CN101256186A - 食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法，应用纯化的食物过敏原蛋白包被酶标板。试剂盒组成包括已包被食物过敏原蛋白的酶标板、人IgG4标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液。样品血清中的特异性IgG4抗体结合固定在酶标板微孔表面上的相应抗原，酶标记抗体识别IgG4并与之结合，形成抗原-IgG4-抗体-酶的复合物，酶与底物反应显色后测出吸光度，由标准曲线计算出样本血清中的特异性IgG4抗体浓度。使用样品血清中过敏原特异性IgG4抗体浓度作为食物过敏原暴露状况的生物指标，判断患者的免疫偏差和免疫耐受性，也可用于患者选择特定食物进行免疫治疗疗效的监控。

Description

食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及了一种半定量检测人血清中食物过敏原特异性IgG4抗体的酶联免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

几十年来，医学界一直在密切关注和研究食物过敏反应和诱发过敏性疾病的天然食物、转基因改良食物、食物添加剂及防腐剂。食物过敏反应分IgE免疫介导的过敏反应和非IgE免疫介导的过敏反应。在IgE介导的过敏反应中，食物中的过敏原成分刺激产生的食物过敏原特异性IgE抗体与在肥大细胞，嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和血小板等细胞膜表面的F_CεR1和F_CεR2受体结合，释放组胺、肿瘤坏死因子(TNFα)等炎症介质，引起过敏反应的病症。在非IgE免疫介导的食物过敏反应中，食物过敏原诱导人肥大细胞和嗜碱性粒细胞膜上的IgG抗体高亲和受体FcγR1活化，与IgG结合后集聚、脱颗粒、释放组胺和花生四烯酸代谢物等炎症介质，触发恶心、腹泻、腹痛等胃肠道症状和其他典型的过敏性鼻炎，过敏性皮炎及风疹等过敏性疾病(Tkaczy c et al，2002，Mol Immunol，38：1289-1296)。IgG抗体是多态形的，有IgG1、IgG2、IgG3及IgG4等4种亚类。Halpern SR et al建议IgG致敏抗体实际上是IgG4(Halpern SR et al，2001，Hematology(Oxford)，40：1175-1179)。Okayama Y et al证实，人肥大细胞上的FcγR1受体活化释放的炎性介质与IgE抗体高亲和受体F_CεR1受体激发释放的炎性介质定性上是无法区分的(Okayama Y et al，2001，J Immunal，166；4705-4712)。Ruiter B et al的研究发现，与非过敏体质的个体相比，无牛奶过敏史的过敏体质儿童和成人的牛奶致敏蛋白特异性IgG4水平较高；对牛奶耐受的过敏体质和非过敏体质个体都发现有卵类粘蛋白特异性IgG4抗体，但没有发现有尘螨的特异性IgG4抗体。由此得出对牛奶耐受的过敏体质儿童和无牛奶过敏反应成人与提高特异性IgG4水平，同时降低特异性IgE抗体水平相一致。牛奶耐受过敏体质个体特异性IgG4水平上调可能与过敏原的类型及其暴露的剂量相关(Ruiter B et al，2007，ClinEXP Allergy，37：1103-1110)。Greenberger PA认为：过敏性疾病的免疫治疗减轻过敏性疾病的症状，特别是对过敏性鼻炎和过敏性哮喘的免疫治疗，反映了细胞因子和免疫球蛋白受过敏原刺激而改变，抗抗原的IgG抗体水平升高2-10倍，IgG4升高10-100倍，而抗抗原的IgE抗体水平则明显下降，鼻腔或支气管的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的数目减少，下调淋巴细胞和IL-4，而干扰素γ(IFNγ)的增高不足(Greenberger PA，2002，Immunotherapy update：Mechanismofaction，Allergy Asthma Proc，23：373-376)。这些研究清楚的说明了IgG4在免疫治疗中的封闭抗体作用是抑制过敏原诱导从碱性粒细胞和肥大细胞释放炎性介质，同时将过敏原展示于T细胞、抑制T细胞活性。IgG4作为致敏抗体或封闭抗体的双重作用是IgG4抗体有二种亚型：IgG4a和IgG4b；IgG4a与IgG1、IgG3的结构上有一定程度相似，而IgG4b与IgG2结构上相似(Van Der ZeeJS，Aalberse RC，1988，N Engl Reg Allergy Proc，9：31-33)。

