JP2000512123A

JP2000512123A - ネフロパシー―関連免疫グロブリンｇ及びそのための抗体

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Publication number: JP2000512123A
Application number: JP09502388A
Authority: JP
Inventors: エル．マクドナルド、トーマス
Original assignee: ボードオブレジェンツオブザユニヴァースティオブネブラスカ
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 2000-09-19
Also published as: CA2259302A1; US5534431A; US5654158A; EP0909278A4; EP0909278A1; WO1998000445A1

Abstract

(57)【要約】末期腎臓病の糸球体硬化症を持つ患者の尿中に高濃度で生じることが見出された新規免疫グロブリン−様糖蛋白質を記載する。このネフロパシー−関連蛋白質は腎臓病を発症する危険性が高い患者の尿、ならびに器官不全又は拒絶の初期徴候を経験している腎臓移植受容者の尿中でもしばしば高濃度で見出される。この糖蛋白質は正常ヒトＩｇＧ分子上のものと同一であるいくつかの抗原性エピトープを有するが、このネフロパシー−関連免疫グロブリン−様分子にユニークなエピトープに結合する２つのモノクローナル抗体を開発した。このネフロパシー−関連蛋白質が腎臓−関連病に対する初期の特異的マーカーとして働くことを可能とするイムノメリックアッセイを開発した。

Description

【発明の詳細な説明】ネフロパシー−関連免疫グロブリンＧ及びそのための抗体発明の背景本発明は、新規免疫学的試薬及び腎臓の病気又は損傷（以下、時々、「ネフロパシー」ともいう）の検出のためのアッセイ、特に、現在の方法では検出できない発生段階におけるネフロパシーを検出できるアッセイにおけるそれらの使用に関する。本発明の基礎は、球状蛋白質の免疫グロブリンクラスにおける糖蛋白質であって、明白な腎臓病の発生に関連することが示されているヒト・ネフロパシー−関連蛋白質の発見である。このネフロパシー−関連免疫グロブリン−様蛋白質（以下、「ＮＲＩｇ」という）は、腎臓−関連病についての非常に初期の特異的マーカーとして働くことができると信じられている。かくして、１つの実施形態において、本発明は、米国特許第４，７８３，５２８号に「ＲｈＣ」として記載されている免疫複合体−捕獲蛋白質試薬を用いるヒト体液からのＮＲＩｇの単離及び精製に関する。もう１つの実施形態において、本発明は、本発明のアッセイで使用する高度に特異的な抗体を調製するためのその純粋な形態のＮＲＩｇの使用に関する。本発明の特に好ましい実施形態は、明白なネフロパシーの発生のプリディクターとして尿中のＮＲＩｇの濃度を検出し及び／又は測定するユニークで高度に感度のよい免疫学的アッセイにおける、かかる抗体及び免疫化ＲｈＣの使用に関する。さらにもう１つの実施形態において、本発明は、生物学的流体中のＮＲＩｇの検出のための単純で経済的で信頼できるアッセイを提供する。これらのアッセイは、本発明のモノクローナル抗体を利用する。ＮＲＩｇについてのそれらの特異性のため、これらの抗体は、例えば巧妙な酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＩＡ）からエレガントで単純な放射免疫拡散（ＲＩＤ）アッセイにいたる範囲の種々の方法によって、非常に広範囲の臨床的状況において腎臓病の検出で特に有用である。本明細書で使用する免疫学的用語は、通常の用法及び定義に合致すると信じられる。いずれかの現在予測されない混乱が起きれば、特に断りのない限り、用語の解釈はＷｉｌｌｉａｍＥ．Ｐａｕｌ，ＦｕｎｄｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）、ＲａｖｅｎＬｔｄ．