JPS6091264A - フイブロネクチンの免疫学的測定 - Google Patents
フイブロネクチンの免疫学的測定Info
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- JPS6091264A JPS6091264A JP19927283A JP19927283A JPS6091264A JP S6091264 A JPS6091264 A JP S6091264A JP 19927283 A JP19927283 A JP 19927283A JP 19927283 A JP19927283 A JP 19927283A JP S6091264 A JPS6091264 A JP S6091264A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なフィブロネクチン及びフィブロネクチン
分解産物の免疫学的測定試薬及びフィブロネクチン及び
フィブロネクチン分解産物の免疫学的測定方法に関する
。
分解産物の免疫学的測定試薬及びフィブロネクチン及び
フィブロネクチン分解産物の免疫学的測定方法に関する
。
フィブロネクチンは動物淘胞表面および血液中にあり、
分子！２θ万〜２を万の二つのサブユニットからなる糖
蛋白である。ただし、細胞表面のものと血液中のものと
では、構造や性質にわずかな違いがあるとされている。
分子！２θ万〜２を万の二つのサブユニットからなる糖
蛋白である。ただし、細胞表面のものと血液中のものと
では、構造や性質にわずかな違いがあるとされている。
多細胞動物では、−個の受精卵が分裂をくり返し、生じ
た細胞を正確に編成して一個体をつくり上げる。その一
つの機能は細胞間の特異的な結合であることが知られて
いる。この細胞間、さらには細胞が他の細胞や基質、コ
ラーゲン、フィブリノゲンへ接着することがフィブロネ
クチンによって促進される。
た細胞を正確に編成して一個体をつくり上げる。その一
つの機能は細胞間の特異的な結合であることが知られて
いる。この細胞間、さらには細胞が他の細胞や基質、コ
ラーゲン、フィブリノゲンへ接着することがフィブロネ
クチンによって促進される。
また成体の、血液組織を除く正常ｍＰ＆や良性腫瘍の細
胞はその位置から遊離することはないが、がん細胞は原
発部位より遊離して他の部位で新たに腫瘍を形成する。
胞はその位置から遊離することはないが、がん細胞は原
発部位より遊離して他の部位で新たに腫瘍を形成する。
これはがん細胞の接着性が異常であるため、肺癌組織を
形成している細胞がひとまとまりでいることができない
ためといわれており、実際培養細胞を用いて腫瘍細胞と
正常細胞とを比べると、細胞−細胞間接着についても、
細胞−基質間接着についても接着性が変化していると報
告されティる（ Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｓｃｉ ２２巻 １
ｇ１／り７６； ； 、Ｔ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎ５ｔ、３９巻 ７θタフ９ご７参照）。
形成している細胞がひとまとまりでいることができない
ためといわれており、実際培養細胞を用いて腫瘍細胞と
正常細胞とを比べると、細胞−細胞間接着についても、
細胞−基質間接着についても接着性が変化していると報
告されティる（ Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｓｃｉ ２２巻 １
ｇ１／り７６； ； 、Ｔ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎ５ｔ、３９巻 ７θタフ９ご７参照）。
さらに近年フィブロネクチンは腫瘍ウィルスによる線維
芽細胞の悪化や、細胞のがん化に伴い細胞膜表面から消
失し、血清中に増加することがわかった。さらに今回、
本発明者らによって、フィブロネクチンは悪性腫瘍やが
ん化細胞が生じた際尿中に排泄されることを見出した。
芽細胞の悪化や、細胞のがん化に伴い細胞膜表面から消
失し、血清中に増加することがわかった。さらに今回、
本発明者らによって、フィブロネクチンは悪性腫瘍やが
ん化細胞が生じた際尿中に排泄されることを見出した。
このフィブロネクチンの尿中への排泄量は悪性ＩＩ！！
！瘍やがんの進行に伴って増加することがわかり、がん
の診断やかん組織の切除後の予後管理に用いることがで
きるのではないかとの知見によって本発明方法を開発す
るに至った。
！瘍やがんの進行に伴って増加することがわかり、がん
の診断やかん組織の切除後の予後管理に用いることがで
きるのではないかとの知見によって本発明方法を開発す
るに至った。
従来よりがんの診断方法には種々の方法がとられており
、例えばがん化されたと思われる細胞組織を取り出し、
細胞を染色して顕微鏡でみる方法やかん細胞が産生ずる
物質、いわゆる腫瘍マーカーを免疫学的に測定する方法
がある。この腫瘍マーカーにはα−フェトプロティン（
ＡＦＰ ）、癌胎児抗原（ＣＩＡ）、塩基性フェトプロ
ティン（ＢＦＰ）、骨髄腫蛋白（Ｍ蛋白）や異所性ホル
モンなどがある。しかし、これらの腫瘍マーカーはｊ）
