KR20140145121A - 면역분석 방법 및 시약 - Google Patents

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Abstract

항원을 고감도이며 또한 정확하게 측정할 수 있는 면역분석 방법 및 그것을 위한 시약이 개시되어 있다. 면역분석 방법은 폴리카르복실산형 계면활성제의 존재 하에서 항원항체반응 및/또는 측정을 행한다. 이 방법에 사용되는 면역분석 시약은 폴리카르복실산형 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 한다. 반응 및/또는 측정계에 폴리카르복실산형 계면활성제를 존재시킨다고 하는 간이한 수단에 의해, 고감도의 면역분석에 있어서도 비특이 반응을 효과적으로 억제할 수 있고, 면역분석에 있어서 항원을 정확하게 측정할 수 있어 특이성이 향상된다.

Description

면역분석 방법 및 시약{IMMUNOLOGICAL ANALYSIS METHOD AND REAGENT}
본 발명은 면역분석 방법 및 그것을 위한 시약에 관한 것이다.
면역분석 방법은 혈청, 혈장, 소변, 대변, 골수액 등의 임상검사에서 널리 사용되고, 최근 간편·신속하게 측정을 행할 수 있기 때문에 반응에서 측정까지를 일괄해서 자동으로 행하는 자동분석장치가 범용되고 있다.
면역분석 방법은 항원항체반응을 이용한 측정법에서 특이성이 높은 측정법인 것이 알려져 있다. 그러나 시료에 따라서는 의양성 또는 의음성 등의 비특이 반응이 일어나는 문제가 있었다. 예를 들면, 항체를 인식해서 반응하는 인자가 시료 중에 존재할 경우가 있고, 이러한 경우에는 시료 중에 측정하려고 하는 항원이 존재하지 않아도 양성의 측정값으로 되고, 또한 한편으로 시료 중의 항원항체반응을 방해하는 인자가 존재할 경우가 있고, 이러한 경우에는 시료 중에 측정하려고 하는 항원이 존재해도 소극적인 측정값으로 되는 등, 참값과는 다른 측정값을 나타낸다고 하는 문제가 있었다.
비특이 반응을 억제하는 방법으로서 인간 IgM 자연항체나, 술폰기 또는 그 염을 갖는 방향족 모노머가 중합된 폴리머를 첨가하는 것이 알려져 있었다(특허문헌 1, 특허문헌 2 참조). 그러나, 이들 첨가제로는 불충분한 것이 있고, 특히 저농도역에서의 비특이 반응 억제는 곤란한 상태이었다. 또한 고감도로 한 시약에 있어서는 항체의 반응성을 향상시키고 있기 때문에 비특이 반응이 일어나기 쉬운 상황이었다.
일본 특허 4065600호 공보 일본 특허 4580180호 공보
본 발명의 목적은, 면역분석에 있어서 항원을 고감도이며 또한 정확하게 측정할 수 있는 면역분석 방법 및 그것을 위한 시약을 제공하는 것이다.
본원 발명자는 예의 연구의 결과, 면역분석에 있어서 폴리카르복실산형 계면활성제를 존재시킴으로써 고감도의 측정이라도 용이하게 비특이 반응을 억제할 수 있는 것을 찾아냈다.
즉, 본 발명은 이하의 1)∼9)에 관련되는 것이다.
1) 폴리카르복실산형 계면활성제의 존재 하에서 항원항체반응 및/또는 측정을 행하는 면역분석 방법.
2) 상기 폴리카르복실산형 계면활성제가 (1)말레산 및/또는 무수 말레산 또는 그 염과 (2)디이소부틸렌의 공중합체인 1)의 방법.
3) 상기 폴리카르복실산형 계면활성제가 존재하는 반응계 및/또는 측정계에 있어서의 상기 폴리카르복실산형 계면활성제의 농도가 0.001%∼3%인 1) 또는 2)의 방법.
4) 항원항체반응의 개시로부터 측정 완료까지를 상기 폴리카르복실산형 계면활성제의 존재 하에서 행하는 1)∼3) 증 어느 하나의 방법.
5) 면역분석 방법이 면역응집법인 1)∼4)의 어느 하나의 방법.
