WO2018000902A1 - 25-羟基维生素d化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

25-羟基维生素d化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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何林
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深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
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Definitions

  • the present invention relates to the field of in vitro detection, and in particular to a 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit and a preparation method thereof.
  • vitamin D vitamin D
  • Vitamin D2 is contained in plant foods. It is synthesized from the plant's ergosterol by sunlight. Vitamin D3 can be synthesized from human skin and adipose tissue by 7-dehydrocholesterol. Vitamin D2 is a fat-soluble vitamin. Vitamin D from food is absorbed through the small intestine with fat. It forms chylomicrons with the help of bile. It enters the bloodstream from the lymphatic vessels and is transported into the liver with its own synthetic vitamin D3.
  • 25-hydroxyvitamin 1 is formed by the action of a monooxygenase system (25-hydroxylase) in hepatocyte microsomes.
  • 25-hydroxyvitamin D is converted to 1,25(0 H)2D3 in the mitochondrial ⁇ -hydroxylase system of renal proximal tubular epithelial cells, which is the largest biological action form of vitamin D and can promote intestinal calcium binding protein. Synthesis.
  • 25-hydroxyvitamin D is the main form of circulation in metabolism, which can reflect the body's vitamin D level. Vitamin D acts on the bone mineral metabolism system and its function is first identified as being able to treat rickets. Vitamin D is now considered to be a multifunctional prohormone that maintains good health.
  • Vitamin D deficiency also known as vitamin D deficiency rickets
  • Vitamin D deficiency rickets is common in infants and young children, and is often seen in the lack of vitamin D in the diet, or the lack of sunlight in the human body.
  • Calcium and phosphorus metabolism are caused by insufficient vitamin D in the body, and calcium salts cannot be normally deposited on the growth part of the bone, so that a chronic nutritional disease characterized by growth of bone formation is called rickets. If the disease occurs in an adult, calcification of the mature bone occurs, called osteomalacia.
  • the determination methods of 25-hydroxyvitamin D are mainly colloidal gold immunochromatography, enzyme-linked immunosorbent assay, and enzymatic chemiluminescence, but these methods have some shortcomings.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay is widely used, but the method also has the following disadvantages: [0010] (1) using 12x8 type, 6x8 type, 8x12 type or whole plate type 96-hole special The microplate is used as an antigen coating device and a reaction container. It can only be divided into 12 batches, 6 batches, 8 batches or whole plates in use, and it is impossible to perform independent, single-person detection;
  • the detection reagent is in a buffering space during the detection process, which easily causes cross-contamination between various reagents and affects the accuracy of the detection result;
  • the detection process is mostly manual operation, the addition amount of the reagent or the sample is not very precise, the operation process is extremely complicated and complicated, the operation error is easy to occur, and the accuracy and precision of the detection result are poor;
  • the chemiluminescence method can be classified into direct chemiluminescence and enzymatic chemiluminescence according to the principle of illumination.
  • Enzymatic chemiluminescence mainly has two kinds of horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase, but all have certain limitations.
  • the main disadvantages of horseradish peroxidase are: Luminol is not spicy In the presence of root peroxidase, it is also oxidized by H 2 O 2 itself, the background is relatively high, affecting the signal-to-noise ratio, the reaction kinetics are complex, the influencing factors are many, the results are not stable enough, and the sensitivity is high and the platform is obtained. The long substrate is not easy.
  • the main disadvantages of alkaline phosphatase are: the substrate reaches the interstage length of the plateau, and the substrate cost is high, resulting in high detection cost and heavy burden on patients.
  • the direct chemiluminescence of acridinium ester as a label has a comparative advantage over enzymatic chemiluminescence, mainly in: the reaction does not require a catalyst, as long as the alkaline environment can be carried out, the reaction is rapid, the background illumination is low, the signal-to-noise ratio High, less interference factors, good reagent stability, can be calibrated at two points, the system is simple, the cost of the stimulating solution is low, the acridine ester is easily linked to the protein, and the photon yield is not reduced after the coupling.
  • a 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit comprising: 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody-coated carboxylated magnetic particles and a vitamin D derivative-labeled chemiluminescent label.
  • the ratio of the 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody to the chemiluminescent label is 50: 1 to 10 in the vitamin D derivative-labeled chemiluminescent label.
