CN109187781A - 血清型冻干粉25-羟基维生素d3和d2质量控制物质及其制备方法 - Google Patents

血清型冻干粉25-羟基维生素d3和d2质量控制物质及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种血清型冻干粉25‑羟基维生素D3和D2质量控制物质及其制备方法，该冻干粉溶液状态时各组分加入溶液后在混合物中的各自含量为：25‑羟基维生素D3 10～200ng/mL，25‑羟基维生素D2 0～200ng/mL，冻干保护剂0.5％～15％，填充剂为0.5％～15％，抗氧化剂0.1～30mmol/L，酸碱调节剂0.1～100mmol/L，防腐剂0.01％～5％。该物质具有均匀性、稳定性好，不需要低温冷冻保存，而且其可用于25‑羟基维生素D3、D2的校准品，也可用于25‑羟基维生素D3、D2的质控品等的优点。

Description

血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质及其制备 方法
技术领域
本发明涉及25-羟基维生素D3和D2质量控制物质技术领域，具体的涉及一种均匀性好、稳定性好，不需要冷冻保存的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质及其制备方法。
研究背景
维生素D(Vitamin D)是一种脂溶性维生素，为固醇类衍生物，主要生理功能是调节人体内钙、磷代谢，对促进钙的吸收、维持人体内钙浓度水平、促进和维持骨骼的正常生长和发育起重要作用。儿童缺乏维生素D会导致骨骼畸形，如出现佝偻病等；而成人缺乏维生素D会导致骨质疏松症。最近有研究证实，血清中较高浓度水平的维生素D可降低乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的发病率；较低浓度水平的维生素D也可能是一个潜在的心血管疾病危险因素。
维生素D具有几个不同于其他维生素的特点：①它是一种类固醇，其作用类似于其它类固醇激素；②当皮肤等得到足够的阳光紫外线照射后，身体就可贮存一定量的维生素D；③仅有的可转换成激素型的维生素。
目前已知的维生素D至少有10种，其中最重要的是D2和D3两种，维生素D2又称麦角钙化醇、维生素D3又称胆钙化醇，二者不能相互转化。对绝大多数人来说，阳光照射形成维生素D是维生素D3的主要来源，而维生素D2主要存在于各种食物中。这两种维生素D经血液循环进入肝脏后经25-羟化酶催化转化为较稳定的25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，总称25-羟基维生素D，然后在肝脏中进一步代谢形成具有生物学活性的1,25-双羟维生素D。人体内血液循环中的25-羟基维生素D和1,25-双羟维生素D大约有85％～88％与维生素D结合蛋白(vitamin D binding protein，DBP)结合，12％～15％与白蛋白结合，大约不到1％为游离形式。由于维生素D和1,25-双羟维生素D的半衰期相对较短(<2d)，因此，半衰期长、性质稳定的25-羟基维生素D被认为是评价体内维生素D水平的重要指标。人血液中25-羟基维生素D≤20ng/mL为缺乏，25-羟基维生素D在21～29ng/mL为相对不足，25-羟基维生素D≥30ng/mL为维生素D充足。按照此标准，国内有78％～98％的普通人群出现维生素D缺乏，其中有约30％严重不足。有研究者对5531例北京城区居民的维生素D含量水平进行研究，显示缺乏患病率高达87.1％，平均25-羟基维生素D水平仅为(12.3±7.5)ng/mL，远低于美国人(23～25)ng/mL和加拿大人的(25～31)ng/mL水平。
随着老年人年龄的增加维生素D水平不断降低，婴幼儿、儿童和适孕妇女中，人群维生素D水平亦不高，缺乏或不足所占比例达30％～98％。因此应该重视中国人群的维生素D状况。
目前市场上25-羟基维生素D试剂盒检测方法主要有酶联免疫法、荧光免疫层析法、胶体金免疫层析法、化学发光法、酶供体竞争法、克隆酶工体竞争法和液相色谱-串联质谱法等。维生素D的准确测定需要一个稳定质量控制物质来校准、监控仪器状态和试剂的好坏，虽然各种试剂盒均有配套的维生素D质控品，有冻干、液体等不同类型，而关于25-羟基维生素D3、D2质量控制物质的专利目前国内尚无相关的报道信息。
