JPH0616048B2 - フィブロネクチンの免疫学的測定 - Google Patents
フィブロネクチンの免疫学的測定Info
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- JPH0616048B2 JPH0616048B2 JP58199272A JP19927283A JPH0616048B2 JP H0616048 B2 JPH0616048 B2 JP H0616048B2 JP 58199272 A JP58199272 A JP 58199272A JP 19927283 A JP19927283 A JP 19927283A JP H0616048 B2 JPH0616048 B2 JP H0616048B2
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- cells
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的測定試薬を用いて、尿中フィブロネク
チン及びフィブロネクチン分解産物の量を測定すること
による、癌、閉鎖性黄疸、白血病又は腎不全からなる疾
病の検出方法に関する。
チン及びフィブロネクチン分解産物の量を測定すること
による、癌、閉鎖性黄疸、白血病又は腎不全からなる疾
病の検出方法に関する。
フィブロネクチンは動物細胞表面および血液中にあり、
分子量20万〜25万の二つのサブユニットからなる糖蛋白
である。ただし、細胞表面のものと血液中のものとで
は、構造や性質にわずかな違いがあるとされている。
分子量20万〜25万の二つのサブユニットからなる糖蛋白
である。ただし、細胞表面のものと血液中のものとで
は、構造や性質にわずかな違いがあるとされている。
多細胞動物では、一個の受精卵が分裂をくり返し、生じ
た細胞を正確に編成して一個体をつくり上げる。その一
つの機能は細胞間の特異的な結合であることが知られて
いる。この細胞間、さらには細胞が他の細胞や基質、コ
ラーゲン、フィブリノゲンへ接着することがフィブロネ
クチンによって促進される。
た細胞を正確に編成して一個体をつくり上げる。その一
つの機能は細胞間の特異的な結合であることが知られて
いる。この細胞間、さらには細胞が他の細胞や基質、コ
ラーゲン、フィブリノゲンへ接着することがフィブロネ
クチンによって促進される。
また成体の、血液組織を除く正常組織や良性腫瘍の細胞
はその位置から遊離することはないが、がん細胞は原発
部位より遊離して他の部位で新たに腫瘍を形成する。こ
れはがん細胞の接着性が異常であるため、腫瘍組織を形
成している細胞がひとまとまりでいることができないた
めといわれており、実際培養細胞を用いて腫瘍細胞と正
常細胞とを比べると、細胞−細胞間接着についても、細
胞−基質間接着についても接着性が変化していると報告
されている（J.Cell Sci２２巻 6851976：J.Natl.Canc
er Inst,39巻 7051967参照）。
はその位置から遊離することはないが、がん細胞は原発
部位より遊離して他の部位で新たに腫瘍を形成する。こ
れはがん細胞の接着性が異常であるため、腫瘍組織を形
成している細胞がひとまとまりでいることができないた
めといわれており、実際培養細胞を用いて腫瘍細胞と正
常細胞とを比べると、細胞−細胞間接着についても、細
胞−基質間接着についても接着性が変化していると報告
されている（J.Cell Sci２２巻 6851976：J.Natl.Canc
er Inst,39巻 7051967参照）。
さらに近年フィブロネクチンは腫瘍ウィルスによる繊維
芽細胞の悪化や、細胞のがん化に伴い細胞膜表面から消
失し、血清中に増加することがわかった。さらに今回、
本発明者らによって、フィブロネクチンは悪性腫瘍やが
ん化細胞が生じた際尿中に排泄されることを見出した。
このフィブロネクチンの尿中への排泄量は悪性腫瘍やが
んの進行に伴って増加することがわかり、がんの診断や
がん組織の切除後の予後管理に用いることができるので
はないかとの知見によって本発明方法を開発するに至っ
た。
芽細胞の悪化や、細胞のがん化に伴い細胞膜表面から消
失し、血清中に増加することがわかった。さらに今回、
本発明者らによって、フィブロネクチンは悪性腫瘍やが
ん化細胞が生じた際尿中に排泄されることを見出した。
このフィブロネクチンの尿中への排泄量は悪性腫瘍やが
んの進行に伴って増加することがわかり、がんの診断や
がん組織の切除後の予後管理に用いることができるので
はないかとの知見によって本発明方法を開発するに至っ
た。
従来よりがんの診断方法には種々の方法がとられてお
り、例えばがん化されたと思われる細胞組織を取り出
し、細胞を染色して顕微鏡でみる方法やがん細胞が産生