  • the carboxylated magnetic particles have a particle diameter of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the chemiluminescent label is luminol, isoluminol, terpyridine or acridinium ester.
  • the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit further comprises a chemiluminescent substrate solution, and the chemiluminescent substrate solution comprises sputum and sputum.
  • the liquid A is a H 2 O 2 solution
  • the liquid B is a NaOH solution.
  • the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit further includes 25-hydroxyvitamin D calibration p
  • the 25-hydroxyvitamin D calibrator was a solution of 25-hydroxyvitamin D at concentrations of 0 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, and 200 ng/mL, respectively.
  • a method for preparing the above 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit comprising the following steps:
  • DC aqueous solution activate the surface carboxyl group of carboxylated magnetic particles, then add 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody, suspend for 2h ⁇ 10h at room temperature, remove the supernatant by magnetic separation, and resuspend in Tris buffer to obtain 25-hydroxy vitamin.
  • D-monoclonal antibody coated carboxylated magnetic particles activate the surface carboxyl group of carboxylated magnetic particles, then add 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody, suspend for 2h ⁇ 10h at room temperature, remove the supernatant by magnetic separation, and resuspend in Tris buffer to obtain 25-hydroxy vitamin.
  • the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit can detect 25-hydroxyvitamin D by using a fully automatic chemiluminescence immunoassay analyzer as a detection tool. After the experiment, the detection sensitivity reaches 0.2 ng/mL, which is at least 10 times more sensitive than the traditional 25-hydroxyvitamin D detection method. The 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit has higher detection accuracy. .
  • FIG. 1 is a flow chart showing a method of preparing a 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit according to an embodiment
  • An embodiment of the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit comprising: 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody coated carboxylated magnetic particles and vitamin D derivative labeled chemiluminescent label
  • the ratio of the 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody to the chemiluminescent label in the vitamin D derivative labeled chemiluminescent label is 50: 1 ⁇ 10.
  • the carboxylated magnetic particles have a particle diameter of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the chemiluminescent label can be luminol, isoluminol, terpyridine or acridinium ester. Among them, the chemiluminescent label is preferably an acridinium ester.
  • the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescent immunoassay kit further comprises a chemiluminescent substrate fluid.
  • the chemiluminescent substrate liquid includes mash and mash.
  • Solution A can be H 2 0 2 solution
  • B solution can be NaOH solution.
  • the liquid A is H 2 0 2 having a concentration of 0.1 mol/L.
  • Solution B is a NaOH solution with a concentration of 0.25 mol/L.
  • the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit further comprises a 25-hydroxyvitamin D calibrator.
  • the 25-hydroxyvitamin D calibrator was a solution of 25-hydroxyvitamin D at concentrations of 0 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, and 200 ng/mL, respectively.
  • the 25-hydroxyvitamin D calibrator can be used to prepare 25-hydroxyvitamin D into a concentration of Ong/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, respectively. And 200ng/mL
  • 25-hydroxyvitamin D A solution of 25-hydroxyvitamin D.
  • This 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit is used for 25-hydroxyvitamin D detection, using a fully automated chemiluminescence immunoassay to detect 25-hydroxyvitamin D calibrators, drawing a standard curve, built into the computer Software; then test the actual sample, calculate the sample concentration based on the sample luminescence value; Finally, evaluate the performance (sensitivity, linearity, precision, interference) of the 25-hydroxyvitamin D automatic chemiluminescence immunoassay system.
  • the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit can detect 25-hydroxyvitamin D by using a fully automatic chemiluminescence immunoassay analyzer as a detection tool.
  • the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit After the experiment, the detection sensitivity reaches 0.2g/mL, which is at least 10 times more sensitive than the traditional 25-hydroxyvitamin D detection method.
  • the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit has higher detection accuracy. .
  • the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit has the following advantages:
  • the chemiluminescence immunoassay system using acridinium ester has a wide linear range and can reach 2 ng/mL ⁇
  • the detection range of the traditional 25-hydroxy vitamin D detection method is 20 ng / mL ⁇ 80 ng / mL;
  • the acridinium ester chemiluminescence immunoassay system has high repeatability, and the intra-assay and batch-to-batch difference are within 5%, which is difficult to achieve by other chemiluminescence immunoassay systems;
  • the chemiluminescence immunoassay system has achieved the quantification of the sample, through the built-in standard curve to the test software
  • the chemiluminescence immunoassay system can be fully automated, and the addition of reagents and samples is completed by the instrument, and the operation is simpler and the human error is reduced.