6) 면역응집법이 라텍스 응집법인 5)의 방법.
7) 1)의 방법에 사용되는 면역분석 시약으로서, 폴리카르복실산형 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역분석 시약.
8) 상기 폴리카르복실산형 계면활성제가 (1)말레산 및/또는 무수 말레산과 (2)디이소부틸렌의 공중합체인 7)의 시약.
9) 면역응집법을 위한 시약을 더 포함하는 면역응집용 시약인 7) 또는 8)의 시약.
10) 라텍스 응집법을 위한 시약을 더 포함하는 라텍스 응집용 시약인 9)의 시약.
(발명의 효과)
본 발명의 방법에 의하면, 반응 및/또는 측정계에 폴리카르복실산형 계면활성제를 존재시킨다고 하는 간이한 수단에 의해, 고감도의 면역분석에 있어서도 비특이 반응을 효과적으로 억제할 수 있고, 면역분석에 있어서 항원을 정확하게 측정할 수 있어 특이성이 향상된다.
도 1은 하기 실시예 및 비교예에 있어서 작성한 검량선(캘리브레이션 커브)을 나타낸다.
도 2는 하기 실시예의 면역분석 방법과, 비특이 반응이 억제되는 것이 알려져 있는 시판의 시약(기존 시약)을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 3은 도 2의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 4는 하기 비교예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 5는 도 4의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 6은 하기 비교예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 7은 도 6의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 8은 하기 비교예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 9는 도 8의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 10은 하기 실시예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 11은 도 10의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 12는 하기 실시예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 13은 도 12의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 14는 하기 실시예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 15는 도 14의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 16은 하기 실시예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 17은 도 16의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 18은 하기 비교예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 19는 도 18의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 20은 하기 실시예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 21은 도 20의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 22는 하기 실시예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 23은 도 22의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
도 24는 하기 실시예의 면역분석 방법과 기존 시약을 사용한 면역분석 방법의 측정 결과의 상관 관계를 나타낸다.
도 25는 도 24의 저농도역을 확대해서 나타낸다.
이하, 본 발명의 방법에 대하여 설명한다. 또한, 본 명세서 중의 「%」는 특별히 언급하지 않는 한 질량기준(w/v%)을 의미한다.
본 발명의 면역분석 방법은 검체 중의 피측정 물질에 대하여 면역적으로 반응하는 면역분석 시약을 이용하여 항원항체반응을 행하고, 얻어진 반응물을 측정하는 면역분석 방법에 있어서, 폴리카르복실산형 계면활성제의 존재 하에서 반응 및/또는 측정을 행하는 것을 특징으로 하는 것이다.
면역분석의 방법 자체는 주지이다. 본 발명의 방법이 적용되는 면역분석 방법이란, 공지의 어떠한 면역분석 방법이라도 좋지만, 그 중에서도 면역응집법이 바람직하고, 특히 불용성 담체 입자로서 라텍스 입자를 사용하는 라텍스 응집법이 바람직하다. 면역응집법에 있어서 감작 입자의 응집을 검출하는 방법은 주지이며, 본 발명에 있어서도 감작 입자의 응집에 의한 흡광도 또는 광산란 등을 검출하는 방법 등의 주지의 방법이 사용 가능하다. 예를 들면, 면역비탁법(TIA법, 라텍스 응집법), 비색법, PRLA법, CL법 및 면역크로마토그래피법 등을 들 수 있고, 감도가 높고 정량 정밀도가 좋은 비탁법 및 비색법이 적합하게 사용된다.
