CN102539748A - 一种利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其采用的酶联板通过如下步骤制备得到：（ 1 ）、将不同种类的抗原或抗体以及它们的混合标准抗原或抗体按浓度 0.01 ～ 50μg/ml 溶于碳酸、磷酸或醋酸缓冲液中，混匀，制得包被液；（ 2 ）、将包被液按设定的排列顺序加入到酶标板的孔内，每孔加一种包被液， 4 ℃孵育过夜，或 37 ℃孵育 1 ～ 5 小时，进行包被；（ 3 ）、用溶解有吐温的磷酸盐缓冲液清洗酶标板，之后，再在酶标板的孔内加入封闭液， 4 ℃孵育过夜，或在室温或 37 ℃孵育 1 ～ 5 小时，进行封闭；封闭后，弃去孔内液体，干燥，即得。本发明利用一块酶联板即可实现多种指标的同时检测，无需特殊的设备，检测效率高，成本低 。

Description

一种利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法

技术领域

本发明涉及一种多指标酶联免疫吸附检测方法。

背景技术

酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。

现有的ELISA检测方法都是单一指标的检测，但随着科技的进步，体外诊断行业的发展，人民生活水平的提高以及对医疗健康的重视，疾病的诊断自然成为国家重点扶持和发展的领域之一。许多单一指标的诊断已不能使医生为疾病的诊疗做出科学的判断，往往错过了最佳的治疗期，使病情进一步恶化，甚至病人因此失去了生命。而多指标诊断(如肿瘤标志物、TORCH、传染病、食物过敏原、自身抗体等)可为医生提供更多的判断依据，从而做出准确的判断，为及时进行有效的治疗提供有力的帮助。因此，多指标诊断已成为体外诊断行业发展的另一方向，具有广阔的市场。

多指标诊断的常用方法为芯片法，但由于芯片法需要昂贵的仪器设备，属于微量检测，对环境和操作要求很高，需专业的操作人员，而且实验的重复性很差，直接影响到临床的推广使用。目前能用于临床检测芯片产品少之又少，大部分产品也仅限于科研使用。芯片法虽然是多指标检测的常用方法，各国都投入了巨大的资金和人力，但由于技术还不是很成熟，短期内在临床推广还困难重重。因此，目前临床中进行多指标检测常常只能采取多种单一指标检测的试剂盒同时检测的方法，但该方法操作繁复，成本昂贵，费时又费力，不能较好地满足临床应用的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其采用的酶联板通过如下步骤制备得到：

(1)、将不同种类的抗原或抗体以及它们的混合标准抗原或抗体按浓度0.01～50μg/ml溶于碳酸、磷酸或醋酸缓冲液中，混匀，制得包被液；

(2)、将步骤(1)制备的包被液按设定的排列顺序加入到酶标板的孔内，每孔加一种包被液，4℃孵育过夜，或37℃孵育1～5小时，进行包被；

(3)、用溶解有吐温的磷酸盐缓冲液清洗酶标板，之后，再在酶标板的孔内加入封闭液，4℃孵育过夜，或在室温或37℃孵育1～5小时，进行封闭；封闭后，弃去孔内液体，干燥，即得酶联板。

优选地，步骤(2)中，每孔内加入的包被液的体积为50～200μl。步骤(3)中，每孔内加入的封闭液的体积为50～200μl。

根据本发明的进一步实施方案：所述检测方法依次包括如下步骤：

(1)、取酶联板，在其孔中加入血清稀释液、标准品、阳性质控和稀释了的血清样本；

(2)、用封口膜或塑料袋封闭酶联板，置室温或37℃孵育0.5～3小时；

(3)、用清洗液清洗酶联板的孔，然后加入酶结合液，置室温或37℃孵育0.5～3小时；

(4)、用清洗液清洗酶联板的孔，在所有反应孔中加入显色液，用封口膜或塑料袋封闭酶联板，置室温或37℃孵育10～60分钟；

(5)、在所有孔内加入终止液，用酶标仪测定吸光度值。

根据本发明，多指标酶联免疫吸附检测的检测原理与单一指标酶联免疫吸附检测的检测原理是相同的，因此，上述的血清稀释液、标准品、阳性质控、清洗液、酶结合液、显色液、终止液等溶液均可以参照单一指标酶联免疫吸附检测所用的溶液来配制。

