JP2000275245A - 免疫測定試薬及び免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 被測定物質に対する抗原又は抗体を担持した
ラテックス粒子懸濁液と被検試料とを接触させ、その接
触後のラテックス粒子凝集度を吸光度によって測定する
免疫測定方法において、被測定物質の高濃度域に測定可
能範囲を拡大することができる免疫測定試薬及び免疫測
定方法を提供する。 【解決手段】 免疫測定試薬は、被測定物質の濃度に応
じてラテックス粒子の凝集を抑制し、ラテックス粒子凝
集度が吸光度測定における反応限界吸光度を越えないよ
うにする量でチオシアン酸塩を含む。免疫測定方法は、
前記反応限界吸光度を越えないようにする量で前記チオ
シアン酸塩を存在させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫測定試薬及び
免疫測定方法に関する。本発明は、特に、ラテックス懸
濁液を使用した免疫凝集反応に基づいて被測定物質を測
定するために用いられ、自動分析測定装置において反応
性を抑制することにより、測定範囲を拡大することがで
きる。

【０００２】

【従来の技術】体液中に存在する微量成分等の測定法の
ひとつとして、目的とする被測定物質に対する抗体又は
抗原をラテックス粒子に担持させ、被測定物質との抗原
抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集の度合いを
検出することにより、被測定物質を測定する方法があ
る。この凝集の程度を検出する方法としては、反応液に
光を照射して散乱光あるいは透過光を測定する方法があ
る。こうした光学的な測定方法は試料中の抗原又は抗体
の定量に用いられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記のような
測定法においては、いずれも血清等のような検体と反応
させたとき、過剰に凝集することにより自動分析測定装
置の測定限界吸光度を超えることがあり、測定可能範囲
が狭くなってしまうことがある。ラテックス凝集反応で
上記のような問題を克服するためには、使用するラテッ
クス粒子を小さくすることが考えられるが、小さなラテ
ックス粒子を使用しても、被測定物質濃度が高くなるの
に伴って凝集が加速度的に促進され、結果的に測定限界
吸光度を超えてしまうことになる。

【０００４】本発明は、上記課題の解決を目指すもので
あり、使用するラテックス粒子を小さくすることなく、
特定の抑制剤を加えて凝集反応を抑制することによって
測定可能範囲を拡大し、且つ検出感度の高い免疫測定試
薬及び免疫測定法を提供することにある。本発明者ら
は、上記問題を解決するために鋭意研究した結果、ラテ
ックス懸濁液と被検試料との免疫反応測定系中にチオシ
アン酸塩を存在させることによって、凝集反応の抑制が
起きることを見い出した。本発明はこうした知見に基づ
くものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、被測
定物質に対する抗原又は抗体を担持したラテックス粒子
懸濁液と、チオシアン酸塩とを含み、前記チオシアン酸
塩の存在下で前記ラテックス粒子懸濁液と被検試料とを
接触させた後のラテックス粒子凝集度を吸光度によって
測定する免疫測定試薬であって、前記被検試料中に含ま
れる可能性のある前記被測定物質の濃度に応じて前記ラ
テックス粒子の凝集を抑制し、前記ラテックス粒子凝集
度が前記吸光度測定における反応限界吸光度を越えない
ようにする量で前記チオシアン酸塩を含むことを特徴と
する、前記の免疫測定試薬に関する。また、本発明は、
被測定物質に対する抗原又は抗体を担持したラテックス
粒子懸濁液と被検試料とをチオシアン酸塩の存在下で接
触させ、その接触後のラテックス粒子凝集度を吸光度に
よって測定する免疫測定方法において、前記被検試料中
に含まれる可能性のある前記被測定物質の濃度に応じて
前記ラテックス粒子の凝集を抑制し、前記ラテックス粒
子凝集度が前記吸光度測定における反応限界吸光度を越
えないようにする量で前記チオシアン酸塩を存在させる
ことを特徴とする、前記の免疫測定方法にも関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明では、ラテックス凝集反応
を抑制する凝集反応抑制剤としてチオシアン酸塩を用い
る。チオシアン酸塩としては、特には、水溶性チオシア
ン酸塩、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム
塩、又はカリウム塩）あるいはアンモニウム塩等を用い
ることができる。

