JP2571383B2 - 生体成分中のヒト・ヘモグロビンの測定方法及び測定用試薬キット - Google Patents

生体成分中のヒト・ヘモグロビンの測定方法及び測定用試薬キット

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【発明の詳細な説明】 <産業上の利用分野> この発明は、抗ヒトヘモグロビンポリクローナル抗体
を用いた生体成分中のヒトヘモグロビン(以下ヒトHbと
略称する)の測定方法及び測定用試薬キットに関するも
のである。
<従来の技術> 抗原抗体反応を利用した生体の微量成分を分析する方
法として、ポリクローナル抗体感作担体とフリーな抗原
を液体中で混合して生ずる凝集反応を、スライド凝集板
上で目視的に、または光学的に測定する方法が知られて
いる。
この方法は、多種類の生体成分を含む試料の中で目的
とする生体成分を高選択的、かつ高感度的に測定可能な
ため、一般に広く使用されており、その中に、例えば抗
ヒトHbポリクローナル抗体をラテックス粒子に結合させ
た抗体感作ラテックス粒子と、糞便中のヒトHbとを反応
させ、糞便中のヒトHbを測定する方法(いわゆるラテッ
クス凝集法)がある(特開昭59−125064号公報参照)。
<発明が解決しようとする問題点> しかしながら、前記した従来の分析方法(ラテックス
凝集法)においては、免疫学的反応の特有の性質とし
て、一定量のポリクローナル抗体感作担体に対し、測定
対象である抗原濃度を増加させていく場合に、ある濃度
までは抗原抗体反応による凝集反応が増加していくが、
一定量の抗原濃度を越えると、逆に凝集反応が減少する
いわゆる地帯現象がみられる。このため高濃度の抗原領
域において、抗原濃度を異常に低濃度に測定してしまう
という、測定方法としては重大な欠陥をもっている方法
である。
そこで、本発明者等は抗ヒトHbポリクローナル抗体を
使用して、凝集反応によって、ヒトHbを測定する方法に
ついて種々検討した結果、別に測定対象であるヒトHbを
使用してヒトHb感作担体を製作しておき、これを前記反
応系に添加(導入)する新たなフリーのヒトHbの測定方
法を開発して、本発明を完成した。
<問題を解決するための手段> すなわち、この発明は測定対象であるヒトHbと特異的
に反応するポリクローナル抗体(溶液または感作担体)
と測定対象であるヒトHb感作担体とが反応して生ずる凝
集反応を、測定対象であるフリーのヒトHbが阻止する程
度(度合)を目視的または光学的に測定することによっ
て、フリーのヒトHbを免疫学的に高特異的、かつ高感度
に測定することができるようにすると共に、フリーのヒ
トHb(抗原)が高濃度に存在する場合においても、ラテ
ックス凝集法における地帯現象を生じさせることなく、
精確に測定することができるようにした生体成分中のヒ
トヘモグロビンの測定方法及び測定用試薬キットを提供
することを目的として開発したものである。
本発明に係る生体成分中のヒトHbの測定方法は、ヒト
Hbと特異的に反応するポリクローナル抗体(溶液または
感作担体)と測定対象であるフリーのヒトHbとが反応し
ても凝集しにくく、目視、または光学的に測定困難な場
合に特に有効である。
また、ヒト便中、または尿中に血液が高濃度に存在す
る場合(例タール便または血尿)に低濃度と間違えるこ
となく測定できるという点においてもラテックス凝集法
に比べて優れている。
次に、本願発明に係る抗ヒトHbポリクローナル抗体を
用いた生体成分中のヒトHbの分析方法の原理をより詳細
に記載する。
従来使用されていたポリクローナル抗体感作担体は、
これをフリーの抗原と混合すると、ポリクローナル抗体
が、抗原分子上の多種の抗原決定基と次々と反応し凝集
塊となる。しかしこの凝集塊が目視的、または光学的に
測定可能な程度に生成するには長時間を要する場合が多
く、精確かつ迅速性を至上命令とする分析方法としては
問題があった。
そこで、本願発明においては測定対象と同一の抗原
(ヒトHb)感作担体を別に製作し、このヒトHb感作担体
を前記反応系内に添加して抗ヒトHbポリクローナル抗体
(溶液または感作担体)と凝集反応を確実に生じさせ、
測定対象であるフリーのヒトHb(抗原)は、前記凝集反
応を阻止する要因(成分)として機能させることとし
た。これにより、前記反応において生ずる凝集の程度を
目視的、または光学的に測定する(測定対象であるフリ
ーのヒトHbを添加する場合と、添加しない場合につい
て)ことにより測定対象であるフリーのヒトHbを、高特
異的、かつ高感度に測定することを可能とすると共に、
前記ヒトHbが高濃度に存在する場合においてもラテック
ス凝集法におけるような地帯現象の発生する余地をなく
して、ヒトHb濃度を異常に低濃度に測定することを防止
したものである。
次に本発明の具体例として、ポリクローナル抗体に抗
ヒトHbポリクローナル抗体を、抗原にはヒトHbを用い、
これらから各々、抗ヒトHbポリクローナル抗体溶液また