根据一个具体方面，阳性质控由阳性血清溶于缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)中制得。酶结合液的制备过程为：称取载体蛋白或量取动物血清，溶于缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)中，配制酶稀释液，然后将辣根过氧化物标记物溶于酶稀释液中配制得到所述酶结合液。显色液由底物液A和底物液B在使用前混合得到，其中底物液A由四甲基联苯胺溶于柠檬酸缓冲液中得到；所述底物液B由过氧化氢溶于醋酸盐缓冲液中得到。

样本稀释液由载体蛋白或动物血清溶于缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)中得到。清洗液由吐温溶于磷酸盐缓冲液中，并稀释后得到。终止液由硫酸溶于纯水中制得。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明利用一块酶联板即可实现多种指标的同时检测，无需特殊的设备，一般的实验室均可进行，操作简单，多种数据一次性获得，提高了检测效率，降低了检测误差，技术上也简单可行，重复性好，可靠性高，为医生对疾病的确诊，疾病严重程度的判定与指导治疗提供了多种有力的依据，减少了检测时间，节约了成本。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明。

本实施例提供一种7种食物过敏原IgG抗体检测方法，其包括制备检测试剂盒的步骤和使用检测试剂盒进行检测的步骤。其中：

制备检测试剂盒的步骤如下：

(1)、将7种食物过敏原(鳕鱼、蟹、蛋清/蛋黄、蘑菇、牛奶、虾、西红柿)和混合标准抗原按5μg/ml溶于50mM的碳酸缓冲液中，混匀，配制包被液。

(2)、将配制好的包被液按竖行排列顺序加入96T酶标板的孔内(每孔100μl)，第一孔为混合标准抗原包被液，其次各孔依次为鳕鱼、蟹、蛋清/蛋黄、蘑菇、牛奶、虾、西红柿过敏原包被液，4℃孵育过夜，进行包被。

(3)、用溶解有吐温的磷酸盐缓冲液洗板3次后，再在酶标板的孔内加入封闭液(含2％BSA的磷酸盐缓冲液)，每孔200μl，4℃孵育过夜，进行封闭。

(4)、弃去孔内液体，室温过夜干燥酶联板，干燥后将酶联板封入铝箔袋中。

(5)、称取10gBSA溶于1升50mM磷酸盐缓冲液中配制样本稀释液，按15ml每瓶进行分装。

(6)、称取10gBSA溶于1升50mM磷酸盐缓冲液中配制酶稀释液，将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(1∶1000)溶于酶稀释液中配制酶结合液，按15ml每瓶进行分装。

(7)、称取0.2g四甲基联苯胺(TMB)溶于1升柠檬酸缓冲液中配制显色液，按6ml每瓶进行分装；量取0.6ml过氧化氢溶于1升醋酸盐缓冲液中配制底物液，按6ml每瓶进行分装。

(8)、量取10ml吐温溶于1升磷酸盐缓冲液中配制浓缩清洗液，按50ml每瓶进行分装。

(9)、量取50ml硫酸溶于1升纯水中配制终止液，按6ml每瓶进行分装。

(10)、量取阳性血清(1∶1200)溶于磷酸盐缓冲液中配制标准血清，按1ml每瓶进行分装。

(11)、量取阳性血清(1∶3000)溶于磷酸盐缓冲液中配制阳性质控，按1ml每瓶进行分装。

(12)、按照试剂盒的组分贴上标签，将酶联板、样本稀释液、酶结合液、标准血清、阳性质控、浓缩清洗液、底物液A和B、终止液、说明书放入试剂盒的相应位置，组装成完整的试剂盒。