する物質、いわゆる腫瘍マーカーを免疫学的に測定する
方法がある。この腫瘍マーカーにはα−フェトブロテイ
ン（AFP）、癌胎児抗原（CEA）、塩基性フェトプロテイ
ン（BFP）、骨髄腫蛋白（Ｍ蛋白）や異所性ホルモンな
どがある。しかし、これらの腫瘍マーカーは臓器特異性
のあるものもあり、全てのがんのスクリーニングテスト
には必ずしも有用でないものもあった。
り、例えばがん化されたと思われる細胞組織を取り出
し、細胞を染色して顕微鏡でみる方法やがん細胞が産生
する物質、いわゆる腫瘍マーカーを免疫学的に測定する
方法がある。この腫瘍マーカーにはα−フェトブロテイ
ン（AFP）、癌胎児抗原（CEA）、塩基性フェトプロテイ
ン（BFP）、骨髄腫蛋白（Ｍ蛋白）や異所性ホルモンな
どがある。しかし、これらの腫瘍マーカーは臓器特異性
のあるものもあり、全てのがんのスクリーニングテスト
には必ずしも有用でないものもあった。
フィブロネクチンは繊維芽細胞、脂肪細胞、平滑筋細
胞、マクロファージなどの間葉系細胞の表面、皮膚、粘
膜の基底膜及び汗腺、皮脂腺、乳腺、唾液腺など外分泌
腺の基底膜に広く分布している。このように間葉系細胞
はすべての臓器にあることから、がんの診断にフィブロ
ネクチンを腫瘍マーカーの一つとすることは極めて有意
義なことである。
胞、マクロファージなどの間葉系細胞の表面、皮膚、粘
膜の基底膜及び汗腺、皮脂腺、乳腺、唾液腺など外分泌
腺の基底膜に広く分布している。このように間葉系細胞
はすべての臓器にあることから、がんの診断にフィブロ
ネクチンを腫瘍マーカーの一つとすることは極めて有意
義なことである。
またフィブロネクチンはフィブリンと架橋形成すること
から急激に血栓が形成される病態、例えば播種性血管内
凝固症候群（DIC）では血漿レベル著しく低下すること
も知られている。
から急激に血栓が形成される病態、例えば播種性血管内
凝固症候群（DIC）では血漿レベル著しく低下すること
も知られている。
さらにフィブロネクチン及びフィブロネクチン分解産物
は閉塞性黄疸、白血病、腎不全患者の尿中にも多量に排
泄されることがわかり、これらの患者のフィブロネクチ
ンの検出・定量は治療上極めて重要である。
は閉塞性黄疸、白血病、腎不全患者の尿中にも多量に排
泄されることがわかり、これらの患者のフィブロネクチ
ンの検出・定量は治療上極めて重要である。
また、尿中に排泄されるフィブロネクチンは生体内で種
々の代謝を受け、約３万及び約19万の分子量からなる分
解産物を生じているとみられる。この分解産物の構造及
び物性などは不明であるが、免疫学的に測定することは
可能である。
々の代謝を受け、約３万及び約19万の分子量からなる分
解産物を生じているとみられる。この分解産物の構造及
び物性などは不明であるが、免疫学的に測定することは
可能である。
いずれにせよ検体中のフィブロネクチン及びフィブロネ
クチン分解産物の測定は細胞−細胞間あるいは細胞−基
質間の異常を知る上で、特に癌、閉塞性黄疸、白血病、
腎不全などの疾病を知る上で臨床上重要な情報を与えて
くれることになる。
クチン分解産物の測定は細胞−細胞間あるいは細胞−基
質間の異常を知る上で、特に癌、閉塞性黄疸、白血病、
腎不全などの疾病を知る上で臨床上重要な情報を与えて
くれることになる。
従来よりフィブロネクチン測定キットが発売されており
（Boehringer-Manheim社）、この方法は抗原−抗体反応
を免疫比濁法によって測定している。しかしながらこの
免疫比濁法は抗原−抗体反応を測定するのに特殊な必要
とするため、簡便に実施することが困難であった。
（Boehringer-Manheim社）、この方法は抗原−抗体反応
を免疫比濁法によって測定している。しかしながらこの
免疫比濁法は抗原−抗体反応を測定するのに特殊な必要
とするため、簡便に実施することが困難であった。
しかして、本発明者らは尿中のフィブロネクチン及びフ
ィブロネクチン分解産物の簡便で且つ迅速な測定方法を
見出すべく研究した結果、、フィブロネクチン又は抗フ
ィブロネクチン抗体を免疫学的に不活性な担体粒子に担
持した試薬を用いれば、免疫学的凝集又は凝集阻止反応
により、極めて簡便に且つ迅速にしかもかなりの精度を
もって尿中のフィブロネクチンを測定しうることを見い
出し、本発明を完成するに至った。以下、フィブロネク
チン及びフィブロネクチン分解産物を“FN”と略称す
る。
ィブロネクチン分解産物の簡便で且つ迅速な測定方法を
見出すべく研究した結果、、フィブロネクチン又は抗フ
ィブロネクチン抗体を免疫学的に不活性な担体粒子に担
持した試薬を用いれば、免疫学的凝集又は凝集阻止反応
により、極めて簡便に且つ迅速にしかもかなりの精度を
もって尿中のフィブロネクチンを測定しうることを見い
出し、本発明を完成するに至った。以下、フィブロネク
