CN107266563A - 一种血红蛋白质控品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种血红蛋白质控品的制备方法,依次包括以下步骤:1)配料;2)洗涤离心;3)获取红细胞液;4)提取血红蛋白;5)透析;6)分装制成冻干粉。本发明中透析好的血红蛋白加入含冻干保护剂和填充剂的稀释液稀释至设定质控品浓度,分装后进行低温预冻和冷冻干燥,制成冻干粉。制备过程中有效地保护了血红蛋白的活性,采用冻干粉进行保存,稳定性好,在临床应用中能有效的监控试剂的性能。此方法具有成本低、操作简便、可以大批量生产且长期保存的优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域,尤其涉及一种血红蛋白质控品的制备方法。
背景技术
便隐血(feces occult blood):又称便潜血,是指消化道少量出血,红细胞被消化破坏,粪便外观无异常改变,肉眼和显微镜下均不能证实的出血。
由于便隐血无法通过肉眼直接发现,导致绝大多数早期消化道恶性肿瘤患者无法及时发现并早期干预治疗,从而延误了治疗的最佳时机,如同隐性杀手一般潜伏在我们身体中。
红细胞中含有血红蛋白,因而使血液呈红色。如果红细胞破裂,血红蛋白释放出来。少量的消化道出血,不引起大便颜色改变,红细胞被消化破坏,大便外观无异常改变,肉眼和显微镜下均不能证实出血,只有在大便隐血试验检查时才发现存在消化道出血。
目前世界上公认的大肠癌筛检方法为粪便隐血试验。粪便隐血试验大多采用胶体金免疫法进行检测,而在临床使用中胶体金免疫法并没有一个稳定的质控品对试剂的的好坏进行监控。目前血红蛋白以液体形式存放,存在易丧失抗原活性、稳定性较差的缺点,市场上很少有与便隐血试剂配套的血红蛋白质控品。
发明内容
本发明提供了一种血红蛋白质控品的制备方法,旨在解决目前血红蛋白以液体形式保存,存在易丧失抗原活性、稳定性较差的问题。
为了解决以上技术问题,本发明通过以下技术方案实现:
一种血红蛋白质控品的制备方法,依次包括以下步骤:
1)配料:取健康人新鲜全血,加入抗凝剂。
2)洗涤离心:向配料中加入生理盐水,离心并除去上清液。以去除白细胞、血小板、血浆蛋白和脂蛋白等。
3)获取红细胞液:洗涤离心完成后加入生理盐水恢复至步骤1)中健康人新鲜血液的体积,得到红细胞液。
4)提取血红蛋白:向红细胞液中加入聚乙二醇辛基苯基醚并于漩涡混匀器上震荡混匀,使红细胞膜破裂并释放出血红蛋白,然后离心,提取上层的血红蛋白溶液,余下部分弃去。
5)透析:向血红蛋白溶液加入缓冲液,然后将血红蛋白溶液装入透析袋,并置于透析液中透析。
6)分装:向透析好的血红蛋白加入含冻干保护剂和填充剂的稀释液稀释至设定质控品浓度,然后分装,分装后进行低温预冻和冷冻干燥,制成冻干粉。
进一步,在步骤1)中取1~5ml健康人新鲜全血,健康人新鲜全血为HIV、HCV、HBsAg和TP均呈阴性的全血。
进一步,在步骤2)中,向配料中加入8~10倍配料体积的生理盐水,生理盐水为0.8%-1%的NaCl溶液。按照800-1200转/分钟离心8-12分钟。洗涤离心过程重复8~10次。
进一步,在步骤4)中,向红细胞液中加入体积比为0.5~2%的聚乙二醇辛基苯基醚并于漩涡混匀器上震荡混匀10~15分钟,使红细胞膜破裂并释放出血红蛋白,再于2800-3200转/分钟离心20~30分钟,用移液器吸取上层70~80%的液体得到血红蛋白溶液,余下部分弃去。
进一步,在步骤5)中,将透析袋置于3~5L且3-5℃透析液中透析16~24小时。
进一步,透析液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:8-10g/L
抗氧化剂:50~200mM
防腐剂质量百分含量:0.1~5%
其中上述溶剂为纯化水。
进一步,在步骤6)中,将透析好的血红蛋白用全自动血球分析仪上进行定值,定值完成后加入含冻干保护剂和填充剂的稀释液稀释至所需质控品浓度。
进一步,稀释液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:8-10g/L
抗氧化剂:50~200mM。抗氧化剂为柠檬酸三钠、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和维生素C中的一种。
冻干保护剂:0.5~10%。冻干保护剂为甘油、海藻糖、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
填充剂:0.5~10%。填充剂为PEG20000、牛血清白蛋白和明胶中的一种。
防腐剂质量百分含量:0.1~5%。防腐剂为叠氮钠、苯甲酸钠和ProClin300中的一种。
