JPH04324358A - 糞便中のヒトヘモグロビン測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は大腸癌や結腸癌等による
消化管出血の有無及び程度を調べるために用いられる糞
便中のヒトヘモグロビン測定法に関するものである。本
発明の測定法は測定に要する時間が短く、食事制限等を
必要とせず、しかも簡便な方法であるので集団検診等多
数の検体を処理する場合に特に有用である。

【０００２】

【従来の技術】糞便中の潜在性血液（以下潜血と略す）
の有無を調べることは消化管疾患、中でも大腸癌や結腸
癌等の消化管出血を伴う疾患の診断に大変有効であり現
在幅広く用いられている。

【０００３】従来行なわれていた潜血の定量あるいは定
性試験は、血液中に含まれるヘモグロビンの有する触媒
作用を化学反応により測定するものであり、代表的なも
のとしてＯ−トリジン法やグアヤック法等がある。これ
らの方法は操作自体は簡便であるが、動物食品中に含ま
れるヘモグロビンや植物蛋白質、更には金属塩等による
影響を受けるため、被検者はわずらわしい食事制限を余
儀なくされていた。従ってこれらの方法を集団検診等に
用いることはかなり難しいことであった。

【０００４】そこで近年上記問題を解決する方法として
ヒトヘモグロビン（以下ヒトＨｂと略す）と特異的に反
応する抗ヒトＨｂ抗体を用いた免疫学的方法が開発され
、広く用いられるようになってきた。

【０００５】これらの方法として例えば抗ヒトＨｂ抗体
を含む寒天平板を用い、加えた試料中のＨｂとの免疫沈
降線の形成の有無によって判定する一次元免疫拡散法（
ゾングスター等，Ｃａｎｃｅｒ，４５，１０９９（１９
８０））が知られているが、この方法は感度が低く多く
の試料を必要とするという欠点を有している。

【０００６】そこで抗ヒトＨｂポリクローナル抗体を結
合させたラテックス粒子の凝集により判定するラテック
ス凝集法（特開昭５９−１２５０６４　号公報）及びラ
テックス凝集法の欠点であるＨｂ濃度が高すぎる時に起
こるプロゾーン現象の発生を考慮し、ヒトＨｂを結合さ
せたラテックスと抗ヒトＨｂ抗体を用い、ヒトＨｂ（抗
原）を凝集阻害因子として作用させ、凝集の起こらない
ものを陽性とするラテックス凝集抑制法（特開昭６３−
２８９４５３）が簡便で感度に優れた方法として開発さ
れた。しかしこれらの方法も感度（０．２５　μｇ／ｍ
ｌ〜２０μｇ／ｍｌ）　が十分に高いとは言えず、また
１度に数検体しか測定できないので多数の検体の処理に
は不向きな方法である。

【０００７】感度の点ではサンドイッチ法による酵素免
疫測定法（ＥｌＡ）が優れており、またこの方法は多数
の検体を一度に処理できるという利点を有している。し
かしながらＥＩＡは前述したそれぞれの方法に比べ、測
定操作が複雑でしかも測定に長時間を有するという欠点
をもっている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は以上の様な状
況に鑑みてなされたものであって、測定操作が簡便で、
しかも酵素免疫測定法と同等、若しくはそれ以上の測定
感度を有し、多数検体を同時に処理できる免疫学的測定
法を提供しようとするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の糞便中のヒトＨ
ｂ測定方法は、糞便中のヒトＨｂを、抗ヒトＨｂ抗体、
及びルミノール或はルミノール誘導体を用いて酸化剤の
存在下に化学発光法により測定することに要旨がある。

【００１０】

【作用】本発明者らは、上記の様な方法を開発すること
を目的として鋭々努力を重ねた結果、固相化した抗ヒト
Ｈｂ抗体に、被測定試料である糞便中のヒトＨｂを選択
的に結合させ、この結合したＨｂを触媒として、過酸化
水素など適当な酸化剤とルミノールあるいはルミノール
誘導体を反応させ、生じた化学発光を測定することによ
りヒトＨｂを測定する方法を完成するに至った。

【００１１】ルミノール或はルミノール誘導体は過酸化
水素の存在下に血液等と反応して発光することは一般に
よく知られている。しかしこの発光はヒトＨｂに対して
特異的なものではなく動物のＨｂやヘミン等とも反応し
発光を生じるので、本発明においては抗ヒトＨｂ抗体に
ヒトＨｂを結合させることによって選択性を高めるもの
である。更に通常のＥｌＡ（サンドイッチ法）では抗ヒ
トＨｂ抗体に結合したヒトＨｂに、更に酵素標識抗ヒト
Ｈｂ抗体を結合させる必要があるので、操作が煩雑とな
り測定に長時間を要するが、本発明では抗ヒトＨｂに結
合したヒトＨｂ自身の触媒作用により直接測定が可能で
あることから、操作も簡単になり、その結果測定時間を
著しく短縮することができる。

