JP2004191332A - 免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】測定範囲を拡大することができ、且つ検出感度の高い免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法を提供する。
【解決手段】前記免疫学的分析試薬は、分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子懸濁液と、前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片とを含む。前記免疫学的分析方法では、分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子と、前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片と、分析対象化合物を含む可能性のある被検試料とを接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する。
【選択図】 なし
【解決手段】前記免疫学的分析試薬は、分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子懸濁液と、前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片とを含む。前記免疫学的分析方法では、分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子と、前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片と、分析対象化合物を含む可能性のある被検試料とを接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法に関する。本発明は、特に、ラテックス粒子懸濁液を使用した免疫凝集反応に基づいて分析対象物質を測定するために用いることができ、反応相におけるラテックス粒子に担持したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の反応速度と、ラテックス粒子懸濁液に添加したモノクローナル抗体の反応速度との違いにより、分析対象物質が多量に含まれている場合に抗原抗体反応の反応性を抑制することによって測定範囲を拡大することができる。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
生体液中に存在する微量成分等の測定法のひとつとして、分析対象物質に対する抗体又は抗原を利用する免疫学的測定方法が多用されている。その免疫学的測定手段としては、抗原抗体反応により形成される免疫複合体を光学的に測定する免疫比ろう法及び免疫比濁法や、放射性物質や酵素を標識体として利用するラジオイムノアッセイやエンザイムノアッセイが用いられてきた。また、近年、多数の被検試料を短時間に処理するための自動分析装置が普及し、更に高感度化が要求されることと相まって、特に、抗体（又は抗原）を結合したラテックス粒子との反応を利用するラテックス凝集法が汎用されている。いわゆるラテックス凝集法とは、分析対象物質と、ラテックス粒子に結合した抗体（又は抗原）との反応により生じるラテックス粒子の凝集の程度を検出することにより、分析対象物質を測定する方法である。この凝集の程度を検出する方法としては、目視的に観察するか、あるいは、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を測定する方法がある。光学的な分析方法は、試料中の抗原又は抗体の定量に用いられている。
【０００３】
しかし、前記のようなラテックス凝集法の実施には測定範囲の限界がある。例えば、粒子径を小さくすれば、分析対象物質の高濃度域を測定することができるが、低濃度度領域の測定ができず、粒子径を大きくすれば、分析対象物質の低濃度域を測定することができるが、高濃度度領域の測定ができない。
このような問題点に対して、異なる粒子径のラテックス粒子懸濁液を混合することによって、単一粒子径のラテックス粒子懸濁液を用いた場合よりも、測定範囲を拡大することができる方法が公知である［国際公開ＷＯ０２／７９７８５号パンフレット（特許文献１）］。また、懸濁液中に大量の金属イオン、アミノ酸、又はカオトロピック剤を添加して感度抑制することで、測定範囲を拡大させる方法がある［特開昭６２−２１８８６６号公報（特許文献２）］。
【０００４】
しかし、異なる粒子径のラテックス粒子懸濁液を使用する方法では、小さな粒子が高濃度域の反応性を高くし、大きな粒子が低濃度域の反応性を高くするが、低濃度域において小さな粒子が反応を抑制するため、大きな粒子単独の場合より反応性が低くなり、測定範囲拡大には限界がみられた。また、金属イオン等を添加する方法においても、分析対象物質の高濃度域を抑制すると、低濃度域にも同時に抑制が生じるため、測定範囲には限界があり、前記問題点を一挙に解決するには至っていないのが実情である。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開ＷＯ０２／７９７８５号パンフレット
【特許文献２】
特開昭６２−２１８８６６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、ラテックス凝集反応における前記の問題点を克服するために鋭意研究を重ねた結果、分析対象物質に対する抗体（ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）をラテックス粒子（好ましくは、２種類以上の粒径の異なるラテックス粒子）に担持したラテックス粒子懸濁液中に、遊離状態のモノクローナル抗体を存在させることで、測定範囲を拡大することができることを見出した。本発明はこうした知見に基づくものである。
従って、本発明の課題は、測定範囲を拡大することができ、且つ検出感度の高い免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、（１）分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子懸濁液、及び
（２）前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片
を含む、免疫学的分析試薬により解決することができる。
また、本発明は、（１）分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子と、
（２）前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片と、
（３）分析対象化合物を含む可能性のある被検試料と
を接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する、免疫学的分析方法に関する。
以下、本発明を、「抗体又はその断片」として「抗体」を用いる場合に基づいて主に説明するが、それらの説明が、当業者の技術常識の範囲内において実施可能である場合には、「抗体又はその断片」として「抗体断片」を用いる場合にもそのまま当てはまる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明では、その分析においてラテックス凝集反応を用いる。本発明においては、分析対象物質に対する抗体（例えば、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又はそれらの抗体フラグメント）を担持したラテックス粒子と、分析対象物質とを接触させ、ラテックス凝集反応を実施する系において、分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体（以下、凝集反応抑制用モノクローナル抗体と称することがある）を更に共存させることにより、低濃度域から高濃度域の広い濃度範囲にわたって、分析対象物質を分析（検出又は測定、好ましくは測定）することができる。
なお、本明細書において「遊離状態」とは、ラテックス懸濁液中で、それ単独で、他の物質と結合することなく、移動可能な状態を意味し、より具体的には、ラテックス粒子に担持されていない状態を意味する。
【０００９】