チン及びフィブロネクチン分解産物を“FN”と略称す
る。
かくして、本発明によれば、免疫学的に不活性な担体粒
子に抗ＦＮ抗体を担持した免疫学的測定試薬を用いた免
疫学的凝集反応により、又は、抗ＦＮ抗体及び免疫学的
に不活性な担体粒子にＦＮを担持したものからなる免疫
学的測定試薬を用いた免疫学的凝集阻止反応により、尿
中ＦＮ及びＦＮ分解産物の量を測定することを特徴とす
る、癌、閉鎖性黄疸、白血病又は腎不全からなる疾病の
検出方法が提供される。
子に抗ＦＮ抗体を担持した免疫学的測定試薬を用いた免
疫学的凝集反応により、又は、抗ＦＮ抗体及び免疫学的
に不活性な担体粒子にＦＮを担持したものからなる免疫
学的測定試薬を用いた免疫学的凝集阻止反応により、尿
中ＦＮ及びＦＮ分解産物の量を測定することを特徴とす
る、癌、閉鎖性黄疸、白血病又は腎不全からなる疾病の
検出方法が提供される。
本発明の測定試薬において使用されるＦＮはヒトの血漿
からそれ自体公知の方法により、例えばゲル過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフイニテイークロマトグ
ラフィー等の方法を単独で又は組み合せ用いて分離精製
することにより取得することができる〔分離精製法の詳
細については必要あれば、Ann.N.Y.Acad.Sci.312巻 25
6（1978）参照〕。
からそれ自体公知の方法により、例えばゲル過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフイニテイークロマトグ
ラフィー等の方法を単独で又は組み合せ用いて分離精製
することにより取得することができる〔分離精製法の詳
細については必要あれば、Ann.N.Y.Acad.Sci.312巻 25
6（1978）参照〕。
一方、抗FN抗体もまたそれ自体公知の方法により調製す
ることができ、例えば上記の如くして得たＦＮにフロイ
ンドのアジュバントその他の補助剤を加えたもので、ウ
サギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、などの人間以外の哺
乳動物を免疫し、その抗血清を回収し、該抗血清から通
常の方法に従い、例えば硫安沈殿法による分画によって
抗ＦＮ抗体を分離することにより取得することができ
る。
ることができ、例えば上記の如くして得たＦＮにフロイ
ンドのアジュバントその他の補助剤を加えたもので、ウ
サギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、などの人間以外の哺
乳動物を免疫し、その抗血清を回収し、該抗血清から通
常の方法に従い、例えば硫安沈殿法による分画によって
抗ＦＮ抗体を分離することにより取得することができ
る。
本発明に従い担持すべきＦＮ及び抗ＥＮ抗体の純度は厳
密に制約されるものではないが、一般にＦＮはデイスク
電気泳動法により実質的に単一の像を示す程度の純度の
ものが好ましく、また抗ＦＮ抗体は血漿中のＦＮとの抗
原−抗体反応において免疫電気泳動法により実質的に単
一の像を示す程度の純度のものが適している。
密に制約されるものではないが、一般にＦＮはデイスク
電気泳動法により実質的に単一の像を示す程度の純度の
ものが好ましく、また抗ＦＮ抗体は血漿中のＦＮとの抗
原−抗体反応において免疫電気泳動法により実質的に単
一の像を示す程度の純度のものが適している。
また、かかるＦＮ又は抗ＦＮ抗体の担持のために用いら
れる免疫学的に不活性な担体粒子としては、例えば、ホ
ルマリンなどで固定化した赤血球、高分子ラテックス、
ベントナイト、コロジオン、シリカ、カオリン等、従来
免疫学的測定試薬の担体として通常使用されているもの
はいずれも使用できる。かかる担体粒子は一般に約0.01
〜約２０ミクロン、好ましくは約0.05〜約１０ミクロン
の平均粒径を有することができる。
れる免疫学的に不活性な担体粒子としては、例えば、ホ
ルマリンなどで固定化した赤血球、高分子ラテックス、
ベントナイト、コロジオン、シリカ、カオリン等、従来
免疫学的測定試薬の担体として通常使用されているもの
はいずれも使用できる。かかる担体粒子は一般に約0.01
〜約２０ミクロン、好ましくは約0.05〜約１０ミクロン
の平均粒径を有することができる。
本発明において「担持」なる語は、ＦＮ又は抗ＦＮ抗体
を上記した如き担体粒子上に物理的に吸着せしめる場合
及び化学的に結合させる場合の両方を包含する意味で用
いるものである。
を上記した如き担体粒子上に物理的に吸着せしめる場合
及び化学的に結合させる場合の両方を包含する意味で用
いるものである。
かくして、担持は通常の方法によって行なうことがで
き、例えば、上記した如き担体粒子にＦＮ又は抗ＦＮ抗