상기 면역분석 방법의 형태로서는, 사용하는 불용성 담체 입자는 특별하게 한정되지 않고, 면역분석 시약에 종래 사용되고 있는 주지의 것이면 된다. 예를 들면, 폴리에틸렌이나 폴리스티렌 등의 라텍스 입자, 알루미나 입자, 실리카 입자, 금 콜로이드, 자성 입자 등의 입자를 들 수 있다. 이들 불용성 담체 중에서는 라텍스 입자, 특히 폴리스티렌 라텍스 입자가 적합하게 사용된다. 면역응집법은 항원 또는 항체를 감작한 감작 입자의 응집을 광학적으로 검출하는 방법으로서 주지이며, 검출에는 비탁법 또는 비색법이 적합하게 사용된다. 예를 들면, 셀 외부로부터 가시광에서 근적외역의 광, 예를 들면 통상 300∼1000㎚, 바람직하게는 500∼900㎚의 광을 조사하고, 흡광도 변화 또는 산란광의 강도 변화를 검출함으로써 상기 감작 입자의 응집의 정도가 측정된다. 라텍스 입자로서 특히 폴리스티렌 라텍스 입자가 적합하게 사용된다. 라텍스 입자의 사이즈는 특별하게 한정되지 않지만, 입경은 30∼600㎚인 것이 바람직하다.
상기한 라텍스 입자에, 측정해야 할 항원과 면역적으로 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 고정화한다. 고정화의 방법도 주지이며, 물리흡착 또는 공유결합 등의 주지의 방법에 의해 행하여진다. 얻어진 감작 입자의 현탁액과 피검시료를 혼합하면 피검시료 중에 포함되는 피측정 물질(항원)에 의해 감작 입자가 응집되어 감작 입자 현탁액의 흡광도가 변화된다. 이 흡광도의 변화량(엔드포인트법) 또는 변화율(레이트법)을 측정한다. 측정해야 할 항원을 여러 가지 기지 농도로 포함하는 복수의 표준시료를 준비하고, 그것들에 대해서 상기 방법에 의해 흡광도의 변화량 또는 변화율을 측정한다. 표준시료 중의 측정해야 할 항원의 농도를 가로축, 측정된 흡광도의 변화량 또는 변화율을 세로축에 플롯해서 검량선을 그린다. 미지의 피검시료에 대해서도 같은 방법에 의해 흡광도의 변화량 또는 변화율을 측정하고, 측정 결과를 상기 검량선에 적용함으로써 피검시료 중의 항원을 정량할 수 있다.
또한, 이러한 면역응집법을 행하는 자동장치가 여러가지 시판되고 있고, 시판의 면역응집용 자동장치를 이용하여 용이하고, 간편하게 행할 수 있다.
본 발명에 있어서의 면역분석에 의한 피측정 물질로서는 면역분석에 의해 측정 가능한 물질이면 조금도 한정되지 않지만, 피측정 물질이 항원일 경우, 예를 들면 CRP(C-반응성 단백질), 전립선 특이항원, 페리틴, β-2마이크로글로불린, 미오글로빈, 헤모글로빈, 알부민, 크레아티닌 등의 단백질 마커, IgG, IgA, IgM 등의 면역글로불린, 각종 종양 마커, LDL, HDL, TG 등의 리포단백질, A형 인풀루엔자 바이러스, B형 인풀루엔자 바이러스, RS 바이러스(RSV), 라이노바이러스, 로타바이러스, 노로바이러스, 아데노바이러스, 아스트로바이러스, HAV, HBs, HCV, HIV, EBV 등의 바이러스 항원, 클라미디아 트라코마티스, 용련균, 백일해균, 헬리코박터 파일로리, 렙토스피라, 트레포네마 팔리둠, 톡소플라즈마 곤디이, 보렐리아, 레지오넬라속균, 탄저균, MRSA 등의 세균 항원, 세균 등이 생산하는 독소, 마이코플라스마 지질 항원, 인간 융모제 고나도트로핀 등의 펩티드 호르몬, 스테로이드 호르몬 등의 스테로이드, 에피네프린이나 모르핀 등의 생리활성 아민류, 비타민B류 등의 비타민류, 프로스타글란딘류, 테트라사이클린 등의 항생물질, 농약, 환경 호르몬 등을 들 수 있지만 이것들에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 예로서, CRP, 전립선 특이항원, 페리틴, β-2마이크로글로불린 및 헤모글로빈 등의 항원을 들 수 있다.
피측정 물질이 항체일 경우, 상기 단백질 마커, 각종 종양 마커, 리포단백질, 바이러스 항원, 세균 항원, 세균 등이 생산하는 독소, 펩티드호르몬, 스테로이드, 생리활성 아민류, 비타민류, 항생물질, 농약, 환경 호르몬 등의 항원과 특이적으로 반응하는 항체 등을 들 수 있다.