【０００７】本発明では、ラテックスとして、通常のラ
テックス凝集法において一般的に使用されているラテッ
クスを用いることができ、例えば、ポリスチレンラテッ
クス、又はスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体ラ
テックス等がある。用いるラテックスの平均粒径は、測
定対象である被測定物質の検出濃度あるいは測定機器に
よって適宜選択することができるが、一般的には０．０
５〜０．５μｍの範囲で適宜選択される。

【０００８】本発明により測定されるべき物質（被測定
物質）は特に限定されず、一般に抗原抗体反応を利用し
て測定し得る生理活性物質はいずれも測定可能である。
被測定物質としては、一般的にタンパク質又は脂質等が
あり、より詳しくは、例えば、各種抗原、抗体、レセプ
ター、又は酵素等が挙げることができる。具体的には、
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、リウマチ因子、βー２
マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）、抗ストレプトリジンＯ抗体、ＩｇＥ、梅毒トレポ
ネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢＳ抗体、
ＨＢＳ抗原、ＨＢｃ抗体、又はＨＢｅ抗体等を例示する
ことができる。また、本発明において被検試料は、前記
の被測定物質を含む可能性を有する試料であれば特に限
定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血
漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げ
ることができる。

【０００９】本発明では、その測定系においてラテック
ス凝集反応を用いる。ラテックス凝集反応では、抗原又
は抗体で感作したラテックスを用いる。ラテックス担体
の感作は、任意の公知の方法で実施することができ、ラ
テックス担体に抗原又は抗体を物理的又は化学的に結合
させることにより感作することができる。抗体で感作す
る場合は、免疫グロブリン分子自体のほか、Ｆａｂ’や
Ｆ（ａｂ）₂のような断片でも使用可能である。抗体と
しては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を
用いることができる。

【００１０】本発明では、ラテックス凝集反応を実施す
る系中に、凝集反応抑制剤としてのチオシアン酸塩を存
在させることができるかぎり、ラテックス凝集反応の実
施前の、チオシアン酸塩の存在態様は、特に限定されな
い。例えば、ラテックス試薬（ラテックス粒子懸濁液）
を用いた抗原抗体反応により、被検試料中の被測定物質
を測定する場合には、被測定物質に対する抗体又は抗原
を感作したラテックス試薬（ラテックス粒子懸濁液）に
予めチオシアン酸塩を添加しておくことができる。別法
として、チオシアン酸塩を含まないラテックス試薬（ラ
テックス粒子懸濁液）を使用することも可能である。こ
の場合には、抗原抗体反応を行う際にチオシアン酸塩を
該反応系に存在させるようにする。例えば、被検試料中
に予めチオシアン酸塩を添加しておく方法；使用する緩
衝液にチオシアン酸塩を加えておく方法等があり、特に
限定されない。従って、本発明による測定試薬は、例え
ば、抗体又は抗原を感作したラテックス粒子とチオシア
ン酸塩との両方を含む１液系の試薬；抗体又は抗原を感
作したラテックス粒子を含む第１試薬と、チオシアン酸
塩を含む緩衝液である第２試薬とで構成される２液系の
試薬；等種々の形態であることができる。

【００１１】本発明においては、上記のような試薬を用
いて凝集反応を行い、生じた凝集の度合い（凝集度）を
光学的に測定することにより、被検試料中の被測定物質
の量を測定することができる。ラテックス粒子の凝集度
を光学的に検出する具体的方法においては、散乱光強
度、吸光度又は透過光強度を測定する光学機器を用いて
測定を行う。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍで
ある。測定方法は、公知の方法に従い、用いるラテック
ス粒子の大きさ（平均粒径）若しくは濃度の選択、又は
反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度又は透過光
強度の増加若しくは減少を測定することにより行われ
る。また、これらの方法を併用することも可能である。