体を最終濃度0.001〜0.5％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは0.01
〜0.2％（Ｗ／Ｖ）になるように緩衝液（例えばグリシ
ン水酸化ナトリウム緩衝液）中に溶解し、撹拌しながら
担体（例えばポリスチレンラテックス）を加え、通常約
４〜約６０℃、好ましくは約15〜約４０℃の温度で約３
０〜約180分間さらに撹拌をつづけることにより、担持
を行なうことができる。この場合、ＦＮ及び抗ＦＮ抗体
に対して免疫学的に不活性なタンパク質〔例えばヒト、
ウシ、ヤギ、ヒツジなどの動物の血清のアルブミンやグ
ロブリンなど〕の緩衝液〔通常0.01〜0.5％（Ｗ／Ｖ）
濃度のものが使用される〕で担持前又は担持後の担体粒
子を処理することができ、これによって非特異的反応を
除くことができる。
き、例えば、上記した如き担体粒子にＦＮ又は抗ＦＮ抗
体を最終濃度0.001〜0.5％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは0.01
〜0.2％（Ｗ／Ｖ）になるように緩衝液（例えばグリシ
ン水酸化ナトリウム緩衝液）中に溶解し、撹拌しながら
担体（例えばポリスチレンラテックス）を加え、通常約
４〜約６０℃、好ましくは約15〜約４０℃の温度で約３
０〜約180分間さらに撹拌をつづけることにより、担持
を行なうことができる。この場合、ＦＮ及び抗ＦＮ抗体
に対して免疫学的に不活性なタンパク質〔例えばヒト、
ウシ、ヤギ、ヒツジなどの動物の血清のアルブミンやグ
ロブリンなど〕の緩衝液〔通常0.01〜0.5％（Ｗ／Ｖ）
濃度のものが使用される〕で担持前又は担持後の担体粒
子を処理することができ、これによって非特異的反応を
除くことができる。
また、前記担体粒子にＦＮ又は抗ＦＮ抗体を化学的に結
合せしめる場合としては、例えばカルボキシル基やアミ
ノ基などＦＮ又は抗ＦＮ抗体と化学的に結合しうる官能
基を表面にもつ担体粒子と担持すべきＦＮ又は抗ＦＮ抗
体とを適当な結合剤例えばカルボジイミド、ビスジアゾ
ペンジジン、グルメタールアルデヒドなどの存在下に反
応させる方法が挙げられる。この場合においても、上記
と同様に不活性なタンパク質で担持前又は担持後の担体
粒子を処理する（化学的に接合せしめる）ことにより非
特異的反応を除き高感度の試薬を得るようにすることが
できる。
合せしめる場合としては、例えばカルボキシル基やアミ
ノ基などＦＮ又は抗ＦＮ抗体と化学的に結合しうる官能
基を表面にもつ担体粒子と担持すべきＦＮ又は抗ＦＮ抗
体とを適当な結合剤例えばカルボジイミド、ビスジアゾ
ペンジジン、グルメタールアルデヒドなどの存在下に反
応させる方法が挙げられる。この場合においても、上記
と同様に不活性なタンパク質で担持前又は担持後の担体
粒子を処理する（化学的に接合せしめる）ことにより非
特異的反応を除き高感度の試薬を得るようにすることが
できる。
上記の担持操作において、担体粒子へのＦＮ又は抗ＦＮ
抗体の担持量及び／又は該不活性タンパク質による処理
の程度を適宜調節することにより、常に一定の高感度の
免疫学的診断試薬を調製することができる。
抗体の担持量及び／又は該不活性タンパク質による処理
の程度を適宜調節することにより、常に一定の高感度の
免疫学的診断試薬を調製することができる。
上記の如く調整された測定試薬は、検体すなわち尿中の
ＦＮの免疫学的測定のために使用することができ、その
測定はそれ自体公知の免疫学的凝集反応又は免疫学的凝
集阻止反応を利用して行なうことができる。
ＦＮの免疫学的測定のために使用することができ、その
測定はそれ自体公知の免疫学的凝集反応又は免疫学的凝
集阻止反応を利用して行なうことができる。
例えば、免疫学的凝集反応においては、スライドガラス
板上又は小試薬管内で、一定の希釈倍率に希釈した検体
と本発明の抗ＦＮ抗体を担持した担体粒子よりなる測定
試薬とを相互に接触せしめる。もし検体中にＦＮが存在
すれば凝集反応が起り、内眼的に観察することができ
る。検体の希釈倍率を増やし、凝集反応が確認できる最
大希釈倍率を求めることにより、検体中のＦＮ濃度を決
定することができる。
板上又は小試薬管内で、一定の希釈倍率に希釈した検体
と本発明の抗ＦＮ抗体を担持した担体粒子よりなる測定
試薬とを相互に接触せしめる。もし検体中にＦＮが存在
すれば凝集反応が起り、内眼的に観察することができ
る。検体の希釈倍率を増やし、凝集反応が確認できる最
大希釈倍率を求めることにより、検体中のＦＮ濃度を決
定することができる。
また、免疫学的凝集阻止反応においては、上記と同様、
スライドガラス板上又は小試験管中に、一定の希釈倍率
に希釈した検体と抗ＦＮ抗体とを滴加し、混和した後、
ＦＮを担持した担体粒子より成る測定試薬を加えて接触
せしめ、その際に凝集像が現われるか否かを測定する
（該希釈検体中にある一定濃度以上でＦＮが存在すれば