本発明により分析することのできる物質（分析対象物質）は、一般に抗原抗体反応を利用して抗原として分析することのできる物質（特に生理活性物質）であれば特に限定されない。分析対象物質の代表例としては、タンパク質又は脂質等を挙げることができ、より詳しくは、例えば、各種抗体、レセプター、又は酵素等を挙げることができる。具体的には、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＩｇＥ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体又はＨＢｃ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、又はトロンボモジュリン等を挙げることができる。
また、本発明で分析可能な被検試料は、前記分析対象化合物を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。
【００１０】
本発明では、その分析においてラテックス凝集反応を用いる。本発明におけるラテックス凝集反応では、分析対象物質に特異的に反応する抗体で感作したラテックスを用いる。
本発明で用いるラテックス粒子としては、公知のラテックス粒子、例えば、ポリスチレン、又はスチレンースチレンスルホン酸塩共重合体等からなるラテックス粒子を挙げることができる。
ラテックス粒子の平均粒径は、分析対象物質の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、通常、０．０４〜０．５μｍの範囲で適宣選択することができる。
また、粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子を用いることもできる。例えば、２種類のラテックス粒子を用いる場合には、小粒径ラテックス粒子の平均粒径は、分析対象物質の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０４〜０．１４μｍの範囲で適宣選択することができる。また、大粒径ラテックス粒子の平均粒径は、分析対象物質の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．１５〜０．５μｍの範囲で適宣選択することができる。
【００１１】
ラテックス粒子に担持させる抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いることができる。また、抗体の種類としては、免疫グロブリン分子自体のほか、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｖ等も使用可能である。ラテックス担体の感作は、任意の公知の方法で実施することができ、ラテックス担体に抗体を物理的又は化学的に結合させることにより感作することができる。
【００１２】
本発明においては、ラテックス粒子に担持させる抗体とは別に、遊離状態で、ラテックス粒子に担持させない状態で分析系に共存させる凝集反応抑制用モノクローナル抗体を使用する。前記凝集反応抑制用モノクローナル抗体としては、分析対象化合物に特異的に反応するモノクローナル抗体である限り、特に限定されるものではなく、分析対象化合物の高濃度域においてラテックス凝集反応を抑制可能であるモノクローナル抗体であることが好ましく、更に、低濃度域において、高濃度域で認められる程度のラテックス凝集反応抑制作用を示さないか、あるいは、実質的にラテックス凝集反応抑制作用を示さないモノクローナル抗体であることがより好ましい。
【００１３】
ラテックス粒子に担持させる抗体及び凝集反応抑制用モノクローナル抗体は、具体的には、分析対象物質（すなわち、抗原）に応じて適宜調製ないし選択することができ、分析対象物質として例示した前記物質、例えば、各種抗体、レセプター、又は酵素等に対する抗体を用いることができる。
例えば、凝集反応抑制用モノクローナル抗体としては、より具体的には、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＩｇＥ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体又はＨＢｃ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、又はトロンボモジュリン等に対する公知のモノクローナル抗体を用いることができ、これらのモノクローナル抗体の多くは、市販されている。例えば、抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、Ｔｓｅｎｇ等，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，１９８８に詳しく記載されており、多種の市販品も存在し、これらの任意の抗ＣＲＰモノクローナル抗体を使用することができる。
【００１４】
凝集反応抑制用モノクローナル抗体としては、１種類のモノクローナル抗体を用いることもできるし、あるいは、２種類以上のモノクローナル抗体を組み合わせて用いることもできる。ラテックス粒子に担持させる抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合には、凝集反応抑制用モノクローナル抗体として、ラテックス粒子に担持させる前記モノクローナル抗体と同じモノクローナル抗体を用いることもできるし、あるいは、ラテックス粒子に担持させる前記モノクローナル抗体とは別のモノクローナル抗体を用いることもできる。
また、前記凝集反応抑制用モノクローナル抗体としては、免疫グロブリン分子それ自体、あるいは抗体フラグメント［例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又はＦｖ］を用いることができる。
【００１５】
本発明では、ラテックス凝集反応を実施する系中に、凝集反応抑制剤としてのモノクローナル抗体を存在させることができる限り、ラテックス凝集反応の実施前の、モノクローナル抗体の存在態様は、特に限定されない。
例えば、ラテックス試薬（ラテックス粒子懸濁液）を用いた抗原抗体反応により、被検試料中の分析対象物質を分析する場合には、分析対象物質に対する抗体を感作したラテックス試薬（ラテックス粒子懸濁液）に予め凝集反応抑制用モノクローナル抗体を共存（添加）しておくことができる。この場合には、抗体を感作したラテックス粒子を適当なブロッキング剤、例えば、アルブミン又は界面活性剤で表面処理を施すことで、共存させる凝集反応抑制用モノクローナル抗体や分析対象物質以外の物質（主にタンパク質）がラテックス粒子へ結合することを防ぐことができる。
別法として、凝集反応抑制用モノクローナル抗体を含まないラテックス試薬（ラテックス粒子懸濁液）を使用することも可能である。この場合には、例えば、使用する緩衝液に凝集反応抑制用モノクローナル抗体を加えておく方法等があり、特に限定されない。
【００１６】
従って、本発明による免疫学的分析試薬は、例えば、抗体を感作したラテックス粒子と凝集反応抑制用モノクローナル抗体との両方を含む１液系の試薬；緩衝液である第１試薬と、抗体を感作したラテックス粒子とモノクローナル抗体との両方を含む第２試薬とで構成される２液系の試薬；あるいは、緩衝液と凝集反応抑制用モノクローナル抗体との両方を含む第１試薬と、抗体を感作したラテックス粒子を含む第２試薬とで構成される２液系の試薬など、種々の形態であることができる。
【００１７】
本発明においては、前記のような試薬を用いて凝集反応を行い、生じた凝集の度合い（凝集度）を光学的に分析（特には測定）することにより、被検試料中の分析対象物質の量を分析（特には測定）することができる。ラテックス粒子の凝集度を光学的に検出する具体的方法においては、例えば、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて測定を行うことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。測定方法は、公知の方法に従い、用いるラテックス粒子の大きさ（平均粒径）若しくは濃度の選択、又は反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより行うことができる。また、これらの方法を併用することも可能である。
【００１８】
