JP5996234B2

JP5996234B2 - 免疫分析方法及び試薬

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Publication number: JP5996234B2
Application number: JP2012078449A
Authority: JP
Inventors: まゆみ加納; 律子橘; 雅行飯塚
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2032-03-30
Also published as: US9939436B2; KR20140145121A; KR102075949B1; EP2833141B1; TWI515430B; US20150086975A1; CN104204801B; CN104204801A; WO2013146977A1; JP2013205408A; EP2833141A4; TW201346262A; EP2833141A1

Description

本発明は、免疫分析方法及びそのための試薬に関する。

免疫分析方法は、血清、血漿、尿、便、髄液等の臨床検査で広く用いられ、近年、簡便・迅速に測定を行うことができることから、反応から測定までを一括して自動で行う自動分析装置が汎用されている。

免疫分析方法は抗原抗体反応を利用した測定法で特異性が高い測定法であることが知られている。しかし試料によっては擬陽性または擬陰性などの非特異反応が起こる問題があった。例えば、抗体を認識して反応する因子が試料中に存在する場合があり、このような場合には試料中に測定しようとする抗原が存在しなくても陽性の測定値になる、また一方で試料中の抗原抗体反応を妨害する因子が存在する場合があり、このような場合は試料中に測定しようとする抗原が存在しても陰性の測定値になるなど、真値とは異なった測定値を示すという問題があった。

非特異反応を抑制する手法としてヒトIgM自然抗体や、スルホン基又はその塩を有する芳香族モノマーが重合されたポリマーを添加することが知られていた（特許文献１、２参照）。しかし、これらの添加剤では不十分なことがあり、特に低濃度域での非特異反応抑制は困難な状態だった。更に高感度にした試薬においては、抗体の反応性を向上しているために非特異反応が起きやすい状況だった。

特許４０６５６００号公報特許４５８０１８０号公報

本発明の目的は、免疫分析において、抗原を高感度でかつ正確に測定することができる免疫分析方法及びそのための試薬を提供することである。

本願発明者は、鋭意研究の結果、免疫分析においてポリカルボン酸型界面活性剤を存在させることにより、高感度な測定であっても、容易に非特異反応を抑制できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）ポリカルボン酸型界面活性剤の存在下で抗原抗体反応及び／又は測定を行う免疫分析方法であって、前記ポリカルボン酸型界面活性剤が、(1)マレイン酸及び／若しくは無水マレイン酸と、(2)ジイソブチレンとの共重合体、並びに／又はその塩であり、前記免疫分析方法がラテックス凝集法である、方法。
２）前記ポリカルボン酸型界面活性剤が存在する反応系及び／又は測定系における該ポリカルボン酸型界面活性剤の濃度が0.001%〜3%である１）の方法。
３）抗原抗体反応の開始から測定完了までを前記ポリカルボン酸型界面活性剤の存在下で行う１）又は２）の方法。
４）１）の方法に使用される免疫分析試薬であって、(1)マレイン酸及び／若しくは無水マレイン酸と、(2)ジイソブチレンとの共重合体、並びに／又はその塩と、ラテックス凝集法のための試薬を含む、ラテックス凝集用試薬である免疫分析試薬。

本発明の方法によれば、反応及び／又は測定系にポリカルボン酸型界面活性剤を存在させるという簡易な手段により、高感度な免疫分析においても非特異反応を効果的に抑制することができ、免疫分析において、抗原を正確に測定でき特異性が向上する。

下記実施例及び比較例において作成した検量線（キャリブレーションカーブ）を示す。下記実施例の免疫分析方法と、非特異反応が抑制されることが知られている市販の試薬（既存試薬）を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図２の低濃度域を拡大して示す。下記比較例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図４の低濃度域を拡大して示す。下記比較例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図６の低濃度域を拡大して示す。下記比較例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図８の低濃度域を拡大して示す。下記実施例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図１０の低濃度域を拡大して示す。下記実施例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図１２の低濃度域を拡大して示す。下記実施例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図１４の低濃度域を拡大して示す。下記実施例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図１６の低濃度域を拡大して示す。下記比較例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図１８の低濃度域を拡大して示す。下記実施例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図２０の低濃度域を拡大して示す。下記実施例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図２２の低濃度域を拡大して示す。下記実施例の免疫分析方法と、既存試薬を用いた免疫分析方法との測定結果の相関関係を示す。図２４の低濃度域を拡大して示す。

