CN104535773A - 一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法 - Google Patents
一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法，通过采集临床过敏病人进行脱敏治疗之后的血清作为候选血清，并采用法玛西亚UniCap检测系统对所得候选血清进行尘螨特异性IgG4亚型抗体检测筛选，然后对筛选得到的候选血清进行提取、纯化并采用冻存液替换稀释血清基质来制备所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；然后结合真空冷冻干燥方法制备冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品来保证所得校准品的均一性和稳定性。涉及的制备方法科学、严谨、完善，并经过协作标定、数据统计，保证效价定值准确，制得的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品可用于标定尘螨特异性IgG4亚型抗体的含量，从而判断脱敏治疗疗效。
Description
技术领域
本发明属于生物体外诊断技术领域，具体涉及一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法。
背景技术
研究发现，在进行尘螨脱敏治疗后，患者血清中尘螨特异性IgG4亚型抗体水平显著上升(P<0.0001)。诱导产生的尘螨特异性IgG4亚型抗体水平的升高，在特异性免疫治疗过程中发挥了重要的作用，可通过检测特异性IgG4抗体水平对脱敏治疗效果进行评价。目前，体外诊断是脱敏疗效检测的常用方法。在生物制品的标准化、质量控制和效力评价中校准品是体外诊断试剂评价的标尺，起着非常重要的作用。
然而目前国际、国内均没有尘螨特异性IgG4亚型抗体的校准品，这给实际研究工作和临床检验工作带来很多不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品(校准物质)，用于标定尘螨特异性IgG4亚型抗体的含量，从而判断脱敏治疗疗效。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，所述校准品中尘螨特异性IgG4亚型抗体蛋白浓度为1ug/mL，尘螨特异性IgG4亚型抗体蛋白纯度≥95wt％，其制备方法包括以下步骤：
(1)候选血清的制备：对临床适应症为过敏的病人进行脱敏治疗之后，无菌采取血液并收集到无菌的采血管中，在室温条件下静置，待血清析出后，取上清，离心分离血清，作为候选血清；
(2)候选物的筛选：通过法玛西亚UniCap检测系统对候选物进行尘螨特异性IgG4抗体检测，尘螨特异性IgG4亚型抗体高阳血清(≥0.1mg/mL)作为候选物；
(3)尘螨特异性IgG4亚型抗体的提取与纯化：
1)尘螨亲和层析纯化，将筛选出的候选物经过尘螨亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集洗脱后的蛋白吸收峰组分；
2)抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱纯化，将步骤1)洗脱后所得的蛋白吸收峰经抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集得第二次蛋白吸收峰组分；
3)分子筛层析纯化，将洗脱后的蛋白吸收峰经分子筛层析柱上样，洗脱，收集得第三次蛋白吸收峰组分；
4)浓缩、除菌、蛋白浓度测定、蛋白纯度鉴定，将洗脱后所得的三次蛋白吸收峰组分经离心超滤浓缩后，通过直径为0.22μm的微孔滤膜除菌后，得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物，并采用凯氏定氮法检测蛋白浓度、通过SDS-PAGE测定蛋白纯度；
(4)校准品的分装、冻干、熔封：
1)配制冻存液，在磷酸根摩尔浓度为0.01mol/L，Tween20体积分数为1‰，pH＝7.2～7.4的PBST缓冲液中加入酪蛋白和核糖，使酪蛋白的质量分数为0.5～5％，核糖的质量分数为1～10％，得冻存液；将所得冻存液用微孔滤膜进行抽滤，得抽滤冻存液；
2)将所得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物用制得的抽滤冻存液稀释至1μg/mL，得所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；
3)将所得标准浓度蛋白溶液进行无菌分装，并用铝箔纸封口后在-80℃温度下过夜；
4)过夜后在铝箔纸上扎小孔，进行真空冷冻干燥、熔封，得所述冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品。
(5)冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的鉴定：
1)物理性状检验；
2)无菌检验、真空度检验，按照《中国药典》的规定方法进行检验；
3)剩余水分测定，按照《中国药典》的规定，以真空烘干法进行剩余水分测定，应不超过标准规定的4％；
4)均一性检验，随机抽取规定数量的样品，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，实验结果应一致。
5)稳定性试验，采用热加速稳定性试验方法，检查在高温条件下样品放置的时间，并以此数据作为依据，为下一批稳定性试验作基础。
6)定值(协作标定)，选择3个以上具有对血清学试验有经验的实验室或医院检验科，每个实验室使用3个样品，每个样品重复2次，各协作标定单位按照协作标定方案的要求，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，并将实验结果交给组织单位。
根据上述方案，所述尘螨亲和层析柱所用胶凝为经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activatedSepharose 4B溶胀基质。
根据上述方案，所述尘螨亲和层析纯化步骤为：将筛选出的候选物经尘螨亲和层析柱上样，上样量为经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，使A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用5～10倍体积的0.05M，PH为4.0的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱结合的蛋白；汇集A280≥0.2的峰组分，得蛋白吸收峰组分。