，ＮｅｗＹｏｒｋによるよく知られた教科書におけるその定義及び用法に合致させるべきである。読み手の便宜のため、いくつかの出版物を本議論で引用する。これらの引用は本発明が関連する技術の水準をより十分に記載するが、これらの引用を含めることは、いずれも本発明に関する先行技術を表すことを許すものではない。現在実施されている腎臓病の臨床的診断は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の、及び血漿中のクレアチニンのレベルの観察された変化、ならびに尿分析で検出された異常及び尿生成量にほとんど絶対的に頼っている。これらのテストは存在する腎臓損傷を明らかにするには有用であるが、それらは将来の腎臓損傷を予測するには有用ではない。本議論は、固有の腎臓病の履歴のない個々の患者のみならず、特に、その全身病が、それらの病気の進行の間のある時点で、腎臓に影響する患者において、その発生の非常に初期の、すなわち、その発端形態の腎臓病を正確に検出するにおいて臨床家及び研究者が直面するような困難を説明するのに役に立つ。この臨床的現象の広い生起に関わらず、また問題となる広範な臨床的及び実験室的研究に関わらず、ほとんどの腎臓病の根底にある病理的メカニズムは知られていない。腎臓に影響し得る病理学的疾患の広い生起を仮定すれば、それらの一次病の合併症としてのネフロパシーを個人が発症する信頼性に関して予測するのに使用できる測定可能な物質の単純で非侵入的な診断テストが依然としてないのは驚くべきである。初期ネフロパシーのためのかかる診断テストは、臨床的介入が引き続いての腎臓損傷の程度を依然として制限する場合、「初期警告シグナル」を構成するはずである。この目的に向けて、ベータ−２−ミクログロブリン等の低分子量血漿蛋白質の測定に、又は腎臓損傷が起こった場合に尿に放出されるＬ−アラニンアミノペプチダーゼ（ＡＡＰ）及びＮ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）等の種々の腎臓酵素の測定に、多大な努力が払われてきた。これらのテストはおくの有用な情報を提供してきたが、それらは限定された適用しか有しなかった。何故ならば、それらは腎臓障害の原因及び部位に関して非特異的であるのみならず、テスト蛋白質は尿中で非常に安定ではないからである。さらに、種々の酵素阻害剤及び他の干渉性物質が通常尿に存在し、これがこれらのテストの特異性及び有用性をかなり低下させる。非侵入的テストの有用性を改良するために、尿に存在する特異的腎臓抗原の免疫学的測定を開発して、ネフロパシーの発生のみならず腎臓障害の部位及び重症度を判断してきた。例えば、Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ及びＧｌａｓｓｏｃｋ（ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｌ３：３０９−３１４、１９７３）は、濃縮されたヒト尿中の近位細管刷子縁上皮抗原を同定するための免疫拡散技術を開発した。Ｚｅｇａｒ及び同僚は、尿中の近位腎臓細管上皮抗原（ＨＲＴＥ−１という）のためのラジオイムノアッセイを開発した。しかしながら、この抗原は腎臓以外の器官で検出し得るので、該アッセイ（Ｎｅｐｈｒｏｎ２６：７−１２，１９８０）は特異性を欠くものであった。多数の研究者が、血清及び尿中の特異的腎臓−関連抗原の存在を検出するプローブとしてのモノクローナル抗体の使用を報告してきた（Ｓａｃｈｓｅら、ＣｌｉｎＣｈｉｍＡｃｔａ１１０：９１−１０４、１９８１；Ｍｉｃｈａｅｌら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｌ２４：７４−１９８３；Ｔｏｌｋｏｆｆ−Ｒｕｂｉｎ，ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｌ２９：１４２−１５２，１９８６）。これらの抗体の使用は、ネフロパシーの部位及び程度双方を測定する定量的手段を提供した。尿の系列的試料は容易に得られるので、このアプローチは腎臓病の段階及び活動度、ならびに療法に対するその応答性をモニターすることを可能とした。