IgG(主要是IgG4)介导的免疫食物过敏反应发病迟缓，通常在摄入食物24-120小时之后，临床表现为多个系统的慢性症状，患者很难做出自我诊断，且检测手段不普及，造成临床诊断的困难。免疫治疗过敏性疾病的过程中，患者血清中特异性IgE浓度逐渐下降至某一范围，而特异性IgG4却逐渐上升至某一水平，成为免疫治疗的疗效的评估指标，酶免疫分析体外检测过敏患者血清中食物过敏原特异性IgG4抗体浓度的优越性就突出了。

酶免疫分析中有多种检测结合酶的方法，如荧光法、化学发光法和TMB比色法等。其中TMB比色法的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法只需使用普通普及型的酶标议，经济快速、简单安全、适合我国多级医院使用。

ELISA方法检测血液样本中食物过敏原特异性IgG4抗体(sIgG4)是利用固相载体固定的过敏原蛋白识别样品液中的sIgG4并与sIgG4结合，洗去未结合的其他蛋白，再加入酶标记的抗人IgG4抗体与已经结合在固定抗原上的sIgG4抗体结合，形成过敏原-sIg G4-抗体-酶的复合物，通过与酶底物显色液反应，检测结合的酶量，间接地测定出样品液中的sIg G4浓度及特定的过敏原。ELISA方法应用的多种技术，如过敏原蛋白的提取纯化方法，人Ig G4抗体和抗人Ig G4抗体的制备、纯化，酶标记抗体的制取纯化等均已成熟(T，kiessigST，1992，Enzyme immunoassay techniques，An overview，J Immunol Methods，150：5-21)，且可按美国临床实验室标准化委员会的文件(I/LA20-A)评价质量，为食物过敏原特异性Ig G4抗体ELISA检测试剂盒的商品化生产奠定了技术基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、快速地半定量检测人血清中的食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法。使用试剂盒检测样品血清中食物过敏原特异性IgG4抗体浓度，用以判断患者的免疫偏差和免疫耐受性以及免疫治疗过程中疗效的判定指标。

本发明的食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒，其组成包括已包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白的酶标板、人IgG4标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液；

其中：

已包被的奶类食物过敏原蛋白的酶标板包括：牛奶、羊奶；

已包被的蛋类食物过敏原蛋白的酶标板包括：家禽蛋白、家禽蛋黄；

已包被的肉类食物过敏原蛋白的酶标板包括：猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉；

已包被的谷物类食物过敏原蛋白的酶标板包括：玉米、小麦、燕麦、大麦、荞麦、大米、小米；

已包被的坚果类食物过敏原蛋白的酶标板包括：杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、开心果、巴西坚果、芝麻；

已包被的水果类食物过敏原蛋白的酶标板包括：西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡柚、柠檬、苹果、葡萄、梨、草莓、桃；

已包被的蔬菜类食物过敏原蛋白的酶标板包括：芹菜、菠菜、洋葱、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西红柿；

已包被的水产类食物过敏原蛋白的酶标板包括：带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼；鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、虾、蟹、蚌、贻贝、牡蛎、黄鳝、鳗鱼；

已包被的豆类食物过敏原蛋白的酶标板包括：扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆；

酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的抗人IgG4单克隆抗体；

TMB底物显色液：2.08mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，12mmol/L过氧化氢，10mmol/L β-环糊精，0.1mol/L pH5.0的醋酸缓冲液。

样品稀释液：10mmol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；

浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；

终止反应液：1.0mol/L H₂SO₄。

本发明的食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)食物过敏原蛋白的制备：将含过敏原蛋白的食物材料经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥；

(2)酶标记抗体的制备：用辣根过氧化物酶(Horseradish peraxidase，HRP)标记纯化的抗人IgG4抗体；

(3)配制人IgG4标准液、TMB底物显色液、浓缩洗涤液和终止反应液；

(4)酶标板包被：用抗人IgG4抗体和食物过敏原蛋白包被酶标板，并封闭。

本发明的试剂盒的使用方法，包括如下操作步骤：

(1)加入样品液和标准液到相应的酶标板微孔中，使样品液中的食物过敏原特异性IgG4抗体各自与相应的固相过敏原蛋白结合或标准液中的人IgG4与固相载体上的抗人IgG4抗体结合，洗去未结合的杂蛋白和其他物质；