根据上述方案，所述抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱所用胶凝为经抗人IgG4抗体偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质。
根据上述方案，所述抗人IgG4亚型抗体亲和层析纯化步骤为：将洗脱后的蛋白吸收峰组分经抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，上样量为经抗人IgG4抗体偶联的CNBR-activatedSepharose 4B溶胀基质体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，使A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用5～10倍体积的0.05M，PH为4.0的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱结合的抗体蛋白；汇集A280≥0.2的峰组分，得第二次蛋白吸收峰组分。
根据上述方案，所述分子筛层析纯化步骤为：以葡聚糖凝胶Sephadex G75为分子筛层析柱所用胶凝，将洗脱后的二次蛋白吸收峰组分经分子筛层析柱上样，上样量为Sephadex G75体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，让A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用5～10倍体积的PBS缓冲液洗脱；汇集A280≥0.2的峰组分，得第三次蛋白吸收峰组分。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明通过采集临床过敏病人进行脱敏治疗之后尘螨特异性IgG4亚型抗体检测阳性的血清作为候选血清，通过效价筛选，然后进行尘螨特异性IgG4亚型抗体的进行提取、纯化并采用冻存液替换稀释血清基质来制备所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，制得的校准品纯度高、稳定性好，可有效判断脱敏治疗的疗效。
2)本发明为了保证该校准品的均一性和稳定性，采用冻存液替换血清基质，再通过真空冷冻干燥法制备冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，进一步保证制得校准品的均一性和稳定性。
3)本发明涉及的制备方法科学、严谨、完善，按照校准品制备程序使每一个步骤科学严谨，经过协作标定，数据统计，保证效价定值准确。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中，所述尘螨亲和层析柱中所用凝胶为经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质，其制备步骤为：称取0.1gCNBR-activated Sepharose 4B基质干粉，悬浮于1mM的HCl中，基质迅速溶胀后用1mM的HCl洗柱15min，每克干粉用200ml，1mM的HCl，得CNBR-activated Sepharose 4B基质；将1.5mg尘螨致敏蛋白溶解到0.5mL，0.1M NaHCO3(PH为8.3，NaCl含量为0.5M)的偶联液中；将含有尘螨致敏蛋白的偶联液与制备好的CNBR-activated Sepharose 4B基质混合，并在4℃条件下翻转过夜；用至少5倍体积的偶联液洗掉多余的尘螨致敏蛋白；用0.1M的TRIS-HCl缓冲液(PH为8.0)封闭基质上的CNBR活性集团；用至少5倍体积的0.1M的醋酸钠-醋酸缓冲液(PH为4.0，NaCl含量为0.5M)和5倍体积的0.5M的NaHCO3(PH为8.3，NaCl含量为0.5M)交换冲洗，至少3个循环，得所述尘螨亲和层析中所用凝胶。
所述抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱中所用凝胶为经抗人IgG4抗体偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质，其制备步骤为：称取0.1g基质干粉，悬浮于1mM的HCl中，基质迅速溶胀后用1mM的HCl洗柱15分钟。每克干粉用200ml，1mM的HCl，得CNBR-activated Sepharose 4B基质；将1.5mg抗人IgG4抗体溶解到0.5mL，0.1M NaHCO3(PH为8.3，NaCl含量为0.5M)的偶联液中；将含有抗人IgG4抗体的偶联液与制备好的CNBR-activated Sepharose 4B基质混合，并在4℃条件下翻转过夜；用至少5倍体积的偶联液洗掉多余的抗人IgG4抗体；用0.1M的TRIS-HCl缓冲液(PH为8.0)封闭基质上的CNBR活性集团；用至少5倍体积的0.1M的醋酸钠-醋酸缓冲液(PH为4.0，NaCl含量为0.5M)和5倍体积的0.5M的NaHCO3(PH为8.3，NaCl含量为0.5M)交换冲洗，至少3个循环，得所述抗人IgG4亚型抗体亲和层析中所用凝胶。
实施例1
一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，其制备方法包括以下步骤：
(1)候选血清的制备
临床适应症为尘螨过敏的病人进行脱敏治疗之后(结果见表1)，分别按常规方法无菌采取血液并收集到无菌的采血管中，在室温条件下(20℃左右)静置4h，待血清析出后，取上清，在4000r/min转速下离心血清20min，得候选血清。
表1 脱敏治疗患者情况
(2)候选物的筛选
通过法玛西亚UniCap检测系统对候选物进行尘螨特异性IgG4亚型抗体检测(结果见表2)，尘螨特异性IgG4亚型抗体高阳血清(≥0.1mg/mL)作为候选物。
表2 脱敏治疗患者候选血清筛选情况
试验结果表明，尘螨特异性IgG4亚型抗体阳性血清(≥0.1mg/mL)共有66份，将66份高阳候选血清混合均匀，用于提取尘螨特异性IgG4亚型抗体。
(3)尘螨特异性IgG4亚型抗体的提取与纯化
1)尘螨亲和层析纯化：