例えば、腎臓病において腎臓刷子上皮細胞から尿に放出される、１２０Ｋａの近位細管抗原、アデノシンデアミナーゼ結合蛋白質（ＡＢＰ）を検出するためのモノクローナル抗体の使用は米国特許第４，７３１，３２６号に記載されている。しかしながら、尿中の腎臓蛋白質の存在を検出するための多数のこれらのアッセイの欠点は、検出されるべき抗原が初期腎臓病の非常に初期のプリディクターとしては有用ではなく；むしろ、該アッセイは臨床的に明白なネフロパシーのタイプ及び位置を測定するのに一義的に有用であるということである。糖尿病を持つ患者の群において、患者のほぼ３５パーセントが腎臓病を発症し、糖尿病の開始のほぼ１５年後に末期腎臓病まで進行する。生憎と、これらの患者における腎臓病は、通常、尿中の過剰の（アルブミン等）血清蛋白質に執拗に存在する、現在使用されているマーカー、及び血中クレアチニンの上昇したレベルによって診断される時点までには、非常に進行しており、不可逆的である。糖尿病患者の尿中の「アルブスティックス（ａｌｂｕｓｔｉｘ）」−陽性蛋白質血症（マクロ蛋白質血症及びマクロアルブミン血症としばしばいわれる疾患）は、通常、明白な臨床的ネフロパシーの存在を信号する。また、この進行した段階の腎不全を呈する患者の多くは、上昇した血圧を有する。病気進行においてこの段階で採取した腎臓バイオプシーは、通常、腎臓に対する進行した不可逆的な構造損傷を示し、この損傷は蛋白質血症の生起によってそれが臨床的に検出されるかなり前に腎臓に存在するようである。マクロ蛋白質血症のこの後期検出とは対照的に、幾人かの研究者は、非常に少量のアルブミン（ミクロアルブミン血症）の尿中での検出は腎臓病に対するより感度のよいマーカーであるという注意を促してきた（例えば、ＭｏｇｅｎｓｅｎＣＥ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ３９：７６１−７６７，１９９０参照）。生憎と、運動、血中糖レベルの貧弱な制御及び他の代謝アンバランスは糖尿病対象においてアルブミン分泌を非特異的に増加させ、それにより、これらの個体における初期腎臓病の信頼できる単一のマーカーとしてのミクロアルブミン血症の臨床的価値を低下させる。さらに、熱心な運動それ自体は幾人かの健康な個体の尿中でミクロアルブミン血症を誘導するのに十分である。腎臓損傷が臨床的問題となる前でさえ、ネフロパシーの発生の開始段階と特異的に関連する物質を検出するためのテストを有するのは大きな臨床的利益であろう。かなりま腎臓損傷が起きる前に適当な療法を開始できるようなネフロパシーのかかる初期検出は臨床的に重要である。腎臓病が実験群で初期に検出されると、成功した療法の結果、進行性腎臓病の安定化となる。明らかに、はっきりとした臨床的集団内のネフロパシーの初期検出から生じるべき非常に大きな利益は、ミクロアルブミン血症よりも特異的な検出システムの開発に仕向ける。腎臓病用の初期マーカーとしてのＮＲＩｇの使用の可能性は高度に重要である。腎臓病の初期発生のインジケーターとしての患者の尿中のアルブミン以外の蛋白質マーカーについてのテストは、腎臓病の開始と種々の病気のうちいずれかを持つ患者に散発的に起こり得る運動−誘発又は偶然のアルブミン血症との間を医師が区別できるようにする。また、末期腎臓病についての特異的マーカーは、臨床的試行において治療様式をモニターし評価するのに高度に有益であろうし、また、かかる療法から益を受ける高度に危険な患者を同定するであろう。発明の概要本発明において、「体液」なる用語は検出可能な量の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含有するいずれのかかる流体も含む。一般に、かかる流体は尿、血清及び血漿を含む（後者は単に消費される凝固因子が除去されていない血清である）。尿は本発明で用いるのに特に好ましい体液である。涙、唾液及び他の粘液分泌物は体液であって、通常、ＩｇＡ免疫グロブリン分子のみを含有する一方、それらは免疫複合体、又はＩｇＧ又はＩｇＭイソタイプいずれかの免疫グロブリン分子を含有し得る。