ヨ器特異性のあるものもあり、全てのがんのスクリーニ
ングテストには必ずしも有用でないものもあった。
、例えばがん化されたと思われる細胞組織を取り出し、
細胞を染色して顕微鏡でみる方法やかん細胞が産生ずる
物質、いわゆる腫瘍マーカーを免疫学的に測定する方法
がある。この腫瘍マーカーにはα−フェトプロティン（
ＡＦＰ ）、癌胎児抗原（ＣＩＡ）、塩基性フェトプロ
ティン（ＢＦＰ）、骨髄腫蛋白（Ｍ蛋白）や異所性ホル
モンなどがある。しかし、これらの腫瘍マーカーはｊ）
ヨ器特異性のあるものもあり、全てのがんのスクリーニ
ングテストには必ずしも有用でないものもあった。
フィブロネクチンは線維芽細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞
、マクロファージなどの間葉系細胞の表面、皮膚、粘膜
の基底膜及び汗腺、皮脂腺、乳腺、唾液腺など外分泌腺
の基底膜に広く分布している。
、マクロファージなどの間葉系細胞の表面、皮膚、粘膜
の基底膜及び汗腺、皮脂腺、乳腺、唾液腺など外分泌腺
の基底膜に広く分布している。
このように間葉系細胞はすべての臓器にあることから、
がんの診断にフィブロネクチンを腫瘍マーカーの一つと
することは極めて有意義なことである。
がんの診断にフィブロネクチンを腫瘍マーカーの一つと
することは極めて有意義なことである。
まだフィブロネクチンはフィブリンと架橋形成すること
から急激に血栓が形成される病態、例えば播種住血管内
凝固症候群（ＤｘＣ）では血漿レベルは著しく低下する
ことも知られている。
から急激に血栓が形成される病態、例えば播種住血管内
凝固症候群（ＤｘＣ）では血漿レベルは著しく低下する
ことも知られている。
さらにフィブロネクチン及びフィブロネクチン分解産物
は閉塞性負担、白血病、腎不全患者の尿中にも多量に排
泄されることがわかり、これらの患者のフィブロネクチ
ンの検出・定量は治療上極めて重要である。
は閉塞性負担、白血病、腎不全患者の尿中にも多量に排
泄されることがわかり、これらの患者のフィブロネクチ
ンの検出・定量は治療上極めて重要である。
また、尿中に排泄されるフィブロネクチンは生体内で種
々の代謝を受け、約３万及び約７９万の分子量からなる
分解産物を生じているとみられる。
々の代謝を受け、約３万及び約７９万の分子量からなる
分解産物を生じているとみられる。
この分解産物の構造及び物性などは不明であるが、免疫
学的に測定することは可能である。
学的に測定することは可能である。
いずれにせよ検体中のフィブロネクチン及びフィブロネ
クチン分解産物の測定は細胞−細胞間あるいは細胞−基
質間の異常を知る上で、特に癌、閉塞性負担、白血病、
腎不全などの疾病を知る上で臨床上重要な情報を与えて
くれることになる。
クチン分解産物の測定は細胞−細胞間あるいは細胞−基
質間の異常を知る上で、特に癌、閉塞性負担、白血病、
腎不全などの疾病を知る上で臨床上重要な情報を与えて
くれることになる。
従来よりフィブロネクチン測定キットが発売されており
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｈｅｉｍ社）、この
方法は抗原−抗体反応を免疫比濁法によって測定してい
る。しかしながらこの免疫比濁法は抗原−抗体反応を測
定するのに特殊な機器を必要とするため、簡便に実施す
ることが困難であった。
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｈｅｉｍ社）、この
方法は抗原−抗体反応を免疫比濁法によって測定してい
る。しかしながらこの免疫比濁法は抗原−抗体反応を測
定するのに特殊な機器を必要とするため、簡便に実施す
ることが困難であった。
しかして、本発明者らは尿中のフィブロネクチン及びフ
ィブロネクチン分解産物の簡便で且つ迅速な測定方法を
見出すべく研究した結果、フィブロネクチン又は抗フィ
ブロネクチン抗体を免疫学的に不活性な担体粒子に担持
した試薬を用いれば、免疫学的凝集又は凝集阻止反応に
より、極めて簡便に且つ迅速にしかもかなりの精度をも
って尿中のフィブロネクチンを測定しうることを見い出
し、本発明を完成するに至った。以下、フィブロネクチ
ン及びフィブロネクチン分解産物を“ＦＮ”′と略称す
る。
ィブロネクチン分解産物の簡便で且つ迅速な測定方法を
見出すべく研究した結果、フィブロネクチン又は抗フィ
ブロネクチン抗体を免疫学的に不活性な担体粒子に担持
した試薬を用いれば、免疫学的凝集又は凝集阻止反応に
より、極めて簡便に且つ迅速にしかもかなりの精度をも
って尿中のフィブロネクチンを測定しうることを見い出
し、本発明を完成するに至った。以下、フィブロネクチ
ン及びフィブロネクチン分解産物を“ＦＮ”′と略称す
る。
かくして、本発明によれば、ＦＮ又はＦＮ抗体で感作し
た免役学的に不活性な担体粒子よシなるＦＨの免疫学的
測定試薬が提供される。
た免役学的に不活性な担体粒子よシなるＦＨの免疫学的
測定試薬が提供される。
本発明によればまた、一定の希釈倍数に希釈した検体に
、抗ＦＮ抗体を感作した免疫学的に不活性な担体粒子よ
りなる免疫学的測定試薬を添加し、或いは一定の希釈倍