在临床检测维生素D中，由于检测样本为人血清，如果质量控制物质的基质与人血清相同或相似，就可以更好的监测实验方法的准确性和稳定性。虽然直接使用人血清作为质量控制物质用于维生素D的临床监测，但由于人血清为液体，临床实验室大多也缺少超低温保存装置，导致其不宜长久保存。目前市场上已有的25-羟基维生素D质控品，有些基质不是人血清，经加速(37.0℃)稳定性考察后稳定性也欠佳。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质，该物质具有均匀性、稳定性好，不需要低温冷冻保存，而且其可用于25-羟基维生素D3、D2的校准品，也可用于25-羟基维生素D3、D2的质控品等。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质，该冻干粉质量控制物质为：
以血清为基质按要求浓度加入25-羟基维生素D3、D2后再加入赋形剂、防腐剂等，搅拌均匀后，进行低温预冻、冷冻干燥，制备成25-羟基维生素D3、D2质量控制物质的冻干粉；
所述的赋形剂包括但不限于冻干保护剂、填充剂、抗氧化剂、酸碱调节剂，各组分加入溶液后在混合物中的各自含量为：
25-羟基维生素D3 10～200ng/mL，
25-羟基维生素D2 0～200ng/mL，
冻干保护剂0.5％～15％，
填充剂为0.5％～15％，
抗氧化剂0.1～30mmol/L，
酸碱调节剂0.1～100mmol/L，
防腐剂0.01％～5％。
本发明还提供一种上述血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，步骤包括：
(1)搜集无病毒的血清或从正常人体搜集来的、用柠檬酸盐和磷酸盐保护的混合血清在-20℃保存，并避免反复冻融；临用前先放2～8℃使其初步融化，然后室温下使之全部融化，完全解冻后混匀，依次用滤纸、0.45μm、0.22μm微孔滤膜进行过滤除去其中的杂质；
(2)在血清中添加沉淀剂或者沉淀剂与二价离子的混合物质进行沉淀、离心等澄清处理获得基质血清；
(3)取步骤(2)中基质血清加入25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的标准溶液制成特定浓度要求的血清基质25-羟基维生素D3、D2质量控制物质；
(4)取步骤(3)中制备的血清基质25-羟基维生素D3、D2质量控制物质，加入赋形剂、防腐剂等，搅拌均匀后进行低温预冻、冷冻干燥，制备成冻干粉(如需要使用将冻干粉复溶后即可使用)。
本发明上述步骤(1)无病毒如无黄疸、丙肝、乙肝、乳糜、梅毒、HIV等的血清(此步中，各血清样本需经过必要的对应的传染病筛查，结果为阴性时才能使用)；如血清长时间放置在2～8℃，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻黏连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的浑浊；因此此步骤推荐血清放-20℃保存，并避免反复冻融；临用前先放2～8℃使其初步融化，然后室温下使之全部融化，完全解冻后，上下轻轻颠倒混匀，并将所有血清混合在一起，搅拌均匀，依次用滤纸、0.45μm、0.22μm微孔滤膜进行过滤除去其中的杂质。
本发明上述步骤(1)从正常人体搜集来的、用柠檬酸盐和磷酸盐保护的混合血清，使用前需将血清用5g/L～9g/L的NaCl溶液进行透析，以除去多余的小分子酸性化合物和金属离子螯合剂，同时也可以使血清pH值恢复到正常水平、使用一些碱性溶液，如NaOH溶液(1～6mol/L)将血清pH调至7.4～8.0。
本发明上述步骤(2)因血清中存在很多不同的组分，有些成分特别是脂蛋白在经过反复冻融或冻干、再复溶时会出现结构上的变化，导致样本浑浊，澄清度不佳；该步骤采用添加沉淀剂进行化学沉淀处理，常用的沉淀剂为聚阴离子/多阴离子(如磷钨酸(PTA)、硫酸葡聚糖(DS)、盐酸葡聚糖、肝素)或非离子多聚体(如聚乙二醇(PEG)；或者是上述的沉淀剂即聚阴离子/多阴离子、非离子多聚体等中的一种与某些二价阳离子(Mg2+、Ca2+、Mn2+)联合使用。
本发明上述步骤(2)所使用的沉淀剂用量，其中磷钨酸(PTA)、硫酸葡聚糖、盐酸葡聚糖、肝素或非离子多聚体如PEG等一般在0～10g/L之间(此处的浓度是指添加到血清中之后的浓度，按血清体积加入一定质量的沉淀剂)，二价阳离子(Mg2+、Ca2+、Mn2+)的浓度在0～100mmol/L；上述浓度范围可有效地将脂蛋白除去，同时得到含绝大部分其他组分的血清基质。