もう１つの体液としての脳脊髄液は稀に免疫グロブリンを含有し、ルーチン的実験のためのその使用は、感染のかなりの危険性及び／又はかかる流体を得るのに利用される侵入的手法に伴う出血のため、極めて非現実的である。以下の議論のうちかなりは臨床的に確認された糖尿病を持つ患者での研究に焦点を当てる。というのは、これは臨床的病理学的存在であり、ここに、本発明の新規なネフロパシー−関連蛋白質が発見された。しかしながら、本発明の新規ネフロパシー−関連蛋白質は糖尿病以外の種々の臨床的病理学における初期腎臓病（例えば、アミロイドーシス；高血圧；及び全身性エリテマトーデスを含めたリウマチ学的障害）の初期ディテクターとしても関連し、そのうえ、腎臓移植を受けた患者において器官拒絶のインジケーターでもある。本発明によると、腎臓病の臨床的徴候のない多数の患者を含めた、初期ネフロパシーを持つ患者の体液中で蛋白質マーカーが見出された。このマーカーの存在はネフロパシーの開始及び進行と正確に相関する。「ＲｈＣ」免疫複合体−捕獲試薬を用い、本発明のネフロパシー−関連マーカー蛋白質はまず末期腎臓病を持つ糖尿病患者からの循環免疫複合体（ＣＩＣ）の一部として単離された。得られた複合体は本発明の実施形態を構成する。かかる複合体において、ネフロパシー−関連ＮＲＩｇ蛋白質は該ＣＩＣの必須成分である。ＮＲＩｇ及びその調製は後記にてより詳しく議論する。略言すると、ＮＲＩｇは約１５０，０００ダルトン（以後、「１５０ｋＤａ」）の分子量を有し、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。これは非常に予測されなかった。何故ならば、糖尿病ネフロパシーの免疫学的基礎は全く確立されていないからである。さらに予測されなかったのは、引き続いてネフロパシーを発症する患者の体液中のこのＮＲＩｇ蛋白質マーカーの初期徴候前出現であった。この予測されない現象は本発明のネフロパシーの初期検出のための免疫学的アッセイの基礎を形成する。かかる免疫学的アッセイは適当な特異性を持つ抗体、好ましくは、本発明により提供され、後記にてより詳細に議論するモノクローナル抗体に依存する。これらの抗体の全てはＮＲＩｇ分子上の区別される抗原性抗原決定基につき高度に特異的である。ＮＲＩｇは免疫原性蛋白質であり、ホムリクローナル及びモノクローナル抗体の生産を誘導するにおいて有用なユニークな抗原性抗原決定基を発現する。かかる抗体生産では、ＮＲＩｇは精製形で使用するのが好ましく、かかる形態において本発明の実施形態を構成する。精製形において、ＮＲＩｇ糖蛋白質は、この蛋白質を＞１μｇ／ｍｌまで特異的に濃縮する手法によってその天然状態から取り出される。特異的抗体の生産では、ＮＲＩｇの濃度は＞１０μｇ／ｍｌであるのが好ましい。精製ＮＲＩｇで適当な宿主動物を免疫化した結果生産された抗体は、ＮＲＩｇで発現された抗原決定基に特異的にかつ非常に高い親和性をもって結合することができる。本発明の抗体の結合親和性は、一般に、少なくとも１０６リットル／モル、好ましくは少なくとも１０８リットル／モル、より好ましくは１０９リットル／モルである。要約すると、ＮＲＩｇはネフロパシー−関連障害に罹った宿主生物の体液に由来する。かかる臨床的障害の発生に際して、天然免疫原性ＮＲＩｇ蛋白質が宿主生物の血清及び尿を含めたいくつかの体液で見出される。特に重要なのは、腎臓病の臨床的徴候が出現する前でさえ、天然ＮＲＩｇが、個体の血清及び尿で見出すことができ、これはＮＲＩｇを、初期腎臓病のディテクターとしてのみならず腎臓病の発生の感度のよい初期プリディクターとしても有用とする。本発明によりモノクローナル抗体を生産するにおいて、本発明のＮＲＩｇ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を合成し分泌するハイブリドーマ細胞系を確立した。かかるモノクローナル抗体の生産における最初の工程として、常法プロトコルに従って動物宿主を免疫化して、ＮＲＩｇに対する抗体を産生する（プラズマ細胞としても知られている）特異的免疫リンパ球の発生を誘導する。