本発明の免疫学的分析方法において、被検試料中に含まれる可能性のある分析対象物質が高濃度で存在する場合に、ラテックス粒子の凝集を抑制し、ラテックス粒子凝集度が吸光度測定における反応限界吸光度を超えないようにする量で、凝集反応抑制用モノクローナル抗体を存在させる。ここで、反応限界吸光度とは、吸光度測定における測定機器の測定可能最大値以上を意味する。反応限界吸光度のおおよその値は、個々の被検試料（群）に関して、予めパイロット試験等を実施することにより、予想することができるので、個々の測定系に応じて、凝集反応抑制用モノクローナル抗体の適切な濃度を決定することができる。
【００１９】
一般的に、抗原抗体反応の測定系に存在させる凝集反応抑制用モノクローナル抗体の濃度は、測定する項目、抗体の親和性、並びに共存する塩、タンパク質、及び／又は糖類等の添加物の濃度等によってその都度適宜選択することができる。例えば、共存させる凝集反応抑制用モノクローナル抗体濃度としては、通常、０．０００５〜０．２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．００１〜０．０１ｍｇ／ｍＬである。前記モノクローナル抗体の濃度が低すぎると、凝集反応の抑制効果が充分でなくなることがあり、逆に高すぎると、分析対象物質と、それに対する抗体を担持したラテックス粒子との間の特異的凝集反応も抑制してしまい、分析試薬の検量線傾きが低くなり、再現性が悪くなることがある。
【００２０】
本発明においては、凝集反応抑制用モノクローナル抗体の濃度を調節することに加え、ラテックス凝集反応に影響を与える他の因子を調節することによって、ラテックス粒子凝集反応を更に精密に抑制し、高濃度域の定量可能範囲を更に拡張させることができる。ラテックス凝集反応に影響を与える他の因子としては、例えば、ラテックス粒子の濃度、ラテックス粒子上の抗体感作量、及びラテックス粒子の粒径等を挙げることができる。
【００２１】
本発明で用いる抗原抗体反応の条件は通常の条件と同様であってよく、反応媒体としては、分析対象物質の種類に応じた各種緩衝液が適宜選択することができる。この緩衝液は、分析対象物質を失活させることがなく、かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよい。例えば、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、又はトリス緩衝液を使用することができる。反応のｐＨは、５〜１０、特に６〜８が好ましい。反応温度は０〜５０℃、特に２０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決めることができる。
【００２２】
本発明によれば、凝集反応抑制用モノクローナル抗体の働きにより、分析対象物質が高濃度で存在する場合に、ラテックス粒子の凝集反応の抑制により測定範囲の拡大が可能となる。本発明では、低濃度域においては、ラテックス粒子のこのような凝集反応抑制が実質的に起こらないか、あるいは、抑制の程度が小さい。高濃度域における前記抑制作用の機構及び低濃度域における前記挙動は、現在のところ完全に解明されたわけではないが、高濃度域における前記抑制作用については、本発明者は以下の機構によるものと考えている。なお、以下に示す機構は現時点の推測に基づくものであって、本発明は以下の推測に基づく機構に限定されるものではない。
【００２３】
本発明は、分析対象物質に対する反応速度が異なることを利用するものである。より詳細には、反応速度の速いポリクローナル抗体感作ラテックス粒子が凝集反応抑制用モノクローナル抗体よりも先に分析対象物質と反応する。高濃度域においては、ポリクローナル抗体感作ラテックス粒子が反応後に更なる架橋をするべきところに対して、凝集反応抑制用モノクローナル抗体が結合物質の反応部位と結合するためにそれ以上の凝集ができなくなることによって、高濃度域にだけ抑制効果が得られることに基づくものである。
【００２４】
また、粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子を用いると、分析対象物質量が少ない場合、抗体を担持した大粒径ラテックス粒子と小粒径ラテックス粒子とが分析対象物質と反応し、抗原抗体反応により凝集するが、大粒径ラテックス粒子が混在するため、その凝集度を吸光度によって測定することができる。一方、分析対象物質が大量の場合、抗体を担持したラテックス粒子だけでは全ての分析対象物質と抗原抗体反応により架橋することができない。分析対象物質がラテックスの反応部位を全てマスクすることにより凝集反応が起こらなくなることを地帯現象（プロゾーン現象）と表現し、未結合の分析対象物質が大量に含まれているにも関わらず、低濃度の測定と誤判定することがある。しかし、凝集反応抑制用モノクローナル抗体が大量の分析対象物質と反応することで前記地帯現象（プロゾーン現象）を抑えることが可能となり、更に高濃度域の凝集反応を抑えることにより、測定範囲拡大が可能となる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）測定試薬の調製》
（１）抗ＣＲＰ抗体感作小粒径ラテックス液の調製
抗ＣＲＰポリクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した液９ｍＬに、平均粒径０．０８μｍのポリスチレンラテックス粒子（日本合成ゴム製：固形分１０重量％）１ｍＬを添加し、室温にて６０分間攪拌した。次いで、この液に０．５重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、室温にて６０分間攪拌した後、この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作小粒径ラテックス液を調製した。
【００２６】
（２）抗ＣＲＰ抗体感作大粒径ラテックス液の調製
平均粒径０．０８μｍのポリスチレンラテックス粒子の代わりに、平均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックスを用いたこと以外は、実施例１（１）の操作を繰り返すことにより、抗ＣＲＰ抗体感作大粒径ラテックス液を調製した。
すなわち、実施例１（１）で用いたのと同じ抗ＣＲＰポリクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した液９ｍＬに、平均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（日本合成ゴム製：固形分１０重量％）１ｍＬを添加し、室温にて６０分間攪拌した。次いで、この液に０．５重量％ＢＳＡを含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、室温にて６０分間攪拌した後、この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作大粒径ラテックス液を調製した。
【００２７】
（３）モノクローナル抗体含有ラテックス粒子懸濁液の調製
実施例１（１）及び実施例１（２）でそれぞれ作製したラテックス液を各々０．１ｍＬ採取し、原液濃度１０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰモノクローナル抗体３μＬを添加後、トリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて１ｍＬとすることにより、モノクローナル抗体含有抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液を調製した。なお、抗ＣＲＰモノクローナル抗体としては市販の２種類の市販のモノクローナル抗体（それぞれをＭｏＡｂ−１及びＭｏＡｂ−２とした）を使用した。
【００２８】
（４）緩衝液の調製
０．５重量％ＢＳＡを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ＰＨ８．０）に、０．９重量％の濃度となるように塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。
【００２９】
（５）ヒトＣＲＰ抗原測定試薬
実施例１（３）で調製したモノクローナル抗体含有抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液（第１試薬）と、実施例１（４）で調製した緩衝液（第２試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としてのヒトＣＲＰ抗原測定試薬として、以下の実施例で評価した。
