CN102072957A - 丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种微粒子化学发光法丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法。试剂盒由测抗HCV磁微粒、测抗HCV示踪结合物、测抗HCV样品稀释液、质控品组成，本发明还公开了该诊断试剂盒的制备方法，其采用的是微粒子化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的灵敏度和特异性，适合于临床HCV的辅助诊断和献血员筛查，填补了国内微粒子化学发光法检测HCV抗体诊断试剂生产的空白。

Description

丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫诊断技术，具体地说是一种磁微粒作为载体的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

丙型病毒性肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）引起的传染病，呈全世界分布，主要通过输血或血制品传播，近年发现丙型肝炎也多见于非输血人群，主要通过注射、针刺、含HCV血液污染伤口和其他密切接触传播，并证实也可通过母婴传播。研究表明，20%~50%的HCV感染者会发生自发性病毒清除，50%~80%感染者会持续感染，其中85%进展为慢性肝炎，10~30年后，部分慢性丙肝患者（尤其年龄较长患者）发展为肝硬化，2~10年后，可能发展为肝细胞癌。由于与慢性乙肝相比，丙肝更隐蔽，潜伏期为2~26周；症状更不明显，高达75%的感染者无任何症状，因此很容易被忽视，中国丙肝漏报率高达52%。

至今还没有研制成功可以预防丙肝的疫苗，防治丙肝只有早期进行诊断，才能在早期进行治疗并防治病情的进一步恶化，否则将会传染给他人和使自身病情加重、影响身体健康和传给后代。因此有必要开发出一种性能较好的诊断方法，能有效地在早期就将该疾病诊断出来，及时治疗，减少因丙肝带来的健康和财产的损失。

目前HCV感染的诊断实验室化验方法有：1.检测HCV抗体的血清化验；2.定量检测HCV RNA的分子试验（包括RT-PCR，TMA，bDNA）；3.基因分型技术。由于感染者体内HCV RNA水平的有限以及不稳定性，使方法2的商业化具有局限性。另外商品化的基因型确定方法已经出现，但是均未通过FDA批准，基因分型技术也未普及。HCV抗体的血清化验主要是酶联免疫吸附法（ELISA）。ELISA检测丙肝抗体的方法已得到了大量的推广，该方法具有很多优点，但在检测的灵敏度，稳定性等方面还有待进一步提高。全自动微粒子化学发光免疫分析是在酶免疫分析基础上结合了高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，与其他方法相比，这种方法有许多独特的优点，首先它用顺磁性微粒作为固相载体，由于颗粒体积小，表面积大，扩大了反应面积，大大提高了检测灵敏度；其次由于使用全自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性，同时也使得批内差异与批间差异都较小。与放射免疫法相比，磁微粒子化学发光法除具有高灵敏度、高精确度、高可靠性等优点外，还具有如下优点：a.无放射性污染，稳定性好；b.特异性高；c.试剂可随用随取，测定方便迅速，可作为急诊检测项目。根据大量的实验结果以及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及其发展前景来看，该方法逐渐成为取代放射性免疫分析和酶免疫分析的首选。但是目前国内尚无生产用于丙肝抗体检测的微粒子化学发光法诊断试剂，目前急需灵敏度和特异性较高的微粒子化学发光诊断试剂，可以作为ELISA试剂和其他试剂的替代品，用于丙肝的诊断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种具有高灵敏度和特异性，适合于临床丙型肝炎病毒的辅助诊断和献血员筛查的微粒子化学发光法丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒，其包括测抗HCV磁微粒、测抗HCV示踪结合物、测抗HCV样品稀释液、质控品。其特征是：所述测抗HCV磁微粒为标记有丙肝病毒特异性重组抗原（含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）的磁性微粒子；测抗HCV示踪结合物为标记有特异性抗人IgG的异鲁米诺；测抗HCV样品稀释液为含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；质控品溯源至国家参考品，包括一低含量HCV抗体的血清和一高含量HCV抗体的血清。

本发明还提供了上述丙肝病毒抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：具体步骤如下：

（1）制备测抗HCV磁微粒  将带羧基磁微粒与EDC的重量比为1：2，磁微粒与丙肝病毒特异性重组抗原（即含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）比例为每毫克磁微粒标记20μg的抗原，在室温下进行标记，标记时间1小时，标记后采用甘氨酸封闭EDC的多余的位点，使之浓度达到25mM，反应30分钟，洗涤三次，加入含1%牛血清白蛋白的0.01MPBS，2-8℃保存；

（2）制备测抗HCV示踪结合物  特异性抗人IgG与异鲁米诺的标记，反应体系为：戊二醛最佳使用浓度为1.25%，特异性抗人IgG与异鲁米诺的最佳重量比为2：1，在室温反应1.5小时，用0.01M PBS（pH7.2-7.4）进行透析，透析后加入等体积甘油-20℃存放；

（3）制备测抗HCV样品稀释液  磷酸二氢钠 0.39g/L、磷酸氢二钠 2.68g/L、氯化钠 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞 1.0g/L，按上述配方配制稀释液；