同一動物種に由来する骨髄腫細胞に関する常法実験プロトコルに従って、これらのリンパ球を免疫化宿主から回収し、融合させて巨大体細胞ハイブリッドを形成させる。元来はＧＫｏｈｌｅｒ及びＣＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５− ４９７，１９７５）によって報告されているこれらのハイブリッド融合プロトコルは、一般に、当業者に知られている。細胞−細胞ハイブリッドは融合で使用された両親細胞の特徴を呈し：悪性骨髄腫親のように、融合細胞ハイブリッドは組織培養において迅速かつ不規則に増殖する能力を有し；加えて、それらは融合に参加した正常抗体−分泌リンパ球親の遺伝子によって特定される大量の抗体を分泌する能力を有する。これらのハイブリッド細胞系は「ハイブリドーマ」と呼ばれる。適当な選択及びクローニングの後、それらを組織培養中、又は不定期間、遺伝的に同一もしくは免疫無防備動物中で増殖させて、ＮＲＩｇに対する抗体を連続的に産生させる。本発明の確立されたハイブリドーマ細胞系の１つはＩｇＭイソタイプの免疫グロブリンを分泌し、ハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ−１０４９０として、メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。本発明のもう１つの確立されたハイブリドーマ細胞系はＩｇＧ１イソタイプの免疫グロブリンを分泌し、ハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ−１０４９１としてＡＴＣＣに寄託された。これらの細胞系は本発明の実施形態を構成する。本発明のもう１つの実施形態において、少なくとも２つの抗体を要するサンドイッチ型イムノメトリックアッセイで有用な異なるイソタイプの少なくとも２つの抗体を含む一組の抗体も提供される。抗原決定基に結合する特異的かつ高い親和性を呈するかかる抗体は本発明のヒトＮＲＩｇ上でユニークに発現された。この組はＮＲＩｇに対する高親和性を持つ抗体の均一調節物よりなるのが好ましい。本発明の特に好ましい実施形態はかかる抗体の一組を含み、ここに、少なくとも１つはマクログロブリンタイプのネズミ由来モノクローナル抗体であり、ＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ−１０４９０によって生産されたモノクローナル抗体と同等の免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）イソタイプであり、この組の少なくとも１つの他の抗体はＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ−１０４９１によって生産されたモノクローナル抗体と同等の免疫グロブリンＧタイプ１（ＩｇＧ）イソタイプのネズミ由来モノクローナル抗体である。一般に、使用される必要があるのは２つのＮＲＩｇ−特異的抗体のみである。この組の各抗体は異なる抗原性部位につき特異的であって、従って、標的ＮＲＩｇ分子上の異なる抗原決定基に結合するので、モノクローナル抗体の該組は、体液中のＮＲＩｇの存在及び／又は濃度の測定にために、通常の「２−部位」又は「サンドイッチ」イムノメトリックアッセイ技術で使用するのにユニークに適合する（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号及び第４，４８６，５３０号参照）。それらがあるアッセイで容易に検出できるように、本発明の抗体は放射能、蛍光、又は酵素マーカーを含めた種々の標準的物質のうちいずれかで標識することができる。かかる標準的マーカーの例は以下のものである。１．放射能：トリチウム、炭素−１４、リン３２、ヨウ素−１２５；２．蛍光：フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド；３．