本发明上述步骤(2)加入沉淀剂或沉淀剂与二价离子的混合物质，则加入后需要放置30min～72h，使血清中一些脂蛋白充分沉淀下来，然后经离心至少10min，温度在10～20℃，将血清中产生的沉淀聚集在离心管底部，取上部澄清血清备用；如果为上述的沉淀剂与二价阳离子混合使用，则经离心后的血清还需进行透析或化学沉淀的方法再处理、用以将二价金属离子恢复到正常血清浓度水平；如果用透析则直接进入下一步处理即步骤(3)的处理步骤；如果采用化学沉淀的方法则需再次离心，将血清中产生的沉淀弃去，取上部澄清血清(基质血清或血清基质)备用；透析为将得到的基质血清于5～10g/L的NaCl、缓冲液中进行透析，直至其浓度降至正常浓度水平；化学沉淀则是添加化学沉淀剂如碳酸钠、硫化钠、磷酸盐、草酸、氢氧化钠等试剂溶液将多余的金属离子进行沉淀，混匀，充分放置30min～72h，经离心(不小于3000r/min)至少10min，温度在10～20℃，可将产生的沉淀聚集在离心管底部，取上部血清备用。
因搜集的临床血清25-羟基维生素D3的水平一般在15～20ng/mL，而25-羟基维生素D2含量则很低，一般在0～5ng/mL，取上述步骤(2)中的基质血清加入一定量25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的标准溶液而制成特定浓度要求的血清基质25-羟基维生素D3、D2质量控制物质。因25-羟基维生素D3、D2纯品均为脂溶性而非水溶性，其标准溶液应先经氮气吹干除去有机溶剂后，再将基质血清加入，搅拌至少4小时，保证25-羟基维生素D3、D2充分溶解在基质血清中。溶解过程中，应避光防止25-羟基维生素D3、D2分解变质，从而影响25-羟基维生素D3、D2质量控制物质的质量性能指标。
本发明上述步骤(4)中的赋形剂包括但不限于冻干保护剂、填充剂、抗氧化剂、酸碱调节剂等，各组分加入溶液后在混合物中各自含量为：冻干保护剂0.5％～15％，填充剂为0.5％～15％，抗氧化剂0.1～30mmol/L，酸碱调节剂0.1～100mmol/L，防腐剂0.01％～5％。
本发明上述步骤(4)中的冻干保护剂为甘油、二甲基亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、人血清白蛋白、葡萄糖、果糖、表面活性剂和多聚物等中的一种或多种组合。
本发明上述步骤(4)中的填充剂为明胶、甘露醇、PEG 4000、山梨醇等中的一种或多种组合。
本发明上述步骤(4)中的抗氧化剂(还原保护剂)为维生素E、抗坏血酸盐、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠等中的一种或多种组合。
本发明上述步骤(4)中的酸碱调节剂为甘氨酸、精氨酸、丙氨酸等氨基酸类中的一种或多种组合。
本发明上述步骤(4)中的防腐剂为苯甲酸及其盐类、叠氮钠、山梨酸及其盐类、proclin 300等中的一种或多种组合。
本发明上述步骤(4)中的低温预冻为在-40～-70℃条件下，预冻至少3小时以上将冻干品预冻成型。
本发明上述步骤(4)中冷冻干燥的条件为第一次干燥阶段的升温速率采用3～5℃每小时，持续20～30小时，第二次干燥阶段的升温速率采用5～15℃每小时，持续10～30小时。
本发明的优点和有益效果：
1.按本发明方法制备的25-羟基维生素D3、D2质量控制物质均匀性、稳定性良好，测值准确，能有效监控临床检验中仪器和试剂状态，保证临床监测的准确度；质量控制物质复溶性良好，加水后在10min内即可溶解完全，样本溶液澄清无浑浊；因用血清为基质，所以本发明25-羟基维生素D3、D2质量控制物质可适用于25-羟基维生素D液相色谱-串联质谱试剂盒、酶联免疫法、荧光免疫层析法、胶体金免疫层析法、化学发光法、酶供体竞争法等其他方法检测25-羟基维生素D3的试剂盒。
2.本发明的25-羟基维生素D3、D2质量控制物质，克服传统的25-羟基维生素D3、D2质量控制物质不稳定，不易长时间保存的缺点；该物质具有均匀性、稳定性好，不需要低温冷冻保存，而且其可用于25-羟基维生素D3、D2的校准品，也可用于25-羟基维生素D3、D2的质控品等。