は感作担体、及びヒトHb感作担体を製造し、これを使用
して便潜血と尿潜血を測定する方法について述べる。
本発明の抗ヒトヘモグロビンポリクローナル抗体の作
製法は、通常の文献に記載されている方法で充分であ
る、特別な方法を必要としない。
本発明に使用する担体粒子は、間接凝集反応用のもの
を使用すればよい。すなわち、ポリエチレンラテック
ス、各種ラテックス、動物の赤血球、カオリン、炭素粒
子等を使用することができる。
本発明の抗ヒトヘモグロビンポリクローナル抗体やヒ
トヘモグロビン抗原を担体に感作する方法も一般の抗体
または抗原を感作する公知の方法によればよい。
例えば、物理的に吸着させる方法は、最も一般的であ
る。また、カルボキシル化ポリスチレンラテックスによ
る共有結合法、グルタールアルデヒド、トリレンジイソ
シアナート、カルボジイミド類、及び塩化クロム等のい
わゆるカップリング剤を使用する方法もある。
次に具体的手法について更に詳細に述べる。
(a)抗ヒトHbポリクロナール抗体感作担体(ラテック
ス)の調整法 抗ヒトHbポリクローナル抗体と担体(ラテックス粒
子)との結合は、物理的結合、あるいは一般の科学的結
合により行なうことができる。次にその結合方法の具体
例を示す。
(イ)物理的方法 ポリスチレンラッテクス粒子(日本合成ゴム(株)
製,直径0.467μm)の懸濁液を、0.15M塩化ナトリウム
を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で10倍に稀釈
し、この緩衝液で3度遠心洗浄する。この沈澱を前記緩
衝液で1%に調整した懸濁液とする。これに抗ヒトHbポ
リクロナール抗体(0.6mg/ml)を添加し、室温で1時間
撹拌した後、ラテックスに結合しない余剰の抗体を遠心
洗浄する。これに牛血清アルブミン0.01%を含有する0.
15M塩化ナトリウム含有トリスー塩酸緩衝液(pH8.0)を
添加し、1%ラテックス懸濁液に調整する。
(ロ)化学的方法 カルボキシル基を導入したポリスチレンラッテクス粒
子(日本合成ゴム(株)製,直径0.497μm)の10%懸
濁液を0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で10倍に稀尺す
る。この稀釈液に、抗ヒトHbポリクロナール抗体(0.6m
g/ml)とカップリング剤を順に添加し、よく撹拌して共
有結合させる。ラテックスに結合しない余剰の抗体を遠
心洗浄する。これに牛血清アルブミン0.01%を含有する
0.15M塩化ナトリウム含有トリスー塩酸緩衝液(pH8.0)
を添加し、1%ラテックス懸濁液に調製する。
(b)ヒトHb感作担体(ラテックス粒子)の調製法 抗体に準ずる。
<実施例1> スライド凝集板法による便中潜血の検出 健康者の便1gを0.15M−NaCl含有 0.1M−トリスー塩
酸緩衝液100mlに懸濁し、遠心分離機にかけ上清液を採
取する。次にヒトHbを前記上清液に添加し、10000μg/m
l,2000μg/ml,400μg/ml,80μg/ml,16μg/ml,3.2μg/m
l,0.64μg/ml,0.128μg/ml,0.0256μg/ml,0μg/ml濃度
のサンプルを各々調製する。これらの各濃度のサンプル
の40μlを、各々スライド凝集板上に滴下した後、前記
(a)の(イ)で調製した抗ヒトHbポリクロナール抗体
溶液,または抗体感作担体,及び前記(b)で調製した
ヒトHb抗原感作担体20μlを追加して滴下し、2分間ゆ
るやかに撹拌しながら観察する。同時に従来法(抗ヒト
Hbポリクロナール抗体感作担体20μl、上記サンプル40
μl)も行なった。
その結果を第1表に示す。
第1表の結果によれば、本願発明に係る方法は、測定
対象であるフリーのヒトHbが0.64μg/ml以下低濃度であ
れば、抗ヒトHbポリクローナル抗体(溶液、または感作
担体)とヒトHb感作担体との凝集反応を阻止しないのに
対し、3.2μg/ml以上10000μg/mlの範囲(約3000倍)で
凝集反応を阻止している。このことは、抗原であるヒト
Hbが大過剰存在しても、低濃度と区別できることを示し
ている。これに対し従来法における抗ヒトHbポリクロー
ナル抗体感作担体と抗原であるヒトHbとの凝集反応が生
ずる範囲は、0.64μg/ml〜16μg/mlの範囲(約25倍)と
非常に狭い。従って、抗原であるヒトHb80μg/ml以上20
00μg/mlの範囲では、0.128μg/ml以下の濃度と同一視
され、非常に高濃度のヒトHbを異常に低濃度に測定して
しまうのである。
すなわち、本願発明に係るヒトHb感作担体を使用する
方法、抗ヒトHbポリクローナル抗体が溶液であっても、
また感作担体であっても、フリーのヒトHbが少なくとも
3.2μg/ml以上あれば、ヒトHb感作担体との凝集反応を
阻止できるので測定可能である。これに対し従来法は、
フリーのヒトHbの濃度が0.64〜16μg/ml存在する場合に
限られ、80μg/ml以上の高濃度のフリーのヒトHbを、0.