  • the preparation method of the above 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit shown in FIG. 1 includes the following steps:
  • the concentration of MES (2-(N-morpholine)ethanesulfonic acid) buffer was 0.02 M and the pH was 5.5.
  • the Tris buffer has a concentration of 0.1 M and contains 2 ⁇ 3 ⁇ 4 BSA and a pH of 8.0.
  • the carboxylated magnetic particles have a particle diameter of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the carbonate buffer has a concentration of 0.1 M and a pH of 9.0 9.5.
  • the impurity removal operation is desalting of the centrifugal desalting column, and the specific operation is as follows: firstly, pure water and TBS buffer are used separately (
  • the ratio of the 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody to the chemiluminescent label in the vitamin D derivative labeled chemiluminescent label is 50: 1 ⁇ 10.
  • the chemiluminescent label can be luminol, isoluminol, terpyridine or acridinium ester. Among them, the chemiluminescent label is preferably an acridinium ester.
  • the above 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay reagent can be obtained by combining the obtained carboxylated magnetic microparticle coated with 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody and the chemiluminescent label labeled with vitamin D derivative.
  • This 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit requires a chemiluminescent substrate solution and a 25-hydroxyvitamin D calibrator when using hydrazine.
  • the chemiluminescent substrate solution and the 25-hydroxyvitamin D calibrator can be prepared by themselves.
  • the chemiluminescent substrate liquid includes a liquid A and a liquid B.
  • Solution A can be H 2 0 2 solution, and B solution can be NaOH solution.
  • the liquid A is H 2 O 2 having a concentration of 0.1 mol/L.
  • Solution B is a NaOH solution with a concentration of 0.25 mol/L.
  • the 25-hydroxyvitamin D calibrator can be formulated into a concentration of 0 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 100 ng/mL, and 200 ng/mL, using a standard buffer.
  • the preparation method of the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit is simple and convenient, and the prepared 25
  • -Hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit has high detection sensitivity and has good application before application.
  • Tris buffer pH 8.0 was resuspended to ljlmg/mL to obtain carboxylated magnetic particles coated with 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody, and 5 mL of each bottle was stored at 4 ° C for use.
  • [50] Take 50 ⁇ 25 mg/mL 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody, add 150 ⁇ L of 0.1 M carbonate buffer with a pH of 9.0-9.5, mix well, and then add 1.5 ⁇ concentration to 5 mg/mL. Mix the acridinium ester solution, avoid the light reaction at room temperature, take it out after 1.5h, desalinate with 2mL zeba centrifugal desalting column, firstly treat with pure water and TBS buffer in the desalting process, and finally add the vitamin D obtained. Derivatized labeled acridinium ester solution, collect the liquid in the centrifuge tube to the preservation tube to obtain the vitamin D derivative labeled acridinium ester, and store 5 mL of each bottle at 4 ° C for use.
  • 25-hydroxyvitamin D was formulated to a concentration of 0 ng/mL 10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL 100 ng/mL with standard buffer (40 mM Tris-HCl, 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0) mL and 200 Ng/mL, 0.5 mL per bottle, lyophilized, and stored at 4 °C.
  • standard buffer 40 mM Tris-HCl, 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0
  • the methodological mode is double antibody sandwich method, that is, the instrument sequentially adds 50 samples, 50 of 25-hydroxyvitamin D monoclonal antibody coating.
  • the carboxylated magnetic particles and 50 25-hydroxyvitamin D treatment solution after reacting for 20 min, add 50 25-hydroxyvitamin D-coated acridinium ester, react for 20 min, perform magnetic separation, and the instrument will react.
  • the mixture was sent to a dark room, and the luminescent substrate A (H 2 0 2 ) and the B solution (NaOH) were sequentially added to carry out a luminescent reaction, and finally the luminescence value was recorded.
  • the sensitivity of the 25-hydroxyvitamin D chemiluminescence immunoassay kit was calculated with reference to the CLSI EP17-A document recommended experimental protocol, and the obtained sensitivity was 0.2 ng/mL.