(2)使已结合的人IgG4抗体与HRP-抗人IgG4抗体相结合，洗去多余的酶标记抗体；

(3)加入TMB底物显色液，室温孵育反应，终止酶反应后检测显色反应的强度。

本发明的有益效果在于：

本发明建立了夹心式ELISA方法间接测定样品液中的食物过敏原特异性Ig G4抗体含量，检测灵敏度小于0.3ng/ml，剂量-反应曲线的线性相关系数≥0.99，具有简便、快速、灵敏、稳定的优点。体内过敏原特异IgG4抗体的封闭抗体特性能控制IgE抗体识别过敏原，调控过敏反应和IgE介导的免疫反应，故检测患者血清中过敏原特异性IgG4抗体水平，为体外诊断提供患者食物过敏原暴露状况的生物指标，尤其可为患者免疫治疗疗效判断特供特有的指标。

具体实施方法

以下结合实施例进一步说明本发明。

实施例1

本发明的食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒，其组成包括已包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白的酶标板、人IgG4标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液。

上述的酶标板为96孔(12条8孔或8条12孔)。

本发明的食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒的制备方法：

1.食物过敏原蛋白的制备

1.1食物过敏原蛋白的粗浸提液

1.1.1奶类提取液

奶类浸液的制作有两种方法：

(1)先用离心法(2400转/分钟)离心15分钟，用小匙除去上层脂肪，取400ml脱脂乳，加入5ml 1％凝乳酶或乳冻片，不搅拌，放入37℃恒温水浴或孵箱内30分钟，如乳清蛋白与酪蛋白(casein)分离，用干净纱布过滤，再用普通滤纸过滤。按1∶2(W/V)的比例，用缓冲盐水提取液稀释乳清蛋白即为乳清蛋白提取液。

(2)将含有乳清的滤液加3倍丙酮，放入冰箱24h，使乳清沉淀；用离心法除去上清液，再用丙酮浸洗几次，干燥后研细成粉未贮存。提取时按1∶50(W/V)用缓冲盐水提取液在冰箱内提取48小时，每日搅拌或振荡2小时。酪蛋白用丙酮和乙醚反复脱脂、最后研磨，用3号或4号筛筛出，按1∶50(W/V)比例提取。

1.1.2蛋类提取液

蛋白和蛋黄均按1∶20(W/V)的比例用缓冲盐水提取液稀释，充分混匀后直接过滤和除菌，不需提取，亦无需作毒性试验。

蛋黄也可制成干粉，方法是加入丙酮脱脂2-3小时，倾去丙酮层，待挥发干燥后，用打碎机打碎，再用乙醚脱脂4小时备用。蛋黄干粉按1∶50比例(W/V)用缓冲盐水提取液提取。

1.1.3肉类提取液

取新鲜瘦肉，去掉脂肪和结缔组织，剁成碎末，或用绞肉机绞碎。交替用甲苯、二甲苯、丙酮及乙醚等不同溶剂反复脱脂，室温下干燥，过筛，贮存于密闭玻璃瓶中备用。

按1∶25(W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时，提取过程中每日搅拌或振荡2小时。

粗滤后如液体混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。

1.1.4谷物、坚果、豆类蛋白提取液

(1)干燥、去壳、脱皮、磨粉贮存；在索氏提取器中按粉∶正己烷＝1∶10(W/V)的比例脱脂6小时，干燥脱脂粉再磨细贮于-20℃下的密封容器中备用。

(2)脱脂粉用提取缓冲液(含20mmol NaH₂PO₄，1mol/L NaCl，pH7.0)提取蛋白；脱脂粉：提取缓冲液的比例为1g∶10ml(W/V)，室温提取1.5小时，然后4℃下20000g离心30分钟，保存上清液。

1.1.5水果、蔬菜类蛋白提取液

将100g水果(包括果皮、去核)、蔬菜洗净、凉干、切碎后加入150ml20mmol/l PBS(pH7.4)溶液，其中含2％的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)悬浮颗粒，2mmol/l的EDTA，10mmol/l的二乙二硫基氨基甲酸酯(DIECA)钠和3mmol/l的NaN₃，匀浆4℃提取4小时后，12000g4℃下离心30分钟，上清液-20℃下保存。