凝集阻止像が観察される）ことにより上記と同様にして
検体中のＦＮ濃度を決定することができる。
スライドガラス板上又は小試験管中に、一定の希釈倍率
に希釈した検体と抗ＦＮ抗体とを滴加し、混和した後、
ＦＮを担持した担体粒子より成る測定試薬を加えて接触
せしめ、その際に凝集像が現われるか否かを測定する
（該希釈検体中にある一定濃度以上でＦＮが存在すれば
凝集阻止像が観察される）ことにより上記と同様にして
検体中のＦＮ濃度を決定することができる。
上記のように本発明の方法によれば、検体の希釈液と試
薬とを加え、スライドガラス板上又は小試験管中の凝集
像を肉眼的に観察するという極めて簡便な操作だけで、
迅速に検体中のＦＮを測定することができ、臨床学的に
は患者のベッドサイドで極めて手軽に数分間でＦＮの定
量を行なうことができ、その結果から、癌、閉鎖性黄
疸、白血病又は腎不全からなる疾病の検出が可能とな
る。本発明におけるかかる効果は前述した従来の測定方
法からは全く予測外のことであり、ＦＮ測定分野に画期
的な発展をもたらすものである。
薬とを加え、スライドガラス板上又は小試験管中の凝集
像を肉眼的に観察するという極めて簡便な操作だけで、
迅速に検体中のＦＮを測定することができ、臨床学的に
は患者のベッドサイドで極めて手軽に数分間でＦＮの定
量を行なうことができ、その結果から、癌、閉鎖性黄
疸、白血病又は腎不全からなる疾病の検出が可能とな
る。本発明におけるかかる効果は前述した従来の測定方
法からは全く予測外のことであり、ＦＮ測定分野に画期
的な発展をもたらすものである。
次に実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１ (a)ＦＮの製造 ヒト新鮮血１に3.8％クエン酸ナトリウム100mlを加え
４℃、6000ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた血漿
を0.1Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で膨潤させたゼ
ラチン−セファロース４Ｂ 500ml中に加える。室温で3
0分間ゆるやかに撹拌したのちガラスフィルター上で吸
引過し次いで１Ｍ尿素を含有する0.1Ｍのリン酸緩衝
液３を用い洗浄した。さらに４Ｍの尿素を含有した
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ7.4）500mlを用いＦＮを
溶出した。この溶出液を0.005Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐ
Ｈ8.3）５で２回透析を行ない凍結乾燥をした。次い
で0.01Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ8.3）で平衡化したセ
ファデックスＧ−200を用いゲル過し得られたＦＮ分
画を凍結乾燥した。
４℃、6000ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた血漿
を0.1Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で膨潤させたゼ
ラチン−セファロース４Ｂ 500ml中に加える。室温で3
0分間ゆるやかに撹拌したのちガラスフィルター上で吸
引過し次いで１Ｍ尿素を含有する0.1Ｍのリン酸緩衝
液３を用い洗浄した。さらに４Ｍの尿素を含有した
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ7.4）500mlを用いＦＮを
溶出した。この溶出液を0.005Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐ
Ｈ8.3）５で２回透析を行ない凍結乾燥をした。次い
で0.01Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ8.3）で平衡化したセ
ファデックスＧ−200を用いゲル過し得られたＦＮ分
画を凍結乾燥した。
(b)抗ＦＮ抗体の製造 上記(a)で得られたＦＮ／mgを生理食塩液／mlに溶解
し、同量のコンプリート・フロインド・アジュバンドで
乳化し、家兎の足蹠および皮下に注射した。この注射を
３週間間隔で行ない、抗体価の上昇を確認後全採血を行
った。得られた血液を室温で４０分間放置したのち、室
温、3,000rpmで３０分間遠心分離により抗血清を分離し
た。
し、同量のコンプリート・フロインド・アジュバンドで
乳化し、家兎の足蹠および皮下に注射した。この注射を
３週間間隔で行ない、抗体価の上昇を確認後全採血を行
った。得られた血液を室温で４０分間放置したのち、室