其中上述溶剂为纯化水。
进一步,低温预冻为在-30℃~-50℃的条件下,将分装后血红蛋白溶液预冻1.5-2.5小时成型。
冷冻干燥分两个阶段。第一个干燥阶段为:升温速度采用3~5℃每小时,持续12~16小时,第一个干燥阶段为:升温速度采用15~20℃每小时,持续8~10小时。
进一步,缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、硼酸与四硼酸钠缓冲液、邻苯二甲酸盐酸缓冲液中的一种。
与现有技术相比本发明的优点是:
本发明中透析好的血红蛋白加入含冻干保护剂和填充剂的稀释液稀释至设定质控品浓度,分装后进行低温预冻和冷冻干燥,制成冻干粉。制备过程中有效地保护了血红蛋白的活性,采用冻干粉进行保存,稳定性好,在临床应用中能有效的监控试剂的性能。此方法具有成本低、操作简便、可以大批量生产且长期保存的优点。
具体实施方式
实施例一:
一种血红蛋白质控品的制备方法,依次包括以下步骤:
1)配料:取1~5ml健康人新鲜全血,加入抗凝剂,抗凝剂采用EDTAK2。健康人新鲜全血为HIV、HCV、HBsAg和TP均呈阴性的全血。
2)洗涤离心:向配料中加入8~10倍配料体积的生理盐水,生理盐水为0.9%的NaCl溶液。按照1000转/分钟离心10分钟,并除去上清液。洗涤离心过程重复8~10次。
3)获取红细胞液:洗涤离心完成后加入生理盐水恢复至步骤1)中健康人新鲜血液的体积,得到红细胞液。
4)提取血红蛋白:向红细胞液中加入体积比为0.5~2%的聚乙二醇辛基苯基醚并于漩涡混匀器上震荡混匀10~15分钟,使红细胞膜破裂并释放出血红蛋白,再于3000转/分钟离心20~30分钟,用移液器吸取上层70~80%的液体得到血红蛋白溶液,余下部分弃去。
5)透析:向血红蛋白溶液加入3-5倍的缓冲液,然后将血红蛋白溶液装入透析袋,并置于透析液中透析。将透析袋置于3~5L且4℃透析液中透析16~24小时。
透析液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:9g/L
抗氧化剂:50~200mM
防腐剂质量百分含量:0.1~5%
其中上述溶剂为纯化水。
6)分装:向透析好的血红蛋白用全自动血球分析仪上进行定值,定值完成后加入含冻干保护剂和填充剂的稀释液稀释至设定质控品浓度,然后分装,分装后进行低温预冻和冷冻干燥,制成冻干粉。
低温预冻为在-30℃~-50℃的条件下,将分装后血红蛋白溶液预冻1.5-2.5小时成型。冷冻干燥分两个阶段。第一个干燥阶段为:升温速度采用3~5℃每小时,持续12~16小时,第一个干燥阶段为:升温速度采用15~20℃每小时,持续8~10小时。
稀释液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:9g/L
抗氧化剂:50~200mM。抗氧化剂为柠檬酸三钠、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和维生素C中的一种。
冻干保护剂:0.5~10%。冻干保护剂为甘油、海藻糖、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
填充剂:0.5~10%。填充剂为PEG20000、牛血清白蛋白和明胶中的一种。
防腐剂质量百分含量:0.1~5%。防腐剂为叠氮钠、苯甲酸钠和ProClin300中的一种。
其中上述溶剂为纯化水。
上述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、硼酸与四硼酸钠缓冲液、邻苯二甲酸盐酸缓冲液中的一种。
按照实施例一中的方案制备的冻干粉进行试验:每月取制备好的冻干粉使用纯化水复溶稀释至4mg/ml、2mg/ml、200ng/ml和100ng/ml,使用便隐血检测试剂盒(胶体金法)检测血红蛋白质控品的性能,每个浓度测试3次结果如表一和表二:
表一
表二
由表一和表二可以看出,按照本发明的制备方法制得的血红蛋白质控品具有良好的稳定性,在临床使用中与便隐血检测试剂盒(胶体金法)配套使用可以很好的监控试剂的性能。
实施例二:
一种血红蛋白质控品的制备方法,依次包括以下步骤:
1)配料:取1~5ml健康人新鲜全血,加入抗凝剂,抗凝剂采用EDTAK2。健康人新鲜全血为HIV、HCV、HBsAg和TP均呈阴性的全血。
2)洗涤离心:向配料中加入8倍配料体积的生理盐水,生理盐水为0.8%-1%的NaCl溶液。按照800转/分钟离心8分钟,并除去上清液。洗涤离心过程重复8次。
3)获取红细胞液:洗涤离心完成后加入生理盐水恢复至步骤1)中健康人新鲜血液的体积,得到红细胞液。