1.1.6水产类蛋白提取液

取新鲜水产肉，去脂肪，粉碎。用丙酮或乙醚反复脱脂、室温下干燥，过筛，贮存于密闭玻璃瓶中备用。

按1∶25(W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时，提取过程中每日搅拌或振荡2小时。

粗滤后如液体混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。

1.2食物过敏原蛋白的提取

食物过敏原蛋白的粗提取液先经微生物培养检测，农药残留测定，取合格品再经透析、SDS-PAGE电泳免疫印迹确认、割胶、离心提取的较纯的过敏原蛋白组分。

(1)将浸提液在透析袋(MWCO 10000)中对10mmol/L PBS(pH7.2)透析48小时，期间缓缓搅动PBS溶液，并更换PBS液4次；

(2)透析后的过敏原蛋白溶液过0.45μm滤膜，并稀释成4mg/ml的蛋白溶液；

(3)过敏原蛋白溶液灌入SDS-PAGE的胶柱，电泳分离；在分子量10-100kD的区域用病人阳性血清在一个电泳胶柱进行免疫印迹，显色；

(4)切割下其余胶柱过敏原蛋白定位的相应条带，加入适量PBS溶液后，室温2000g离心10分钟；

(5)测出过敏原蛋白溶液的浓度，加入适量防腐剂，-20℃下冷冻贮存。

2.人IgG4标准液的制备

2.1材料

人IgG4抗体：来源于人血浆中经亲和色谱纯化，纯度＞95％的人IgG4抗体(购自美国Meridian life science公司)。

2.2步骤

用样品稀释液将人IgG4抗体配制成浓度为300、100、30、15、3.0、0.30ng/ml人IgG4标准液。

3.包被酶标板

3.1材料

(1)活化处理过的酶标板(Nunc，Nunc-Immuno platesTM，USA或Greiner，Greiner labortechnik，Germany)；

(2)食物过敏原蛋白；

(3)0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)或活化包被液；

(4)0.01mol/L PBS溶液；

(5)3％BSA封闭液；

(6)金属箔袋及真空封口机等。

3.2步骤

(1)用包被液(0.05mol/L碳酸缓冲液，pH9.6或根据食物过敏原蛋白的特性选择的活化包被液)适当稀释过敏原蛋白溶液成0.05μg/ml-10μg/ml的包被浓度，混匀，待包被的活化处理过的酶标板微孔内每孔加入100μl；

(2)酶标板封膜后4℃下反应过夜；

(3)倒掉包被的抗体和抗原溶液，洗板，每孔加入250μl 3％BSA封闭液，4℃下封闭过夜；

(4)倒空封闭液，用洗涤液洗板4次，拍干；

(5)将酶标板真空干燥后，密封入带干燥剂的金属箔袋内，在4℃下贮存。

4.酶标记抗体(辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgG4抗体)的制备

4.1材料

(1)辣根过氧化物酶(HRP，RZ＞3.2，活性＞200U/ml；购自美国Sigmaaldrich公司)；

(2)0.1mol/L NaIO4溶液；

(3)0.2mol/L碳酸缓冲液，pH9.5；

(4)抗人IgG4抗体(购自美国Sigmaaldrich公司)；

(5)4.0mg/ml的NaBH₄溶液；

(6)0.15mol/L的PBS，pH7.4；

(7)Protein A-Sepharose 4 Fast Flow亲和色谱柱材料及色谱柱；

(8)亲和色谱纯化用的柠檬酸、磷酸及Tris缓冲液；

(9)Sephadex G25凝胶色谱柱；

(10)分光光度计等。

4.2步骤

(1)称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，然后加入0.2ml新配的0.1mol/LNaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟；

(2)将上述溶液装入透析袋中，对1mol/L pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；

(3)加20μl 0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上己醛化的HRP溶液的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg抗人IgG4抗体在1ml 0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；

(4)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄液，混匀，4℃下再静置2小时；

(5)将上述溶液装入透析袋中，对0.15mol/L pH7.4 PBS透析，4℃过夜。少量沉淀应离心弃去；

(6)色谱柱中装入2ml Protein A-Sepharose 4 Fast Flow；用5mlpH3.0柠檬酸钠缓冲液清洗柱，接着用10mlpH8.0的磷酸缓冲液清洗；

(7)用Tris调节上述制备的HRP标记的抗人Ig G4抗体溶液的pH值至8.0，以约5ml/小时的速度将标记制备的HRP--抗人IgG4抗体溶液上柱；

(8)用pH8.0的磷酸缓冲液清洗色谱柱，清洗流出液含非免疫球蛋白等杂蛋白；

(9)用10ml 0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液洗脱HRP-抗人IgG4抗体。酶标记抗体洗脱后柱用10ml磷酸缓冲液清洗；

(10)在280nm处监控洗脱液的吸光度，收集大于基线的馏份。收集的馏份迅速用2mol/L Tris溶液中和；

(11)收集的馏份过PD10(Sephadex G25)柱并用PBS交换洗脱馏份的介质溶液；

(12)灭菌后，加入载体蛋白冷冻干燥，收集的酶标记抗体，贮存在4℃以下的暗处。

5.过敏原特异性Ig G4抗体ELISA检测试剂盒的使用方法

(1)酶标板条安装

已包被的酶标板条平衡至室温后，开启包装袋，取出所需检测食物过敏原蛋白包被的酶标板条组合，牢固地安装在酶标板框架上。不需用的酶标板置于包装袋中，驱气密封好，放在2-8℃下贮存。