【００１２】この免疫測定法において、前記被検試料中
に含まれる可能性のある前記被測定物質の濃度に応じて
前記ラテックス粒子の凝集を抑制し、前記ラテックス粒
子凝集度が前記吸光度測定における反応限界吸光度を越
えないようにする量で前記チオシアン酸塩を存在させ
る。ここで、反応限界吸光度とは、吸光度測定における
測定機器の測定可能最大値以上を意味する。反応限界吸
光度のおおよその値は、個々の被検試料（群）に関し
て、予めパイロット試験等を実施することにより、予想
することができるので、個々の測定系に応じて、チオシ
アン酸塩の適切な濃度を決定することができる。

【００１３】一般的に、抗原抗体反応の反応系に存在さ
せるチオシアン酸塩の濃度は、その反応系に共存する
塩、タンパク質、及び／又は糖類等の添加物の濃度によ
って変化する。一般には、抗原抗体反応系の全重量に対
して、チオシアン酸塩が好ましくは１〜５重量％、より
好ましくは２〜３重量％の量で存在させるように調整す
る。チオシアン酸塩の濃度が低すぎると、凝集反応の抑
制効果が十分でなくなり、逆に高すぎると、被測定物質
と、それに対する抗体又は抗原を担持したラテックス粒
子との間の特異的凝集反応も抑制してしまい、検出感度
が悪くなる。

【００１４】本発明においては、チオシアン酸塩の濃度
を調節することに加え、ラテックス凝集反応に影響を与
える他の因子を調節することによって、ラテックス粒子
凝集度を更に精密に抑制し、高濃度域の定量可能範囲を
更に拡張させることができる。ラテックス凝集反応に影
響を与える他の因子としては、例えば、ラテックス粒子
の濃度、ラテックス粒子上の抗体若しくは抗原の感作
量、及びラテックス粒子の粒径等を挙げることができ
る。

【００１５】本発明で用いる抗原抗体反応の条件は通常
の条件と同様であることができ、反応媒体としては、被
検試料及び被測定物質の種類に応じて各種緩衝液を適宜
選択することができる。この緩衝液は、被測定物質を失
活させることがなく、且つ抗原抗体反応を阻害しないよ
うなイオン濃度やｐＨを有するものであればよい。例え
ば、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、又はトリス緩衝液
を使用することができる。抗原抗体反応のｐＨは、５〜
１０、特に６〜８が好ましい。抗原抗体反応温度は０〜
５０℃、特に２０〜４０℃が好ましい。抗原抗体反応時
間は適宜決めることができる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】《Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）測定試薬
及び測定法》 （１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製 抗ＣＲＰ抗体を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０１Ｍト
リス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して調製した抗体液９
ｍｌに、平均粒径０．１μｍのポリスチレンラテックス
（固形分１０重量％）１ｍｌを添加し、室温にて６０分
間攪拌した。次いで、この混合液に、ＢＳＡを０．５重
量％含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、室
温にて６０分間攪拌した後、この混合液を３５０００ｒ
ｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）１０ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁さ
せ、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。

【００１７】（２）チオシアン酸塩含有緩衝液の調製 ０．５重量％濃度でＢＳＡを含有する０．１Ｍトリス緩
衝液（ｐＨ８．０）に、チオシアン酸ナトリウムを加
え、１０．０重量％、５重量％、２．６重量％、及び
１．２重量％の濃度になるように溶解し、一連のチオシ
アン酸塩含有緩衝液を調製した。

【００１８】（３）ヒトＣＲＰ抗原測定試薬 本実施例のヒトＣＲＰ抗原測定試薬は、上記（１）項の
抗ＣＲＰ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記
（２）項のチオシアン酸塩含有緩衝液からなる第２試薬
とから構成される２液系の試薬である。

【００１９】（４）標準ＣＲＰ抗原液 ＣＲＰ抗原を０ｍｇ／ｄｌ、０．５ｍｇ／ｄｌ、１ｍｇ
／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌ、１５ｍｇ／ｄｌ、４０ｍｇ／ｄ
ｌ、７０ｍｇ／ｄｌ、及び１００ｍｇ／ｄｌの濃度で含
む一連のヒト血清を調製し、標準ＣＲＰ抗原液として使
用した。

