CN110567780A

CN110567780A - 一种糖化血红蛋白质控品及其制备方法

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Publication number: CN110567780A
Application number: CN201910960400.XA
Authority: CN
Inventors: 李俊; 彭伟; 邹丽洁; 冯巧芳; 林滔
Original assignee: WUXI CITY KAIAOSHAN BIOPHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd; WUXI BOHUISI BIO-PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUXI CITY KAIAOSHAN BIOPHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd; WUXI BOHUISI BIO-PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2019-12-13

Abstract

本发明涉及一种糖化血红蛋白质控品及其制备方法，制备所述血红蛋白质控品时使用的冻干保护液中包含缓冲盐、防腐剂、还原剂和冻干保护剂，所述还原剂为还原型谷胱甘肽或二硫苏糖醇。所述冻干保护液制备方法简单，可以提高糖化血红蛋白质控品在常温下的稳定性，因此制备得到的血红蛋白质控品可以在常温下保存一段时间，其测试值不会发生显著的变化，作为质控品可靠度较高，同时便于运输，不再要求全程冷链运输，降低运输成本。

Description

一种糖化血红蛋白质控品及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及血红蛋白质控品领域，尤其涉及一种糖化血红蛋白质控品及其制备方法。

背景技术

糖化血红蛋白(Glycated hemoglobin，GHb)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类相结合的产物，包括HbA1a、HbA1b、HbA1c，其中HbA1c约占70％,。GHb是通过缓慢、持续及不可逆的糖化反应形成，其含量的多少取决于血糖浓度以及血糖与血红蛋白接触时间，而与抽血时间、患者是否空腹、是否使用胰岛素等因素无关。因此，GHb可有效地反映糖尿病患者检测前一段时间内的血糖情况，是在临床上广泛应用的用于评估糖尿病人长期血糖控制水平的一项检测指标。

质控品是一类在临床检验工作中广泛应用的物质，其作用是评估体外诊断设备及试剂的性能是否符合预先设置的标准。临床检验中要求糖化血红蛋白质控品必须覆盖正常测试范围及异常测试范围，对于GHb，非糖尿病病人的测试结果一般在4％-6.5％，糖尿病病人的测试结果一般在6.5％-14％，因此糖化血红蛋白质控品生产厂家通常会提供不同水平的质控品，低水平质控品的测试值在4％-6％左右，落在非糖尿病病人的测试结果范围内，高水平质控品的测试值在8％-10％左右，落在糖尿病病人的测试结果范围内。

糖化血红蛋白质控品的制备以人全血为原料，经过离心、洗涤、破碎细胞，去除杂质及冻干等多个步骤制成。首先，对血液样本进行离心处理，获得红细胞。利用细胞洗涤液对所述红细胞进行洗涤，形成红细胞悬液。在洗涤后的红细胞加入反应液进行糖基化，当糖基化过程中糖化血红蛋白的浓度达到所需的质控物浓度时，利用细胞洗涤液对糖基化处理后的红细胞悬液进行洗涤和去糖基化；在去糖基化的红细胞悬液中加入稳定剂、冻干保护剂，制成液体或冻干的糖化血红蛋白质控物。

CN109400701A公开了一种冻干态糖化血红蛋白质控品的制备方法，以正常人红细胞为原料直接制备低水平糖化血红蛋白质控品；再以正常人或糖尿病患者红细胞为原料，通过离子亲和层析法制备高浓度、高纯度的HbA1c，取一定量纯化的HbA1c添加到低水平质控品中，得到高水平糖化血红蛋白质控品；最后将低水平和高水平质控品按比例混合，调配得到中水平糖化血红蛋白质控品，然后分别加入一定量防腐剂和冻干保护剂，通过真空冷冻干燥即得到性质稳定的低、中、高冻干态糖化血红蛋白质控品。此发明方法简单，三水平梯度明显，制备的高、中、低三个水平质控品性质稳定。由于糖化血红蛋白质控品为人血红蛋白的冻干制剂，本质上属于生物大分子，因此其保存一般要求在2～8℃环境下保存及运输，温度条件要求较为严苛。

目前商业化的糖化血红蛋白质控品，产品形式一般为冻干粉，在2～8℃下可以稳定保存12～18个月。运输时要求全程在冷链中进行，运输成本高昂，存储也需要在低温环境下进行。在常温环境下的短时间暴露，往往就会使糖化血红蛋白质控品的测试值发生显著的变化，因而影响其作为质控品的功能。

因此本发明要解决的技术问题是糖化血红蛋白冻干质控品如何在常温下保持一段时间稳定的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种冻干保护液，能够显著提高糖化血红蛋白冻干质控品在常温下的稳定性，使用本发明提供的冻干保护液与制备方法得到的糖化血红蛋白质控品可以在30℃下保存7天，在37℃下保存4天。

第一方面，本发明提供了一种糖化血红蛋白质控品的制备方法，所述方法包括如下步骤：向血红蛋白上清溶液中加入冻干保护液，分装至冻干瓶中，冻干后得到所述糖化血红蛋白质控品；所述冻干保护液中包含缓冲盐、防腐剂、还原剂和冻干保护剂，所述还原剂为还原型谷胱甘肽或二硫苏糖醇。