数に希釈した検体に予め抗ＦＮ抗体を加えておき、次い
でＦＮを感作した免疫学的に不活性な担体粒子よりなる
免疫学的測定試薬を添加し、凝集の生成の有無を判定す
ることによって該検体中のＦＮを測定することを特徴と
する、Ｆσの免疫学的測定方法が提供される。
、抗ＦＮ抗体を感作した免疫学的に不活性な担体粒子よ
りなる免疫学的測定試薬を添加し、或いは一定の希釈倍
数に希釈した検体に予め抗ＦＮ抗体を加えておき、次い
でＦＮを感作した免疫学的に不活性な担体粒子よりなる
免疫学的測定試薬を添加し、凝集の生成の有無を判定す
ることによって該検体中のＦＮを測定することを特徴と
する、Ｆσの免疫学的測定方法が提供される。
本発明の測定試薬において使用されるＦＮはヒトの血漿
からそれ自体公知の方法により、例えばゲルｒ過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー等の方法を単独で又は組み合せ用いて分離精製
することにより取得することができる〔分離梢製法の詳
細については必要あれば、Ａｎｎ、Ｎ、 Ｙ、 Ａｃａ
ｄ、８ ｃｉ、 ３／２巻２Ｊ乙（／り７と）参照〕。
からそれ自体公知の方法により、例えばゲルｒ過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー等の方法を単独で又は組み合せ用いて分離精製
することにより取得することができる〔分離梢製法の詳
細については必要あれば、Ａｎｎ、Ｎ、 Ｙ、 Ａｃａ
ｄ、８ ｃｉ、 ３／２巻２Ｊ乙（／り７と）参照〕。
一方、抗ＦＮ抗体もまたそれ自体公知の方法により調製
することができ、例えば上記の如くして得たＦＨにフロ
イントのアジュバントその他の補助剤を加えたもので、
ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、などの人間以外の
補乳動物を免疫し、その抗血清を回収し、該抗血清から
通常の方法に従い、例えば硫安沈殿法による分画によっ
て抗ＩＦＮ抗体を分ＡＷすることにより取得することが
できる。
することができ、例えば上記の如くして得たＦＨにフロ
イントのアジュバントその他の補助剤を加えたもので、
ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、などの人間以外の
補乳動物を免疫し、その抗血清を回収し、該抗血清から
通常の方法に従い、例えば硫安沈殿法による分画によっ
て抗ＩＦＮ抗体を分ＡＷすることにより取得することが
できる。
本発明に・従い感作すべきＦＮ及び抗ＦＮ抗体の純度は
厳密に制約されるものではないが、一般にＦＮはディス
ク電気泳動法により実質的に単一の像を示す程度の純度
のものが好ましく、また抗ＦＮ抗体は血漿中のＦＮとの
抗原−抗体反応において免疫電気泳動法により実質的に
単一の像を示す程度の純度のものが適している。
厳密に制約されるものではないが、一般にＦＮはディス
ク電気泳動法により実質的に単一の像を示す程度の純度
のものが好ましく、また抗ＦＮ抗体は血漿中のＦＮとの
抗原−抗体反応において免疫電気泳動法により実質的に
単一の像を示す程度の純度のものが適している。
また、かかるＦＮ又は抗ＦＮ抗体の感作のために用いら
れる免疫学的に不活性な担体粒子としては、例えば、ホ
ルマリンなどで固定化した赤血球、高分子ラテックス、
ベントナイト、コロジオン、シリカ、カオリン等、従来
免疫化学的測定試薬の担体として通常使用されているも
のはいずれも使用できる。かかる担体粒子は一般に約０
．θ／〜約２０ミクロン、好ましくは約θ、θ！〜約７
０ミクロンの平均粒径を有することができる。
れる免疫学的に不活性な担体粒子としては、例えば、ホ
ルマリンなどで固定化した赤血球、高分子ラテックス、
ベントナイト、コロジオン、シリカ、カオリン等、従来
免疫化学的測定試薬の担体として通常使用されているも
のはいずれも使用できる。かかる担体粒子は一般に約０
．θ／〜約２０ミクロン、好ましくは約θ、θ！〜約７
０ミクロンの平均粒径を有することができる。
本発明において「相持」なる語は、ＦＮ又は抗ＦＮ抗体
を上記した如き担体粒子上に物理的に吸着せしめる場合
及び化学的に結合させる場合の両方を包含する意味で用
いるものである。
を上記した如き担体粒子上に物理的に吸着せしめる場合
及び化学的に結合させる場合の両方を包含する意味で用
いるものである。
かくして、相持は通常の方法によって行なうことができ
、例えば、上記した如き担体粒子にＦＮ又は抗ＦＮ抗体
を最終濃度θ、θ０／〜Ｏ，タチ（Ｗ／Ｖ）、好ｉ Ｌ
＜ Ｂｏ、０／ 〜０．−２５６ （Ｗ／Ｖ ） ニナ
ルように緩ｉＪｉ液（例えばグリシンＮａＯＨ緩衝液）
中に浴解し、撹拌しながら担体（例えばポリスチレンラ
テックス）を加え、通常約グ〜約ｇθ°Ｃ１好ましくは
約／！〜約ｙｏ″ＣＯｄ度で約３０〜約／と０分間さら
に攪拌をつづけることにより、感作を行なうことができ
る。この場合、ＦＮ及び抗ＦＮ抗体に対して免疫学的に
不活性なタンパク質〔例えばヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ
などの動物の血清のアルブミンやグロブリンなど〕の緩
衝液〔通常０．０／〜（１７，Ｊ−％（Ｗ／ ｖ） 濃