3.本发明的冷冻干燥采用两次干燥：第一次干燥也称升华干燥，即在低温真空状态下一般是从预冻温度开始升温，将已预冻好的样本中的水分除去，因在低温状态下可保持血清样本中的蛋白质、酶等的活性，样本中大部分的水尽量在此阶段除去；第二次干燥也称解析干燥，其上升温度即为第一次干燥结束时的温度，然后开始升温，除去样本中剩余的少量水，针对本发明升温一般升到20～25℃，不能过高；比如预冻温度是-50℃，第一次干燥阶段到-30℃结束，升温速率按5℃/h，升至某一温度需要维持一定的时间，比如从-50℃升到-45℃，升温需要1个小时，升至-45℃后需维持一定时间，比如说在-45℃维持7～10个小时，之后再继续升温；因此本发明上述第一阶段和第二阶段持续时间是由升温时间和维持时间共同作用所需要的时间。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于以下几种实例：
搜集无黄疸、乳糜，经传染病筛查结果为阴性(丙肝、乙肝、梅毒、HIV等传染病检测结果为阴性)的血清样本，混匀，分别用滤纸、0.22μm、0.45μm微孔滤膜过滤后备用。
制备100支，规格为1.0mL/支的25-羟基维生素D3、D2质量控制物质，其中25-羟基维生素D3含量为25ng/mL、25-羟基维生素D2含量为20ng/mL。
实例1
(1)基质血清的制备
量取100mL备用血清，称取磷钨酸，使其在血清中的最终浓度为(PTA沉淀剂)1.0g/L，先用少量纯化水溶解后，多次少量加入血清中，低速搅拌均匀；然后称取适量氯化镁(引入二价阳离子)加入，使Mg2+浓度达到30mmol/L，低速搅拌，放置12小时后，离心3000r/min、10min，温度10℃，取上层无沉淀血清备用。
将血清装进洗净的透析袋中并放于6g/L NaCl、磷酸盐缓冲液(15mmol/L)中进行透析，透析时间48小时，中间更换透析液6-8次，使血清中Mg2+浓度水平恢复到血清正常水平范围内(成人体内含镁0.823-1.234mol)。
(2)添加25-羟基维生素D3、D2标准溶液
对该血清内的25-羟基维生素D3、D2采用液相色谱-串联质谱法进行检测，并根据质量控制物质要求浓度水平计算添加25-羟基维生素D3、D2标准溶液的体积。
准备一个干净的容器，先将所需添加的25-羟基维生素D3、D2标准溶液加入到该容器中，用氮气吹干，再将100mL经过步骤(1)处理好的血清加入其中，室温避光、低速搅拌5小时使25-羟基维生素D3、D2充分溶解到血清中。
(3)向步骤(2)的血清中加入海藻糖(冻干保护剂)3.0g、山梨醇(填充剂)4.0g，甘氨酸(酸碱调节剂)100mg、抗坏血酸钠(抗氧化剂或称还原剂)0.4g、Proclin-300(防腐剂)50μL，搅拌均匀后，分装。于-60℃低温预冻4小时，然后进行冷冻干燥：第一次干燥阶段采用升温速率4℃/h、持续30h，第二次干燥阶段采用15℃/h升温速率，持续10小时，真空压盖，得到冻干粉；第二阶段的升温一般升到20～25℃。
实例2
1、基质血清的制备
量取100mL备用血清，称取硫酸葡聚糖，使其在血清中的浓度达到1.2g/L，先用少量纯化水溶解后，多次少量的加入血清中，低速搅拌均匀；然后称取适量四水合氯化锰，使Mn2+浓度达到50mmol/L，低速搅拌，放置8小时后，离心5000r/min、10min，温度10℃，取上层无沉淀血清备用。
将血清装进洗净的透析袋中并放于9g/L NaCl、醋酸盐缓冲液(10mmol/L)中进行透析，透析时间48小时，中间更换透析液9-10次，使血清中Mn2+浓度水平恢复到血清正常水平范围内。
2、添加25-羟基维生素D3、D2标准溶液
对该基质血清内的25-羟基维生素D3、D2采用液相色谱-串联质谱法进行检测，并根据质量控制物质要求浓度水平计算添加25-羟基维生素D3、D2标准溶液的体积。
准备一个干净的容器，先将所需添加的25-羟基维生素D3、D2标准溶液加入到该容器中，用氮气吹干，再将100mL处理好的血清加入其中，室温避光、低速搅拌4小时使25-羟基维生素D3、D2充分溶解到血清中。
3、向步骤2中的血清加入果糖(冻干保护剂)5.0g、明胶(填充剂)6.0g，丙氨酸(酸碱调节剂)60mg、硫代硫酸钠(抗氧化剂)0.3g、苯甲酸钠(防腐剂)0.05g，搅拌均匀后，分装。于-50℃低温预冻5小时，第一次干燥阶段采用升温速率5℃/h，持续25h；第二次干燥阶段采用10℃/h升温速率，持续15小时，真空压盖，得到冻干粉；第二阶段的升温一般升到20～25℃。
实例3
1、基质血清的制备