【００３０】
【実施例２】
《標準ＣＲＰ溶液の測定》
（１）標準ＣＲＰ溶液の調製
ＣＲＰ標準品をトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、０ｍｇ／ｄＬ、０．５ｍｇ／ｄＬ、１ｍｇ／ｄＬ、２ｍｇ／ｄＬ、４ｍｇ／ｄＬ、８ｍｇ／ｄＬ、１２ｍｇ／ｄＬ、１６ｍｇ／ｄＬ、２０ｍｇ／ｄＬ、２４ｍｇ／ｄＬ、２８ｍｇ／ｄＬ、３２ｍｇ／ｄＬ、３６ｍｇ／ｄＬ、４０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、８０ｍｇ／ｄＬ、及び１００ｍｇ／ｄＬ濃度の標準ＣＲＰ希釈列を作製した。
【００３１】
（２）測定
標準ＣＲＰ希釈列２μＬに、実施例１（４）で調製した緩衝液１００μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例１（３）で調製したモノクローナル抗体含有抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス懸濁液１００μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
【００３２】
抗ＣＲＰモノクローナル抗体としてＭｏＡｂ−１又はＭｏＡｂ−２のいずれか一方を用いた場合のそれぞれの結果を、図１に示す。図１には、比較用として、実施例１（３）で調製したモノクローナル抗体含有抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液の代わりに、抗ＣＲＰモノクローナル抗体無添加の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液を用いた場合の結果を、併せて示す。なお、本測定における反応液中の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の濃度は、その手順から明らかなように、０．０１５ｍｇ／ｍＬである。
【００３３】
図１から明らかなように、ラテックス粒子懸濁液にモノクローナル抗体を無添加の場合には、ＣＲＰ濃度が３２ｍｇ／ｄＬ以上で反応限界吸光度オーバーとなり、測定範囲が低濃度域に限定された。
それに対して、モノクローナル抗体を添加した場合には、ＣＲＰ濃度が高濃度の領域であっても、高濃度域における測定感度を抑制することにより、測定が可能であった。しかも、この場合、低濃度域の測定感度はほとんど低下しておらず、その結果、低濃度域から高濃度域の広い濃度範囲にわたって、測定が可能であった。但し、使用したモノクローナル抗体の種類により、測定範囲の拡大作用に差が認められ、本実施例においては、モノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１がより好適であった。
【００３４】
【実施例３】
《モノクローナル抗体の添加濃度の影響の確認》
本実施例は、ラテックス粒子懸濁液に添加するモノクローナル抗体の添加濃度が、測定範囲の拡大作用に及ぼす影響を評価する目的で実施した。具体的には、抗ＣＲＰモノクローナル抗体としてＭｏＡｂ−１を使用し、反応液中の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の濃度を３段階（０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、及び０．０２ｍｇ／ｍＬ）に変化させること以外は、前記実施例２（２）の操作を繰り返した。
【００３５】
結果を、抗ＣＲＰモノクローナル抗体無添加の場合（比較用）の結果と併せて、図２に示す。図２から明らかなように、添加するモノクローナル抗体の濃度によって、測定範囲の拡大作用に差が認められ、特に、高濃度域における測定感度の抑制の程度は、モノクローナル抗体の添加濃度に依存した。すなわち、高濃度域における反応性は、モノクローナル抗体の添加濃度依存的に抑制されることが判明した。
本実施例から明らかなように、例えば、本実施例の手順に準じて予備実験等を行うことによって、モノクローナル抗体の適切な添加濃度を容易に決定することができる。
なお、本実施例で凝集反応抑制用モノクローナル抗体として用いた抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１が、ラテックス粒子不在下において、ＣＲＰと凝集反応を生じるか否かを確認したところ、本実施例で使用した濃度範囲では、凝集反応は生じなかった。
【００３６】
【実施例４】
《各ＣＲＰ濃度における反応速度の確認》
本実施例は、種々の異なるＣＲＰ濃度における反応速度（タイムコース）を測定することにより、ラテックス粒子懸濁液に添加するモノクローナル抗体によってもたらされる反応性抑制の程度と、ＣＲＰ濃度との関連性を調べる目的で実施した。
測定は、実施例３に記載の操作に準じて行った。具体的には、反応液中の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の濃度は２段階（０．００５ｍｇ／ｍＬ及び０．０１ｍｇ／ｍＬ）とし、ＣＲＰ濃度は３段階（０．５ｍｇ／ｄＬ、１２ｍｇ／ｄＬ、及び２８ｍｇ／ｄＬ）とした。また、吸光度の経時的測定は、ラテックス粒子懸濁液の添加から５分経過後から開始し、１７．８秒毎の測定を５分間実施した（測定ポイントの第１６．５番〜第３４番に相当）。
【００３７】
ＣＲＰ濃度が０．５ｍｇ／ｄＬの場合の結果を図３に示し、ＣＲＰ濃度が１２ｍｇ／ｄＬの場合の結果を図４に示し、ＣＲＰ濃度が２８ｍｇ／ｄＬの場合の結果を図５に示す。
図３〜図５に示すように、ラテックス粒子懸濁液に添加するモノクローナル抗体の効果（すなわち、反応性抑制の程度）は、分析対象化合物（ＣＲＰ）の低濃度域では小さいのに対して、高濃度域では大きかった。すなわち、公知の感度抑制剤（例えば、金属イオン、アミノ酸、又はカオトロピック剤）では、従来の技術欄で述べたように、分析対象物質の高濃度域と低濃度域とを同時に抑制してしまうのに対して、本発明において用いるモノクローナル抗体では、高濃度域側のみを効果的に抑制することが可能である。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の免疫学的分析試薬又は免疫学的分析方法によれば、ラテックス粒子を使用し免疫凝集反応に基づく分析対象物質の分析（特には測定）において、高濃度域の凝集反応が抑制されることで、低濃度域から高濃度域まで測定範囲を拡大することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】凝集反応抑制用モノクローナル抗体として抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１又はＭｏＡｂ−２を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、種々濃度の標準ＣＲＰ溶液の吸光度変化量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】異なる濃度の抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、種々濃度の標準ＣＲＰ溶液の吸光度変化量を測定した結果を示すグラフである。
【図３】異なる濃度の抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、標準ＣＲＰ溶液（ＣＲＰ濃度＝０．５ｍｇ／ｄＬ）における吸光度変化量のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図４】異なる濃度の抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、標準ＣＲＰ溶液（ＣＲＰ濃度＝１２ｍｇ／ｄＬ）における吸光度変化量のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図５】異なる濃度の抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、標準ＣＲＰ溶液（ＣＲＰ濃度＝２８ｍｇ／ｄＬ）における吸光度変化量のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法に関する。本発明は、特に、ラテックス粒子懸濁液を使用した免疫凝集反応に基づいて分析対象物質を測定するために用いることができ、反応相におけるラテックス粒子に担持したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の反応速度と、ラテックス粒子懸濁液に添加したモノクローナル抗体の反応速度との違いにより、分析対象物質が多量に含まれている場合に抗原抗体反応の反応性を抑制することによって測定範囲を拡大することができる。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
