CN114279778A - 一种复合高值参考品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合高值参考品的制备方法，包括以下步骤：S1：向混合血清加入氯化钙溶液和硫酸葡聚糖溶液，4℃静置过夜，次日离心去除上清，向沉淀中加入草酸钾缓冲液，混匀充分，二次离心去除沉淀，收集上清透析，获得复合高值参考品的粗品；S2：加入保护剂，混匀，保护剂成份为柠檬酸三钠，海藻糖，硫代硫酸钠，山梨醇和丙氨酸；S3：利用冻干机内冻干，得复合高值参考品最终产物。复合高值参考品添加了保护剂，使复合物在液体状态下或者冻干后稳定后更加好，冻融不易出现沉淀，且无基质效应；用于配制对应的载脂蛋白A1、载脂蛋白B和脂蛋白a三项的检测校准品或参考品，在试剂检测的应用中具有良好的检测性能，检测精度高，响应效果好。

Description

一种复合高值参考品的制备方法

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种载脂蛋白A1、载脂蛋白B和脂蛋白a三项的复合高值参考品的制备方法，用于配制对应的检测校准品或质控品。

背景技术

临床上，脂蛋白三项血清载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)和脂蛋白a(Lpa)测定常被用于心脑血管病的风险度评估、药物治疗的疗效监察以及异常脂蛋白血症的诊断，目前国际和国内通用的血清ApoA1、ApoB和Lpa测定试剂盒，均采用免疫比浊法，因其快速、准确、精密并适用于各种类型的自动生化分析仪，特别适用于临床实验室作大批量标本的测定。但测定时需釆用多点作非线性校准，市场上大多数原料都存在基质效应，目前校准品的大多来源为人的样品混合物，如混合血清，因此需要一个稳定的复合高值参考品用来配制校准品或者质控品。

传统的方法是将健康人的混合血清直接进行超速离心，将血清通过多次超速离心后进行分离提纯，之后将提纯后的校准物质冷冻干燥，在低温下保存。这种方法不仅离心次数多，耗时长，而且冻干后的校准物复溶时，在高温及反复冻融条件下会引起部分分析物质被破坏，溶液易浑浊，稳定性一般，也会出现一定的基质效应。如果不注意使用会导致校准结果偏高，实际测得病人标本结果会影响临床判断。国外知名诊断试剂公司像罗氏诊断以及朗道公司研发的血脂校准品，稳定时间长，准确度好，产品可溯源性强，但价格较贵。临床中综合考虑到成本、操作等因素，中小医院使用起来不是很方便。

因此，有必要研发出一种在液体状态稳定，冻干后保存期限更长，使用起来更方便的载脂蛋白A1、载脂蛋白B和脂蛋白a三项的复合高值参考品。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种载脂蛋白A1、载脂蛋白B和脂蛋白a三项的复合高值参考品的制备方法，所制得的复合高值参考品，液体状态稳定，冻干后保存期限长。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该复合高值参考品的制备方法，包括以下步骤：

S1：向混合血清中加入质量体积比为0.5％-1.5％的氯化钙溶液和0.5％-1.5％的硫酸葡聚糖溶液，加入量分别为50μL/L血清；4℃静置过夜，次日离心去除上清，向沉淀中加入质量体积比为3％-6％的草酸钾缓冲液，加入量为100μl/L血清，混匀充分，二次离心去除沉淀，收集上清透析，获得复合高值参考品的粗品。

上述技术方案制备得到的复合高值参考品，添加保护剂，使复合物在液体状态下或者冻干后稳定后更加好，冻融不易出现沉淀，且无基质效应；用于配制对应的载脂蛋白A1、载脂蛋白B和脂蛋白a三项校准品，在试剂检测的应用中具有良好的检测性能，检测精度高，响应效果好。