度のものが使用される〕で感作前又は感作後の担体粒子
を処理することができ、これによって非特異的反応を除
くことができる。
、例えば、上記した如き担体粒子にＦＮ又は抗ＦＮ抗体
を最終濃度θ、θ０／〜Ｏ，タチ（Ｗ／Ｖ）、好ｉ Ｌ
＜ Ｂｏ、０／ 〜０．−２５６ （Ｗ／Ｖ ） ニナ
ルように緩ｉＪｉ液（例えばグリシンＮａＯＨ緩衝液）
中に浴解し、撹拌しながら担体（例えばポリスチレンラ
テックス）を加え、通常約グ〜約ｇθ°Ｃ１好ましくは
約／！〜約ｙｏ″ＣＯｄ度で約３０〜約／と０分間さら
に攪拌をつづけることにより、感作を行なうことができ
る。この場合、ＦＮ及び抗ＦＮ抗体に対して免疫学的に
不活性なタンパク質〔例えばヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ
などの動物の血清のアルブミンやグロブリンなど〕の緩
衝液〔通常０．０／〜（１７，Ｊ−％（Ｗ／ ｖ） 濃
度のものが使用される〕で感作前又は感作後の担体粒子
を処理することができ、これによって非特異的反応を除
くことができる。
また、前記担体粒子にＦＭ又は抗ＦＮ抗体を化学的に結
合せしめる場合としては、例えばカルボキシル基やアミ
ノ基など］？′Ｎ又は抗ＦＮ抗体と化学的に結合しうる
官能基を表面にもつ担体粒子と感作すべ＠ＦＮ又は抗Ｆ
Ｎ抗体とを適当な結合剤例えばカルボジイミド、ビスジ
アゾベンジジン、グルクールアルデヒドなどの存在下に
反応させる方法が挙げられる。この場合においても、上
記と同様に不活性なタンパク質を感作前又は感作後の担
体粒子で処理する（化学的に結合せしめる）ことにより
非特異的反応を除き高感度の試薬を得るようにすること
ができる。
合せしめる場合としては、例えばカルボキシル基やアミ
ノ基など］？′Ｎ又は抗ＦＮ抗体と化学的に結合しうる
官能基を表面にもつ担体粒子と感作すべ＠ＦＮ又は抗Ｆ
Ｎ抗体とを適当な結合剤例えばカルボジイミド、ビスジ
アゾベンジジン、グルクールアルデヒドなどの存在下に
反応させる方法が挙げられる。この場合においても、上
記と同様に不活性なタンパク質を感作前又は感作後の担
体粒子で処理する（化学的に結合せしめる）ことにより
非特異的反応を除き高感度の試薬を得るようにすること
ができる。
上記の感作操作において、担体粒子へのＦＮ又は抗ＦＮ
抗体の感作址及び／又は該不活性タンパク質による処理
の程度を適宜調節することにより、常に一定の高感度の
免疫学的診断試薬を調製することができる。
抗体の感作址及び／又は該不活性タンパク質による処理
の程度を適宜調節することにより、常に一定の高感度の
免疫学的診断試薬を調製することができる。
上記の如く調製された本発明の測定試薬は、検体例えば
血漿、尿、胸水、髄液、血清、などの体液中のＦＨの免
疫学的測定のために使用することができ、その測定はそ
れ自体公知の免疫学的凝集反応又は免疫学的凝集１９１
止を利用して行なうことができる。
血漿、尿、胸水、髄液、血清、などの体液中のＦＨの免
疫学的測定のために使用することができ、その測定はそ
れ自体公知の免疫学的凝集反応又は免疫学的凝集１９１
止を利用して行なうことができる。
例えば、免疫学的凝集反応においては、スライドガラス
板上又は小試験管内で、一定の希釈倍率に希釈した検体
と本発明の抗ＦＮ抗体を感作した担体粒子よりなる測定
試薬とを相互に接触せしめる。もし検体中にＦＮが存在
すれば凝集反応が起り、肉眼的に観察することができる
。検体の希釈倍率を増やし、凝集反応が確認できる最大
希釈倍率をめることにより、検体中のＦ’ Ｎ 濃度を
決定することができる。
板上又は小試験管内で、一定の希釈倍率に希釈した検体
と本発明の抗ＦＮ抗体を感作した担体粒子よりなる測定
試薬とを相互に接触せしめる。もし検体中にＦＮが存在
すれば凝集反応が起り、肉眼的に観察することができる
。検体の希釈倍率を増やし、凝集反応が確認できる最大
希釈倍率をめることにより、検体中のＦ’ Ｎ 濃度を
決定することができる。
また、免疫学的凝集１９１止反応においては、上記と同
様、スライドガラス板上又は小試験管中に、一定の希釈
倍率に希釈した検体と抗ＦＮ抗体とを滴加し、混和した
後、本発明によるＦＮを感作した担体粒子より成る６（
１１定試薬を加えて接触せしめ、その際に凝集像が現わ
れるか否かを判定する（該希釈検体中にある一定濃度以
上でＦＮが存在すれば凝集阻止像が観察される）ことに
より上記と同様にして検体中のＦＨｄ度を決定すること
ができる。
様、スライドガラス板上又は小試験管中に、一定の希釈
倍率に希釈した検体と抗ＦＮ抗体とを滴加し、混和した
後、本発明によるＦＮを感作した担体粒子より成る６（
１１定試薬を加えて接触せしめ、その際に凝集像が現わ
れるか否かを判定する（該希釈検体中にある一定濃度以
上でＦＮが存在すれば凝集阻止像が観察される）ことに
より上記と同様にして検体中のＦＨｄ度を決定すること
ができる。
上記のように本発明の方法によれば、検体の希釈液と試
薬とを加え、スライドガラス板上又は小試験管中の凝集
像を肉眼的に観察するという極めて）７１１便な操作だ
けで、迅速に検体中のＦＮを測定することができ、臨床
学的には患者のベッドサイドで極めて手軽に数分間でＦ