生体液中に存在する微量成分等の測定法のひとつとして、分析対象物質に対する抗体又は抗原を利用する免疫学的測定方法が多用されている。その免疫学的測定手段としては、抗原抗体反応により形成される免疫複合体を光学的に測定する免疫比ろう法及び免疫比濁法や、放射性物質や酵素を標識体として利用するラジオイムノアッセイやエンザイムノアッセイが用いられてきた。また、近年、多数の被検試料を短時間に処理するための自動分析装置が普及し、更に高感度化が要求されることと相まって、特に、抗体（又は抗原）を結合したラテックス粒子との反応を利用するラテックス凝集法が汎用されている。いわゆるラテックス凝集法とは、分析対象物質と、ラテックス粒子に結合した抗体（又は抗原）との反応により生じるラテックス粒子の凝集の程度を検出することにより、分析対象物質を測定する方法である。この凝集の程度を検出する方法としては、目視的に観察するか、あるいは、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を測定する方法がある。光学的な分析方法は、試料中の抗原又は抗体の定量に用いられている。
【０００３】
しかし、前記のようなラテックス凝集法の実施には測定範囲の限界がある。例えば、粒子径を小さくすれば、分析対象物質の高濃度域を測定することができるが、低濃度度領域の測定ができず、粒子径を大きくすれば、分析対象物質の低濃度域を測定することができるが、高濃度度領域の測定ができない。
このような問題点に対して、異なる粒子径のラテックス粒子懸濁液を混合することによって、単一粒子径のラテックス粒子懸濁液を用いた場合よりも、測定範囲を拡大することができる方法が公知である［国際公開ＷＯ０２／７９７８５号パンフレット（特許文献１）］。また、懸濁液中に大量の金属イオン、アミノ酸、又はカオトロピック剤を添加して感度抑制することで、測定範囲を拡大させる方法がある［特開昭６２−２１８８６６号公報（特許文献２）］。
【０００４】
しかし、異なる粒子径のラテックス粒子懸濁液を使用する方法では、小さな粒子が高濃度域の反応性を高くし、大きな粒子が低濃度域の反応性を高くするが、低濃度域において小さな粒子が反応を抑制するため、大きな粒子単独の場合より反応性が低くなり、測定範囲拡大には限界がみられた。また、金属イオン等を添加する方法においても、分析対象物質の高濃度域を抑制すると、低濃度域にも同時に抑制が生じるため、測定範囲には限界があり、前記問題点を一挙に解決するには至っていないのが実情である。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開ＷＯ０２／７９７８５号パンフレット
【特許文献２】
特開昭６２−２１８８６６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、ラテックス凝集反応における前記の問題点を克服するために鋭意研究を重ねた結果、分析対象物質に対する抗体（ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）をラテックス粒子（好ましくは、２種類以上の粒径の異なるラテックス粒子）に担持したラテックス粒子懸濁液中に、遊離状態のモノクローナル抗体を存在させることで、測定範囲を拡大することができることを見出した。本発明はこうした知見に基づくものである。
従って、本発明の課題は、測定範囲を拡大することができ、且つ検出感度の高い免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、（１）分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子懸濁液、及び
（２）前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片
を含む、免疫学的分析試薬により解決することができる。
また、本発明は、（１）分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子と、
（２）前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片と、
（３）分析対象化合物を含む可能性のある被検試料と
を接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する、免疫学的分析方法に関する。
以下、本発明を、「抗体又はその断片」として「抗体」を用いる場合に基づいて主に説明するが、それらの説明が、当業者の技術常識の範囲内において実施可能である場合には、「抗体又はその断片」として「抗体断片」を用いる場合にもそのまま当てはまる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明では、その分析においてラテックス凝集反応を用いる。本発明においては、分析対象物質に対する抗体（例えば、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又はそれらの抗体フラグメント）を担持したラテックス粒子と、分析対象物質とを接触させ、ラテックス凝集反応を実施する系において、分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体（以下、凝集反応抑制用モノクローナル抗体と称することがある）を更に共存させることにより、低濃度域から高濃度域の広い濃度範囲にわたって、分析対象物質を分析（検出又は測定、好ましくは測定）することができる。
なお、本明細書において「遊離状態」とは、ラテックス懸濁液中で、それ単独で、他の物質と結合することなく、移動可能な状態を意味し、より具体的には、ラテックス粒子に担持されていない状態を意味する。
【０００９】
本発明により分析することのできる物質（分析対象物質）は、一般に抗原抗体反応を利用して抗原として分析することのできる物質（特に生理活性物質）であれば特に限定されない。分析対象物質の代表例としては、タンパク質又は脂質等を挙げることができ、より詳しくは、例えば、各種抗体、レセプター、又は酵素等を挙げることができる。具体的には、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＩｇＥ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体又はＨＢｃ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、又はトロンボモジュリン等を挙げることができる。
また、本発明で分析可能な被検試料は、前記分析対象化合物を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。
【００１０】
本発明では、その分析においてラテックス凝集反応を用いる。本発明におけるラテックス凝集反応では、分析対象物質に特異的に反応する抗体で感作したラテックスを用いる。
本発明で用いるラテックス粒子としては、公知のラテックス粒子、例えば、ポリスチレン、又はスチレンースチレンスルホン酸塩共重合体等からなるラテックス粒子を挙げることができる。
ラテックス粒子の平均粒径は、分析対象物質の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、通常、０．０４〜０．５μｍの範囲で適宣選択することができる。
また、粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子を用いることもできる。例えば、２種類のラテックス粒子を用いる場合には、小粒径ラテックス粒子の平均粒径は、分析対象物質の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０４〜０．１４μｍの範囲で適宣選択することができる。また、大粒径ラテックス粒子の平均粒径は、分析対象物質の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．１５〜０．５μｍの範囲で適宣選択することができる。