本发明提供的制备方法简单，能够减缓糖化血红蛋白在常温下的变性过程，提高糖化血红蛋白冻干质控品的稳定性。

作为本发明一种优选的技术方案，所述还原型谷胱甘肽在冻干保护液中的质量浓度为0.5～3％，例如可以是0.5％、0.8％、1％、1.5％、1.8％、2％、2.5％或3％。

优选地，所述二硫苏糖醇在冻干保护液中的质量浓度为0.3～2％，例如可以是0.3％、0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％或2％。

作为本发明一种优选的技术方案，所述冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮或甘油中的任意一种或两种以上的组合，优选为海藻糖。

优选地，所述海藻糖在冻干保护液中的质量浓度为3～10％，例如可以是3％、3.5％、4％、5％、5.5％、6％、7％、8％、9％或10％。

作为本发明一种优选的技术方案，所述缓冲盐为三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸或2-(N-吗啡啉)乙磺酸钠中的任意一种或两种以上的组合；

优选地，所述冻干保护液的pH值为6.8～7.4，例如可以是6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4。

优选地，所述防腐剂为叠氮钠、苯甲酸钠、山梨酸钾或Procline 300中的任意一种或两种以上的组合，优选为叠氮钠。

作为本发明一种优选的技术方案，所述血红蛋白上清溶液与冻干保护液的体积比为1:(1～3)，例如可以是1:1、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.4、1:2.8或1:3。

作为本发明一种优选的技术方案，所述血红蛋白上清溶液的制备方法包括如下步骤：采集人新鲜静脉血，离心得到红细胞，加入生理盐水漂洗，得到洗净的红细胞，在所述洗净的红细胞中加入低渗液，搅拌，离心后得到所述血红蛋白上清溶液。其中，以血浆的正常渗透压(7.6个大气压或5776毫米汞柱)为标准，低于血浆正常渗透压的溶液则称为低渗液。

作为本发明一种优选的技术方案，所述人新鲜静脉血的糖化血红蛋白值为4～6％或8～10％。

优选地，所述低渗液为氯化钠溶液。

优选地，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.15～0.35％，例如可以是0.15％、0.18％、0.2％、0.22％、0.25％、0.3％、0.32％或0.35％。

作为本发明一种优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：采集人新鲜静脉血，所述的人新鲜静脉血的糖化血红蛋白值为4～6％或8～10％，离心得到红细胞，加入生理盐水漂洗2～3次，得到洗净的红细胞，在所述洗净的红细胞中加入0.15～0.35％氯化钠溶液，搅拌，离心后得到血红蛋白上清溶液；

向血红蛋白上清溶液中加入冻干保护液，分装至冻干瓶中，冻干后得到糖化血红蛋白质控品，所述冻干保护液中包含质量浓度为0.5～3％的还原型谷胱甘肽或质量浓度为0.3～2％的二硫苏糖醇，还包含海藻糖、防腐剂和缓冲盐，所述冻干保护液的pH为7.0，所述血红蛋白上清溶液与冻干保护液的体积比为1:(1～3)。

第二方面，本发明提供了一种糖化血红蛋白质控品，所述糖化血红蛋白质控品使用第一方面所述方法制备。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明提供的糖化血红蛋白质控品制备方法简单，利用所述的冻干保护液，能够显著提高糖化血红蛋白冻干质控品在常温下的稳定性，本发明制备的糖化血红蛋白质控品可以在30℃下保存7天，在37℃下保存4天，其测试值更加稳定，同时便于运输和存储。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下实施例中，血红蛋白上清溶液的制备方法如下：

收集2份人新鲜静脉血各10mL，其中一份血样GHb为低值5％，另一份血样GHb为高值10％，通过检测确保血液为HIV，HBV以及HCV阴性；离心去除血浆后，加入5mL的生理盐水漂洗，离心去除生理盐水，重复2次；往洗净的红细胞中加入5mL的0.25％氯化钠溶液，搅拌10min，使红细胞膜破裂，释放出血红蛋白；16000转/分钟高速离心去除细胞碎片，得到GHb5％和10％的血红蛋白上清溶液各5mL。

实施例1

以GHb 5％的血红蛋白上清溶液为例，向其中加入5mL冻干保护液，再平均分成30份至冻干瓶中，真空冻干后得到30份糖化血红蛋白质控品，该质控品的初始GHb值记为5％。其中10份在30℃下保存7天，10份在37℃下保存4天，剩余10份在4℃下保存7天。GHb 10％的血红蛋白上清溶液处理方法与GHb 5％的相同。

其中冻干保护液配方如表1所示。测试每一份糖化血红蛋白质控品的GHb，测试GHb使用的仪器为博唐平糖化血红蛋白检测仪，型号为：A1C CheK Pro；测试试剂为所用仪器的配套试剂，测试步骤按所用仪器的说明书进行。测试时，分别将不同温度下保存的样品按1～10进行编号，保存相应的时间之后测试其糖化血红蛋白值，具体测试数据如表2所示，表中“MEAN”表示10份样品的平均糖化血红蛋白值，“CV”表示变异系数，其等于数据标准差与均值的比值。