면역분석에 사용되는 검체는 피측정 물질을 포함하는 것이면 특별하게 한정되지 않지만, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 대변, 타액, 조직액, 골수액, 면봉액 등의 체액 등 또는 그 희석물을 들 수 있고, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 대변, 골수액 또는 이들 희석물이 바람직하다.
상기와 같이, 본 발명의 방법에서는 반응계 및/또는 측정계에 있어서 폴리카르복실산형 계면활성제가 존재하는 상태 하에서 항원항체반응 및/또는 측정을 행하는 것을 특징으로 하고 있다. 「폴리카르복실산형 계면활성제」는 1분자 중에 복수의 카르복실기 또는 그 염, 및/또는 산 무수물기를 갖는(산 무수물기의 적어도 일부는 수중에서 가수분해해서 카르복실기를 발생시키므로, 수중에서는 1분자 중에 복수의 카르복실기를 갖는다) 고분자로 이루어지는 계면활성제로서 알려져 있는, 음이온 계면활성제의 일종이며, 여러 가지 것이 공지로 시판되고 있으며, 공업적으로 사용되고 있다. 본 발명에서는 모든 폴리카르복실산형을 사용할 수 있지만, 그 중에서도 (1)말레산 및/또는 무수 말레산과 (2)디이소부틸렌의 공중합체, 및/또는 그 염이 바람직하다. 여기에서, 염으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 나트륨염이 바람직하다. 이러한 공중합체 또는 그 염은 공업적으로 널리 이용되고 있고, 시판도 되고 있으므로, 본 발명에 있어서도 시판품을 바람직하게 이용할 수 있다(하기 실시예 참조).
폴리카르복실산형 계면활성제의 중량 평균 분자량은 특별하게 한정되지 않지만, 1000∼5만 정도의 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서 상기 폴리카르복실산형 계면활성제는 항원항체반응의 개시로부터 항원항체반응량의 검출·정량이 종료될 때까지 중 어느 하나의 단계에서 폴리카르복실산형 계면활성제가 반응 및/또는 측정계(「반응·측정계」라고도 칭한다) 내에 포함되어 있으면 되지만, 항원항체반응의 개시로부터 검출·정량까지의 사이에 걸쳐서 포함되어 있는 것이 바람직하다. 따라서, 폴리카르복실산형 계면활성제는 항원항체반응의 개시 전 또는 개시와 동시에 반응계 내에 첨가하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 검체를 희석할 때에 첨가해도 좋고, 항체 또는 항원과 검체를 혼합할 때에 첨가해도 좋다.
또한, 면역분석에 사용하는 각종 시약에 미리 폴리카르복실산형 계면활성제를 함유시키는 것이라도 좋고, 본 발명은 이러한 폴리카르복실산형 계면활성제를 함유한 면역분석 시약을 제공하는 것이기도 하다. 여기에서, 면역분석에 사용하는 각종 시약으로서는, 예를 들면 검체 희석액, 항체/항원 희석액, 고상화 항체/항원, 감작 입자 현탁액, 세정액, 효소액, 기질액, 검량선 작성용의 피검물질 표준액 등을 들 수 있고, 폴리카르복실산형 계면활성제를 함유한 면역분석 시약으로서는 이들 시약에 폴리카르복실산형 계면활성제를 첨가한 것, 예를 들면 검체를 희석하는 완충액이나, 항체 또는 항원을 포함하는 시약 등에 폴리카르복실산형 계면활성제를 함유시킨 것을 들 수 있다.
또한, 예를 들면 항체 또는 항원을 고정화(감작)한 라텍스 입자(감작 입자)를 포함하는 면역응집 시약에 폴리카르복실산형 계면활성제를 함유시켜 둘 수 있다. 이 경우, 면역분석 시약 중의 감작 입자의 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 0.01∼0.5%인 것이 바람직하다. 감작 입자 부유액 중의 항체량 및 항원량은 상법과 같아도 좋으며, 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 항체 감작 라텍스의 경우, 항체량은 라텍스 부유액 중에 0.01∼2.0mg/mL로 하는 것이 바람직하다.