使用上述制备的检测试剂盒进行检测的步骤如下(使用前将实施例1中所有试剂平衡至室温)：

(1)准备绘制标准曲线：取5支1ml管，依次在这4个管中加入150μl血清稀释液。在第一管中加入150μl标准血清。混合后，取150μl加入到第二管中；再混合后，取150μl加入到第三管中；同样混合后，取150μl加入到第四管中，同样混合后，取150μl加入到第五管中。从每管中各取100μl加入到酶联板内相应的标准孔中。

(2)、将浓缩清洗液按1∶20稀释，混匀，配得清洗缓冲液。

(3)、使用前30分钟将底物液A和B等比例混合制得显色液。

(4)、在酶联板相应孔中加入100μl阳性质控。

(5)、在酶联板样本孔中加入100μl样本稀释液，然后加入10μl患者血清，用封口膜或塑料袋封闭酶联板，置37℃孵育1小时。

(6)、孵育后，用清洗缓冲液清洗每个孔，清洗5次，在所有孔中加入100μl酶结合液，置37℃孵育30分钟。

(10)、孵育后，用清洗缓冲液清洗每个孔，清洗5次，在所有孔中加入100μl显色液，封闭酶联板，置37℃孵育10分钟，在所有孔中加入50μl终止液。

(11)、用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度值。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一种利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：该方法采用的酶联板通过如下步骤制备得到：

（1）、将不同种类的抗原或抗体以及它们的混合标准抗原或抗体按浓度0.01～50μg/ml溶于碳酸、磷酸或醋酸缓冲液中，混匀，制得包被液；

（2）、将步骤（1）制备的包被液按设定的排列顺序加入到酶标板的孔内，每孔加一种包被液，4℃孵育过夜，或37℃孵育1～5小时，进行包被；

（3）、用溶解有吐温的磷酸盐缓冲液清洗酶标板，之后，再在酶标板的孔内加入封闭液，4℃孵育过夜，或在室温或37℃孵育1～5小时，进行封闭；封闭后，弃去孔内液体，干燥，即得酶联板。

2. 根据权利要求1所述的利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：步骤（2）中，每孔内加入的包被液的体积为50～200μl。

3. 根据权利要求1所述的利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：步骤（3）中，每孔内加入的封闭液的体积为50～200μl。

4. 根据权利要求1所述的利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：所述方法依次包括如下步骤：

（1）、取酶联板，在其孔中加入血清稀释液、标准品、阳性质控和稀释了的血清样本；

（2）、用封口膜或塑料袋封闭酶联板，置室温或37℃孵育0.5～3小时；

（3）、用清洗液清洗酶联板的孔，然后加入酶结合液，置室温或37℃孵育0.5～3小时；

（4）、用清洗液清洗酶联板的孔，在所有反应孔中加入显色液，用封口膜或塑料袋封闭酶联板，置室温或37℃孵育10～60分钟；

（5）、在所有孔内加入终止液，用酶标仪测定吸光度值。

5. 根据权利要求4所述的利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：所述阳性质控由阳性血清溶于缓冲液中制得。

6. 根据权利要求4所述的利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：所述酶结合液的制备过程为：称取载体蛋白或量取动物血清，溶于缓冲液中，配制酶稀释液，然后将辣根过氧化物标记物溶于酶稀释液中配制得到所述酶结合液。

7. 根据权利要求4所述的利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：所述的显色液由底物液A和底物液B在使用前混合得到，其中底物液A由四甲基联苯胺溶于柠檬酸缓冲液中得到；所述底物液B由过氧化氢溶于醋酸盐缓冲液中得到。

8. 根据权利要求4所述的利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：所述的样本稀释液由载体蛋白或动物血清溶于缓冲液中得到。

9. 根据权利要求4所述的利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：所述的清洗液由吐温溶于磷酸盐缓冲液中，并稀释后得到。

10. 根据权利要求4所述的利用酶联板进行多指标酶联免疫吸附检测的方法，其特征在于：所述终止液由硫酸溶于纯水中制得。