表1冻干保护液配方

试剂	浓度
		Tris	20mM
NaN<sub>3</sub>	0.1％
		还原型谷胱甘肽	2％
海藻糖	6％
		pH	7.0

表2糖化血红蛋白质控品的测试数据

实施例2

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中还原型谷胱甘肽的质量浓度为0.5％，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据如表3所示。

表3糖化血红蛋白质控品的测试数据

实施例3

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中还原型谷胱甘肽的质量浓度为3％，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据如表4所示。

表4糖化血红蛋白质控品的测试数据

实施例4

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中还原剂为二硫苏糖醇，质量浓度为1％，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据如表5所示。

表5糖化血红蛋白质控品的测试数据

实施例5

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中还原剂为二硫苏糖醇，质量浓度为0.3％，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据如表6所示。

表6糖化血红蛋白质控品的测试数据

实施例6

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中还原剂为二硫苏糖醇，质量浓度为2％，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据如表7所示。

表7糖化血红蛋白质控品的测试数据

实施例7

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中海藻糖的质量浓度为3％，冻干保护液体积为10mL，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据如表8所示。

表8糖化血红蛋白质控品的测试数据

实施例8

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中海藻糖的质量浓度为10％，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据如表9所示。

表9糖化血红蛋白质控品的测试数据

实施例9

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中还原剂为二硫苏糖醇，质量浓度为1％，海藻糖的质量浓度为3％，冻干保护液体积为15mL，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据如表10所示。

表10糖化血红蛋白质控品的测试数据

实施例10

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中还原剂为二硫苏糖醇，质量浓度为1％，海藻糖的质量浓度为10％，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据如表11所示。

表11糖化血红蛋白质控品的测试数据

对比例1

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中不含有还原剂，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据对比如表12所示。

表12糖化血红蛋白质控品的测试数据

对比例2

与实施例1的区别在于，冻干保护液配方中含有0.5％(w/v)的抗坏血酸作为还原剂，而不含有还原性谷胱甘肽，其余条件和测试方法与实施例1相同。

测试数据对比如表13所示。

表13糖化血红蛋白质控品的测试数据

结合实施例1和对比例1分析可知，实施例1中糖化血红蛋白质控品在30℃保存7天、37℃保存4天后的测试值相比在4℃下保存的样品测试值上升不超过2％，稳定性较好，而对比例1中初始值为5％的样品在30℃下保存7天后测试值上升13.7％，在30℃下保存7天后测试值上升18.8％，因此实施例1中的糖化血红蛋白质控品在常温下的稳定性更优。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种糖化血红蛋白质控品的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

向血红蛋白上清溶液中加入冻干保护液，分装至冻干瓶中，冻干后得到所述糖化血红蛋白质控品；

所述冻干保护液中包含缓冲盐、防腐剂、还原剂和冻干保护剂；

所述还原剂为还原型谷胱甘肽或二硫苏糖醇。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述还原型谷胱甘肽在冻干保护液中的质量浓度为0.5～3％；

优选地，所述二硫苏糖醇在冻干保护液中的质量浓度为0.3～2％。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮或甘油中的任意一种或两种以上的组合，优选为海藻糖；

优选地，所述海藻糖在冻干保护液中的质量浓度为3～10％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲盐为三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸或2-(N-吗啡啉)乙磺酸钠中的任意一种或两种以上的组合；

优选地，所述冻干保护液的pH值为6.8～7.4。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠、苯甲酸钠、山梨酸钾或Procline 300中的任意一种或两种以上的组合，优选为叠氮钠。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述血红蛋白上清溶液与冻干保护液的体积比为1:(1～3)。

7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述血红蛋白上清溶液的制备方法包括如下步骤：

采集人新鲜静脉血，离心得到红细胞，加入生理盐水漂洗，得到洗净的红细胞，在所述洗净的红细胞中加入低渗液，搅拌，离心后得到所述血红蛋白上清溶液。

8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的人新鲜静脉血的糖化血红蛋白值为4～6％或8～10％；

优选地，所述低渗液为氯化钠溶液；

优选地，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.15～0.35％。

9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

采集人新鲜静脉血，所述的人新鲜静脉血的糖化血红蛋白值为4～6％或8～10％，离心得到红细胞，加入生理盐水漂洗2～3次，得到洗净的红细胞，在所述洗净的红细胞中加入0.15～0.35％氯化钠溶液，搅拌，离心后得到血红蛋白上清溶液；

向所述血红蛋白上清溶液中加入冻干保护液，分装至冻干瓶中，真空冻干后得到糖化血红蛋白质控品，所述冻干保护液中包含质量浓度为0.5～3％的还原型谷胱甘肽或质量浓度为0.3～2％的二硫苏糖醇，还包含海藻糖、防腐剂和缓冲盐，所述冻干保护液的pH为6.8～7.4，所述血红蛋白上清溶液与冻干保护液的体积比为1:(1～3)。

10.一种糖化血红蛋白质控品，其特征在于，所述糖化血红蛋白质控品使用权利要求1-9任一项所述方法制备。