【００１１】
ラテックス粒子に担持させる抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いることができる。また、抗体の種類としては、免疫グロブリン分子自体のほか、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｖ等も使用可能である。ラテックス担体の感作は、任意の公知の方法で実施することができ、ラテックス担体に抗体を物理的又は化学的に結合させることにより感作することができる。
【００１２】
本発明においては、ラテックス粒子に担持させる抗体とは別に、遊離状態で、ラテックス粒子に担持させない状態で分析系に共存させる凝集反応抑制用モノクローナル抗体を使用する。前記凝集反応抑制用モノクローナル抗体としては、分析対象化合物に特異的に反応するモノクローナル抗体である限り、特に限定されるものではなく、分析対象化合物の高濃度域においてラテックス凝集反応を抑制可能であるモノクローナル抗体であることが好ましく、更に、低濃度域において、高濃度域で認められる程度のラテックス凝集反応抑制作用を示さないか、あるいは、実質的にラテックス凝集反応抑制作用を示さないモノクローナル抗体であることがより好ましい。
【００１３】
ラテックス粒子に担持させる抗体及び凝集反応抑制用モノクローナル抗体は、具体的には、分析対象物質（すなわち、抗原）に応じて適宜調製ないし選択することができ、分析対象物質として例示した前記物質、例えば、各種抗体、レセプター、又は酵素等に対する抗体を用いることができる。
例えば、凝集反応抑制用モノクローナル抗体としては、より具体的には、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＩｇＥ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体又はＨＢｃ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、又はトロンボモジュリン等に対する公知のモノクローナル抗体を用いることができ、これらのモノクローナル抗体の多くは、市販されている。例えば、抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、Ｔｓｅｎｇ等，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，１９８８に詳しく記載されており、多種の市販品も存在し、これらの任意の抗ＣＲＰモノクローナル抗体を使用することができる。
【００１４】
凝集反応抑制用モノクローナル抗体としては、１種類のモノクローナル抗体を用いることもできるし、あるいは、２種類以上のモノクローナル抗体を組み合わせて用いることもできる。ラテックス粒子に担持させる抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合には、凝集反応抑制用モノクローナル抗体として、ラテックス粒子に担持させる前記モノクローナル抗体と同じモノクローナル抗体を用いることもできるし、あるいは、ラテックス粒子に担持させる前記モノクローナル抗体とは別のモノクローナル抗体を用いることもできる。
また、前記凝集反応抑制用モノクローナル抗体としては、免疫グロブリン分子それ自体、あるいは抗体フラグメント［例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又はＦｖ］を用いることができる。
【００１５】
本発明では、ラテックス凝集反応を実施する系中に、凝集反応抑制剤としてのモノクローナル抗体を存在させることができる限り、ラテックス凝集反応の実施前の、モノクローナル抗体の存在態様は、特に限定されない。
例えば、ラテックス試薬（ラテックス粒子懸濁液）を用いた抗原抗体反応により、被検試料中の分析対象物質を分析する場合には、分析対象物質に対する抗体を感作したラテックス試薬（ラテックス粒子懸濁液）に予め凝集反応抑制用モノクローナル抗体を共存（添加）しておくことができる。この場合には、抗体を感作したラテックス粒子を適当なブロッキング剤、例えば、アルブミン又は界面活性剤で表面処理を施すことで、共存させる凝集反応抑制用モノクローナル抗体や分析対象物質以外の物質（主にタンパク質）がラテックス粒子へ結合することを防ぐことができる。
別法として、凝集反応抑制用モノクローナル抗体を含まないラテックス試薬（ラテックス粒子懸濁液）を使用することも可能である。この場合には、例えば、使用する緩衝液に凝集反応抑制用モノクローナル抗体を加えておく方法等があり、特に限定されない。
【００１６】
従って、本発明による免疫学的分析試薬は、例えば、抗体を感作したラテックス粒子と凝集反応抑制用モノクローナル抗体との両方を含む１液系の試薬；緩衝液である第１試薬と、抗体を感作したラテックス粒子とモノクローナル抗体との両方を含む第２試薬とで構成される２液系の試薬；あるいは、緩衝液と凝集反応抑制用モノクローナル抗体との両方を含む第１試薬と、抗体を感作したラテックス粒子を含む第２試薬とで構成される２液系の試薬など、種々の形態であることができる。
【００１７】
本発明においては、前記のような試薬を用いて凝集反応を行い、生じた凝集の度合い（凝集度）を光学的に分析（特には測定）することにより、被検試料中の分析対象物質の量を分析（特には測定）することができる。ラテックス粒子の凝集度を光学的に検出する具体的方法においては、例えば、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて測定を行うことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。測定方法は、公知の方法に従い、用いるラテックス粒子の大きさ（平均粒径）若しくは濃度の選択、又は反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより行うことができる。また、これらの方法を併用することも可能である。
【００１８】
本発明の免疫学的分析方法において、被検試料中に含まれる可能性のある分析対象物質が高濃度で存在する場合に、ラテックス粒子の凝集を抑制し、ラテックス粒子凝集度が吸光度測定における反応限界吸光度を超えないようにする量で、凝集反応抑制用モノクローナル抗体を存在させる。ここで、反応限界吸光度とは、吸光度測定における測定機器の測定可能最大値以上を意味する。反応限界吸光度のおおよその値は、個々の被検試料（群）に関して、予めパイロット試験等を実施することにより、予想することができるので、個々の測定系に応じて、凝集反応抑制用モノクローナル抗体の適切な濃度を決定することができる。
【００１９】
一般的に、抗原抗体反応の測定系に存在させる凝集反応抑制用モノクローナル抗体の濃度は、測定する項目、抗体の親和性、並びに共存する塩、タンパク質、及び／又は糖類等の添加物の濃度等によってその都度適宜選択することができる。例えば、共存させる凝集反応抑制用モノクローナル抗体濃度としては、通常、０．０００５〜０．２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．００１〜０．０１ｍｇ／ｍＬである。前記モノクローナル抗体の濃度が低すぎると、凝集反応の抑制効果が充分でなくなることがあり、逆に高すぎると、分析対象物質と、それに対する抗体を担持したラテックス粒子との間の特異的凝集反応も抑制してしまい、分析試薬の検量線傾きが低くなり、再現性が悪くなることがある。
【００２０】
本発明においては、凝集反応抑制用モノクローナル抗体の濃度を調節することに加え、ラテックス凝集反応に影響を与える他の因子を調節することによって、ラテックス粒子凝集反応を更に精密に抑制し、高濃度域の定量可能範囲を更に拡張させることができる。ラテックス凝集反応に影響を与える他の因子としては、例えば、ラテックス粒子の濃度、ラテックス粒子上の抗体感作量、及びラテックス粒子の粒径等を挙げることができる。
【００２１】