将筛选出来的候选物经尘螨亲和层析柱上样，每0.5ml经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质上样4ml所述候选物；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，使A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用10倍体积的0.05M，PH为4.0的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱结合的蛋白；洗脱液以1ml为洗脱组分分部收集，收集管中应含有0.5M的NaHCO3(PH为8.3)以调节PH值至中性；汇集A280≥0.2的峰组分，得蛋白吸收峰组分。
2)抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱纯化：
将洗脱后的蛋白吸收峰经抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，每0.5ml经抗人IgG4抗体偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质可上样4ml所述蛋白吸收峰组分；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，让A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用5倍体积的0.05M，PH为4.0的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱结合的抗体蛋白；洗脱液以1ml为洗脱组分分部收集，收集管中应含有0.5M的NaHCO3(PH为8.3)以调节PH值至中性；汇集A280≥0.2的峰组分，得第二次蛋白吸收峰组分；
3)分子筛层析纯化：
以葡聚糖凝胶Sephadex G75为分子筛层析柱所用凝胶，将洗脱后的二次蛋白吸收峰组分经分子筛层析柱上样，上样量为Sephadex G75体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，让A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用10倍体积的PBS缓冲液洗脱；汇集A280≥0.2的峰组分，得第三次蛋白吸收峰组分。
4)浓缩与除菌、蛋白浓度测定、蛋白纯度鉴定：
将洗脱后的第三次蛋白吸收峰组分离心超滤浓缩后，通过直径大小为0.22um的微孔滤膜除菌后，得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物；采用凯氏定氮法检测蛋白浓度为5.6mg/mL；通过SDS-PAGE测定蛋白纯度为98％。
(4)校准品的分装、冻干、熔封：
1)配制冻存液，在磷酸根摩尔浓度为0.01mol/L，Tween20体积分数为1‰，pH＝7.3的PBST缓冲液中加入酪蛋白和核糖，使酪蛋白的质量分数为5％，核糖的质量分数为10％，得冻存液；将所得冻存液用微孔滤膜进行抽滤，得抽滤冻存液；
2)将尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品用所述抽滤冻存液稀释至1μg/mL，得所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；
3)将上述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品用瓶颈分液器(calibrex digital 520，分装精度为±0.01mL，购自瑞士sororex公司)无菌分装至1mL西林瓶，用铝箔纸封口后，在-80℃温度下过夜；
4)过夜后在铝箔纸上扎3个小孔，10Pa以内的真空条件下冷冻干燥8h，至完全干燥，得冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，最后进行熔封。
(5)冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的鉴定
1)物理性状检验
冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品为淡黄色疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，溶解后为淡黄色澄明液体。
2)无菌检验
无菌检验测定结果符合《中国药典》的规定。
3)真空度检验
真空度检验结果符合《中国药典》的规定。
4)剩余水分测定
剩余水分测定结果分别为1.6％、1.4％、1.2％、2.6％，符合《中国药典》的规定
5)均一性检验
随机抽取15支冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，实验结果均为1ug/mL。
6)稳定性试验
采用热加速稳定性试验方法进行稳定性测试(结果见表3)，取4支冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品在37℃温箱保存，每周取1支测定效价，保存4周时效价未发生变化；4支冻干校准品25℃温箱保存，每二周取1支测定效价，保存9周时效价未发生变化。
表3 稳定性试验结果
根据阿伦尼乌斯公式结论，37℃保存1天相当于4℃保存48天，因此得出本发明所述方法制得的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品在4℃可保存3年以上。
7)定值(协作标定)
7.1协作标定
选择3个以上具有对血清学试验有经验的医院检验科，检验科使用3个样品，每个样品重复2次，各协作标定单位按照协作标定方案的要求，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定。汇总三家协作标定单位的标定结果，该尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的浓度均为1ug/mL(见表4)，该标定结果与研制该校准品时标定的结果一致。
7.2定值
表4 尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品定值
本发明涉及的各原料及其上下限取值、区间值都能实现本发明，本发明的工艺参数(如温度、时间等)的下限取值以及区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
Claims (7)
1.一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，其特征在于，所述校准品中尘螨特异性IgG4亚型抗体蛋白浓度为1ug/mL，纯度≥95wt％。