以下、本発明の方法について説明する。なお、本明細書中の「％」は特に断りがない限り質量基準（ｗ／ｖ％）を意味する。

本発明の免疫分析方法は、検体中の被測定物質に対し免疫的に反応する免疫分析試薬を用いて、抗原抗体反応を行い、得られた反応物を測定する免疫分析方法において、特定のポリカルボン酸型界面活性剤の存在下で反応及び／又は測定を行うことを特徴とするものである。

免疫分析の手法自体は周知である。本発明の方法が適用される免疫分析方法は、免疫凝集法であり、特に不溶性担体粒子としてラテックス粒子を用いるラテックス凝集法である。ラテックス凝集法において感作粒子の凝集を検出する方法は周知であり、本発明においても、感作粒子の凝集による吸光度又は光散乱等を検出する方法等の周知の方法が使用可能である。

当該免疫分析方法の態様としては、用いる不溶性担体粒子は、例えば、ポリエチレンやポリスチレン等のラテックス粒子である。これらのラテックス粒子の中では、特にポリスチレンラテックス粒子が好適に用いられる。ラテックス凝集法は、抗原或いは抗体を感作した感作粒子の凝集を光学的に検出する方法として周知であり、検出には比濁法が好適に用いられる。例えば、セル外部より可視光から近赤外域の光、例えば通常３００〜１０００ｎｍ、好ましくは５００〜９００ｎｍの光を照射し、吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出することにより、当該感作粒子の凝集の程度が測定される。ラテックス粒子として特にポリスチレンラテックス粒子が好適に用いられる。ラテックス粒子のサイズは特に限定されないが、粒径は３０〜６００ｎｍであることが好ましい。

上記したラテックス粒子に、測定すべき抗原と免疫的に反応する抗体若しくはその抗原結合性断片を固定化する。固定化の方法も周知であり、物理吸着又は共有結合等の周知の方法により行われる。得られた感作粒子の懸濁液と被検試料とを混合すると、被検試料中に含まれる被測定物質（抗原）によって感作粒子が凝集され、感作粒子懸濁液の吸光度が変化する。この吸光度の変化量（エンドポイント法）又は変化率（レート法）を測定する。測定すべき抗原を種々の既知濃度で含む複数の標準試料を準備し、それらについて上記方法により吸光度の変化量又は変化率を測定する。標準試料中の測定すべき抗原の濃度を横軸、測定された吸光度の変化量又は変化率を縦軸にプロットして検量線を描く。未知の被検試料についても同じ方法により吸光度の変化量又は変化率を測定し、測定結果を上記検量線に当てはめることにより、被検試料中の抗原を定量することができる。

なお、このような免疫凝集法を行う自動装置が種々市販されており、市販の免疫凝集法用自動装置を用いて、容易、簡便に行うことができる。

本発明における免疫分析による被測定物質としては、免疫分析により測定可能な物質であれば何ら限定されないが、被測定物質が抗原の場合、例えばＣＲＰ（Ｃ−反応性蛋白質）、前立腺特異抗原、フェリチン、β−２マイクログロブリン、ミオグロビン、ヘモグロビン、アルブミン、クレアチニン等のタンパク質マーカー、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の免疫グロブリン、各種腫瘍マーカー、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＴＧ等のリポ蛋白、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、ＨＡＶ、ＨＢs、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、MRSA等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト絨毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタグランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、農薬、環境ホルモン等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。好ましい例として、ＣＲＰ、前立腺特異抗原、フェリチン、β−２マイクログロブリン及びヘモグロビン等の抗原が挙げられる。

被測定物質が抗体の場合、上記のタンパク質マーカー、各種腫瘍マーカー、リポ蛋白、ウイルス抗原、細菌抗原、細菌等が産生する毒素、ペプチドホルモン、ステロイド、生理活性アミン類、ビタミン類、抗生物質、農薬、環境ホルモン等の抗原と特異的に反応する抗体等が挙げられる。

免疫分析に用いられる検体は、被測定物質を含むものであれば特に限定されないが、血液、血清、血漿、尿、便、唾液、組織液、髄液、ぬぐい液等の体液等又はその希釈物が挙げられ、血液、血清、血漿、尿、便、髄液又はこれらの希釈物が好ましい。

