CN109655615A - 一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒及其方法 - Google Patents

一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂盒及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒及其方法。本发明利用空间邻近化学发光技术实现完全均相检测脂蛋白相关磷脂酶A2，它基于双夹心技术，两单克隆抗体分别结合在脂蛋白相关磷脂酶A2分子的抗原决定簇上；将校准品或待测样本、辣根过氧化物酶标记的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体、吖啶酯标记的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体一起加入到微孔板中，无需包被，孵育后两单克隆抗体与样本中的抗原形成抗体‑抗原‑抗体夹心复合物，不需要洗涤过程，加入触发剂后，连续检测一段时间内的发光强度值，并计算样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量。该试剂盒具有质量稳定、检测快速便捷、灵敏度高、特异性强的特点。

Description

一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒及其 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶 A2的检测试剂盒及其方法。
背景技术
脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)是磷脂酶A2家族成员，分子量45.4kDa。人血浆Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞和其他炎症细胞产生。人体内循环中的 Lp-PLA2以与脂蛋白颗粒结合的形式存在，其中2/3与低密度脂蛋白结合，1/3 与高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白(VLDL)结合。故Lp-PLA2既有促动脉粥样硬化的作用，也有抗动脉粥样硬化的作用，但Lp-PLA2流行病学研究发现， Lp-PLA2活性与HDL呈负相关。目前Lp-PLA2促动脉粥样硬化作用的研究较多。结合在LDL上的Lp-PLA2随LDL被运送到血管壁上易受损伤的区域，水解氧化型低密度脂蛋白，水解后产生致炎症反应及致动脉粥样硬化因子溶血卵磷脂和氧化型游离脂肪酸，后两者是促炎介质，不仅能吸引炎性细胞及诱导趋化因子加重斑块炎症反应，而且还能增加斑块的易损性，而斑块破裂导致炎性细胞释放更多Lp-PLA2。
目前检测Lp-PLA2的方法比较多，常用方法有免疫荧光法、连续监测法、放射性免疫法、酶联免疫分析法、磁微粒化学发光法、化学发光免疫分析法等。随着生物科技的发展，其检测方法逐渐向酶联免疫吸附试验、化学发光免疫分析法发展。免疫荧光法的主要缺点是非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复杂；连续监测法是指每隔一定时间(2～60s)，连续多次测定酶促反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法，该方法技术程序也比较复杂，因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定；放射性免疫法具有放射性污染和对人体的损伤，而且还需要较高的实验室条件等；酶联免疫分析法的缺点在于无法准确进行定量，且批间差异较大，线性范围有限，无法持续监控 Lp-PLA2水平；化学发光免疫分析法是一种较为先进的免疫学方法，具有高灵敏、高特异、快速、高通量等特点。现阶段化学发光免疫法也逐渐成为检测Lp-PLA2水平的主流方法，并且由于自动化检测系统的普及，极大地提升了实验的精密度。根据目前Lp-PLA2的临床应用情况，市场应用前景较好的可靠方法为化学发光免疫分析法。
化学发光免疫分析法主要有微孔板式化学发光和微孔板式磁颗粒化学发光。目前实验室检测脂蛋白相关磷脂酶A2出现了一种化学发光检测方法，如中国专利申请CN201510068055公开了一种脂蛋白相关磷脂酶A2微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，在微孔板上使用磁颗粒，将亲和素-生物素桥联包被抗体，加入抗原和酶标抗体形成生物素化的抗体-抗原-酶标抗体复合物，将微孔板置于带有磁分离器的微孔板洗板机上洗涤，加入化学发光底物反应，而后检测其发光强度(RLU)，脂蛋白相关磷脂酶A2浓度与发光强度(RLU)成正相关。该方法具有检测范围宽，操作简单等特点，但需要洗涤过程，会产生大量的废弃物，且反应时间较长，不利于临床上大批量快速检测的需求。因此，针对上述技术问题，有必要提供一种质量稳定，检测快速便捷，灵敏度高，特异性强的用于测定血液中脂蛋白相关磷脂酶A2的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒及其方法，该试剂盒利用空间邻近化学发光技术实现完全均相检测脂蛋白相关磷脂酶A2，具有质量稳定，检测快速便捷，灵敏度高，特异性强的特点。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，包括试剂R1、试剂 R2和触发剂，所述试剂R1包括吖啶酯标记的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述试剂R2包括辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体和抗氧化剂。