温、3,000rpmで３０分間遠心分離により抗血清を分離し
た。
この抗血清４０mlに同量の0.9％ NaCl含有１／200Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ7.2）を加え撹拌したのち、飽和硫酸
アンモニウムによる塩析で抗ＦＮを抗体を製造した。
ン酸緩衝液（ｐＨ7.2）を加え撹拌したのち、飽和硫酸
アンモニウムによる塩析で抗ＦＮを抗体を製造した。
(c)抗ＦＮ抗体担持ポリスチレンラテックスの製造 上記(b)で製造した抗ＦＮ抗体６mgを５mlの０．２４Ｍ
グリシン緩衝液（ｐＨ9.6）に溶解し、これに２％（Ｗ
／Ｖ）ポリスチレンラテックス懸濁液（平均粒径：0.22
0μ）５mlを加えて混合し、室温で２時間撹拌した。こ
の後、遠心分離して得た沈殿を０．３％にウシ血清アル
ブミン（BSA）を含むグリシン緩衝液１０mlに懸濁さ
せ、抗ＦＮ抗体担持ポリスチレンラテックスを得た。
グリシン緩衝液（ｐＨ9.6）に溶解し、これに２％（Ｗ
／Ｖ）ポリスチレンラテックス懸濁液（平均粒径：0.22
0μ）５mlを加えて混合し、室温で２時間撹拌した。こ
の後、遠心分離して得た沈殿を０．３％にウシ血清アル
ブミン（BSA）を含むグリシン緩衝液１０mlに懸濁さ
せ、抗ＦＮ抗体担持ポリスチレンラテックスを得た。
(d)尿中のＦＮの測定（凝集反応法） 健常者及び胃癌患者の尿１９検体を0.2％ウシ血清アル
ブミンを含有した生理食塩液で２．５倍、５倍、１０
倍、２０倍、４０倍及び８０倍に希釈し、各希釈尿をキ
ャピラリーピペットで２滴ずつ（約100μ）を反応ス
ライド板上に滴下し、これに上記(c)で製造した抗ＦＮ
抗体担持ポリスチレンラテックスを１滴ずつ滴下する。
両者を混合し、スライド板をゆるやかに揺動し、２分後
に肉眼で凝集像の有無を観察した。なお、本実施例にお
いては試薬の感度を０．５μｇ／mlに調整したものを用
いた。各被検液のＦＮ濃度は下記第１〜２表に示すとお
りであった。
ブミンを含有した生理食塩液で２．５倍、５倍、１０
倍、２０倍、４０倍及び８０倍に希釈し、各希釈尿をキ
ャピラリーピペットで２滴ずつ（約100μ）を反応ス
ライド板上に滴下し、これに上記(c)で製造した抗ＦＮ
抗体担持ポリスチレンラテックスを１滴ずつ滴下する。
両者を混合し、スライド板をゆるやかに揺動し、２分後
に肉眼で凝集像の有無を観察した。なお、本実施例にお
いては試薬の感度を０．５μｇ／mlに調整したものを用
いた。各被検液のＦＮ濃度は下記第１〜２表に示すとお
りであった。
表中、＋は凝集像を示し、−は非凝集像を示す。
実施例２ (a)抗ＦＮ抗体担持ポリスチレンラテックスの製造 実施例１(b)で製造した抗ＦＮ抗体４mgを0.24Ｍグリシ
ン緩衝液（ｐＨ９．６）５mlに溶解し、２％ポリスチレ
ンラテックス（粒径0.500μ）５mlを加えて室温で１時
間撹拌した。撹拌後４℃、10,000rpmで20分間遠心分離
を行い得られた沈殿物を上記緩衝液１０mlで洗浄した。
再度遠心分離跡、沈殿物を0.2％BSA含有グリシン緩衝液
１０mlに懸濁させ、抗ＦＮ抗体担持ポリスチレンラテッ
クスを製造した。
ン緩衝液（ｐＨ９．６）５mlに溶解し、２％ポリスチレ
ンラテックス（粒径0.500μ）５mlを加えて室温で１時
間撹拌した。撹拌後４℃、10,000rpmで20分間遠心分離
を行い得られた沈殿物を上記緩衝液１０mlで洗浄した。
再度遠心分離跡、沈殿物を0.2％BSA含有グリシン緩衝液
１０mlに懸濁させ、抗ＦＮ抗体担持ポリスチレンラテッ
クスを製造した。
(b)尿中のＦＮの測定（凝集反応法） 被検者の尿１１検体を0.2％ウシ血清アルブミンを含有
した0.24Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ7.5）で２倍、４倍、
８倍、１６倍及び３２倍に希釈し、各希釈液の１滴（約
５０μ）を反応スライド板上に滴下し、上記(a)で製
造した抗ＦＮ抗体担持ポリスチレンラテックスを１滴ず
つ滴下する。この両者を均一に混合し、スライド板をゆ
るやかに揺動し、２分後肉眼で凝集像を観察した。な
お、この実施例においては試薬の感度を／μｇ／mlに調
整したものを用いた。各被検液のＦＮ濃度は下記第３〜
４表に示すおとおりであった。
した0.24Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ7.5）で２倍、４倍、
８倍、１６倍及び３２倍に希釈し、各希釈液の１滴（約
５０μ）を反応スライド板上に滴下し、上記(a)で製
造した抗ＦＮ抗体担持ポリスチレンラテックスを１滴ず
つ滴下する。この両者を均一に混合し、スライド板をゆ
るやかに揺動し、２分後肉眼で凝集像を観察した。な
お、この実施例においては試薬の感度を／μｇ／mlに調