量取100mL备用血清，称取适量肝素钠，使其在血清中的浓度达到1.5g/L，先用少量纯化水溶解后，多次少量的加入血清中，低速搅拌均匀；然后称取适量氯化镁，使Mg2+浓度达到60mmol/L，低速搅拌，放置6小时后，离心4000r/min、10min，温度10℃，取上层无沉淀血清备用。
称取碳酸钠0.35g，用少量纯化水溶解后，少量多次加入血清中，可使血清中多余的Mg2+沉淀下来，低速搅拌、静置2h后，离心，取上层血清混匀备用。
2、添加25-羟基维生素D3、D2标准溶液
对该基质血清内的维生素D3、D2采用液相色谱-串联质谱法进行检测，并根据质量控制物质要求浓度水平计算添加25-羟基维生素D3、D2标准溶液的体积。
准备一个干净的容器，先将所需添加的25-羟基维生素D3、D2标准溶液加入到该容器中，用氮气吹干，再将100mL处理好的血清加入其中，室温避光、低速搅拌5小时使D3、D2充分溶解到血清中。
3、向步骤2中的血清加入人血清白蛋白(冻干保护剂)6.0g，甘露醇(填充剂)7.0g，丙氨酸(酸碱调节剂)60mg、亚硫酸钠(抗氧化剂)0.3g、叠氮钠(防腐剂)0.05g，搅拌均匀后，分装。于-40℃低温预冻6小时，第一次干燥阶段采用升温速率5℃/h，持续25h；第二次干燥阶段采用10℃/h升温速率，持续15小时，真空压盖，得到冻干粉；第二阶段的升温一般升到20～25℃。
维生素D冻干质量控制物质均匀性、稳定性考察
取得到的25-羟基维生素D3、D2冻干粉，随机抽取10瓶，准确加入1.0mL纯化水，并用液相色谱-串联质谱法进行检测，计算25-羟基维生素D3、D2测量结果的平均值(X1)分别为22.68、18.16，标准差(S1)分别为0.8753、0.6835，结果如表1所示。
表1维生素D冻干质量控制物质均匀性考察(单位：ng/mL)
将上述质量控制物质任取3瓶混匀，连续测定10次，计算D3、D2测量结果的平均值(X2)分别为22.42、17.79，标准差(S2)分别为0.6286、0.4977，结果如表2所示。
表2维生素D质量控制物质3瓶混匀后测量结果(单位：ng/mL)
按照下列公式计算瓶间重复性CV％：
当S1<S2时，令CV瓶间＝0
式中：为平均差
S为标准差
n为测量次数
Xi为指定参数第i次测量值
经计算，本方法制备的维生素D质量控制物质D3、D2的瓶间S瓶间分别为0.609、0.468，D3、D2对应的重复性CV瓶间分别为2.7％、2.6％，小于7％。
取冻干粉6瓶，放37℃水浴中，经3天、5天、7天后分别取出2瓶，复溶，对25-羟基维生素D3、D2进行检测，每瓶检测2次，结果详见表3。
表3 25-羟基维生素D3、D2质量控制物质37℃加速稳定性考察结果(单位ng/mL)
从表3的数据可看出，本发明制备的25-羟基维生素D3、D2质量控制物质在37℃加速稳定性考察后7天仍稳定，表明本发明该质量控制物质质量稳定并可存放较长时间(2～8℃可存放1年)。
实例所用的原料，除另有说明外，均为市售商业产品。
以上实例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权力范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质，其特征在于：该冻干粉质量控制物质为：以血清为基质按要求浓度加入25-羟基维生素D3、D2后再加入赋形剂、防腐剂，搅拌均匀后，进行低温预冻、冷冻干燥，制备成25-羟基维生素D3、D2质量控制物质的冻干粉：
所述的赋形剂包括但不限于冻干保护剂、填充剂、抗氧化剂、酸碱调节剂，各组分加入溶液后在混合物中的各自含量为：
25-羟基维生素D3 10～200ng/mL，
25-羟基维生素D2 0～200ng/mL，
冻干保护剂0.5％～15％，
填充剂为0.5％～15％，
抗氧化剂0.1～30mmol/L，
酸碱调节剂0.1～100mmol/L，
防腐剂0.01％～5％。
2.根据权利要求1所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤包括：
(1)搜集无病毒血清或从正常人体搜集来的、用柠檬酸盐和磷酸盐保护的混合血清在-20℃保存，并避免反复冻融；临用前先放2～8℃使其初步融化，然后室温下使之全部融化，完全解冻后混匀，依次用滤纸、0.45μm、0.22μm微孔滤膜进行过滤除去其中的杂质；
(2)在血清中添加沉淀剂或者沉淀剂与二价离子的混合物质进行沉淀、离心澄清处理获得基质血清；