本发明试剂盒的检测原理为：分别加入待测样本或校准品、吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体、辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体形成抗体-抗原-抗体复合物，无需洗涤过程，加入抗氧化剂和触发剂后立即连续检测一段时间(通常是1～3s)内的发光强度，并计算其峰面积，与标准曲线对比，即可计算出样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量，脂蛋白相关磷脂酶A2的含量与其峰面积成正相关。
本发明能够取得上述效果关键点在于，辣根过氧化物酶可氧化触发剂产生自由基，自由基随即氧化抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体上的吖啶酯，由于自由基的半衰期非常短，只能在分子内扩散，故只有形成抗体-抗原-抗体复合物才能反应发光。抗氧化剂能够防止自由基与游离的吖啶酯反应，有效降低了本底，从而提高了检测试剂盒的准确度和灵敏度。
其与以往的化学发光法相比，最主要的区别在于，本发明检测方法为空间邻近化学发光法，属于完全均相检测，是最接近体内自然状态的反应，具有简单快速、检查范围宽的特点。
本试剂盒无需进行包被处理，没有改变抗体的空间结构，使抗体结合表位充分暴露，保留最强的特异性，使试剂盒具有更高的灵敏度和准确度；无需洗涤过程，大大优化了工艺流程，对试剂盒的各性能均有较大的保障。因此，本试剂盒具有检测范围宽、检测快速便捷、灵敏度高、特异性及重复性好等特点，且减少了大量废弃物的排放，更适合临床上使用。
进一步地，所述抗氧化剂包括抗坏血酸，抗坏血酸能够防止自由基与游离的吖啶酯反应，确保自由基只能在抗体-抗原-抗体复合物的分子内传递，从而降低了本底，提高了检测结果的准确性。
进一步地，所述触发剂为包括H2O2和对羟基肉桂酸。
进一步地，所述试剂R1包括下述浓度的组分：
吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体 0.5-10mg/L，
所述试剂R2包括下述浓度的组分：
辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体 0.1-2mg/L；
抗坏血酸 0.01-1w/v％
所述触发剂包括下述浓度的组分：
H2O2 0.01-10w/v％
对羟基肉桂酸 0.01-10w/v％，
进一步地，所述试剂盒还包括缓冲液、稳定剂和防腐剂。
进一步地，所述试剂R1包括下述浓度的组分：
所述试剂R2包括下述浓度的组分：
触发剂包括下述浓度的组分：
H2O2 0.01-0.5w/v％
对羟基肉桂酸 0.01-4w/v％
进一步地，所述缓冲液的pH为6.5-8.5，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris 缓冲液、醋酸缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种，更进一步地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乙二胺四乙酸二钠、PEG 20000、吐温-20、EC氧化酶、酶稳定剂、甘油中的至少一种，优选地，所述稳定剂为牛血清白蛋白、PEG 20000、EC氧化酶、吐温-20和甘露醇。
进一步地，所述防腐剂为叠氮钠、ProClin300、KY-100生物防腐剂中的至少一种，更进一步地，所述试剂R1和试剂R2中ProClin300的浓度为 0.045-0.5w/v％。
本发明还提供了上述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒的检测方法，在待测样本中加入试剂R1和试剂R2，在37℃孵育5-30min，加入触发剂，立即检测反应物的发光强度值，计算待测样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量，其中，待测样本、试剂R1、试剂R2、抗氧化剂和触发剂的体积比为 1:8:8:15。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明的试剂盒利用空间邻近化学发光技术实现完全均相检测脂蛋白相关磷脂酶A2，更利于抗原抗体的反应，检测非常快速，大大缩短了反应时间，且能提高抗体的利用率，降低试剂盒的成本，使得本发明试剂盒具有更高的灵敏度、准确度和更好的重复性。
2)本发明试剂盒加入抗氧化剂，能快速清除样本中的自由基或其他干扰物质，确保自由基只能在抗体-抗原-抗体复合物的分子内传递，有效地控制本底。
3)本发明不需要进行包被处理，优化了工艺流程，有效控制了成本；在检测过程中不需要洗涤过程，不需要大量的洗涤液，减少了废弃物的排放，更利于临床上使用及其对废弃物的处理。
附图说明
图1为采用实施例3试剂盒测定得到的标准曲线图，其中X轴表示脂蛋白相关磷脂酶A2浓度，Y轴表示峰面积；
图2为实施例3的检测试剂盒与海格德的检测试剂盒的相关性对比图，其中X轴表示本发明实施例3的试剂盒测定的血清结果，Y轴表示的是海格德试剂盒测定的血清结果。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、脂蛋白相关磷脂酶A2校准品的制备
本发明校准品的基质液包括以下浓度的组分：
根据上述配方配制校准品基质液，用此基质液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原稀释成相应浓度的校准品，浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL，另加基质液0ng/mL，共6瓶，每瓶1mL，于2～8℃保存。
实施例2、吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体和辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的浓度选定标准
本试剂盒所用的抗体为外购所得，购于武汉华美生物科技有限公司。
采用方阵法将吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体和辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体以不同稀释度进行配比，以最低信噪比大于 5，最高信噪比大于80为基准，优先选择成本最低的配比关系。
将吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体以1/500、1/1000、1/2000、 1/4000、1/8000、1/16000的不同稀释度，与辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体1/500、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000的不同稀释度进行方阵法考察。两组比例交叉配比，发现最优的配比比例为吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体以1/2000和辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体1/8000，故选择这个合适的配比比例。即吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的浓度为5mg/L，辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶 A2抗体的浓度为0.45mg/L。
实施例3、一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒
本实施例的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和触发剂，
试剂R1包括下述浓度的组分：
试剂R2包括下述浓度的组分：
试剂R3包括下述浓度的组分：
对羟基肉桂酸 2w/v％
过氧化氢 2w/v％
按照上述配方制备得到试剂盒半成品，经过验证合格后才能组装成脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒。
实施例4、一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒
本实施例的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和触发剂，
试剂R1包括下述浓度的组分：
试剂R2包括下述浓度的组分：
所述触发剂包括下述浓度的组分：
H2O2 0.01w/v％
对羟基肉桂酸 0.01w/v％
按照上述配方制备得到试剂盒半成品，经过验证合格后才能组装成脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒。
实施例5、一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒
本实施例的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和触发剂，
试剂R1包括下述浓度的组分：
试剂R2包括下述浓度的组分：
所述触发剂包括下述浓度的组分：
H2O2 0.5w/v％
对羟基肉桂酸 4w/v％
按照上述配方制备得到试剂盒半成品，经过验证合格后才能组装成脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒。
实施例6、检测方法
以实施例3所述的脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂盒，多功能酶标仪LB942S 为例，其参数如表1。
分析方法：加入5μL待测样本和40μL试剂R1、40μL试剂R2，37℃孵育 15min，加入5μL抗氧化剂和75μL触发剂，立即连续检测一段时间(1～3s) 内的发光强度值(RLU)，通过仪器计算得到峰面积。测定后以校准品的脂蛋白相关磷脂酶A2浓度的log值作为X坐标，以峰面积的log值作为Y坐标，作出标准曲线如图1所示，方程y＝1.0003x-0.6991，R2＝1，根据该标准曲线计算出样品中脂蛋白相关磷脂酶A2的浓度，测定结果见图1。
表1
采用本发明的试剂盒进行检测时，孵育时间可根据实际检测需要调整为 5～30min。
实施例7、相关性试验
使用本发明试剂盒(具体配方同实施例3)和深圳市海格德人脂蛋白相关磷脂酶2(Lp-PLA2)测定试剂盒(酶联免疫法)，分别采用多功能酶标仪LB942S 和酶标仪infinitef50，对40份新鲜人血清按各自的参数同时进行测定进行相关性回归分析，测定结果见图2。
由图2的结果看出，两种试剂的相关系数R2＝0.9969，回归方程 y＝0.957x+2.1798。结果表明本试剂与已上市对比试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
实施例8、准确度和精密度试验
试剂：本发明试剂盒(具体配方同实施例3)、校准品、质控品。
仪器：多功能酶标仪LB942S。
操作步骤：使用校准品定标，测定各质控10次，计算测试均值、SD、CV 和相对偏差。
表2结果显示，本发明试剂盒检测各质控的相对偏差均小于2％，准确度非常好。测定10次同个样本的CV值均小于3％，精密度较好。
表2测定结果(ng/mL)
实施例9、线性试验
采用本发明试剂盒(具体配方同实施例3)、校准品、高浓度脂蛋白相关磷脂酶A2样品、质控品。
仪器：多功能酶标仪LB942S。
操作步骤：取高浓度脂蛋白相关磷脂酶A2样品配制成800ng/mL，以空白溶液作为稀释液，按16:1、8:1、4:1、2:1、0:1(原倍)稀释，各样本重复测定3 次。
表3测定结果(ng/mL)
分别采用实施例4～5的试剂盒的进行线性试验，其结果也与表3基本一致，本发明试剂盒在50ng/mL～800ng/mL范围内线性良好，线性范围较宽。
实施例10、抗干扰试验
取新鲜混合血清，分成5等份，按照下表4加入相应的干扰物质，取本发明试剂盒(具体配方同实施例3)测定血清中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量，测定结果如表5所示。
相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－无干扰物样本的测定均值)/无干扰物样本的测定均值×100％。