Ｎの定量を行なうことが可能となる。本発明におけるか
かる効果は前述した従来の測定法からは全く予測外のこ
とであり、ＦＮ測定分野に画期的な発展をもたらすもの
である。
薬とを加え、スライドガラス板上又は小試験管中の凝集
像を肉眼的に観察するという極めて）７１１便な操作だ
けで、迅速に検体中のＦＮを測定することができ、臨床
学的には患者のベッドサイドで極めて手軽に数分間でＦ
Ｎの定量を行なうことが可能となる。本発明におけるか
かる効果は前述した従来の測定法からは全く予測外のこ
とであり、ＦＮ測定分野に画期的な発展をもたらすもの
である。
次に実＋Ｊ例により本発明をさらに説明する。
実施例／
（ａ）ＦＨの製造
ヒト新呻血／ｌに３．？チクエン酸ナトリウム／θθゴ
を加え”Ｃｓ １０００ ｒｐｍで３θ分間遠心分離し
、得″られた血漿を０．７Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７０
ｇ ）で膨潤させたゼラチン−セファロース４１Ｂ！０
０ｔｘｔ中に加える。室温で３０分間ゆるやかに攪拌し
たのちガラスフィルター上で吸引濾過し次いで７Ｍ尿素
を含有する０、１Ｍのリン酸緩衝液３１を用い洗浄した
。さらにｐＭの尿素を含有した０、７Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７，グ）！θＯゴを用いＦＮを溶出した。この溶
出液をθ、θθ夕Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ０１緩衝ａ＜ｐＨざ
、３）夕ｌで２回透析を行ない凍結乾燥をした。次いで
θ、Ｑ／Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ♂、３）
で平衡化したセファデックスＧ−２θθを用いゲルー過
し得られたＦＮ分画を凍結乾燥した。
を加え”Ｃｓ １０００ ｒｐｍで３θ分間遠心分離し
、得″られた血漿を０．７Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７０
ｇ ）で膨潤させたゼラチン−セファロース４１Ｂ！０
０ｔｘｔ中に加える。室温で３０分間ゆるやかに攪拌し
たのちガラスフィルター上で吸引濾過し次いで７Ｍ尿素
を含有する０、１Ｍのリン酸緩衝液３１を用い洗浄した
。さらにｐＭの尿素を含有した０、７Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７，グ）！θＯゴを用いＦＮを溶出した。この溶
出液をθ、θθ夕Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ０１緩衝ａ＜ｐＨざ
、３）夕ｌで２回透析を行ない凍結乾燥をした。次いで
θ、Ｑ／Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ♂、３）
で平衡化したセファデックスＧ−２θθを用いゲルー過
し得られたＦＮ分画を凍結乾燥した。
（ｂ）抗ＦＮ抗体の製造
上記（ａ）で得られたＦＮ ／Ｍｆを生理食塩液／ ！
Ｉ＋／に溶解し、同量のコンプリート・フロイント・ア
ジ−パントで乳化し、家兎の足踏および皮下に注射した
。この注射を３ｄ間間隔で行ない、抗体価の上昇を確認
後金採血を行った。得られた血液を室温で７０分間放置
［７たのち、室温、３００θｒｐｍで３θ分間遠心分離
により血清を分離した。
Ｉ＋／に溶解し、同量のコンプリート・フロイント・ア
ジ−パントで乳化し、家兎の足踏および皮下に注射した
。この注射を３ｄ間間隔で行ない、抗体価の上昇を確認
後金採血を行った。得られた血液を室温で７０分間放置
［７たのち、室温、３００θｒｐｍで３θ分間遠心分離
により血清を分離した。
この抗血清グθａｔに同量のθ、９ｔ１．ＭａＣ１含有
／／コθθＭ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を加え攪
拌したのち、”飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗Ｆ
Ｎ抗体を製造した。
／／コθθＭ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を加え攪
拌したのち、”飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗Ｆ
Ｎ抗体を製造した。
（Ｃ）抗ＦＮ抗体感作ポリスチレンラテックスの製造
上記（１））で製造した抗ＦＮ抗体乙ｑをタボの０、認
グＭグリシン緩衝液（ｐＨ９，乙）に溶解し、これに２
％ＣＷ／Ｖ）ポリスチレンラテックス懸濁液（平均粒径
：θ、、２２θμ）−（′ゴを加えて混合１室禍で２時
間攪拌した。この後、遠心分離して得た沈殿を０．３％
にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むグリシン緩衝液
１０ゴに懸濁させ、抗ＦＮ抗体感作ポリスチレンラテッ
クスを得だ。
グＭグリシン緩衝液（ｐＨ９，乙）に溶解し、これに２
％ＣＷ／Ｖ）ポリスチレンラテックス懸濁液（平均粒径
：θ、、２２θμ）−（′ゴを加えて混合１室禍で２時
