속 양이온, 알칼리 토금속 양이온, 암모늄 및 트리알킬포스포늄 양이온으로부터 선택되고,
    Z는 O 및 S 원자로부터 선택되고, R6은 치환된 또는 비치환된 C1-C4 알킬, 페닐, 벤질, 알콕시알킬 및 카르복시알킬기로부터 선택되고,
    R7-14는 각각 수소이거나, 또는 1 또는 2개의 치환체는 알킬, 알콕시, 히드록시, 및 할로겐으로부터 선택되고, R7-14의 나머지는 수소이거나; 또는 R7-14는 각각 수소이고, R1은 표지 치환체이거나; 또는 R7-14 중의 하나는 표지 치환체이고, R7-14의 나머지는 수소이다.)
  2. 제1항에 있어서, 반응 혼합물을 임의의 순서로 또는 동시에 형성하는 것이 인핸서를 추가로 포함하는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 선택적인 신호 억제제가, 분석물과의 복합체에서 화학발광 표지와 활성화제 표지 사이의 반응에 의해 생성된 신호의 비가 상기 복합체에 존재하지 않은 경우의 화학발광 표지와 활성화제 표지 사이의 반응으로부터의 신호를 초과하도록 유도하는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 선택적인 신호 억제제가 아스코르브산, 아스코르브산 나트륨 염, 트롤록스, 페녹사진, 3-아미노티로신, 및 2-아미노페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학발광-표지된 특이적 결합 멤버가 특이적 결합 멤버에 직접 또는 간접적으로 연결된 화학발광 표지 화합물을 포함하고, 화학발광 표지가 하기 화학식의 아크리단 케텐디티오아세탈 화합물인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
    Figure 112017084511427-pct00052

    여기서,
    Figure 112017084511427-pct00053
    는 특이적 결합 멤버에 대한 화학발광 표지의 부착 지점을 나타내고, R1 및 R2는 1-20개 탄소 원자의 치환된 또는 비치환된 알킬기, 치환된 또는 비치환된 알케닐기, 치환된 또는 비치환된 알키닐기, 치환된 또는 비치환된 아릴기, 및 치환된 또는 비치환된 아르알킬기로부터 독립적으로 선택되고, R1 또는 R2가 치환된 기일 때, 이는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, C(=O)NHNH2 기, 4급 암모늄기, 및 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있고, R3은 1-20개 탄소 원자의 알킬기, 치환된 알킬기, 치환된 또는 비치환된 알케닐기, 치환된 또는 비치환된 알키닐기, 치환된 또는 비치환된 아릴기, 치환된 또는 비치환된 아르알킬기, 페닐기, 치환된 또는 비치환된 벤질기, 알콕시알킬, 카르복시알킬 및 알킬술폰산기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R3이 치환된 기일 때, 이는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, 4급 암모늄기, 및 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있다.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너가 특이적 결합쌍 멤버에 직접 또는 간접적으로 연결된 활성화제 표지 화합물을 포함하고, 활성화제 표지가 전이금속 염, 전이금속 착물 및 효소로부터 선택되고, 활성화제 표지가 퍼옥시다제 활성을 갖는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  7. 제6항에 있어서, 활성화제 표지 화합물이 퍼옥시다제 효소인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너 및 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너 중의 적어도 하나가 가용성 단백질, 스트렙타비딘, 아비딘, 뉴트라비딘, 비오틴, 양이온화 BSA, fos, jun, 가용성 합성 덴드리머, 가용성 합성 중합체, 가용성 천연 중합체, 다당류, 덱스트란, 올리고뉴클레오티드, 리포좀, 미셀, 및 베시클로부터 선택되는 보조 물질을 포함하는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  9. 제2항에 있어서, 인핸서가 퍼옥시다제 활성을 갖는 활성화제의 촉매적 전환을 촉진하는 화합물 또는 화합물의 혼합물인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  10. 제9항에 있어서, 인핸서가 페놀 화합물, 방향족 아민, 벤족사졸, 히드록시벤조티아졸, 아릴 보론산 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트리거 용액이 퍼옥시드 화합물을 포함하는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트리거 용액이 페놀 화합물, 방향족 아민, 벤족사졸, 히드록시벤조티아졸, 아릴 보론산 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 인핸서를 포함하는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너 및 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너가 각각 샘플 내의 분석물에 결합하는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너가 분석물의 유사체에 연결된 화학발광 표지를 포함하고, 분석물 및 화학발광-표지된 유사체가 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너와 결합하기 위해 경쟁하는 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 어느 성분도 입자 또는 다른 고상에 직접 또는 간접적으로 접합되지 않은 것인 샘플 내의 분석물에 대한 검정 방법.
  16. 분석물에 대한 제1 특이적 결합 파트너;
    제1 특이적 결합 파트너에 접합된 화학발광 화합물;
    분석물에 대한 제2 특이적 결합 파트너; 및
    활성화제 표지가 화학발광 표지의 활성화를 초래하는, 제2 특이적 결합 파트너에 접합된 활성화제 화합물;
    선택적인 신호 억제제; 및
    화학발광에 필요한 여기 상태 화합물을 생성하기 위해 필요한 반응물질을 제공하는 트리거 용액
    을 포함하며, 상기 모든 성분이 수용액에 가용성이고,
    상기 선택적인 신호 억제제가
    Figure 112017084511427-pct00054