128μg/ml以下の低濃度の場合と同様、測定することが
できない。
<実施例2> スライド凝集法による尿中潜血の検出 健康者の尿を採取し、遠心分離機にかけ上清液を採取
する。その上清液を0.3M−NaCl含有の0.2Mトリス塩酸緩
衝液と等量混合した後ヒトHbを添加し、10000μg/ml,20
00μg/ml,400μg/ml,80μg/ml,16μg/ml,3.2μg/ml,0.6
4μg/ml,0.128μg/ml,0.0256μg/ml,0μg/ml濃度のサン
プルを各々調製する。これらの各濃度のサンプルの40μ
lを、各々スライド凝集板上に滴下した後、前記(a)
の(イ)で調製した抗ヒトHbポリクロナール抗体溶液,
または抗体感作担体,及び前記(b)で調製したヒトHb
抗原感作担体20μlを追加して滴下し、2分間ゆるやか
に撹拌しながら観察する。
その結果を第2表に示す。
第2表の結果によれば、本願発明に係る方法は、測定
対象であるフリーのヒトHbが便中であれ、尿中であれ、
それぞれ特有に共存する物質に影響されることなく、測
定対象であるヒトHbを高選択的、かつ高感度に測定可能
であることを示している。
<実施例3> 分光光度計を用いた便中潜血の検出(反応) 実施例1で使用したサンプル100mlに抗体0.02mg、ま
たは抗ヒトHbポリクローナル感作担体0.01%を含む0.15
トリスー塩酸緩衝液2500μlと、前記(B)で調製した
ヒトHb感作担体(0.1%)400μlを加え、手速く混合し
た後、光路長10mmのセルに入れ、分光光度計(日立320
型)を用い、波長700nmにおける、反応開始0.5分〜5.5
分間の吸光度を測定した。
その結果は第1図の通りであった。
第1図に示される標準曲線から、便中ヒトHb濃度を実
施例1のスライド凝集法により、更に高感度かつ高濃度
に測定することができることがわかる。
また、第1図から従来法の欠点である「高濃度抗原域
において、抗原濃度を異常に低濃度に測定してしまう」
という欠陥を回避できることは明らかである。
<発明の効果> 以上のようにこの発明に係る生体成分中のヒトHbの測
定方法によれば、多くの他種の物質を含む生体試料(得
にヒト便中、または尿中)の目的とする微量の潜血を簡
便に、高選択的かつ高感度で測定できると共に、高濃度
のヒトHbを低濃度と間違えることなく測定できるという
効果を有する。
【図面の簡単な説明】
第1図は、フリーのヒトHb濃度と吸光度の関係を示す標
準曲線である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−48658(JP,A) 特開 昭61−228351(JP,A)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】抗ヒトヘモグロビンポリクロナール抗体を
    用いて生体成分試料中のヒトヘモグロビンを測定する方
    法であって、抗ヒトヘモグロビンポリクローナル抗体ま
    たは該抗体を感作した担体と、ヒトヘモグロビンを感作
    した担体とにより生ずる凝集反応を、生体成分試料中の
    ヒトヘモグロビンが阻止する程度を比較測定することを
    特徴とする生体成分中のヒトヘモグロビンの測定方法。
  2. 【請求項2】測定対象であるヒトヘモグロビンが便潜血
    中に存在する場合の特許請求の範囲第1項記載の生体成
    分中のヒトヘモグロビンの測定方法。
  3. 【請求項3】測定対象であるヒトヘモグロビンが尿潜血
    中に存在する場合の特許請求の範囲第1項記載の生体成
    分中のヒトヘモグロビンの測定方法。
  4. 【請求項4】ポリクローナル抗体を溶液として用いる特
    許請求の範囲第1項記載の生体成分中のヒトヘモグロビ
    ンの測定方法。
  5. 【請求項5】ポリクローナル抗体を担体に感作して用い
    る特許請求の範囲第1項記載の生体成分中のヒトヘモグ
    ロビンの測定方法。
  6. 【請求項6】主な構成が、抗ヒトヘモグロビンポリク
    ローナル抗体または該抗体を感作した担体と、ヒトヘ
    モグロビンを感作した担体との少なくとも二者からなる
    か、更には測定対象であるヒトヘモグロビンの標準品
    を添付した三者からなることを特徴とする生体成分中の
    ヒトヘモグロビンの測定用試薬キット。
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