間攪拌した。この後、遠心分離して得た沈殿を０．３％
にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むグリシン緩衝液
１０ゴに懸濁させ、抗ＦＮ抗体感作ポリスチレンラテッ
クスを得だ。
（ｄ）尿中のＦＨの測定（凝集反応法）健常者及び胃癌
患者の尿／９検体を０．２チウク血清アルブミンを含有
した生理食塩液で２．１倍、５倍、７０倍、２０倍、７
０倍及び？θ倍に希釈し、各希釈尿をキャピラリーピペ
ットで一滴ずつ（約／θ０μｌ）を反応スライド板上に
滴下し、これに上記（Ｃ）で製造した抗ＦＮ抗体感作ポ
リスチレンラテックスを７滴ずつ滴下する。両者を混合
し、スライド板をゆるやかに揺動し、２分後に肉眼で凝
集像の有無を観察した。なお、本実施例においては試薬
の感度をθ、ｊμｆ／ｗｅに調整したものを用いた。各
被検液のＦＮ濃度は下記第１〜コ表に示すとおりであっ
た。
患者の尿／９検体を０．２チウク血清アルブミンを含有
した生理食塩液で２．１倍、５倍、７０倍、２０倍、７
０倍及び？θ倍に希釈し、各希釈尿をキャピラリーピペ
ットで一滴ずつ（約／θ０μｌ）を反応スライド板上に
滴下し、これに上記（Ｃ）で製造した抗ＦＮ抗体感作ポ
リスチレンラテックスを７滴ずつ滴下する。両者を混合
し、スライド板をゆるやかに揺動し、２分後に肉眼で凝
集像の有無を観察した。なお、本実施例においては試薬
の感度をθ、ｊμｆ／ｗｅに調整したものを用いた。各
被検液のＦＮ濃度は下記第１〜コ表に示すとおりであっ
た。
表中、十は凝集像を示し、−は非凝集像を示す。
第 ／ 表
第 ２ 表
実施例コ
（ａ）抗ＦＮ抗体感作ポリスチレンラテックスの製造実
施例／（ｂ）で製造した抗ＦＮ抗体グ岬を０．２グＭグ
リシン緩衝液（ｐＨ９，６）！ｇｔに溶解し、コチボリ
スチレンラテックス（粒径θ、２００μ） −ｔ ｒ：
１を加えて室温で７時間攪拌した。攪拌後Ｚ″Ｃ１／４
θθ０ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い得られた沈殿物
を上記緩衝液／θｄで洗浄した。再度遠心分離後、沈殿
物を０．−２チＢ８Ａ含有グリシン緩衝液／θｗｒｌ
Ｋ ｔ（２）濁させ、抗ＦＮ抗体感作ポリスチレンラテ
ックスを製造した。
施例／（ｂ）で製造した抗ＦＮ抗体グ岬を０．２グＭグ
リシン緩衝液（ｐＨ９，６）！ｇｔに溶解し、コチボリ
スチレンラテックス（粒径θ、２００μ） −ｔ ｒ：
１を加えて室温で７時間攪拌した。攪拌後Ｚ″Ｃ１／４
θθ０ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い得られた沈殿物
を上記緩衝液／θｄで洗浄した。再度遠心分離後、沈殿
物を０．−２チＢ８Ａ含有グリシン緩衝液／θｗｒｌ
Ｋ ｔ（２）濁させ、抗ＦＮ抗体感作ポリスチレンラテ
ックスを製造した。
（ｂ）尿中のＦＨの測定（凝集反応法）被検者の尿／／
検体をθ、２チウシ血清アルブミンを含有した０、２グ
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ７，Ｊ−）でコ倍、グ倍、と倍
、／６倍、及び３２倍に希釈し、各希釈液の７滴（約オ
θμｌ）を反応スライド板上に滴下し、上記（ａ）で製
造した抗ＦＮ抗体感作ポリスチレンラテックスを７滴ず
つ滴下する。この両者を均一に混合し、スライド板をゆ
るやかに揺動し、λ分後肉眼で凝集像を観察した。なお
、との実施例においては試薬の感度を／μｆ／にｌに調
整したものを用いた。各被検液のＦＭ濃度は下記第３〜
グ表に示すとおりであった。
検体をθ、２チウシ血清アルブミンを含有した０、２グ
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ７，Ｊ−）でコ倍、グ倍、と倍
、／６倍、及び３２倍に希釈し、各希釈液の７滴（約オ
θμｌ）を反応スライド板上に滴下し、上記（ａ）で製
造した抗ＦＮ抗体感作ポリスチレンラテックスを７滴ず
つ滴下する。この両者を均一に混合し、スライド板をゆ
るやかに揺動し、λ分後肉眼で凝集像を観察した。なお
、との実施例においては試薬の感度を／μｆ／にｌに調
整したものを用いた。各被検液のＦＭ濃度は下記第３〜
グ表に示すとおりであった。
表中、＋は凝集像を示し、−は非凝集像を示す。
第３表
第 グ 表
実施例３
（ａ）抗ＦＮ抗体感作血球の製造
常法によりホルマリン固定したヒツジ赤血球グチ懸濁液
（リン酸緩衝液、ｐＨ７，グ）に等量のθ、θ／％タン
ニン酸溶液を加えてｊ乙°Ｃで３０分反応させ、次いで
リン酸緩衝液で赤血球を洗浄後、ざチ憑濁液とした。つ
いで前記実施例／（ｂ）で製造した抗ＦＮ抗体の０．７
％溶液を加え！に°Ｃで２時間反応させた。反応終了後
、リン酸緩衝液にて血球を遠心洗浄し、０．２チウシ血
清アルブミンを含むリン酸緩衝液にて３チ血球濃度の懸
濁液とした。
（リン酸緩衝液、ｐＨ７，グ）に等量のθ、θ／％タン
ニン酸溶液を加えてｊ乙°Ｃで３０分反応させ、次いで
リン酸緩衝液で赤血球を洗浄後、ざチ憑濁液とした。つ
いで前記実施例／（ｂ）で製造した抗ＦＮ抗体の０．７
％溶液を加え！に°Ｃで２時間反応させた。反応終了後
、リン酸緩衝液にて血球を遠心洗浄し、０．２チウシ血