【００１２】更に測定方法に沿って具体的に説明する。 まず検体（糞便）を適当な緩衝液等に懸濁し、遠心分離
或は濾過等により上澄み液を得るか、或はろ紙等で吸水
することよりその液体成分を抽出する。得られた液体成
分を例えば、ポリ塩化ビニル，ポリスチレン，ナイロン
等の合成プラスチック材、ガラスやニトロセルロースフ
ィルム、あるいはシリコンビーズなどの免疫反応用固相
化担体に固定化された抗ヒトＨｂ抗体と反応させること
により、液体成分中のヒトＨｂを分離する。ここで抗ヒ
トＨｂ抗体としてはモノクローナル抗体を用いることが
好ましいが、ポリクローナル抗体を用いることも可能で
ある。

【００１３】抗ヒトＨｂ抗体に結合したヒトＨｂを触媒
とし、ルミノール或はルミノール誘導体と過酸化水素水
を反応させる。この際ルミノール或はルミノール誘導体
または過酸化水素水を反応開始剤として用い、生じたル
ミノール発光を検出器により測定する。上記ルミノール
誘導体としてはイソルミノールや６−Ｎ−（４−アミノ
ブチル）−エチル−２，３−ジヒドロ−１，４−フタル
ヒドラジンジオン等の様なヒトＨｂと反応してルミノー
ル発光を生じるものを全て使用することができる。また
本発明では、酸化剤として過酸化水素水を用いたが、他
のＮａＢＯ３、Ａｓ（Ｖ）、Ａｕ（ＩＩＩ）等の酸化剤
を用いることも当然本発明に包含される。

【００１４】以下実施例によって本発明を更に詳述する
が、下記実施例は本発明を制限するものではなく、前・
後記の趣旨を逸脱しない範囲で変更実施することは全て
本発明の技術範囲に包含される。

【００１５】

【実施例】

実施例１ ヒト糞便を一部採取し、０．１　％牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）を加えＤｕｌｂｅｃｃｏ処方リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ　７．４）　に溶解した後、４℃，９０００ｇ×１０
ｍｉｎ　で遠心分離を行なった。得られた上澄み液を希
釈液とした。該希釈液を用いてヒトＨｂ（Ｓｉｇｍａ　
社製）標準液を調製した。また抗ヒトＨｂモノクローナ
ル抗体（帝國製薬（株）製）を０．１　Ｍ炭酸重炭酸緩
衝液（ｐＨ９．６）を用いてマウスＩｇＧ１（Ａ２８０
（１％）　＝１５）量で１０μｇ／ｍｌ　に調製し、グ
レイナー社製イミュロン６００チューブに１００μｌ／
ｔｕｂｅ　加え３７℃で１時間放置して、抗体を固相化
した。０．０５％　ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ　で十分に
洗浄した後、０．１　％　ＢＳＡを加え、室温で３０分
間放置してブロッキングを行なった。前回と同様０．０
５％　ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ　で十分に洗浄後、１０
ｎｇ／ｍｌ　になる様に調製したヒトＨｂ標準液を加え
、室温で１時間放置した後、０．０５％　ｔｗｅｅｎ２
０／ＰＢＳ　で十分に洗浄した。

【００１６】該反応チューブに純水を１００μｌ加え、
更に１μＭルミノール／０．１　Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ１１．０）　を加え混和した後、極微弱発光検出器（
ＣＬＥＡ−Ｉ，帝國製薬（株）製）に入れ２０　ｍＭ　
Ｈ２Ｏ２を自動注入後６秒間の発光量を測定した（５回
）。測定時のチャートを緩衝液を用いたブランクのチャ
ート（４回）と共に図１に示す。図１に示される様に本
発明の測定方法は優れた再現性を有していた。

【００１７】実施例２ 実施例１に準じ、ヒトＨｂ標準液を用いてチューブ当た
り５０ｐｇ，１００ｐｇ，１ｎｇ，５ｎｇに調製し、実
施例１と同様にして発光量を測定した。測定値を用いて
作成したヒトＨｂの検量線を図２に示す。本発明の方法
により、ヒトＨｂは１００ｐｇより極めて直線的に測定
できることがわかった。

【００１８】

【発明の効果】本発明は以上の様に構成されており、多
くの検体を短時間に簡便に測定できる方法を提供できる
様になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の測定結果を示す図。

【図２】実施例２において作成されたヒトＨｂの検量線
を示すグラフ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　糞便中のヒトヘモグロビンを、抗ヒト
   ヘモグロビン抗体、及びルミノール或はルミノール誘導
   体を用いて酸化剤の存在下に化学発光法により測定する
   ことを特徴とする糞便中のヒトヘモグロビン測定法。