【００２０】（５）測定方法 それぞれの標準ＣＲＰ抗原液３μｌに、上記（２）項の
チオシアン酸塩含有緩衝液２００μｌを添加して混合
し、３７℃で約５分間保持した後、上記（１）項の抗Ｃ
ＲＰ抗体感作ラテックス液２００μｌを添加して攪拌し
た。この添加から５分間経過するまでの間の吸光度変化
を波長５７０ｎｍにて測定した。ブランク試験（チオシ
アン酸塩０％）では、上記（２）項のチオシアン酸塩含
有緩衝液２００μｌを用いる代わりに、０．５重量％濃
度でＢＳＡを含有する０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．
０）２００μｌを添加した。なお、吸光度測定は、日立
自動分析装置７０６０型を用いて行った。

【００２１】（６）結果 結果を表１及び図１に示す。

【００２２】 《表１》 チオシアン酸Ｎａ 0% 0.60% 1.30% 2.50% 5.00%終濃度 CRP濃度 0.0mg/dl -2 1 -2 - -7 0.5mg/dl 199 162 98 59 24 1 mg/dl 464 323 208 200 154 5 mg/dl 1671 1518 1357 1067 992 15 mg/dl 4485 4162 3529 3201 2763 40 mg/dl ＡＢＳ ＡＢＳ 10915 8336 6383 70 mg/dl ＡＢＳ ＡＢＳ ＡＢＳ 12447 10350100 mg/dl ＡＢＳ ＡＢＳ ＡＢＳ ＡＢＳ 13380 ＊ＡＢＳは反応限界吸光度オーバー（＞３２０００）である チオシアン酸塩濃度を高くすることで反応限界吸光度エ
ラーが出なくなり、測定可能範囲が高濃度域に拡大する
ことが明確に示された。但し、チオシアン酸塩濃度が
５．００％を越えると、測定範囲下限の感度が低下し、
測定範囲を狭くすることになる。そこで、より詳細に調
べた結果、本発明の目的を実現させるチオシアン酸塩の
濃度は１〜５％が好適で、特に測定範囲が最も広い条件
は２〜３重量％であった。

【００２３】

【比較例１】前記実施例１（１）と同様の操作を繰り返
すことによって、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製
したが、但し、平均粒径が０．０６μｍのポリスチレン
ラテックスを使用し、且つラテックス濃度を１．０５０
％、０．５２５％及び０．２６３％として、それぞれの
抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の７００ｎｍでの吸光度
（Ｏ．Ｄ．）が、１．００、０．５０及び０．２５とな
る３種の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。こ
れらの３種の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を用い、前
記実施例１（２）で調製したチオシアン酸ナトリウム５
％を含有するチオシアン酸塩含有緩衝液を使用し、それ
以外は前記実施例１（３）〜（５）に記載の操作を繰り
返した。得られた結果を表２及び図２に示す。

【００２４】 《表２》 ラテックス濃度 1.050% 0.525% 0.263% ７００ｎｍ吸光度 1.00 0.50 0.25 CRP濃度 0.0mg/dl -5 -10 -1 0.5mg/dl 19 20 33 1 mg/dl 29 51 69 5 mg/dl 344 440 537 15 mg/dl 942 1789 2459 40 mg/dl 3346 4840 5996 70 mg/dl 6519 6134 5521100 mg/dl 12677 7141 4429

【００２５】

【比較例２】前記実施例１（１）と同様の操作を繰り返
すことによって、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製
したが、但し、平均粒径が０．１μｍのポリスチレンラ
テックスを使用し、且つラテックス濃度を１．３１３
％、０．１５６％及び０．０７８％として、それぞれの
抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の７００ｎｍでの吸光度
（Ｏ．Ｄ．）が、１．００、０．５０及び０．２５とな
る３種の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。こ
れらの３種の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を用い、前
記実施例１（２）で調製したチオシアン酸ナトリウム５
％を含有するチオシアン酸塩含有緩衝液を使用し、それ
以外は前記実施例１（３）〜（５）に記載の操作を繰り
返した。得られた結果を表３及び図３に示す。