上記の通り、本発明の方法では、反応系及び／又は測定系において、ポリカルボン酸型界面活性剤が存在する状態下で抗原抗体反応及び／又は測定を行うことを特徴としている。「ポリカルボン酸型界面活性剤」は、１分子中に複数のカルボキシル基若しくはその塩、及び／又は酸無水物基を持つ（酸無水物基の少なくとも一部は水中で加水分解してカルボキシル基を生じるので、水中では１分子中に複数のカルボキシル基を持つ）高分子から成る界面活性剤として知られている、陰イオン界面活性剤の一種であり、種々のものが公知で市販されており、工業的に使用されている。本発明では、(1)マレイン酸及び／若しくは無水マレイン酸と、(2)ジイソブチレンとの共重合体、並びに／又はその塩を用いる。ここで、塩としては、特に限定されないが、ナトリウム塩が好ましい。このような共重合体又はその塩は、工業的に広く用いられており、市販もされているので、本発明においても市販品を好ましく利用することができる（下記実施例参照）。

ポリカルボン酸型界面活性剤の重量平均分子量は特に限定されないが、１０００〜５万程度のものが好ましい。

本発明の方法において、当該ポリカルボン酸型界面活性剤は、抗原抗体反応の開始から抗原抗体反応量の検出・定量が終了するまでのいずれかの段階でポリカルボン酸型界面活性剤が反応及び／又は測定系（「反応・測定系」とも称する）内に含まれていればよいが、抗原抗体反応の開始から検出・定量までの間に亘って含まれていることが好ましい。従って、ポリカルボン酸型界面活性剤は、抗原抗体反応の開始前又は開始と同時に反応系内に添加するのが好ましい。具体的には、検体を希釈する際に添加してもよいし、抗体又は抗原と検体とを混合する際に添加してもよい。

また、免疫分析に用いる各種試薬に予めポリカルボン酸型界面活性剤を含有させることでもよく、本発明は斯かるポリカルボン酸型界面活性剤を含有した免疫分析試薬を提供するものでもある。ここで、免疫分析に用いる各種試薬としては、例えば、検体希釈液、抗体／抗原希釈液、固相化抗体／抗原、感作粒子懸濁液、洗浄液、酵素液、基質液、検量線作成用の被検物質標準液等が挙げられ、ポリカルボン酸型界面活性剤を含有した免疫分析試薬としては、これらの試薬にポリカルボン酸型界面活性剤を添加したもの、例えば、検体を希釈する緩衝液や、抗体又は抗原を含む試薬等にポリカルボン酸型界面活性剤を含有させたものが挙げられる。

また、例えば、抗体又は抗原を固定化（感作）したラテックス粒子（感作粒子）を含む免疫凝集試薬にポリカルボン酸型界面活性剤を含有させておくことができる。この場合、免疫分析試薬中の感作粒子の濃度は、特に限定されないが、０．０１〜０．５％であることが好ましい。感作粒子浮遊液中の抗体量及び抗原量は常法どおりであってよく、特に限定されないが、例えば抗体感作ラテックスの場合、抗体量はラテックス浮遊液中に０．０１〜２．０ｍｇ／ｍＬとするのが好ましい。

ポリカルボン酸型界面活性剤の反応・測定系内における濃度は、非特異反応抑制の点から、好ましくは０．００１〜３％であり、さらに好ましくは０．００５〜１％である。したがって、免疫分析試薬に予めポリカルボン酸型界面活性剤を含有させる場合には、反応及び／又は測定系内での濃度が上記の濃度になるように免疫分析試薬に含有させればよい。

免疫分析に用いられるブランク試料は、被測定物質を含み得ないものであれば特に限定されないが、精製水、生理食塩液、緩衝液、陰性検体又はその希釈物が好ましい。

後記実施例に記載されるように、ポリカルボン酸型界面活性剤を反応及び／又は測定系内に存在させた場合、非特異反応が抑制される。そして、特異性は、ポリカルボン酸型界面活性剤を存在させない場合に比べて、優位に向上する。したがって、本発明の方法を用いることにより、特に非特異反応が起きやすい高感度化した試薬においては、従来よりも試薬性能を向上することが可能になる。