优选的，还包括有以下步骤：

S2：加入保护剂，混匀，保护剂成份为柠檬酸三钠，海藻糖，硫代硫酸钠，山梨醇和丙氨酸。

优选的，还包括有以下步骤：

S3：利用冻干机内冻干，得复合高值参考品最终产物。

优选的，将所述步骤S3中制备得到的复合高值参考品配制对应的载脂蛋白A1、载脂蛋白B和脂蛋白a的校准品或质控品。

优选的，在所述步骤S1中，4℃静置过夜的时间为10-16小时。

优选的，在所述步骤S2中，所述保护剂的成份为0.5％的柠檬酸三钠，1％的海藻糖，1％的硫代硫酸钠，2.5％的山梨醇和8％的丙氨酸，均为质量体积比。

优选的，在所述步骤S3中，冻干后的复合高值参考品最终产物37℃放置。

优选的，还包括有以下步骤：

S3：加入保护剂后，在37℃储存。

优选的，还包括有以下步骤：

S3：加保护剂冻干后复溶在4℃储存。

与现有技术相比：本发明的混合血清均通过乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒表面抗体以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体检测，且检测结果须呈阴性，确认无毒无害，在进行测定时不会对被测定者造成损害，提高了生物安全性。且做出来的复合高值参考品基质效应小，不管是在冻干或者液体状态下稳定性都非常好，活性浓度高，可满足临床上需要，稀释成不同梯度的校准品或者质控品，能够提高测定样本中载脂蛋白A1、载脂蛋白B和脂蛋白a含量测定的准确性。

附图说明

下面结合附图和本发明的实施方式进一步详细说明：

图1是实施方案一中复合高值参考品中载脂蛋白B的性能验证相关性分析图；

图2是实施方案一中复合高值参考品中载脂蛋白A1的性能验证相关性分析图；

图3是实施方案一中复合高值参考品中脂蛋白a的性能验证相关性分析图。

具体实施方式

本发明的复合高值参考品的制备方法，包括以下步骤：

S1：向混合血清中加入质量体积比为0.5％-1.5％的氯化钙溶液和0.5％-1.5％的硫酸葡聚糖溶液，加入量分别为50μL/L血清；4℃静置过夜，次日离心去除上清，向沉淀中加入质量体积比为3％-6％的草酸钾缓冲液，加入量为100μl/L血清，混匀充分，二次离心去除沉淀，收集上清透析，获得复合高值参考品的粗品；

S2：加入保护剂，混匀，保护剂成份为柠檬酸三钠，海藻糖，硫代硫酸钠，山梨醇和丙氨酸；

S3：利用冻干机内冻干，得复合高值参考品最终产物。

步骤S3中冻干程序参数如下表1所示：

表1

将所述步骤S3中制备得到的复合高值参考品配制对应的载脂蛋白A1、载脂蛋白B和脂蛋白a的校准品或质控品；在所述步骤S1中，4℃静置过夜的时间为10-16小时；在所述步骤S2中，所述保护剂的成份为质量体积比为0.5％的柠檬酸三钠，1％的海藻糖，1％的硫代硫酸钠，2.5％的山梨醇和8％的丙氨酸。

其中，在所述步骤S3中，冻干后的复合高值参考品最终产物37℃放置；

或S3：加入保护剂后，在37℃储存；或S3：加保护剂冻干后复溶在4℃储存。

实施方案一：直接采用步骤S1得到的复合高值参考品的粗品，即向混合血清加入质量体积比为1％的氯化钙和1％的硫酸葡聚糖溶液，加入量分别为50μL/L血清；4℃静置过夜，次日离心去除上清，向沉淀中加入质量体积比为5％的草酸钾溶液，加入量为100μl/L血清，混匀充分，二次离心去除沉淀，收集上清透析，获得脂蛋白三项的复合高值参考品的粗品。利用四川迈克生物科技股份有限公司的免疫比浊法检测试剂盒和日立7060的全自动生化分析仪设备检测步骤S1得到的复合高值参考品的粗品活性浓度。