폴리카르복실산형 계면활성제의 반응·측정계 내에 있어서의 농도는 비특이 반응 억제의 점으로부터, 바람직하게는 0.001∼3%이며, 더욱 바람직하게는 0.005∼1%이다. 따라서, 면역분석 시약에 미리 폴리카르복실산형 계면활성제를 함유시킬 경우에는 반응 및/또는 측정계 내에서의 농도가 상기 농도로 되도록 면역분석 시약에 함유시키면 좋다.
면역분석에 사용되는 블랭크 시료는 피측정 물질을 포함할 수 없는 것이면 특별하게 한정되지 않지만, 정제수, 생리식염액, 완충액, 음성 검체 또는 그 희석 물이 바람직하다.
후기 실시예에 기재되는 바와 같이, 폴리카르복실산형 계면활성제를 반응 및/또는 측정계 내에 존재시켰을 경우 비특이 반응이 억제된다. 그리고, 특이성은 폴리카르복실산형 계면활성제를 존재시키지 않을 경우에 비하여 우위로 향상된다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용함으로써 특히 비특이 반응이 일어나기 쉬운 고감도화한 시약에 있어서는 종래보다 시약 성능을 향상시키는 것이 가능하게 된다.
이하, 본 발명을 실시예 및 비교예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 무엇보다, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1, 비교예 1∼3
(1) 시약의 조제
페리틴에 대한 항체를 이용하여 이하와 같이 면역응집법에 의한 측정 시약을 조제했다.
i) 항페리틴 항체를 평균 입경 300㎚의 폴리스티렌 라텍스 부유액 1mL에 대하여 0.03mg 담지시켜서 이루어지는 감작 입자를, 완충액(트리스, pH8.0)에 0.04%로 되도록 현탁하여 라텍스 부유액을 조제했다.
ii) 완충액(트리스, pH8.5)에 폴리카르복실산형 계면활성제(말레산·디이소부틸렌 공중합체 나트륨)를 첨가하고, 하기의 시약 A를 조제했다(실시예 1). 비교예 1∼3으로서 아무것도 첨가하지 않거나, 또는 다른 첨가제를 더욱 첨가한 시약 B∼D를 조제했다.
예 시약 첨가제(농도)
실시예 1 A +말레산·디이소부틸렌 공중합체 나트륨*1 1.0%
비교예 1 B 없슴
비교예 2 C +정상 토끼 글로불린 3g/L
비교예 3 D +폴리스티렌술폰산 나트륨*2 1.0%
*1: 폴리카르복실산형 계면활성제(음이온성 계면활성제)「폴리스타 OM」(상품명, 니치유 가부시키가이샤로부터 시판)
*2: 음이온성 계면활성제「PS-5」(상품명, 토소 가부시키가이샤로부터 시판)
(2) 자동분석장치에 의한 측정
자동분석장치는 히타치사 7180형 자동분석장치에 의해 엔드포인트법으로 자동측정을 행했다.
상술의 시약 A∼D를 이용하여 비특이 반응을 일으키는 것으로 알려져 있는 RF 양성 검체를 포함하는 혈청 24검체의 측정을 행하였다. 검체 용액 10.0μL에 시약 A∼D의 상기에서 조제한 완충액 100μL를 첨가하고, 이 혼합액을 37℃에서 교반 혼합했다. 5분간 방치 후, 라텍스 부유액 100μL를 첨가하여 37℃에서 더 교반 혼합했다. 약 5분간의 응집 반응을 흡광도 변화량으로서 측정하고, 검량선으로부터 각 검체의 페리틴 농도를 산출했다.
(3) 기존 시약과의 감도 비교
상기 실시예 1 및 비교예 1∼3의 측정 감도와, 비특이 반응이 억제되어 있는 것을 알고 있는 기존의 시판 라텍스 시약인 FER-라텍스 X2 「세이켄」 CN(덴카세이켄) (이하, 「기존 시약」)의 감도의 비교를 행하였다. 결과를 도 1 나타낸다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1∼3의 방법에서는 기존 시약을 사용한 방법과 비교하여 같은 페리틴 농도이면 흡광도 변화량이 커져 있고, 실시예 1 및 비교예 1∼3의 방법의 쪽이 측정 감도가 높은 것을 알 수 있다.