  • the mixed serum is separately added to the interfering substance, including: combining bilirubin, free bilirubin, hemoglobin, ascorbic acid, glycerol, and the addition ratio is performed according to 1:20, respectively, and the mixed serum is added and various interferences are added.
  • the measured value of the serum after the mixture is calculated, and the deviation between the two is calculated, and ⁇ 10% is an acceptable range.
  • the results show that the interference level meets the NCCLS document standard and can be used for accurate assessment of 25-hydroxyvitamin D status in clinical laboratories.
  • the sensitivity of the chemiluminescence detection method is improved by about 20 compared with the enzyme-linked immunosorbent assay.
  • the above-mentioned embodiments are merely illustrative of several embodiments of the present invention, and the description thereof is more specific and detailed, but is not to be construed as limiting the scope of the invention. It should be noted that a number of variations and modifications may be made by those skilled in the art without departing from the spirit and scope of the invention. Therefore, the scope of the invention should be determined by the appended claims.

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Abstract

一种25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒包括：25-羟基维生素D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和维生素D衍生物标记的化学发光标记物。该25-羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成25-羟基维生素D的检测，其检测灵敏度达到0.2ng/mL，检测精度较高。

Description

发明名称： 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 技术领域
[0001] 本发明涉及体外检测领域， 尤其涉及一种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试 剂盒及其制备方法。
背景技术
[0002] 在此处键入背景技术描述段落维生素 D (vitamin D) 为固醇类衍生物， 具有抗 佝偻病作用， 又称抗佝偻病维生素。 可分为维生素 D2和维生素 D3。 维生素 D2多 含于植物性食物中， 它是由植物的麦角固醇经阳光照射而合成的， 维生素 D3可 由人体皮肤和脂肪组织在 7-脱氢胆固醇经过阳光照射合成。 维生素 D2属脂溶性 维生素， 来自食物中的维生素 D与脂肪一起经小肠吸收， 在胆汁协助下形成乳糜 微粒， 由淋巴管进入血液， 与自身合成的维生素 D3—起转运入肝脏。 在肝脏中 经肝细胞微粒体中的单氧酶系统 （25-羟化酶） 的作用， 形成 25-羟维生素1)。 25- 羟维生素 D在肾近端小管上皮细胞线粒体内 α羟化酶系统的作用下转变为 1， 25(0 H)2D3， 它是维生素 D最大的生物作用形式， 可以促进肠道钙结合蛋白的合成。 而 25羟维生素 D是代谢中的主要循环形式， 能够反映机体的维生素 D水平。 维生 素 D作用于骨矿物质代谢系统， 它的功能首先被确认为可以治疗佝偻病。 现在维 生素 D被认为是一种能维护身体健康的多功能激素原。
[0003] 维生素 D缺乏又称维生素 D缺乏性佝偻病， 常见于婴幼儿， 多见于膳食中缺乏 维生素 D， 或者是人体缺乏阳光的照射。 由于体内维生素 D不足而引起钙、 磷代 谢障碍， 钙盐不能正常地沉积于骨骼的生长部分， 以致出现生长骨发生病变为 特征的一种慢性营养性疾病， 称为佝偻病。 如果该病发生于成人， 则出现发育 成熟骨骼的钙化不全， 称为骨软化症。 研究还表明， 维生素 D缺乏可能使某些癌 症、 心血管疾病、 自身免疫性疾病和感染性疾病的发病风险升高。
[0004] 根据当前糖尿病报告杂志上发表的结果， 3262例年齢 50-70岁之间的中国人参 加的一项研究表明 94%的人维生素 D缺乏或不足， 这些人中有 42%还有代谢综合 征。 其它一些研究表明， 而长期摄入过多的维生素 D (5000IU) ， 将引起高血钙 和高尿钙。 特征为食欲减退， 过度口渴、 恶心、 呕吐、 烦躁、 体弱、 便泌腹泻 交替出现， 严重者将因肾钙化、 心脏和大动脉钙化而死亡。 随着医疗专业人员 和患者意识到维生素 D缺乏的潜在健康风险， 实验室检验量激增， 需要我们提 供更快、 更准、 更有效的检测方法， 帮助医生和患者更早的得到检测结果。
[0005] 目前 25-羟维生素 D的测定方法主要胶体金免疫层析法、 酶联免疫吸附法、 酶促 化学发光法， 但这些方法都存在着一些不足。
技术问题
[0006] 一、 胶体金免疫层析法
[0007] 免疫金标技术和抗原抗体特异性反应的一种结合形式。 试剂使用方便， 生产成 本和检测成本较低， 但产品整体性能容易受影响。
[0008] 二、 酶联免疫吸附法