（4）质控品溯源至国家参考品，包括质控品1和2，其中质控品1为低含量HCV抗体的血清，质控品2为高含量HCV抗体的血清。

本发明的原理是利用微粒子化学发光免疫分析技术，用特异性的HCV重组多抗原组份（即含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）标记磁微粒，特异性抗人IgG标记异鲁米诺，反应体系采用两步法，即测抗HCV磁微粒与待测样本先温育一段时间，再加入测抗HCV示踪结合物，形成抗原—HCV抗体—特异性抗人IgG免疫复合物，再加入激发液，催化产生光子，通过化学发光分析仪检测相对发光单位，发光值的高低与样本中HCV抗体的含量成正比，样本的含量可以利用该批号试剂盒已设定的曲线，通过全自动化学发光测定仪自动计算出来。

本发明试剂盒的优点是采用了微粒子化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的灵敏度和更好的特异性，填补了国内HCV抗体检测的微粒子化学发光法诊断试剂生产的空白。

具体实施方式

本发明试剂盒采用微粒子化学发光免疫分析技术，检测血清中是否存在HCV抗体。下面具体描述HCV抗体诊断试剂盒及其制备方法。

一种丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒，其包括测抗HCV磁微粒、测抗HCV示踪结合物、测抗HCV样品稀释液、质控品。所述测抗HCV磁微粒为标记有丙肝病毒特异性重组多抗原组份（含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）的磁性微粒子；测抗HCV示踪结合物为标记有特异性抗人IgG的异鲁米诺；测抗HCV样品稀释液为含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；质控品溯源至国家参考品，包括质控品1和2，其中质控品1为低含量HCV抗体的血清，质控品2为高含量HCV抗体的血清。

本发明上述HCV抗体诊断试剂盒的制备方法，其具体步骤如下：

（1）制备测抗HCV磁微粒。将带羧基磁微粒与EDC的重量比为1：2，磁微粒与丙肝病毒特异性重组多抗原组份（即含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）比例为每毫克磁微粒标记20μg的抗原，在室温进行标记，标记时间1小时，标记后采用甘氨酸封闭EDC的多余的位点，使之浓度达到25mM，反应30分钟，洗涤三次，加入含1%牛血清白蛋白的0.01MPBS，2-8℃保存。

（2）制备测抗HCV示踪结合物。特异性抗人IgG与异鲁米诺通过戊二醛作用形成示踪结合物，反应体系为：戊二醛最佳使用浓度为1.25%，特异性抗人IgG与异鲁米诺的最佳重量比为2：1，在室温反应1.5小时，用0.01M PBS（pH7.2-7.4）进行透析，透析后加入等体积甘油-20℃存放。

（3）制备测抗HCV样品稀释液  取磷酸二氢钠 0.39g/L、磷酸氢二钠 2.68g/L、氯化钠 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞 1.0g/L，按上述配方配制稀释液。

（4）质控品溯源至国家参考品，包括质控品1和2，其中质控品1为低含量HCV抗体的血清，质控品2为高含量HCV抗体的血清。

本发明上述各种原材料的选择要求如下。

磁微粒标记用HCV抗原的选择  要求具有天然抗原的主要免疫活性区、纯度高、效价高、特异性高等。将HCV特异性重组多抗原组份（含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）作为抗原来源，这种多抗原组份为大肠杆菌表达的基因重组蛋白，包含HCV多种抗原优势表位，能够保证HCV抗体具有较高的检出率。首先就蛋白的外观、含量、纯度、效价进行验证，结果抗原溶液外观澄清、无肉眼可见异物、无摇不散的沉淀，纯度较高（均＞95%），并具有较高的效价和很好的活性，特异性和灵敏度较好，研究结果表明重组多抗原组份完全可用于本发明诊断试剂盒的制备。

异鲁米诺标记用特异性抗人IgG的选择  首先分析抗人IgG抗体的外观；用紫外吸收法测定蛋白质含量；用SDS－PAGE鉴定纯度；用ELISA法检测效价。根据上述多次试验研究，本发明制备试剂盒所用的抗人IgG抗体的质量标准为微带乳光的澄清液体，不含异物，无摇不散的沉淀； SDS-PAGE检测，主带清晰无明显杂带，蛋白含量≧2mg/ml，效价≧1:10000。

磁微粒的选择  通过对磁微粒的外观，标记蛋白的比率，磁响应性，磁微粒吸附一致性等方面进行分析，经过多次分析研究，将磁微粒混匀，在灯光下观察，易分散，无聚集，无异物；将蛋白采用不同的方法进行标记，标记率应大于90%；将磁微粒置370-380特斯拉的磁铁上，观察磁微粒的聚集速度，分散均匀的磁微粒在10秒钟内完全聚集；磁微粒吸附一致性CV≤10%。研究结果表明黙克的直径为0.90-1.10μm的磁微粒，含有羧基基团，标记率最高，可用于本发明诊断试剂盒的制备。