本発明で用いる抗原抗体反応の条件は通常の条件と同様であってよく、反応媒体としては、分析対象物質の種類に応じた各種緩衝液が適宜選択することができる。この緩衝液は、分析対象物質を失活させることがなく、かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよい。例えば、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、又はトリス緩衝液を使用することができる。反応のｐＨは、５〜１０、特に６〜８が好ましい。反応温度は０〜５０℃、特に２０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決めることができる。
【００２２】
本発明によれば、凝集反応抑制用モノクローナル抗体の働きにより、分析対象物質が高濃度で存在する場合に、ラテックス粒子の凝集反応の抑制により測定範囲の拡大が可能となる。本発明では、低濃度域においては、ラテックス粒子のこのような凝集反応抑制が実質的に起こらないか、あるいは、抑制の程度が小さい。高濃度域における前記抑制作用の機構及び低濃度域における前記挙動は、現在のところ完全に解明されたわけではないが、高濃度域における前記抑制作用については、本発明者は以下の機構によるものと考えている。なお、以下に示す機構は現時点の推測に基づくものであって、本発明は以下の推測に基づく機構に限定されるものではない。
【００２３】
本発明は、分析対象物質に対する反応速度が異なることを利用するものである。より詳細には、反応速度の速いポリクローナル抗体感作ラテックス粒子が凝集反応抑制用モノクローナル抗体よりも先に分析対象物質と反応する。高濃度域においては、ポリクローナル抗体感作ラテックス粒子が反応後に更なる架橋をするべきところに対して、凝集反応抑制用モノクローナル抗体が結合物質の反応部位と結合するためにそれ以上の凝集ができなくなることによって、高濃度域にだけ抑制効果が得られることに基づくものである。
【００２４】
また、粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子を用いると、分析対象物質量が少ない場合、抗体を担持した大粒径ラテックス粒子と小粒径ラテックス粒子とが分析対象物質と反応し、抗原抗体反応により凝集するが、大粒径ラテックス粒子が混在するため、その凝集度を吸光度によって測定することができる。一方、分析対象物質が大量の場合、抗体を担持したラテックス粒子だけでは全ての分析対象物質と抗原抗体反応により架橋することができない。分析対象物質がラテックスの反応部位を全てマスクすることにより凝集反応が起こらなくなることを地帯現象（プロゾーン現象）と表現し、未結合の分析対象物質が大量に含まれているにも関わらず、低濃度の測定と誤判定することがある。しかし、凝集反応抑制用モノクローナル抗体が大量の分析対象物質と反応することで前記地帯現象（プロゾーン現象）を抑えることが可能となり、更に高濃度域の凝集反応を抑えることにより、測定範囲拡大が可能となる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）測定試薬の調製》
（１）抗ＣＲＰ抗体感作小粒径ラテックス液の調製
抗ＣＲＰポリクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した液９ｍＬに、平均粒径０．０８μｍのポリスチレンラテックス粒子（日本合成ゴム製：固形分１０重量％）１ｍＬを添加し、室温にて６０分間攪拌した。次いで、この液に０．５重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、室温にて６０分間攪拌した後、この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作小粒径ラテックス液を調製した。
【００２６】
（２）抗ＣＲＰ抗体感作大粒径ラテックス液の調製
平均粒径０．０８μｍのポリスチレンラテックス粒子の代わりに、平均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックスを用いたこと以外は、実施例１（１）の操作を繰り返すことにより、抗ＣＲＰ抗体感作大粒径ラテックス液を調製した。
すなわち、実施例１（１）で用いたのと同じ抗ＣＲＰポリクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した液９ｍＬに、平均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（日本合成ゴム製：固形分１０重量％）１ｍＬを添加し、室温にて６０分間攪拌した。次いで、この液に０．５重量％ＢＳＡを含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、室温にて６０分間攪拌した後、この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作大粒径ラテックス液を調製した。
【００２７】
（３）モノクローナル抗体含有ラテックス粒子懸濁液の調製
実施例１（１）及び実施例１（２）でそれぞれ作製したラテックス液を各々０．１ｍＬ採取し、原液濃度１０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰモノクローナル抗体３μＬを添加後、トリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて１ｍＬとすることにより、モノクローナル抗体含有抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液を調製した。なお、抗ＣＲＰモノクローナル抗体としては市販の２種類の市販のモノクローナル抗体（それぞれをＭｏＡｂ−１及びＭｏＡｂ−２とした）を使用した。
【００２８】
（４）緩衝液の調製
０．５重量％ＢＳＡを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ＰＨ８．０）に、０．９重量％の濃度となるように塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。
【００２９】
（５）ヒトＣＲＰ抗原測定試薬
実施例１（３）で調製したモノクローナル抗体含有抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液（第１試薬）と、実施例１（４）で調製した緩衝液（第２試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としてのヒトＣＲＰ抗原測定試薬として、以下の実施例で評価した。
【００３０】
【実施例２】
《標準ＣＲＰ溶液の測定》
（１）標準ＣＲＰ溶液の調製
ＣＲＰ標準品をトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、０ｍｇ／ｄＬ、０．５ｍｇ／ｄＬ、１ｍｇ／ｄＬ、２ｍｇ／ｄＬ、４ｍｇ／ｄＬ、８ｍｇ／ｄＬ、１２ｍｇ／ｄＬ、１６ｍｇ／ｄＬ、２０ｍｇ／ｄＬ、２４ｍｇ／ｄＬ、２８ｍｇ／ｄＬ、３２ｍｇ／ｄＬ、３６ｍｇ／ｄＬ、４０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、８０ｍｇ／ｄＬ、及び１００ｍｇ／ｄＬ濃度の標準ＣＲＰ希釈列を作製した。
【００３１】
（２）測定
標準ＣＲＰ希釈列２μＬに、実施例１（４）で調製した緩衝液１００μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例１（３）で調製したモノクローナル抗体含有抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス懸濁液１００μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
【００３２】
抗ＣＲＰモノクローナル抗体としてＭｏＡｂ−１又はＭｏＡｂ−２のいずれか一方を用いた場合のそれぞれの結果を、図１に示す。図１には、比較用として、実施例１（３）で調製したモノクローナル抗体含有抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液の代わりに、抗ＣＲＰモノクローナル抗体無添加の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液を用いた場合の結果を、併せて示す。なお、本測定における反応液中の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の濃度は、その手順から明らかなように、０．０１５ｍｇ／ｍＬである。