清アルブミンを含むリン酸緩衝液にて３チ血球濃度の懸
濁液とした。
（ｂ）尿中のＦＮの測定（凝集反応法）被検者の尿／り
検体をθ、／チウシ血清アルブミンを含有した０、７Ｍ
グリシン緩衝液（ｐＨ７，−２）で７０倍、２０倍、グ
θ倍、ざ０倍、７３０倍及び３．２０倍に希釈し、各希
釈液３００μβずつを小試験管に入れ上記（ａ）で製造
した抗ＦＮ抗体感作血球の３チ懸濁液！θμｌを加えｌ
昆合したのち強く振盪し、ミラー付スタンドにコ時間静
置し、管底像により判定した。本実梅例においては測定
感度をθ、／μｍ／／ゴに調整しであるので、各被検液
中のＦＩＪ濃度は下記第Ｊ−、／表に示すごとくである
。
検体をθ、／チウシ血清アルブミンを含有した０、７Ｍ
グリシン緩衝液（ｐＨ７，−２）で７０倍、２０倍、グ
θ倍、ざ０倍、７３０倍及び３．２０倍に希釈し、各希
釈液３００μβずつを小試験管に入れ上記（ａ）で製造
した抗ＦＮ抗体感作血球の３チ懸濁液！θμｌを加えｌ
昆合したのち強く振盪し、ミラー付スタンドにコ時間静
置し、管底像により判定した。本実梅例においては測定
感度をθ、／μｍ／／ゴに調整しであるので、各被検液
中のＦＩＪ濃度は下記第Ｊ−、／表に示すごとくである
。
表中、＋は凝集像を示し、−は非凝集１＆を示す。
第！表
第 乙 表
実施例グ
（ａ）ＦＮＭ＆作血球の製造
θ、７５Ｍリン酸嵯衝液（ｐＨ７，２）／θｔｔｔｌに
水洗した赤血球をクチになるように懸濁させる。別にＦ
Ｎ／ｗｇを！Ｍｔのリン酸緩衝液に溶解しこのＦ’Ｎ溶
液に前記の赤血球浮遊液を徐々に加え、軽く混和する。
水洗した赤血球をクチになるように懸濁させる。別にＦ
Ｎ／ｗｇを！Ｍｔのリン酸緩衝液に溶解しこのＦ’Ｎ溶
液に前記の赤血球浮遊液を徐々に加え、軽く混和する。
さらに認、！チに希釈したゲルタールアルデヒド溶液７
０１１を加えて最終濃度２チとし室温で７時間振盪した
のちリン酸緩衝食塩水中に懸濁させた。赤血球で吸収し
た正常家兎の血清をθ、２チ含むリン酸緩衝液にて３９
！Ｉ血球濃度の懸濁液とした。
０１１を加えて最終濃度２チとし室温で７時間振盪した
のちリン酸緩衝食塩水中に懸濁させた。赤血球で吸収し
た正常家兎の血清をθ、２チ含むリン酸緩衝液にて３９
！Ｉ血球濃度の懸濁液とした。
（１））尿中のＦＨの測定（凝集阻止反応）健常者及び
胃癌患者の尿／グ検体をθ、、２ｑ６ウシ血清アルブミ
ンを含有した生量食塩液で−１を倍、１倍、７０倍、２
９倍、り０倍及び？θ倍に希釈し、各希釈尿λθθμｌ
ずつを小試験管に入れ前記実施例／（ｂ）で製造した抗
ＦＮ抗体の０．／チ溶液１０θμｌを各々の小試験管中
に加えた。ついで上記（ａ）で製造したＦＮ感作血球の
３チ懸濁液！θμｌを加え混和したのち強く振盪し、ミ
ラー付スタンドに２時間静置し、管底像により判定した
。本実施例においては測定感度を／μｆ／；ｔｔｔに調
製しであるので各被検尿中の１Ｍ量は下記第２〜１０表
に示す如くである。
胃癌患者の尿／グ検体をθ、、２ｑ６ウシ血清アルブミ
ンを含有した生量食塩液で−１を倍、１倍、７０倍、２
９倍、り０倍及び？θ倍に希釈し、各希釈尿λθθμｌ
ずつを小試験管に入れ前記実施例／（ｂ）で製造した抗
ＦＮ抗体の０．／チ溶液１０θμｌを各々の小試験管中
に加えた。ついで上記（ａ）で製造したＦＮ感作血球の
３チ懸濁液！θμｌを加え混和したのち強く振盪し、ミ
ラー付スタンドに２時間静置し、管底像により判定した
。本実施例においては測定感度を／μｆ／；ｔｔｔに調
製しであるので各被検尿中の１Ｍ量は下記第２〜１０表
に示す如くである。
表中、＋は凝集阻止像を示し、−は凝集像を示す。
第 ９ 表
手 続 ｈｌｉ 正 書
昭和！２年１４月１・）日
特許庁長官 若 杉 和 夫 殿
／ 事件の表示
昭和！ｉ年特許願第１９９．１７．２号Ｊ 発明の名称
フィブロネクチンの免疫学的測定
３ 補正をする者
事件との関係 特許出願人
よ 捕正により増加する発明の数 な し乙 イｍ正の
対象 明細書 Ｚ 補正の内容
対象 明細書 Ｚ 補正の内容
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ／ フィブロネクチン又は抗ヒトフィブロネクチン抗体
で担持した免疫学的に不活性な担体粒子よりなる、フィ
ブロネクチン及びフィブロネクチン分解産物の免疫学的
測定試薬。 ２ 免疫学的に不活性な担体粒子に抗フィブロネクチン
抗体を担持した免疫学的測定試薬を、一定の希釈倍率に
希釈した検体に添加し、或いは一定の希釈倍数に希釈し
た検体に予め抗フィブロネクチン抗体を加えておき、次
いで免疫学的に不活性な担体粒子にフィブロネクチンを
担持したフィブロネクチン担持担体よりなる免疫学的測
定試薬を添加し、凝集の生成の有無を判定することによ
って該検体中のフィブロネクチン及びフィブロネクチン
分解産物を測定することを特徴とする、フィブロネクチ
ン及びフィブロネクチン分解産物の免疫学的測定方法。 ３ 検体が尿である、特許請求の範囲第２項記載の免疫