[0009] 酶联免疫吸附法 (ELISA)被广泛应用， 但该方法也存在着下述的不足之处： [0010] (1)使用 12x8型、 6x8型、 8x12型或整板型 96孔专用微孔板作为抗原包被用具和 反应容器， 在使用吋只能分成 12批次、 6批次、 8批次或整板一次使用， 无法进 行独立的、 单人份的检测；
[0011] (2)定量测定所用的试剂种类较多， 每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装， 并 且每使用一种试剂吋都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中， 不但试 剂瓶种类多， 加注试剂的操作也极为繁琐；
[0012] (3)缺少对检测信息的相应标注， 只能通过査看试剂盒外包装盒的标识才能了 解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息， 而且所知悉的信息在检测过程中 不受控， 具有很大的随意性；
[0013] (4)检测试剂在检测过程中处于幵放的空间， 容易引起各种试剂之间的交叉污 染而影响检测结果的准确性；
[0014] (5)检测过程多采用手工操作， 试剂或样本的加量不很精确， 操作过程极为繁 琐和复杂， 容易发生操作差错， 检测结果的准确度和精密度较差；
[0015] (6)在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数 X48/96人份， 如果需 要检测 10个项目， 则试剂的配置及使用数须为 10x48/96人份， 如果只有一份样本 需要检测 10个不同的项目， 也需要配置 10x48/96人份的试剂， 存在着不够经济合 理的缺点。
[0016] 三、 化学发光法
[0017] 化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和酶促化学发光。
[0018] 酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶 （HRP) 和碱性磷酸酶两种， 但都有一定 的局限性， 辣根过氧化物酶主要缺点为： 鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情 况下， 也会被 H 20 2氧化自身发光， 本底相对较高， 影响信噪比， 反应动力学复 杂， 影响因素多， 结果不够稳定， 要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。 碱性磷酸酶主要缺点为： 底物达到平台期的吋间长， 底物成本高， 导致检测成 本高， 患者负担重。
[0019] 吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比酶促化学发光具有明细优势， 主要表现 在： 反应不需要催化剂， 只要碱性环境即可进行， 反应迅速， 背景发光低， 信 噪比高， 干扰因素少， 试剂稳定性好， 可以两点定标， 体系简单， 激发液成本 低， 吖啶酯易与蛋白质联结， 且联结后光子产率不减少。
问题的解决方案
技术解决方案
[0020] 基于此， 有必要提供一种检测灵敏度较高的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测 试剂盒及其制备方法。
[0021] 一种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 包括： 25-羟基维生素 D单克隆 抗体包被的羧基化的磁微粒和维生素 D衍生物标记的化学发光标记物。
[0022] 所述 25-羟基维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中， 所述 25-羟基维生 素 D单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35=
[0023] 所述维生素 D衍生物标记的化学发光标记物中， 所述 25-羟基维生素 D单克隆抗 体与所述化学发光标记物的比例为 50: 1~10。
[0024] 所述羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~ 1 μηι。
[0025] 所述化学发光标记物为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。
[0026] 所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 还包括化学发光底物液， 所 述化学发光底物液包括 Α液和 Β液。
[0027] 所述 A液为 H 20 2溶液， 所述 B液为 NaOH溶液。 [0028] 所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 还包括 25-羟基维生素 D定标 p
[0029] 所述 25-羟基维生素 D定标品为浓度分别为 0ng/mL、 10ng/mL、 20ng/mL、 50ng/ mL、 lOOng/mL和 200ng/mL的 25-羟基维生素 D的溶液。
[0030] 一种上述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒的制备方法， 包括如下步 骤：
[0031] 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 E
DC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入 25-羟基维生素 D单克隆 抗体， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到 25-羟基 维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒； 以及
[0032] 取 25-羟基维生素 D单克隆抗体， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后加入化学发光 标记物后混匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到维生素 D衍生物标记的化学 发光标记物。
发明的有益效果
有益效果
[0033] 这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析 仪为检测工具， 完成 25-羟基维生素 D的检测这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫 检测试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏度达到 0.2ng/mL， 相对于传统的 25-羟基维 生素 D的检测方法灵敏度至少提高了 10倍， 这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检 测试剂盒的检测精度较高。