脂蛋白三项的复合高值参考品的各项目的活性浓度检测数据如下表2所示：

表2

对脂蛋白三项的复合高值参考品进行浓度梯度稀释，分别对三个项目的稀释液进行吸光度OD值测定。

其中，针对载脂蛋白B，得到的数据如下表3所示：

表3

稀释度溶液浓度与吸光度值的相关性分析如图1所示。

其中，针对载脂蛋白A1，得到的数据如下表4所示：

表4

稀释度溶液浓度与吸光度值的相关性分析如图2所示。

其中，针对脂蛋白a，得到的数据如下表5所示：

表5

稀释度溶液浓度与吸光度值的相关性分析如图3所示。

结论：方案一制备的脂蛋白复合高值参考品的载脂蛋白A1、载脂蛋白B、脂蛋白a浓度分别是4.51、6.92、1.35g/L，各项目的浓度都高于参考范围的检测上限；进行梯度稀释后，各项目的稀释度溶液浓度与吸光度值的相关性都大于0.99，性能稳定，可以作为高值参考品应用。

实施方案二：向实施方案一获得的粗品中加入保护剂，混匀，保护剂成份为质量体积比为0.5％的柠檬酸三钠，1％的海藻糖，1％的硫代硫酸钠，2.5％的山梨醇和8％的丙氨酸，即增加步骤S2。

在37℃条件下，利用试剂盒监测脂蛋白三项的复合高值参考品的稳定性性能。

监测到的数据如下表6所示：

表6

结论：加入保护剂的情况下，降幅均小于10％，说明在保护剂的作用下，脂蛋白三项的复合高值参考品性能稳定性都非常好。

实施方案三：将方案二的加入了保护剂的样品利用东富龙的机器进行冻干，即增加步骤S3。

分为两个实验监测脂蛋白三项的复合高值参考品的稳定性性能，一是将冻干品复溶(加入1mL纯水复溶)后在4℃条件下放置，利用试剂盒监测15天的稳定性性能；二是冻干品直接在37℃条件下放置，利用试剂盒监测15天的稳定性性能，每次实验时将冻干品复溶测定。

监测到的数据如下表7和表8所示：

表7

表8

结论：利用冻干技术进行冻干，不论是复溶后以液态储存还是直接以冻干品形态储存，脂蛋白三项的复合高值参考品的性能稳定性依然非常好，各项目的降幅均小于15％，说明不管是液体状态还是冻干状态稳定性都是达标的，可以作为复合高值参考品应用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种复合高值参考品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：向混合血清中加入质量体积比为0.5％-1.5％的氯化钙溶液和0.5％-1.5％的硫酸葡聚糖溶液，加入量分别为50μL/L血清；4℃静置过夜，次日离心去除上清，向沉淀中加入质量体积比为3％-6％的草酸钾缓冲液，加入量为100μl/L血清，混匀充分，二次离心去除沉淀，收集上清透析，获得复合高值参考品的粗品。

2.根据权利要求1所述的复合高值参考品的制备方法，其特征在于，还包括有以下步骤：S2：加入保护剂，混匀，保护剂成份为柠檬酸三钠，海藻糖，硫代硫酸钠，山梨醇和丙氨酸。

3.根据权利要求2所述的复合高值参考品的制备方法，其特征在于，还包括有以下步骤：S3：利用冻干机内冻干，得复合高值参考品最终产物。

4.根据权利要求1-3任一项所述的复合高值参考品的制备方法，其特征在于，将所述步骤S3中制备得到的复合高值参考品配制对应的载脂蛋白A1、载脂蛋白B和脂蛋白a的校准品或质控品。

5.根据权利要求1-3任一项所述的复合高值参考品的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1中，4℃静置过夜的时间为10-16小时。

6.根据权利要求2或3所述的复合高值参考品的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述保护剂的成份为0.5％的柠檬酸三钠，1％的海藻糖，1％的硫代硫酸钠，2.5％的山梨醇和8％的丙氨酸，均为质量体积比。

7.根据权利要求3所述的复合高值参考品的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，冻干后的复合高值参考品最终产物37℃放置。

8.根据权利要求1或2所述的复合高值参考品的制备方法，其特征在于，还包括有以下步骤：S3：加入保护剂后，在37℃储存。

9.根据权利要求1或2所述的复合高值参考品的制备方法，其特征在于，还包括有以下步骤：S3：加保护剂冻干后复溶在4℃储存。

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