学的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58199272A JPH0616048B2 (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | フィブロネクチンの免疫学的測定 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58199272A JPH0616048B2 (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | フィブロネクチンの免疫学的測定 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6091264A true JPS6091264A (ja) | 1985-05-22 |
| JPH0616048B2 JPH0616048B2 (ja) | 1994-03-02 |
Family
ID=16405023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58199272A Expired - Lifetime JPH0616048B2 (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | フィブロネクチンの免疫学的測定 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0616048B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63163167A (ja) * | 1986-12-25 | 1988-07-06 | Takara Shuzo Co Ltd | ヒト癌の検出方法 |
| JPH02115767A (ja) * | 1988-09-15 | 1990-04-27 | Aspen Diagnostics Corp | 妊娠誘発高血圧および子かんのイムノアツセイおよび試薬 |
| JPH02266262A (ja) * | 1989-01-23 | 1990-10-31 | Miles Inc | 細胞蛋白質の免疫検定法 |
| US5096830A (en) * | 1987-11-17 | 1992-03-17 | Adeza Biomedical Corporation | Preterm labor and membrane rupture test |
| US5185270A (en) * | 1987-11-17 | 1993-02-09 | Adeza Biomedical Corporation | Fetal fibronectin pregnancy test |
| US5223440A (en) * | 1987-11-17 | 1993-06-29 | Adeza Biomedical Corporation | Ex vivo product of conception test to determine abortion |
-
1983
- 1983-10-26 JP JP58199272A patent/JPH0616048B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ANAL.BIOCHEM=1981 * |
| INVESTIGATIVE UROLOGY=1980 * |
| J.IMMUNOL.METHOD=1981 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63163167A (ja) * | 1986-12-25 | 1988-07-06 | Takara Shuzo Co Ltd | ヒト癌の検出方法 |
| US5096830A (en) * | 1987-11-17 | 1992-03-17 | Adeza Biomedical Corporation | Preterm labor and membrane rupture test |
| US5185270A (en) * | 1987-11-17 | 1993-02-09 | Adeza Biomedical Corporation | Fetal fibronectin pregnancy test |
| US5223440A (en) * | 1987-11-17 | 1993-06-29 | Adeza Biomedical Corporation | Ex vivo product of conception test to determine abortion |
| JPH02115767A (ja) * | 1988-09-15 | 1990-04-27 | Aspen Diagnostics Corp | 妊娠誘発高血圧および子かんのイムノアツセイおよび試薬 |
| JPH02266262A (ja) * | 1989-01-23 | 1990-10-31 | Miles Inc | 細胞蛋白質の免疫検定法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0616048B2 (ja) | 1994-03-02 |
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