(2)样品孵育

取100μl人IgG4标准液系列和稀释后的样品液加入到相应的包被酶标板孔中；空白孔中只加入100μl样品稀释液；用膜封好酶标板孔，在37℃下孵育45分钟。

(3)洗板

吸走或倒空孔中液体，洗板4次后拍干。

(4)酶标记抗体孵育

用移液器每孔加入100μl酶标记抗体溶液；封好酶标板，在37℃下孵育反应用45分钟；如步骤(3)洗板4次。

(5)底物反应显色

每孔加入100μlTMB底物显色液，轻轻晃摇30秒钟，室温静置反应15分钟。

(6)终止反应检测

每孔加入100μl终止反应液，20分钟内在酶标仪的450nm波长下测出每孔的吸光度值。

(7)结果计算

计算重复孔的平均吸光度值；以标准溶液系列的平均吸光度值的对数值对相应浓度的对数值进行线性回归，构建剂量-反应曲线；由样品重复孔的平均吸光度值从剂量-反应曲线计算出患者该过敏原的特异性IgG4抗体含量。

实施例2：试剂盒用于过敏患者脱敏治疗过程中特异性IgG4含量的检测。

一名婴儿时就对牛奶过敏的8岁男孩，先双盲试验15天无过敏反应症状，牛奶点刺液皮试阳性IV级，检测血液中牛奶特异性IgE(sIgE)抗体和特异性IgG4(sIgG4)抗体浓度的背景值。第16天开始进行逐渐加量的口服牛奶脱敏制剂治疗，疗程18个月，并于脱敏治疗后的第1、3、6、18个月检测血液中牛奶特异性IgE和IgG4抗体浓度，结果列于下表：

脱敏治疗时间(月)	0	1	3	6	12	18
							sIgE浓度(IU/ml)	62.3±7.1	46.8±5.4	22.2±8.3	20.5±4.6	16.4±6.2	13.7±5.9
sIgG4浓度(μg/l)	120.6±10.3	122.5±11.8	143.8±9.2	145.1±10.8	146.3±12.6	135.9±13.4

上表数据说明：使用本发明的试剂盒可简便、快速、准确地检测出样本中sIgG4含量作为免疫治疗过程中疗效的生物指标。

Claims (3)

1、食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒组成包括已包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白酶标板、人IgG4标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液；

其中：

已包被的奶类食物过敏原蛋白的酶标板包括：牛奶、羊奶；

已包被的蛋类食物过敏原蛋白的酶标板包括：家禽蛋白、家禽蛋黄；

已包被的肉类食物过敏原蛋白的酶标板包括：猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉；

已包被的谷物类食物过敏原蛋白的酶标板包括：玉米、小麦、燕麦、大麦、荞麦、大米、小米；

已包被的坚果类食物过敏原蛋白的酶标板包括：杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、开心果、巴西坚果、芝麻；

已包被的水果类食物过敏原蛋白的酶标板包括：西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡柚、柠檬、苹果、葡萄、梨、草莓、桃；

已包被的蔬菜类食物过敏原蛋白的酶标板包括：芹菜、菠菜、洋葱、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西红柿；

已包被的水产类食物过敏原蛋白的酶标板包括：带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼；鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、虾、蟹、蚌、贻贝、牡蛎、黄鳝、鳗鱼；

已包被的豆类食物过敏原蛋白的酶标板包括：扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆；

酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的抗人IgG4单克隆抗体；

TMB底物显色液：2.08mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，12mmol/L过氧化氢，10mmol/L β-环糊精，0.1mol/L pH5.0的醋酸缓冲液。

样品稀释液：10mmol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；

浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；

终止反应液：1.0mol/L H₂SO₄。

2、根据权利要求1所述的食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于所说的酶标板为96孔。

3.权利要求1所述的食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)食物过敏原蛋白的制备：将含过敏原蛋白的食物材料经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥；

(2)酶标记抗体的制备：用辣根过氧化物酶标记纯化的抗人IgG4抗体；

(3)配制人IgG4标准液、TMB底物显色液、浓缩洗涤液和终止反应液；

(4)酶标板包被：用抗人IgG4抗体和食物过敏原蛋白包被酶标板，并封闭。