整したものを用いた。各被検液のＦＮ濃度は下記第３〜
４表に示すおとおりであった。
表中、＋は凝集像を示し、−は非凝集像を示す。
実施例３ (a)抗ＦＮ抗体担持血球の製造 常法によりホルマリン固定したヒツジ赤血球４％懸濁液
（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）に等量の0.01％タンニン
酸溶液を加えて５６℃で３０分反応させ、次いでリン酸
緩衝液で赤血球を洗浄後、８％懸濁液とした。ついで前
記実施例１(b)で製造した抗ＦＮ抗体の0.1％溶液を加え
５６℃で２時間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液
にて血球を遠心洗浄し、0.2％ウシ血清アルブミンを含
むリン酸緩衝液にて３％血球濃度の懸濁液とした。
（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）に等量の0.01％タンニン
酸溶液を加えて５６℃で３０分反応させ、次いでリン酸
緩衝液で赤血球を洗浄後、８％懸濁液とした。ついで前
記実施例１(b)で製造した抗ＦＮ抗体の0.1％溶液を加え
５６℃で２時間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液
にて血球を遠心洗浄し、0.2％ウシ血清アルブミンを含
むリン酸緩衝液にて３％血球濃度の懸濁液とした。
(b)尿中のＦＮの測定（凝集反応法） 被検者の尿１９検体を0.1％ウシ血清アルブミンを含有
した0.1Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ７．２）で１０倍、２
０倍、４０倍、８０倍、１６０倍及び320倍に希釈し、
各希釈液300μずつを小試験管に入れ上記(a)で製造し
た抗ＦＮ抗体担持血球の３％懸濁液５０μを加え混合
したのち強く振盪し、ミラー付スタンドに２時間静置
し、管底像により判定した。本実施例においては測定感
度を0.1μｇ／mlに調整してあるので、各被検液中のＦ
Ｎ濃度は下記第５〜８表に示すごとくである。
した0.1Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ７．２）で１０倍、２
０倍、４０倍、８０倍、１６０倍及び320倍に希釈し、
各希釈液300μずつを小試験管に入れ上記(a)で製造し
た抗ＦＮ抗体担持血球の３％懸濁液５０μを加え混合
したのち強く振盪し、ミラー付スタンドに２時間静置
し、管底像により判定した。本実施例においては測定感
度を0.1μｇ／mlに調整してあるので、各被検液中のＦ
Ｎ濃度は下記第５〜８表に示すごとくである。
表中、＋は凝集像を示し、−は非凝集像を示す。
実施例４ (a)ＦＮ担持血球の製造 0.15Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.2）１０mlに水洗した赤血
球を４％になるように懸濁させる。別にＦＮ１mgを５ml
のリン酸緩衝液に溶解しこのＦＮ溶液に前記の赤血球浮
遊液を徐々に加え、軽く混和する。さらに2.5％に希釈
したグルタールアルデヒド溶液１０mlを加えて最終濃度
２％とし室温で１時間振盪したのちリン酸緩衝食塩水中
に懸濁させた。赤血球で吸収した正常家兎の血清を0.2
％含有リン酸緩衝液にて３％血球濃度の懸濁液とした。
球を４％になるように懸濁させる。別にＦＮ１mgを５ml
のリン酸緩衝液に溶解しこのＦＮ溶液に前記の赤血球浮
遊液を徐々に加え、軽く混和する。さらに2.5％に希釈
したグルタールアルデヒド溶液１０mlを加えて最終濃度
２％とし室温で１時間振盪したのちリン酸緩衝食塩水中
に懸濁させた。赤血球で吸収した正常家兎の血清を0.2
％含有リン酸緩衝液にて３％血球濃度の懸濁液とした。
(b)尿中のＦＮの測定（凝集阻止反応） 健常者及び胃癌患者の尿１４検体を0.2％ウシ血清アル
ブミンを含有した生理食塩液で2.5倍、５倍、２０倍、
４０倍及び８０倍に希釈し、各希釈尿２００μずつを
小試験管に入れ前記実施例１(b)で製造した抗ＦＮ抗体
の0.1％溶液100μを各々の小試験管中に加えた。つい
で上記(a)で製造したＦＮ担持血球の３％懸濁液５０μ
を加え混和したのち強く振盪し、ミラー付スタンドに
２時間静置し、管底像により判定した。本実施例におい
ては測定感度を１μｇ／mlに調製してあるので各被検尿
中のＦＮ量は下記第９〜１０表に示す如くである。
ブミンを含有した生理食塩液で2.5倍、５倍、２０倍、
４０倍及び８０倍に希釈し、各希釈尿２００μずつを
小試験管に入れ前記実施例１(b)で製造した抗ＦＮ抗体
の0.1％溶液100μを各々の小試験管中に加えた。つい
で上記(a)で製造したＦＮ担持血球の３％懸濁液５０μ
を加え混和したのち強く振盪し、ミラー付スタンドに