【００２６】 《表３》 ラテックス濃度 0.313% 0.156% 0.078% ７００ｎｍ吸光度 1.00 0.50 0.25 CRP濃度 0.0mg/dl 4 8 5 0.5mg/dl 245 222 198 1 mg/dl 556 518 471 5 mg/dl 1773 1481 980 15 mg/dl 4434 3328 2459 40 mg/dl 13249 10759 5996 70 mg/dl 12293 9596 5521100 mg/dl 10590 6969 3455

【００２７】

【比較例３】前記実施例１（１）と同様の操作を繰り返
すことによって、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製
したが、但し、平均粒径が０．３２μｍのポリスチレン
ラテックスを使用し、且つラテックス濃度を０．０２２
０％、０．０１１０％及び０．００５６％として、それ
ぞれの抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の７００ｎｍでの
吸光度（Ｏ．Ｄ．）が、１．００、０．５０及び０．２
５となる３種の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製し
た。これらの３種の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を用
い、前記実施例１（２）で調製したチオシアン酸ナトリ
ウム５％を含有するチオシアン酸塩含有緩衝液を使用
し、それ以外は前記実施例１（３）〜（５）に記載の操
作を繰り返した。得られた結果を表４及び図４に示す。

【００２８】 《表４》 ラテックス濃度 0.0220% 0.0110% 0.0056% ７００ｎｍ吸光度 1.00 0.50 0.25 CRP濃度 0.0mg/dl -22 -4 -13 0.5mg/dl 1735 558 184 1 mg/dl 1878 599 182 5 mg/dl 1824 606 188 15 mg/dl 1724 589 176 40 mg/dl 1705 562 159 70 mg/dl 1723 533 154100 mg/dl 1647 513 142

【００２９】表２〜４及び図２〜４に示したように、粒
径の異なるラテックス粒子の濃度を変えても、本発明に
よる効果は得られなかった。

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、チオシアン酸塩をラテ
ックス凝集反応抑制剤として用いることにより、高濃度
域においても測定可能範囲を拡大することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】チオシアン酸塩濃度変化が吸光度変化に与える
影響を示すグラフである。

【図２】平均粒径０．０６μｍのラテックスを使用した
場合の吸光度変化に与える影響を示すグラフである。

【図３】平均粒径０．１μｍのラテックスを使用した場
合の吸光度変化に与える影響を示すグラフである。

【図４】平均粒径０．３２μｍのラテックスを使用した
場合の吸光度変化に与える影響を示すグラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物質に対する抗原又は抗体を担持
   したラテックス粒子懸濁液と、チオシアン酸塩とを含
   み、前記チオシアン酸塩の存在下で前記ラテックス粒子
   懸濁液と被検試料とを接触させた後のラテックス粒子凝
   集度を吸光度によって測定する免疫測定試薬であって、
   前記被検試料中に含まれる可能性のある前記被測定物質
   の濃度に応じて前記ラテックス粒子の凝集を抑制し、前
   記ラテックス粒子凝集度が前記吸光度測定における反応
   限界吸光度を越えないようにする量で前記チオシアン酸
   塩を含むことを特徴とする、前記の免疫測定試薬。
2. 【請求項２】 被測定物質に対する抗原又は抗体を担持
   したラテックス粒子懸濁液と被検試料とをチオシアン酸
   塩の存在下で接触させ、その接触後のラテックス粒子凝
   集度を吸光度によって測定する免疫測定方法において、
   前記被検試料中に含まれる可能性のある前記被測定物質
   の濃度に応じて前記ラテックス粒子の凝集を抑制し、前
   記ラテックス粒子凝集度が前記吸光度測定における反応
   限界吸光度を越えないようにする量で前記チオシアン酸
   塩を存在させることを特徴とする、前記の免疫測定方
   法。
3. 【請求項３】 被測定物質に対する抗原又は抗体を担持
   したラテックス粒子懸濁液と被検試料とを接触させ、そ
   の接触後のラテックス粒子凝集度を吸光度によって測定
   する免疫測定方法におけるラテックス凝集反応抑制剤と
   してのチオシアン酸塩の使用。