对附图的简要说明
附图说明
[0034] 图 1为一实施方式的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的流 程图；
[0035] 图 2为实施例 3得到的 25-羟基维生素 D标准曲线图。
本发明的实施方式 [0036] 为使本发明的上述目的、 特征和优点能够更加明显易懂， 下面结合附图和具体 实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。 在下面的描述中阐述了很多具 体细节以便于充分理解本发明。 但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它 方式来实施， 本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进， 因此本发明不受下面公幵的具体实施的限制。
[0037] 一实施方式的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 包括： 25-羟基维生 素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和维生素 D衍生物标记的化学发光标记物
[0038] 优选的， 25-羟基维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中， 25-羟基维生 素 D单克隆抗体与羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35=
[0039] 优选的， 维生素 D衍生物标记的化学发光标记物中， 25-羟基维生素 D单克隆抗 体与化学发光标记物的比例为 50: 1~10。
[0040] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。
[0041] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。
[0042] 在其他的实施例中， 上述 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒还包括化学 发光底物液。
[0043] 化学发光底物液包括 Α液和 Β液。 A液可以为 H 20 2溶液， B液可以为 NaOH溶液
[0044] 本实施例中， A液为浓度为 0.1mol/L的 H 20 2
溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。
[0045] 在其他的实施例中， 上述 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒还包括 25- 羟基维生素 D定标品。
[0046] 25-羟基维生素 D定标品为浓度分别为 0ng/mL、 10ng/mL、 20ng/mL、 50ng/mL、 lOOng/mL和 200ng/mL的 25-羟基维生素 D的溶液。
[0047] 具体的， 25-羟基维生素 D定标品可以采用标准品缓冲液将 25-羟基维生素 D配制 成浓度分别为 Ong/mL、 10ng/mL、 20ng/mL、 50ng/mL、 lOOng/mL和 200ng/mL的
25-羟基维生素 D的溶液。 这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒用于 25-羟基维生素 D检测吋， 利 用全自动化学发光免疫分析仪对 25-羟基维生素 D定标品进行检测， 绘制标准曲 线， 内置于电脑软件； 接着测试实际样本， 根据样本发光值计算样本浓度； 最 后对 25-羟基维生素 D全自动化学发光免疫分析系统进行性能 （灵敏度、 线性、 精密度、 干扰性） 的评价。
[0049] 这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析 仪为检测工具， 完成 25-羟基维生素 D的检测这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫 检测试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏度达到 0.2g/mL， 相对于传统的 25-羟基维生 素 D的检测方法灵敏度至少提高了 10倍， 这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测 试剂盒的检测精度较高。
[0050] 此外， 这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒还具有以下优点：
[0051] 1、 选择吖啶酯作为标记材料， 并应用于化学发光免疫分析系统， 该发光体系 为直接化学发光， 与传统的酶促化学发光相比， 该反应不需要酶的参与， 更加 节约成本；
[0052] 2、 选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽， 能达到 2ng/mL~
120ng/mL, 而传统的 25-羟基维生素 D的检测方法的检线性范围为 20ng/mL~ 80ng/mL;
[0053] 3、 吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高， 批内及批间差均在 5%以内， 这是 其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
[0054] 4、 化学发光免疫分析系统已实现样本的定量， 通过内置标准曲线到测试软件
， 只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
[0055] 5、 化学发光免疫分析系统可以实现全自动化， 试剂及样本的添加全有仪器完 成， 操作更加简便， 减少了人为的误差。
[0056] 如图 1所示的上述 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒的制备方法， 包括 如下步骤：
[0057] 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 E DC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入 25-羟基维生素 D单克隆 抗体， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到 25-羟基 维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒。