4)提取血红蛋白:向红细胞液中加入体积比为0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚并于漩涡混匀器上震荡混匀10分钟,使红细胞膜破裂并释放出血红蛋白,再于2800转/分钟离心20分钟,用移液器吸取上层70%的液体得到血红蛋白溶液,余下部分弃去。
5)透析:向血红蛋白溶液加入3倍体积缓冲液,然后将血红蛋白溶液装入透析袋,并置于透析液中透析。将透析袋置于3L且3℃透析液中透析16小时。
透析液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:9g/L
抗氧化剂:50~200mM
防腐剂质量百分含量:0.1~5%
其中上述溶剂为纯化水。
6)分装:向透析好的血红蛋白用全自动血球分析仪上进行定值,定值完成后加入含冻干保护剂和填充剂的稀释液稀释至设定质控品浓度,然后分装,分装后进行低温预冻和冷冻干燥,制成冻干粉。
其中,低温预冻为在-30℃℃的条件下,将分装后血红蛋白溶液预冻1.5小时成型。冷冻干燥分两个阶段。第一个干燥阶段为:升温速度采用3℃每小时,持续12小时,第一个干燥阶段为:升温速度采用15℃每小时,持续8小时。
稀释液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:9g/L
抗氧化剂:50mM。抗氧化剂为柠檬酸三钠、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和维生素C中的一种。
冻干保护剂:0.5%。冻干保护剂为甘油、海藻糖、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
填充剂:0.5%。填充剂为PEG20000、牛血清白蛋白和明胶中的一种。
防腐剂质量百分含量:0.1%。防腐剂为叠氮钠、苯甲酸钠和ProClin300中的一种。
其中上述溶剂为纯化水。
上述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、硼酸与四硼酸钠缓冲液、邻苯二甲酸盐酸缓冲液中的一种。
实施例三:
一种血红蛋白质控品的制备方法,依次包括以下步骤:
1)配料:取5ml健康人新鲜全血,加入抗凝剂,抗凝剂采用EDTAK2。健康人新鲜全血为HIV、HCV、HBsAg和TP均呈阴性的全血。
2)洗涤离心:向配料中加入10倍配料体积的生理盐水,生理盐水为1%的NaCl溶液。按照1100转/分钟离心11分钟,并除去上清液。洗涤离心过程重复10次。
3)获取红细胞液:洗涤离心完成后加入生理盐水恢复至步骤1)中健康人新鲜血液的体积,得到红细胞液。
4)提取血红蛋白:向红细胞液中加入体积比为2%的聚乙二醇辛基苯基醚并于漩涡混匀器上震荡混匀15分钟,使红细胞膜破裂并释放出血红蛋白,再于3100转/分钟离心30分钟,用移液器吸取上层80%的液体得到血红蛋白溶液,余下部分弃去。
5)透析:向血红蛋白溶液加入5倍的缓冲液,然后将血红蛋白溶液装入透析袋,并置于透析液中透析。将透析袋置于5L且5℃透析液中透析24小时。
透析液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:9g/L
抗氧化剂:50~200mM
防腐剂质量百分含量:0.1~5%
其中上述溶剂为纯化水。
6)分装:向透析好的血红蛋白用全自动血球分析仪上进行定值,定值完成后加入含冻干保护剂和填充剂的稀释液稀释至设定质控品浓度,然后分装,分装后进行低温预冻和冷冻干燥,制成冻干粉。
低温预冻为在-45℃的条件下,将分装后血红蛋白溶液预冻2小时成型。冷冻干燥分两个阶段。第一个干燥阶段为:升温速度采用5℃每小时,持续16小时,第一个干燥阶段为:升温速度采用20℃每小时,持续10小时。
稀释液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:9g/L
抗氧化剂:50~200mM。抗氧化剂为柠檬酸三钠、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和维生素C中的一种。
冻干保护剂:10%。冻干保护剂为甘油、海藻糖、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
填充剂:10%。填充剂为PEG20000、牛血清白蛋白和明胶中的一种。
防腐剂质量百分含量:5%。防腐剂为叠氮钠、苯甲酸钠和ProClin300中的一种。
其中上述溶剂为纯化水。
以上所述仅为本发明的具体实施例,但本发明的技术特征并不局限于此,任何本领域的技术人员在本发明的领域内,所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。