异鲁米诺的选择  将异鲁米诺用DMSO(二甲基亚砜)进行溶解，用纯化水进行稀释至1.2×10^-5M/L的量，加入10μl异鲁米诺液体，各加入200μl激发液，测定其发光值，发光值应≥160000，经过研究，采用Sigma-Aldrich提供的异鲁米诺作为发光的原料。

本发明HCV抗体诊断试剂盒检测样品中HCV抗体的检测方法是：首先取出浓缩洗液，用纯化水按照倍数进行稀释。而后取出激发液A液和B液，放置化学发光仪合适的位置。激发液A液为含有1%NaOH的缓冲液，激发液B液为含有1‰H₂O₂的缓冲液。接着将试剂盒从冰箱中取出后，放于仪器试剂区至少混匀30分钟后方可使用，并严格按照设定的程序进行加样和温育。具体加样方法如下：10μL血清/血浆样本、100μL样品稀释液以及20μL测抗HCV磁微粒在37℃的条件下反应10分钟，然后用稀释好的洗液洗涤5次，再加入150μL测抗HCV示踪结合物，37℃反应10分钟，再用洗液洗涤5次，最终分别加入200μL激发A液和激发B液，测定发光值。样本的含量可以利用该批号试剂盒已设定的曲线，通过发光仪自动计算出来。

本发明质量控制要求是：试剂盒第一次操作，必须采用定标质控品进行定标，每间隔两周用定标质控品对试剂盒的主曲线进行修正，按照修正的主曲线对样本进行定量。定标质控品的测定值须在允许范围内，方可进行定标，如果定标质控结果与预期不符，提示检测结果不可靠，不应出具检测报告。

本发明试剂盒检测HCV国家参考品，检测的结果显示：该试剂盒的阴阳参考品符合率、灵敏度、特异性、精密性、稳定性等各项质量指标均符合国家标准。阴性符合率：30份阴性参比品符合率30/30；阳性符合率：30份阳性参比品符合率30/30；灵敏度检测：L1应检出阳性，L2应检出阳性，L3可检出阳性或阴性，L4应检出阴性；精密性：10孔检测变异系数（CV）≤10%；稳定性：试剂各组分于37℃放置6天，检定结果达到标准。

本发明试剂盒由河南中医学院第三附属医院、中国人民解放军第一五三中心医院、中国人民解放军第三七一医院三家医院进行临床考核，结果为：

（1）河南中医学院第三附属医院考核226例阴性样本和85例阳性样本，本发明试剂盒阴性样本226例全部检出，阳性样本85例全部检出。该试剂盒阴性符合率为100%，阳性符合率为100%。

（2）中国人民解放军第一五三中心医院考核186例阴性样本和77例阳性样本，本发明试剂盒阴性样本186例全部检出，阳性样本检出76例。该试剂盒阴性符合率为100%，阳性符合率为98.7%。

（3）中国人民解放军第三七一医院考核224例阴性样本和81例阳性样本，本发明试剂盒阴性样本224例全部检出，阳性样本81例全部检出。该试剂盒阴性符合率为100%，阳性符合率为100%。

该诊断试剂盒总的灵敏度为99.5%，特异性为100%，诊断试剂盒（间接法微粒子化学发光法）灵敏度为99.5%，特异性为100%，适合于临床丙肝的辅助诊断和献血员筛查。

Claims (2)

1.一种丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒，其包括测抗HCV磁微粒、测抗HCV示踪结合物、测抗HCV样品稀释液、质控品。其特征是：所述测抗HCV磁微粒为标记有丙肝病毒特异性重组抗原（含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）的磁性微粒子；测抗HCV示踪结合物为标记有特异性抗人IgG的异鲁米诺；测抗HCV样品稀释液为含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；质控品溯源至国家参考品，包括一低含量HCV抗体的血清和一高含量HCV抗体的血清。

2.一种权利要求1所述丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是具体步骤如下：

（1）制备测抗HCV磁微粒  将带羧基磁微粒与EDC的重量比为1：2，磁微粒与丙肝病毒特异性重组抗原（即含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段）比例为每毫克磁微粒标记20μg的抗原，在室温下进行标记，标记时间1小时，标记后采用甘氨酸封闭EDC的多余的位点，使之浓度达到25mM，反应30分钟，洗涤三次，加入含1%牛血清白蛋白的0.01MPBS，2-8℃保存；

（2）制备测抗HCV示踪结合物  特异性抗人IgG与异鲁米诺的标记，反应体系为：戊二醛最佳使用浓度为1.25%，特异性抗人IgG与异鲁米诺的最佳重量比为2：1，在室温反应1.5小时，用0.01M PBS（pH7.2-7.4）进行透析，透析后加入等体积甘油-20℃存放；

（3）制备测抗HCV样品稀释液  磷酸二氢钠 0.39g/L、磷酸氢二钠 2.68g/L、氯化钠 8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳汞 1.0g/L，按上述配方配制稀释液；

（4）质控品溯源至国家参考品，包括质控品1和2，其中质控品1为低含量HCV抗体的血清，质控品2为高含量HCV抗体的血清。