2.权利要求1所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)候选血清的制备：对临床适应症为过敏的病人进行脱敏治疗之后，无菌采取血液并收集到无菌的采血管中，在室温条件下静置，待血清析出后，取上清，离心分离血清，作为候选血清；
(2)候选物的筛选：通过法玛西亚UniCap检测系统对候选物进行尘螨特异性IgG4亚型抗体检测，选择尘螨特异性IgG4亚型抗体≥0.1mg/mL的高阳血清作为候选物；
(3)尘螨特异性IgG4亚型抗体的提取与纯化：
1)尘螨亲和层析纯化，将筛选出的候选物经过尘螨亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集洗脱后的蛋白吸收峰组分；
2)抗人IgG4亚型抗体亲和层析纯化，将步骤1)洗脱所得的蛋白吸收峰组分经抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集得第二次蛋白吸收峰组分；
3)分子筛层析纯化，将洗脱后的蛋白吸收峰经分子筛层析柱上样，洗脱，收集得第三次蛋白吸收峰组分；
4)浓缩、除菌、蛋白浓度测定、蛋白纯度鉴定，将洗脱后所得的三次蛋白吸收峰组分经离心超滤浓缩，然后通过微孔滤膜除菌，得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物，然后采用凯氏定氮法检测其蛋白浓度；采用SDS-PAGE方法测定其蛋白纯度；
(4)校准品的分装、冻干、熔封：
1)配制冻存液，在磷酸根摩尔浓度为0.01mol/L，Tween20体积分数为1‰，pH＝7.2～7.4的PBST缓冲液中加入酪蛋白和核糖，使酪蛋白的质量分数为0.5～5％，核糖的质量分数为1～10％，得冻存液；将所得冻存液用微孔滤膜进行抽滤，得抽滤冻存液；
2)将所得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物用制得的抽滤冻存液稀释至蛋白浓度为1μg/mL，得所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；
3)将所得尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品进行无菌分装，并用铝箔纸封口后在-80℃温度下过夜；
4)过夜后在铝箔纸上扎小孔，进行真空冷冻干燥、熔封，得所述冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；
(5)冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的鉴定：
1)物理性状检验；
2)无菌检验、真空度检验，按照《中国药典》的规定方法进行检验；
3)剩余水分测定，按照《中国药典》的规定，以真空烘干法进行剩余水分测定，应不超过标准规定的4％；
4)均一性检验，随机抽取规定数量的样品，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，实验结果应一致；
5)稳定性试验，采用热加速稳定性试验方法，检查在高温条件下样品放置的时间，并以此数据作为依据，为下一批稳定性试验作基础；
6)定值(协作标定)，选择3个以上具有对血清学试验有经验的实验室或医院检验科，每个实验室使用3个样品，每个样品重复2次，各协作标定单位按照协作标定方案的要求，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，并将标定结果交给组织单位。
3.根据权利要求2所述的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，所述尘螨亲和层析柱所用凝胶为经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质。
4.根据权利要求3所述的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，所述尘螨亲和层析纯化步骤为：将筛选出的候选物经尘螨亲和层析柱内上样，上样量为经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，使A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用5～10倍体积的0.05M，PH为4.0的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱结合的蛋白；汇集A280≥0.2的峰组分，得蛋白吸收峰组分。
5.根据权利要求2所述的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，所述抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱所用凝胶为经抗人IgG4抗体偶联的CNBR-activatedSepharose 4B溶胀基质。
6.根据权利要求5所述的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，所述抗人IgG4亚型抗体亲和层析纯化步骤为：将洗脱后的蛋白吸收峰组分经抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，上样量为经抗人IgG4抗体偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，使A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用5～10倍体积的0.05M，PH为4.0的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱结合的抗体蛋白；汇集A280≥0.2的峰组分，得第二次蛋白吸收峰组分。
7.根据权利要求2所述的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，所述分子筛层析纯化步骤为：以葡聚糖凝胶Sephadex G75为分子筛层析柱所用胶凝，将洗脱后的二次蛋白吸收峰组分经分子筛层析柱上样，上样量为Sephadex G75体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，让A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用5～10倍体积的PBS洗脱；汇集A280≥0.2的峰组分，得第三次蛋白吸收峰组分。
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