以下、本発明を実施例及び比較例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１、比較例１〜３
（１）試薬の調製
フェリチンに対する抗体を用いて、以下の通りに免疫凝集法による測定試薬を調製した。
ｉ）抗フェリチン抗体を平均粒径３００ｎｍのポリスチレンラテックス浮遊液１ｍＬに対し０．０３ｍｇ担持させてなる感作粒子を、緩衝液（トリス、ｐＨ８．０）に０．０４％となるように懸濁し、ラテックス浮遊液を調製した。
ii）緩衝液（トリス、ｐＨ８．５）にポリカルボン酸型界面活性剤(マレイン酸・ジイソブチレン共重合体ナトリウム)を添加し、下記の試薬Ａを調製した（実施例１）。比較例１〜３として、何も添加しない、または他の添加剤を更に加えた試薬Ｂ〜Ｄを調製した。

*1: ポリカルボン酸型界面活性剤（陰イオン性界面活性剤）「ポリスターＯＭ」（商品名、日油株式会社から市販）
*2: 陰イオン性界面活性剤「ＰＳ−５」（商品名、東ソー株式会社から市販）

（２）自動分析装置による測定
自動分析装置は日立社７１８０型自動分析装置によりエンドポイント法で自動測定を行った。
前述の試薬Ａ〜Ｄを用いて、非特異反応を起こすことで知られているＲＦ陽性検体を含む血清２４検体の測定を行った。検体溶液１０．０μＬに試薬Ａ〜Ｄの上記で調製した緩衝液１００μＬを添加し、この混合液を３７℃で撹拌混合した。５分間放置後、ラテックス浮遊液１００μＬを添加し、更に３７℃で撹拌混合した。約５分間の凝集反応を吸光度変化量として測定し、検量線より各検体のフェリチン濃度を算出した。

（３）既存試薬との感度比較
上記実施例１及び比較例１〜３の測定感度と、非特異反応が抑制されていることがわかっている既存の市販ラテックス試薬であるＦＥＲ−ラテックスＸ２「生研」ＣＮ（デンカ生研）（以下、「既存試薬」）との感度の比較を行った。結果を図１示す。

図１に示されるように、実施例１及び比較例１〜３の方法では、既存試薬を用いた方法と比較して、同じフェリチン濃度であれば吸光度変化量が大きくなっており、実施例１及び比較例１〜３の方法の法が測定感度が高いことがわかる。

（４）既存試薬との特異性比較
上記実施例１及び比較例１〜３の測定結果と、上記既存試薬を用いた方法との測定結果を比較した。結果を図２〜９にぞれぞれ示す。

既存試薬は非特異反応が抑制されている試薬であることが知られている。実施例１の結果を示す図２及び図３と、各比較例の結果を示す図４〜図９を比べると、高感度化した免疫分析方法において、ポリカルボン酸型界面活性剤を添加することで、非特異反応が抑制され、既存試薬を用いた場合の測定結果との相関が向上することが示された。特に低濃度領域にて向上することが示された。

実施例２〜５、比較例４
（１）試薬の調製
フェリチンに対する抗体を用いて、以下の通りに免疫凝集法による測定試薬を調製した。
ｉ）抗フェリチン抗体を平均粒径３００ｎｍのポリスチレンラテックス浮遊液１ｍＬに対し０．０３ｍｇ担持させてなる感作粒子を、緩衝液（トリス、ｐＨ８．０）に０．０４％となるように懸濁し、ラテックス浮遊液を調製した。
ii）緩衝液（トリス、ｐＨ８．５）に、ポリカルボン酸型界面活性剤(マレイン酸・ジイソブチレン共重合体ナトリウム、「ポリスターＯＭ」（商品名、日油株式会社から市販）)を添加し、下記の試薬Ｅ〜Ｈを調製した（実施例２〜５）。比較例４として、何も添加しない試薬Ｉを調製した。