(4) 기존 시약과의 특이성 비교
상기 실시예 1 및 비교예 1∼3의 측정 결과와 상기 기존 시약을 사용한 방법의 측정 결과를 비교했다. 결과를 도 2∼도 9에 각각 나타낸다.
기존 시약은 비특이 반응이 억제되어 있는 시약인 것이 알려져 있다. 실시예 1의 결과를 나타내는 도 2 및 도 3과, 각 비교예의 결과를 나타내는 도 4∼도 9를 비교하면, 고감도화한 면역분석 방법에 있어서 폴리카르복실산형 계면활성제를 첨가함으로써 비특이 반응이 억제되어, 기존 시약을 사용했을 경우의 측정 결과와의 상관이 향상되는 것이 나타내어졌다. 특히, 저농도영역에서 향상되는 것이 나타내어졌다.
실시예 2∼5, 비교예 4
(1) 시약의 조제
페리틴에 대한 항체를 이용하여 이하와 같이 면역응집법에 의한 측정 시약을 조제했다.
i) 항페리틴 항체를 평균 입경 300㎚의 폴리스티렌 라텍스 부유액 1mL에 대하여 0.03mg 담지시켜서 이루어지는 감작 입자를, 완충액(트리스, pH8.0)에 0.04%가 되도록 현탁하여 라텍스 부유액을 조제했다.
ii) 완충액(트리스, pH 8.5)에 폴리카르복실산형 계면활성제[말레산·디이소부틸렌 공중합체 나트륨, 「폴리스타 OM」(상품명, 니치유 가부시키가이샤로부터 시판)]를 첨가하고, 하기의 시약 E∼H를 조제했다(실시예 2∼5). 비교예 4로서 아무것도 첨가하지 않는 시약 I를 조제했다.
예 시약 첨가제(농도)
실시예 2 E +말레산·디이소부틸렌 공중합체 나트륨 0.1%
실시예 3 F +말레산·디이소부틸렌 공중합체 나트륨 0.5%
실시예 4 G +말레산·디이소부틸렌 공중합체 나트륨 1.0%
실시예 5 H +말레산·디이소부틸렌 공중합체 나트륨 2.0%
비교예 4 I 없슴
(2) 자동분석장치에 의한 측정
자동분석장치는 히타치사 7180형 자동분석장치에 의해 엔드포인트법으로 자동측정을 행하였다.
상술의 시약 E∼I를 이용하여 비특이 반응을 일으키는 것으로 알려져 있는 RF 양성 검체를 포함하는 혈청 24검체의 측정을 행하였다. 검체 용액 10.0μL에 시약 E∼I의 상기에서 조제한 완충액 100μL를 첨가하고, 이 혼합액을 37℃에서 교반 혼합했다. 5분간 방치 후, 라텍스 부유액 100μL를 첨가하여 37℃에서 더 교반 혼합했다. 약 5분간의 응집 반응을 흡광도 변화량으로서 측정하고, 검량선으로부터 각 검체의 페리틴 농도를 산출했다.
(3) 기존 시약과의 비교
상기 실시예 2∼5 및 비교예 4의 측정 결과와 상기 기존 시약을 사용한 방법의 측정 결과를 비교했다. 결과를 도 10∼도 19에 각각 나타낸다.
기존 시약은 비특이 반응이 억제되어 있는 시약인 것이 알려져 있다. 실시예 2∼5의 결과를 나타내는 도 10∼도 17과, 비교예 4의 결과를 나타내는 도 18∼도 19를 비교하면, 고감도화한 면역분석 방법에 있어서 폴리카르복실산형 계면활성제를 첨가함으로써 비특이 반응이 억제되어, 기존 시약을 사용했을 경우의 측정 결과와의 상관이 향상되는 것이 나타내어졌다. 특히 저농도영역에서 향상되는 것이 나타내어졌다.