[0058] MES (2-(N-吗啡啉)乙磺酸） 缓冲液的浓度为 0.02M， pH为 5.5。
[0059] Tris缓冲液的浓度为 0.1M并且含有 2<¾BSA， pH为 8.0。
[0060] EDC (1-乙基 -3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺） 水溶液的浓度为 10mg/mL~20m g/mL, EDC与羧基化的磁微粒的比例为 0.05: 0.1-1 =
[0061] 优选的， 25-羟基维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中， 25-羟基维生 素 D单克隆抗体与羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35=
[0062] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。
[0063] 取 25-羟基维生素 D单克隆抗体， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后加入化学发光 标记物后混匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到维生素 D衍生物标记的化学 发光标记物。
[0064] 碳酸盐缓冲液浓度为 0.1M， pH为 9.0 9.5，
[0065] 除杂的操作为离心脱盐柱脱盐， 具体操作为： 先分别用纯净水及 TBS缓冲液 （
40 mM Tris-HCl， 0.5% BSA, l% NaCl, pH 8.0) 处理离心脱盐柱， 最后加入得 到的 25-羟基维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的溶液， 最后收集离心 管中的液体。
[0066] 优选的， 维生素 D衍生物标记的化学发光标记物中， 25-羟基维生素 D单克隆抗 体与化学发光标记物的比例为 50: 1~10。
[0067] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。
[0068] 得到的 25-羟基维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和维生素 D衍生物标 记的化学发光标记物组合即可得到上述 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂 品- °
[0069] 这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒在使用吋， 还需要化学发光底物 液和 25-羟基维生素 D定标品。
[0070] 化学发光底物液和 25-羟基维生素 D定标品可以自行配制得到。
[0071] 化学发光底物液包括 A液和 B液。 A液可以为 H 20 2溶液， B液可以为 NaOH溶液 [0072] 本实施例中， A液为浓度为0.1mol/L的H 2O 2
溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。
[0073] 具体的， 25-羟基维生素 D定标品可以采用标准品缓冲液将 25-羟基维生素 D配制 成浓度分别为 0ng/mL 10ng/mL 20ng/mL 50ng/mL lOOng/mL和 200ng/mL的
25-羟基维生素 D的溶液。
[0074] 这种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便， 制得的 25
-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏度较高， 具有良好的应用前
[0075]
[0076] 以下为具体实施例。
[0077] 实施例 1 : 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒的制备
[0078] (1) 25-羟基维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的制备：
[0079] 取含有 50mg粒径为 0.05μηι~1μιη的羧基化的磁微粒 （MagnaBind™, 货号 21353 ) 悬浮液， 磁分离去上清， 用 0.02 M pH为 5.5 MES缓冲液重悬， 加入 lmL新配 置的 10mg/mL的 EDC水溶液， 活化磁珠表面羧基， 加入 4mg25-羟基维生素 D单克 隆抗体 （biorbyt, 货号 orb48780) ， 室温下混悬 6h， 磁分离， 去除上清， 用含 2 <¾BSA的 0.1M pH为 8.0的 Tris缓冲液重悬至 ljlmg/mL， 得到 25-羟基维生素 D单克 隆抗体包被的羧基化的磁微粒， 每瓶 5mL分装保存于 4°C备用。
[0080] (2) 维生素 D衍生物标记的吖啶酯的制备：
[0081] 取 50μί浓度为 25mg/mL的 25-羟基维生素 D单克隆抗体， 加入 150μί浓度为 0.1M pH为 9.0~9.5的碳酸盐缓冲液， 混匀， 然后加入 1.5μί浓度为 5mg/mL的吖啶酯 溶液混匀， 室温下避光反应， 1.5h后取出， 用 2mL的 zeba离心脱盐柱脱盐处理， 脱盐过程中首先分别用纯净水及 TBS缓冲液进行处理， 最后加入得到的维生素 D 衍生物标记的吖啶酯溶液， 收集离心管中的液体至保存管得到维生素 D衍生物标 记的吖啶酯， 每瓶 5mL分装保存于 4°C备用。
[0082] (3) 25-羟基维生素 D定标品的制备：
[0083] 用标准品缓冲液 (40 mM Tris-HCl, 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0) 将 25-羟基 维生素 D配置成浓度为 0ng/mL 10ng/mL 20ng/mL 50ng/mL lOOng/mL和 200 ng/mL, 每瓶 0.5 mL分装冻干， 4 °C保存备用。
[0084]
[0085] 实施例 2: 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测方法
[0086] 以全自动化学发光免疫分析仪 （YHLO， 货号 iFlash3000) 为检测工具， 方法学 模式为双抗体夹心法， 即仪器依次加入 50 的样品、 50 的 25-羟基维生素 D单 克隆抗体包被的羧基化的磁微粒以及 50 的 25-羟基维生素 D处理液， 反应 20 min后， 再加 50 的 25-羟基维生素 D包被的吖啶酯， 反应 20 min后， 进行磁分离 ， 仪器将反应混合物送入暗室， 依次加入发光底物 A液 （H 20 2) 及 B液 （NaOH ) 进行发光反应， 最后记录发光值。
[0087]