表5结果表示，本发明试剂盒不受胆固醇＜5mg/mL、黄疸(胆红素＜ 0.2mg/mL)、脂血(甘油三酯＜10mg/mL)、溶血(血红蛋白＜5mg/mL)的干扰，说明本发明试剂盒的抗干扰能力较强。
表4干扰物质浓度
表5测定结果
实施例11、检测试剂中不同组分对性能影响
1.抗坏血酸对本底影响
配制试剂R1时不添加抗坏血酸，其它成分不变，检测本底S0的峰面积，结果如表6。
表6抗坏血酸对本底影响
添加抗坏血酸能够防止自由基与游离的吖啶酯反应，确保自由基只能在抗体-抗原-抗体复合物的分子内传递，从而降低了本底，提高了检测结果的准确性。
2.不同浓度抗坏血酸浓度对本底影响
分别选用含抗坏血酸浓度0.01w/v％、0.05w/v％、0.1w/v％、0.5w/v％、 1w/v％的缓冲液配制试剂R1，其它成分不变，检测本底如表7。
表7不同浓度抗坏血酸对本底影响
从表7可以看出当抗坏血酸浓度大于0.05w/v％时本底基本保持不变，故抗坏血酸最佳浓度为0.05w/v％。
3.EC氧化酶对试剂R1稳定性影响
配制试剂R1时不添加EC氧化酶，其它成分不变，将试剂R1放置37℃1 天和14天，检测本底S0的峰面积，结果如表8。
表8 EC氧化酶对试剂R1稳定性影响
由表8可知，添加EC氧化酶的试剂R1在37℃放置14天后的本底基本不变。EC氧化酶对抗坏血酸和硫代硫酸钠有保护作用，提高试剂R1的稳定性及抗干扰能力。
4.EC氧化酶浓度对试剂R1稳定性影响
配制不同浓度EC氧化酶的试剂R1，其它成分不变，将试剂R1在37℃放置14天后检测本底的峰面积。结果如表9。
表9 EC氧化酶浓度对试剂R1稳定性影响
由表9可知，当EC氧化酶浓度大于0.05w/v％时S0的变化率在5％以内，故EC氧化酶最佳浓度选择0.05w/v％。
综上所述，本发明的试剂盒利用空间邻近化学发光技术实现完全均相检测脂蛋白相关磷脂酶A2，更利于抗原抗体的反应，检测非常快速，大大缩短了反应时间，提高抗体的利用率，降低试剂盒的成本，使得本发明试剂盒具有更高的灵敏度、准确度和更好的重复性；本发明试剂盒加入抗氧化剂，能快速清除样本中的自由基或其他干扰物质，能有效地控制本底；本发明不需要进行包被处理，优化了工艺流程，有效控制了成本；在检测过程中不需要洗涤过程，不需要大量的洗涤液，减少了废弃物的排放，更利于临床上使用及其对废弃物的处理。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和触发剂，所述试剂R1包括吖啶酯标记的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述试剂R2包括辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体和抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述抗氧化剂包括抗坏血酸、尿酸、茶多酚、谷胱甘肽、硫代硫酸钠中的至少一种，优选地，所述抗氧化剂为抗坏血酸和硫代硫酸钠。
3.根据权利要求1所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述触发剂为对羟基肉桂酸、过氧化氢、过氧化脲中的至少一种，优选地，所述触发剂为对羟基肉桂酸和过氧化氢。
4.根据权利要求1～3任一项所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括下述浓度的组分：
吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体 0.5-10mg/L
所述试剂R2包括下述浓度的组分：
辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体 0.1-2mg/L
抗坏血酸 0.01-1w/v％
所述触发剂包括下述浓度的组分：
H2O2 0.01-10w/v％
对羟基肉桂酸 0.01-10w/v％。
5.根据权利要求4所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液、稳定剂和防腐剂。
6.根据权利要求5所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括下述浓度的组分：
所述试剂R2包括下述浓度的组分：
所述触发剂包括下述浓度的组分：
H2O2 0.01-10w/v％
对羟基肉桂酸 0.01-10w/v％。
7.根据权利要求5或6所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液的pH为6.5-8.5，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液、HEPES缓冲液中至少一种，优选地，所述缓冲液的pH为7.4，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求5或6所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乙二胺四乙酸二钠、PEG 20000、吐温-20、EC氧化酶、酶稳定剂、甘油中的至少一种，优选地，所述稳定剂为牛血清白蛋白、PEG 20000、EC氧化酶、吐温-20和甘露醇。
9.根据权利要求5或6所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠、ProClin300、KY-100生物防腐剂中的至少一种。
10.根据权利要求1～9任一项所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，在待测样本中加入试剂R1和试剂R2，在37℃孵育5-30min，加入触发剂，立即检测反应物的发光强度值，计算待测样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量，其中，待测样本、试剂R1、试剂R2、抗氧化剂和触发剂的体积比为1:8:8:15。
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