실시예 6, 실시예 7, 비교예 5
(1) 시약의 조제
페리틴에 대한 항체를 이용하여 이하와 같이 면역응집법에 의한 측정 시약을 조제했다.
i) 항페리틴 항체를 평균 입경 300㎚의 폴리스티렌 라텍스 부유액 1mL에 대하여 0.03mg 담지시켜서 이루어지는 감작 입자를, 완충액(트리스, pH 8.0)에 0.04%로 되도록 현탁하여 라텍스 부유액을 조제했다.
ii) 완충액(트리스, pH8.5)에 폴리카르복실산형 계면활성제를 첨가하고, 하기의 시약 J(실시예 6), 시약 K(실시예 7)를 조제했다. 비교예 5로서 아무것도 첨가하지 않는 시약 L을 조제했다.
예 시약 첨가제(농도)
실시예 6 J +말레산·디이소부틸렌 공중합체 나트륨*1 1.0%
실시예 7 K +폴리카르복실산형 계면활성제*2 1.0%
비교예 5 L 없슴
*1: 폴리카르복실산형 계면활성제(음이온성 계면활성제)「폴리스타 OM」(상품명, 니치유 가부시키가이샤로부터 시판)
*2: 폴리카르복실산형 계면활성제(상품명 「데몰 EP」, 카오 가부시키가이샤로부터 시판)
(2) 자동분석장치에 의한 측정
자동분석장치는 히타치사 7180형 자동분석장치에 의해 엔드포인트법으로 자동측정을 행하였다. 상술의 시약 J∼L을 이용하여 비특이 반응을 일으키는 것으로 알려져 있는 RF 양성 검체를 포함하는 혈청 24검체의 측정을 행하였다. 검체 용액 10.0μL에 시약 J∼L의 상기에서 조제한 완충액 100μL를 첨가하고, 이 혼합액을 37℃에서 교반 혼합했다. 5분간 방치 후, 라텍스 부유액 100μL를 첨가하여 37℃에서 더 교반 혼합했다. 약 5분간의 응집 반응을 흡광도 변화량으로서 측정하고, 검량선으로부터 각 검체의 페리틴 농도를 산출했다.
(3) 기존 시약과의 비교
상기 실시예 6 및 7과 비교예 5의 측정 결과와, 상기 기존 시약을 사용한 방법의 측정 결과를 비교했다. 결과를 도 20∼도 25에 각각 나타낸다.
기존 시약은 비특이 반응이 억제되어 있는 시약인 것이 알려져 있다. 실시예 6∼7의 결과를 나타내는 도 20∼도 23과, 비교예 5의 결과를 나타내는 도 24∼도 25를 비교하면, 고감도화한 면역분석 방법에 있어서 폴리카르복실산형 계면활성제를 첨가함으로써 비특이 반응이 억제되어, 기존 시약을 사용했을 경우의 측정 결과와의 상관이 향상되는 것이 나타내어졌다. 특히, 저농도영역에서 향상되는 것이 나타내어졌다.

Claims (10)

  1. 폴리카르복실산형 계면활성제의 존재 하에서 항원항체반응 및/또는 측정을 행하는 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리카르복실산형 계면활성제는 (1)말레산 및/또는 무수 말레산과 (2)디이소부틸렌의 공중합체, 및/또는 그 염인 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 폴리카르복실산형 계면활성제가 존재하는 반응계 및/또는 측정계에 있어서의 상기 폴리카르복실산형 계면활성제의 농도는 0.001%∼3%인 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원항체반응의 개시로부터 측정 완료까지를 상기 폴리카르복실산형 계면활성제의 존재 하에서 행하는 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역분석 방법은 면역응집법인 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    면역응집법은 라텍스 응집법인 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  7. 제 1 항에 기재된 면역분석 방법에 사용되는 면역분석 시약으로서, 폴리카르복실산형 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역분석 시약.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 폴리카르복실산형 계면활성제는 (1)말레산 및/또는 무수 말레산과 (2)디이소부틸렌의 공중합체인 것을 특징으로 하는 면역분석 시약.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    면역응집법을 위한 시약을 더 포함하는 면역응집용 시약인 것을 특징으로 하는 면역분석 시약.
  10. 제 9 항에 있어서,
    라텍스 응집법을 위한 시약을 더 포함하는 라텍스 응집용 시약인 것을 특징으로 하는 면역분석 시약.
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