[0088] 实施例 3: 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒性能评价
[0089] 采用实施例 2中的方法对 25-羟基维生素 D定标品进行检测， 得到绘制标准曲线 如图 2所示。
[0090] 接着对接着测试实际样本， 根据样本发光值计算样本浓度。
[0091] 灵敏度的检测：
[0092] 参照 CLSI EP17-A文件推荐实验方案， 计算 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测 试剂盒的灵敏度， 求得的灵敏度为 0.2ng/ mL。
[0093] 线性的检测：
[0094] 对浓度为 2ng /mL、 10ng /mL、 50ng /mL、 80ng /mL、 120ng /mL标准品做线性 分析， 计算线性相关系数， r=0.9996， 另外， 该试剂盒对 25-羟基维生素 D样品检 测的线性范围为 2g/ml ~120g/mL。
[0095] 精密度测定：
[0096] 取浓度为 20ng/mL及 100ng/mL两个 25-羟基维生素 D样品， 每个样本每个浓度各 做 3个平行， 用三批试剂盒进行检测， 计算试剂盒批内及批间差， 结果表明该试 剂盒批内及批间差均小于 5%。
[0097] 干扰性实验：
[0098] 取混合血清分别添加干扰物包括： 结合胆红素、 游离胆红素、 血红蛋白、 抗坏 血酸、 甘油酯， 添加比例按照 1 : 20进行， 分别测定混合血清及添加了各种干扰 物后混合血清的测值， 计算二者之间的偏差， 以 ±10%为可接受范围。 结果表明 ， 干扰性均达到 NCCLS的文件标准， 可用于临床实验室 25-羟基维生素 D状况 的准确评估。
[0099]
[0100] 实施例 4、 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒的对比实验
[0101] 分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为 O.lng /mL、 20ng /mL的 25-羟基维生素 D样品做检测， 两种方法检测灵敏度相比， 数据如下表所示
Figure imgf000012_0001
由上表可以看出， 化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了约 20 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但 并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的 普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改 进， 这些都属于本发明的保护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 其特征在于， 包括：
25-羟基维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和维生素 D衍生物 标记的化学发光标记物。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 其 特征在于， 所述 25-羟基维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中 ， 所述 25-羟基维生素 D单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的比例为 1 ： 25-35=
[权利要求 3] 根据权利要求 1所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 其 特征在于， 所述维生素 D衍生物标记的化学发光标记物中， 所述 25-羟 基维生素 D单克隆抗体与所述化学发光标记物的比例为 50: 1~10。
[权利要求 4] 根据权利要求 1所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 其 特征在于， 所述羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。
[权利要求 5] 根据权利要求 1所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 其 特征在于， 所述化学发光标记物为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或 吖啶酯。
[权利要求 6] 根据权利要求 1所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 其 特征在于， 还包括化学发光底物液， 所述化学发光底物液包括 Α液和 B液。
[权利要求 7] 根据权利要求 6所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 其 特征在于， 所述 A液为 H 20 2溶液， 所述 B液为 NaOH溶液。
[权利要求 8] 根据权利要求 1所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 其 特征在于， 还包括 25-羟基维生素 D定标品。
[权利要求 9] 根据权利要求 8所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫检测试剂盒， 其 特征在于， 所述 25-羟基维生素 D定标品为浓度分别为 0ng/mL、 10ng/ mL、 20ng/mL、 50ng/mL、 lOOng/mL和 200ng/mL的 25-羟基维生素 D 的溶液。
[权利要求 10] —种根据权利要求 1~9中任一项所述的 25-羟基维生素 D化学发光免疫 检测试剂盒的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接 着加入 EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入 25- 羟基维生素 D单克隆抗体， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到 25-羟基维生素 D单克隆抗体包被的羧基化的磁 微粒； 以及
取 25-羟基维生素 D单克隆抗体， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后加入 化学发光标记物后混匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到维生素 D衍生物标记的化学发光标记物。
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