    Figure 112017084511427-pct00055

    아스코르브산 또는 그의 염, 및 트롤록스로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 화학발광-표지된 특이적 결합 파트너가 특이적 결합쌍 멤버에 직접 또는 간접적으로 연결된 화학발광 표지 화합물을 포함하고, 상기 화학발광 표지가 아크리단 케텐디티오아세탈 화합물, 아크리단 에스테르, 아크리단 티오에스테르, 아크리단 술폰아미드, 및 하기 화학식 VIII의 아크리단 에놀 유도체로부터 선택되는 것인 샘플 내의 분석물을 검출하기 위한 키트.
    <화학식 VIII>
    Figure 112017084511427-pct00056

    (R1은 1-20개의 탄소 원자의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 및 아르알킬기로부터 선택되고, 임의의 상기 기는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, 4급 암모늄기, 및 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있고,
    X는 C1-C8 알킬, 아릴, 아르알킬기, 1-20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 아릴 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, 글리코실기 및 화학식 PO(OR')(OR")의 포스포릴기로부터 선택되고, 여기서 R' 및 R"는 독립적으로 C1-C8 알킬, 시아노알킬, 아릴 및 아르알킬기, 트리알킬실릴기, 알칼리 금속 양이온, 알칼리 토금속 양이온, 암모늄 및 트리알킬포스포늄 양이온으로부터 선택되고,
    Z는 O 및 S 원자로부터 선택되고, R6은 치환된 또는 비치환된 C1-C4 알킬, 페닐, 벤질, 알콕시알킬 및 카르복시알킬기로부터 선택되고,
    R7-14는 각각 수소이거나, 또는 1 또는 2개의 치환체는 알킬, 알콕시, 히드록시, 및 할로겐으로부터 선택되고, R7-14의 나머지는 수소이거나; 또는 R7-14는 각각 수소이고, R1은 표지 치환체이거나; 또는 R7-14 중의 하나는 표지 치환체이고, R7-14의 나머지는 수소이다.)
  17. 제16항에 있어서, 어느 성분도 입자 또는 다른 고상에 직접 또는 간접적으로 접합되지 않은 것인 키트.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 선택적인 신호 억제제가 아스코르브산, 아스코르브산 나트륨 염, 트롤록스, 페녹사진, 3-아미노티로신, 및 2-아미노페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 화학발광 화합물이 하기 화학식의 아크리단 케텐디티오아세탈 화합물인 키트.
    Figure 112017084511427-pct00057

    (여기서,
    Figure 112017084511427-pct00058
    는 특이적 결합 멤버에 대한 화학발광 표지의 부착 지점을 나타내고,
    R1 및 R2는 1-20개 탄소 원자의 치환된 또는 비치환된 알킬기, 치환된 또는 비치환된 알케닐기, 치환된 또는 비치환된 알키닐기, 치환된 또는 비치환된 아릴기, 및 치환된 또는 비치환된 아르알킬기로부터 독립적으로 선택되고, R1 또는 R2가 치환된 기일 때, 이는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, C(=O)NHNH2 기, 4급 암모늄기, 및 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있고,
    R3은 1-20개 탄소 원자의 알킬기, 치환된 알킬기, 치환된 또는 비치환된 알케닐기, 치환된 또는 비치환된 알키닐기, 치환된 또는 비치환된 아릴기, 치환된 또는 비치환된 아르알킬기, 페닐기, 치환된 또는 비치환된 벤질기, 알콕시알킬, 카르복시알킬 및 알킬술폰산기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R3이 치환된 기일 때, 이는 카르보닐기, 카르복실기, 트리(C1-C8 알킬)실릴기, SO3 -기, OSO3 -2기, 글리코실기, PO3 -기, OPO3 -2기, 할로겐 원자, 히드록실기, 티올기, 아미노기, 4급 암모늄기, 및 4급 포스포늄기로부터 선택되는 1-3개의 기로 치환될 수 있다.)
  20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 활성화제 화합물이 전이금속 염, 전이금속 착물 및 효소로부터 선택되고, 활성화제 표지가 퍼옥시다제 활성을 갖는 것인 키트.
  21. 제16항 또는 제17항에 있어서, 트리거 용액이 과산화수소, 과산화우레아, 및 퍼보레이트 염으로부터 선택되는 퍼옥시드를 포함하는 것인 키트.
  22. 제16항 또는 제17항에 있어서, 트리거 용액이 페놀 화합물, 방향족 아민, 벤족사졸, 히드록시벤조티아졸, 아릴 보론산 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 인핸서를 포함하는 것인 키트.
  23. 제16항 또는 제17항의 키트의 성분,
    샘플을 반응 혼합물에 전달하기 위한 유체 취급 시스템,
    화학발광-표지된 특이적 결합 파트너, 활성화제-표지된 특이적 결합 파트너, 선택적인 신호 억제제를 반응 혼합물에 전달하기 위한 유체 취급 시스템, 및
    화학발광 신호를 방출하기 위해 트리거 용액을 반응 혼합물에 전달하기 위한 유체 취급 시스템; 및
    화학발광 신호를 검출하기 위한 검출 시스템
    을 포함하고, 여기서 트리거 용액의 전달을 위한 유체 취급 시스템은 트리거 유체 주입시 및 주입 후에 방출되는 화학발광 신호를 측정하기 위해 검출 시스템과 공동으로 작용하는 것인, 제1항에 따른 검정 방법을 수행하기 위한 시스템.
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