(3)取步骤(2)中基质血清加入25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的标准溶液制成特定浓度要求的血清基质25-羟基维生素D3、D2质量控制物质；
(4)取步骤(3)中制备的血清基质25-羟基维生素D3、D2质量控制物质，加入赋形剂、防腐剂等，搅拌均匀后进行低温预冻、冷冻干燥，制备成冻干粉。
3.根据权利要求2所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(1)从正常人体搜集来的、用柠檬酸盐和磷酸盐保护的混合血清，使用前需将血清用5g/L～9g/L的NaCl溶液进行透析，和/或为了使血清pH值恢复到正常水平、使用碱性溶液将血清pH调至7.4～8.0。
4.根据权利要求2所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(2)添加沉淀剂或者沉淀剂与二价离子的混合物质后，则放置30min～72h，然后温度在10～20℃经离心至少10min，将血清中产生的沉淀聚集在离心管底部，取上部澄清血清备用。
5.根据权利要求2所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(2)所使用的沉淀剂为磷钨酸、硫酸葡聚糖、盐酸葡聚糖、肝素或PEG中的一种，其浓度为0～10g/L；所述的二价阳离子为Mg2+、Ca2+或Mn2+，其浓度在0～100mmol/L。
6.根据权利要求3所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：
步骤(2)添加的为沉淀剂，则在加入后放置30min～72h，经离心至少10min，温度在10～20℃，将血清中产生的沉淀聚集在离心管底部，取上部澄清血清备用；
步骤(2)添加的为沉淀剂与二价阳离子混合，则经离心后的血清需进行透析或化学沉淀的方法再处理；
透析为将得到的基质血清于5～10g/L的NaCl、缓冲液中进行透析，直至其浓度降至正常浓度水平直接进入下一步处理即步骤(3)的处理步骤；
化学沉淀则是添加化学沉淀剂：碳酸钠、硫化钠、磷酸盐、草酸、氢氧化钠中的一种或多种的试剂溶液将多余的金属离子进行沉淀，混匀；然后放置30min～72h，经离心至少10min，温度在10～20℃，将产生的沉淀聚集在离心管底部，取上部血清备用。
7.根据权利要求3所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的标准溶液先经氮气吹干除去有机溶剂后，再将基质血清加入，搅拌至少4小时。
8.根据权利要求3所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(4)中的赋形剂包括但不限于冻干保护剂、填充剂、抗氧化剂、酸碱调节剂；各组分加入溶液后在混合物中各自含量为：冻干保护剂0.5％～15％，填充剂为0.5％～15％，抗氧化剂0.1～30mmol/L，酸碱调节剂0.1～100mmol/L，防腐剂0.01％～5％。
9.根据权利要求8所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(4)中的冻干保护剂为甘油、二甲基亚砜、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、人血清白蛋白、葡萄糖、果糖、表面活性剂和多聚物中的一种或多种组合；步骤(4)中的填充剂为明胶、甘露醇、PEG 4000、山梨醇中的一种或多种组合；步骤(4)中的抗氧化剂为维生素E、抗坏血酸盐、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠中的一种或多种组合；步骤(4)中的酸碱调节剂为甘氨酸、精氨酸、丙氨酸中的一种或多种组合；步骤(4)中的防腐剂为苯甲酸及其盐类、叠氮钠、山梨酸及其盐类、proclin 300中的一种或多种组合。
10.根据权利要求8所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(4)中的低温预冻为在-40～-70℃条件下，预冻至少3小时以上将冻干品预冻成型；步骤(4)中冷冻干燥的条件为第一次干燥阶段的升温速率采用3～5℃每小时，持续20～30小时，第二次干燥阶段的升温速率采用5～15℃每小时，持续10～30小时。
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