２時間静置し、管底像により判定した。本実施例におい
ては測定感度を１μｇ／mlに調製してあるので各被検尿
中のＦＮ量は下記第９〜１０表に示す如くである。
表中、＋は凝集阻止像を示し、−は凝集像を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】免疫学的に不活性な担体粒子に抗フィブロ
ネクチン抗体を担持した免疫学的測定試薬を用いた免疫
学的凝集反応により、又は、抗フィブロネクチン抗体及
び免疫学的に不活性な担体粒子にフィブロネクチンを担
持したものからなる免疫学的測定試薬を用いた免疫学的
凝集阻止反応により、尿中フィブロネクチン及びフィブ
ロネクチン分解産物の量を測定することを特徴とする、
癌、閉鎖性黄疸、白血病又は腎不全からなる疾病の検出
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58199272A JPH0616048B2 (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | フィブロネクチンの免疫学的測定 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58199272A JPH0616048B2 (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | フィブロネクチンの免疫学的測定 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6091264A JPS6091264A (ja) | 1985-05-22 |
| JPH0616048B2 true JPH0616048B2 (ja) | 1994-03-02 |
Family
ID=16405023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58199272A Expired - Lifetime JPH0616048B2 (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | フィブロネクチンの免疫学的測定 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0616048B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63163167A (ja) * | 1986-12-25 | 1988-07-06 | Takara Shuzo Co Ltd | ヒト癌の検出方法 |
| US5096830A (en) * | 1987-11-17 | 1992-03-17 | Adeza Biomedical Corporation | Preterm labor and membrane rupture test |
| US5223440A (en) * | 1987-11-17 | 1993-06-29 | Adeza Biomedical Corporation | Ex vivo product of conception test to determine abortion |
| US5185270A (en) * | 1987-11-17 | 1993-02-09 | Adeza Biomedical Corporation | Fetal fibronectin pregnancy test |
| US5079171A (en) * | 1988-09-15 | 1992-01-07 | Adeza Biomedical Corporation | Determining pregnancy induced hypertension and eclampsia by immunoassay of cellular fibronectin |
| CA1333149C (en) * | 1989-01-23 | 1994-11-22 | James E. Brown | Immunoassay for cellular proteins |
-
1983
- 1983-10-26 JP JP58199272A patent/JPH0616048B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＩＶＥＵＲＯＬＯＧＹＶＯＬ．１７ＮＯ．５（１９８０）Ｐ．４０１−４０４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6091264A (ja) | 1985-05-22 |
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