【００３３】
図１から明らかなように、ラテックス粒子懸濁液にモノクローナル抗体を無添加の場合には、ＣＲＰ濃度が３２ｍｇ／ｄＬ以上で反応限界吸光度オーバーとなり、測定範囲が低濃度域に限定された。
それに対して、モノクローナル抗体を添加した場合には、ＣＲＰ濃度が高濃度の領域であっても、高濃度域における測定感度を抑制することにより、測定が可能であった。しかも、この場合、低濃度域の測定感度はほとんど低下しておらず、その結果、低濃度域から高濃度域の広い濃度範囲にわたって、測定が可能であった。但し、使用したモノクローナル抗体の種類により、測定範囲の拡大作用に差が認められ、本実施例においては、モノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１がより好適であった。
【００３４】
【実施例３】
《モノクローナル抗体の添加濃度の影響の確認》
本実施例は、ラテックス粒子懸濁液に添加するモノクローナル抗体の添加濃度が、測定範囲の拡大作用に及ぼす影響を評価する目的で実施した。具体的には、抗ＣＲＰモノクローナル抗体としてＭｏＡｂ−１を使用し、反応液中の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の濃度を３段階（０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、及び０．０２ｍｇ／ｍＬ）に変化させること以外は、前記実施例２（２）の操作を繰り返した。
【００３５】
結果を、抗ＣＲＰモノクローナル抗体無添加の場合（比較用）の結果と併せて、図２に示す。図２から明らかなように、添加するモノクローナル抗体の濃度によって、測定範囲の拡大作用に差が認められ、特に、高濃度域における測定感度の抑制の程度は、モノクローナル抗体の添加濃度に依存した。すなわち、高濃度域における反応性は、モノクローナル抗体の添加濃度依存的に抑制されることが判明した。
本実施例から明らかなように、例えば、本実施例の手順に準じて予備実験等を行うことによって、モノクローナル抗体の適切な添加濃度を容易に決定することができる。
なお、本実施例で凝集反応抑制用モノクローナル抗体として用いた抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１が、ラテックス粒子不在下において、ＣＲＰと凝集反応を生じるか否かを確認したところ、本実施例で使用した濃度範囲では、凝集反応は生じなかった。
【００３６】
【実施例４】
《各ＣＲＰ濃度における反応速度の確認》
本実施例は、種々の異なるＣＲＰ濃度における反応速度（タイムコース）を測定することにより、ラテックス粒子懸濁液に添加するモノクローナル抗体によってもたらされる反応性抑制の程度と、ＣＲＰ濃度との関連性を調べる目的で実施した。
測定は、実施例３に記載の操作に準じて行った。具体的には、反応液中の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の濃度は２段階（０．００５ｍｇ／ｍＬ及び０．０１ｍｇ／ｍＬ）とし、ＣＲＰ濃度は３段階（０．５ｍｇ／ｄＬ、１２ｍｇ／ｄＬ、及び２８ｍｇ／ｄＬ）とした。また、吸光度の経時的測定は、ラテックス粒子懸濁液の添加から５分経過後から開始し、１７．８秒毎の測定を５分間実施した（測定ポイントの第１６．５番〜第３４番に相当）。
【００３７】
ＣＲＰ濃度が０．５ｍｇ／ｄＬの場合の結果を図３に示し、ＣＲＰ濃度が１２ｍｇ／ｄＬの場合の結果を図４に示し、ＣＲＰ濃度が２８ｍｇ／ｄＬの場合の結果を図５に示す。
図３〜図５に示すように、ラテックス粒子懸濁液に添加するモノクローナル抗体の効果（すなわち、反応性抑制の程度）は、分析対象化合物（ＣＲＰ）の低濃度域では小さいのに対して、高濃度域では大きかった。すなわち、公知の感度抑制剤（例えば、金属イオン、アミノ酸、又はカオトロピック剤）では、従来の技術欄で述べたように、分析対象物質の高濃度域と低濃度域とを同時に抑制してしまうのに対して、本発明において用いるモノクローナル抗体では、高濃度域側のみを効果的に抑制することが可能である。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の免疫学的分析試薬又は免疫学的分析方法によれば、ラテックス粒子を使用し免疫凝集反応に基づく分析対象物質の分析（特には測定）において、高濃度域の凝集反応が抑制されることで、低濃度域から高濃度域まで測定範囲を拡大することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】凝集反応抑制用モノクローナル抗体として抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１又はＭｏＡｂ−２を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、種々濃度の標準ＣＲＰ溶液の吸光度変化量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】異なる濃度の抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、種々濃度の標準ＣＲＰ溶液の吸光度変化量を測定した結果を示すグラフである。
【図３】異なる濃度の抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、標準ＣＲＰ溶液（ＣＲＰ濃度＝０．５ｍｇ／ｄＬ）における吸光度変化量のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図４】異なる濃度の抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、標準ＣＲＰ溶液（ＣＲＰ濃度＝１２ｍｇ／ｄＬ）における吸光度変化量のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図５】異なる濃度の抗ＣＲＰモノクローナル抗体ＭｏＡｂ−１を含む本発明の免疫学的分析試薬を用いて、標準ＣＲＰ溶液（ＣＲＰ濃度＝２８ｍｇ／ｄＬ）における吸光度変化量のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
Claims (4)
- （１）分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子懸濁液、及び
（２）前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片
を含む、免疫学的分析試薬。 - （１）分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持した粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子懸濁液、及び
（２）前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片
を含む、免疫学的分析試薬。 - （１）分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持したラテックス粒子と、
（２）前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片と、
（３）分析対象化合物を含む可能性のある被検試料と
を接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する、免疫学的分析方法。 - （１）分析対象物質に対する抗体又はその断片を担持した粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子と、
（２）前記分析対象物質に対する遊離状態のモノクローナル抗体又はその断片と、
（３）分析対象化合物を含む可能性のある被検試料と
を接触させ、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する、免疫学的分析方法。
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