（２）自動分析装置による測定
自動分析装置は日立社７１８０型自動分析装置によりエンドポイント法で自動測定を行った。
前述の試薬Ｅ〜Ｉを用いて、非特異反応を起こすことで知られているＲＦ陽性検体を含む血清２４検体の測定を行った。検体溶液１０．０μＬに試薬Ｅ〜Ｉの上記で調製した緩衝液１００μＬを添加し、この混合液を３７℃で撹拌混合した。５分間放置後、ラテックス浮遊液１００μＬを添加し、更に３７℃で撹拌混合した。約５分間の凝集反応を吸光度変化量として測定し、検量線より各検体のフェリチン濃度を算出した。

（３）既存試薬との比較
上記実施例２〜５及び比較例４の測定結果と、上記既存試薬を用いた方法との測定結果を比較した。結果を図１０〜１９にぞれぞれ示す。

既存試薬は非特異反応が抑制されている試薬であることが知られている。実施例２〜５の結果を示す図１０〜図１７と、比較例４の結果を示す図１８〜図１９を比べると、高感度化した免疫分析方法において、ポリカルボン酸型界面活性剤を添加することで、非特異反応が抑制され、既存試薬を用いた場合の測定結果との相関が向上することが示された。特に低濃度領域にて向上することが示された。

実施例６、７、比較例５
（１）試薬の調製
フェリチンに対する抗体を用いて、以下の通りに免疫凝集法による測定試薬を調製した。
ｉ）抗フェリチン抗体を平均粒径３００ｎｍのポリスチレンラテックス浮遊液１ｍＬに対し０．０３ｍｇ担持させてなる感作粒子を、緩衝液（トリス、ｐＨ８．０）に０．０４％となるように懸濁し、ラテックス浮遊液を調製した。
ii）緩衝液（トリス、ｐＨ８．５）に、ポリカルボン酸型界面活性剤を添加し、下記の試薬Ｊ（実施例６）、試薬Ｋ（実施例７）を調製した。比較例５として、何も添加しない試薬Lを調製した。

*1: ポリカルボン酸型界面活性剤（陰イオン性界面活性剤）「ポリスターＯＭ」（商品名、日油株式会社から市販）
*2: ポリカルボン酸型界面活性剤（商品名「デモールEP」、花王株式会社から市販）

（２）自動分析装置による測定
自動分析装置は日立社７１８０型自動分析装置によりエンドポイント法で自動測定を行った。前述の試薬J〜Lを用いて、非特異反応を起こすことで知られているＲＦ陽性検体を含む血清２４検体の測定を行った。検体溶液１０．０μＬに試薬J〜Lの上記で調製した緩衝液１００μＬを添加し、この混合液を３７℃で撹拌混合した。５分間放置後、ラテックス浮遊液１００μＬを添加し、更に３７℃で撹拌混合した。約５分間の凝集反応を吸光度変化量として測定し、検量線より各検体のフェリチン濃度を算出した。

（３）既存試薬との比較
上記実施例６及び７並びに比較例５の測定結果と、上記既存試薬を用いた方法との測定結果を比較した。結果を図２０〜２５にぞれぞれ示す。

既存試薬は非特異反応が抑制されている試薬であることが知られている。実施例６〜７の結果を示す図２０〜図２３と、比較例５の結果を示す図２４〜図２５を比べると、高感度化した免疫分析方法において、ポリカルボン酸型界面活性剤を添加することで、非特異反応が抑制され、既存試薬を用いた場合の測定結果との相関が向上することが示された。特に低濃度領域にて向上することが示された。

Claims

ポリカルボン酸型界面活性剤の存在下で抗原抗体反応及び／又は測定を行う免疫分析方法であって、前記ポリカルボン酸型界面活性剤が、(1)マレイン酸及び／若しくは無水マレイン酸と、(2)ジイソブチレンとの共重合体、並びに／又はその塩であり、前記免疫分析方法がラテックス凝集法である、方法。
前記ポリカルボン酸型界面活性剤が存在する反応系及び／又は測定系における該ポリカルボン酸型界面活性剤の濃度が0.001%〜3%である請求項１記載の方法。
抗原抗体反応の開始から測定完了までを前記ポリカルボン酸型界面活性剤の存在下で行う請求項１又は２記載の方法。
請求項１記載の方法に使用される免疫分析試薬であって、(1)マレイン酸及び／若しくは無水マレイン酸と、(2)ジイソブチレンとの共重合体、並びに／又はその塩と、ラテックス凝集法のための試薬を含む、ラテックス凝集用試薬である免疫分析試薬。