Claims (10)
1.一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:依次包括以下步骤:
1)配料:取健康人新鲜全血,加入抗凝剂;
2)洗涤离心:向配料中加入生理盐水,离心并除去上清液;
3)获取红细胞液:洗涤离心完成后加入生理盐水恢复至步骤1)中健康人新鲜血液的体积,得到红细胞液;
4)提取血红蛋白:向红细胞液中加入聚乙二醇辛基苯基醚并于漩涡混匀器上震荡混匀,使红细胞膜破裂并释放出血红蛋白,然后离心,提取上层的血红蛋白溶液,余下部分弃去;
5)透析:向血红蛋白溶液加入缓冲液,然后将血红蛋白溶液装入透析袋,并置于透析液中透析;
6)分装:向透析好的血红蛋白加入含冻干保护剂和填充剂的稀释液稀释至设定质控品浓度,然后分装,分装后进行低温预冻和冷冻干燥,制成冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:
在步骤1)中取1~5ml健康人新鲜全血,健康人新鲜全血为HIV、HCV、HBsAg和TP均呈阴性的全血。
3.根据权利要求1所述的一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:
在步骤2)中,向配料中加入8~10倍配料体积的生理盐水,生理盐水为0.8%-1%的NaCl溶液;按照800-1200转/分钟离心8-12分钟;洗涤离心过程重复8~10次。
4.根据权利要求1所述的一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:
在步骤4)中,向红细胞液中加入体积比为0.5~2%的聚乙二醇辛基苯基醚并于漩涡混匀器上震荡混匀10~15分钟,使红细胞膜破裂并释放出血红蛋白,再于2800-3200转/分钟离心20~30分钟,用移液器吸取上层70~80%的液体得到血红蛋白溶液,余下部分弃去。
5.根据权利要求1所述的一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:
在步骤5)中,将透析袋置于3~5L且3-5℃透析液中透析16~24小时。
6.根据权利要求1所述的一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:
透析液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:8-10g/L
抗氧化剂:50~200mM
防腐剂质量百分含量:0.1~5%
其中上述溶剂为纯化水。
7.根据权利要求1所述的一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:
在步骤6)中,将透析好的血红蛋白用全自动血球分析仪上进行定值,定值完成后加入含冻干保护剂和填充剂的稀释液稀释至所需质控品浓度。
8.根据权利要求7所述的一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:
稀释液包括:
缓冲液:50~200mM,pH=7.0~7.5
氯化钠:8-10g/L
抗氧化剂:50~200mM;抗氧化剂为柠檬酸三钠、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和维生素C中的一种;
冻干保护剂:0.5~10%;冻干保护剂为甘油、海藻糖、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种;
填充剂:0.5~10%;填充剂为PEG20000、牛血清白蛋白和明胶中的一种;
防腐剂质量百分含量:0.1~5%;防腐剂为叠氮钠、苯甲酸钠和ProClin300中的一种;
其中上述溶剂为纯化水。
9.据权利要求1或7所述的一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:
低温预冻为在-30℃~-50℃的条件下,将分装后血红蛋白溶液预冻1.5-2.5小时成型;
冷冻干燥分两个阶段;第一个干燥阶段为:升温速度采用3~5℃每小时,持续12~16小时,第一个干燥阶段为:升温速度采用15~20℃每小时,持续8~10h。
10.据权利要求1至8任一所述的一种血红蛋白质控品的制备方法,其特征是:
缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、硼酸与四硼酸钠缓冲液、邻苯二甲酸盐酸缓冲液中的一种。
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