酵素：ホースラディッシュペルオキシダゼ、アルカリ性ホスファターゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼこれらのマーカーで抗体を標識し、かかるマーカーを検出する方法は後記にてより詳細に議論するが、一般的には当該分野でよく知られている。本発明のイムノメトリックアッセイのあるものを行うには、不溶化形態のＮＲＩｇ−特異的捕獲試薬（すなわち、本発明の抗体、又はＲｈＣ）を使用する必要がある。かく使用される場合、かかるＮＲＩｇ−捕獲試薬は不溶化されるか、あるいはそうでなければ種々の標準固定化基材上に支持される。捕獲試薬が付着される材料の例はガラス、合成ポリマー、合成樹脂、セルロース及び種々の金属である。これらの捕獲試薬を付着させる手法は、使用される剤及び基材に応じて変化するが、一般に、当該分野でよく知られている。固体マトリックスに対する抗体の結合方法のいくつかは、ＥＨａｒｌｏｗ及びＤＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，５１１−５５２頁，１９８８に議論されている。しかしながら、ＲｈＣに関しては、プラスチック製ミクロテストプレート（例えば、Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡによって製造された「Ｉｍｍｕｌｏｎ−２」）へのＲｈＣの結合には、後記にて十分に議論するごとく、臨界的条件が必要であることは予期せぬことに見出されたことに注目すべきである。略言すれば、これらは、プラスチック表面へのＲｈＣの固定化の間における特別に調製された（トリス−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル− １，３−プロパンジオールを含有する）トリス緩衝液の使用、ならびに該プロセスは固定化工程の間に２５℃近くの雰囲気温度でなされなければならないという要件である。抗体又はＲｈＣが付着されるべき又はそうでなければ不溶化されるべき不活性材料は、平坦であるかあるいは皿又はマルチウェルプレートのような便宜な形態に成型された膜又はシートのような広範な連続的形態を有し得るか、あるいは所望のサイズの不連続的粒子又はビーズの形態とし得る。ＮＲＩｇは多数のイムノメトリックアッセイで検出できる。本発明の特に好ましい実施形態において、腎臓病の初期連取つのための単純で、経済的で、感度がよく、かつ信頼性のあるアッセイが提供され、ここにＲｈＣがＮＲＩｇ蛋白質につき特異的な捕獲剤として使用される。固定化されたＲｈＣはテスト試料中でいずれかのＮＲＩｇを捕獲しそれに結合する。ＮＲＩｇに対する免疫学的特異性を呈する標識抗体を、次いで、試料に添加して、ＲｈＣ蛋白質に結合したいずれのＮＲＩｇの存在をも確認しマークする。かくして、この実施形態によると、工程：（Ａ）ＲｈＣ蛋白質が不活性基質に結合して固定化ＲｈＣ試薬（この試薬は未標識である）を形成するのを可能とする条件下で、分析すべき体液中に不溶な該基質にＲｈＣ蛋白質を接触させ；（Ｂ）体液試料を固定化試薬と接触させて、固定化ＲｈＣ蛋白質試薬及びテスト試料に存在していたかも知れないいずれかのＮＲＩｇを含有する不溶化複合体を形成させ；（Ｃ）これらの不溶化複合体を該ＮＲＩｇに結合する第１の抗体と接触させ（この第１の抗体は標識されているか又は未標識であってよい）、（１）該第１の抗体が標識されている場合は、該不溶化複合体に結合した標識抗体の量又は未反応標識抗体の量を測定し；（２）該第１の抗体が未標識である場合、該第１の抗体に特異的にかつそれだけに結合する標識された第２の抗体に該第１の抗体を接触させ、該第１の抗体に結合した標識された第２の抗体の量又は未反応標識第２抗体の量を測定し、次いで、（Ｄ）テスト試料からの不溶化複合体に結合した標識抗体の量を、工程（Ａ） −（Ｃ）に従って調製した陽性又は陰性対象試料からの不溶化複合体に結合した標識抗体の量に関連付けて体液中のテスト試料中におけるＮＲＩｇの存在又は濃度を決定する；を含む体液のテスト試料中のＮＲＩｇの存在の判定方法が提供される。かくして、要約すると、本発明は、抗原性物質、ＲｈＣ蛋白質及びＲｈＣ蛋白質以外の異なる部位で抗原に結合した抗体の複合体を形成させることを含む、ネフロパシーの引き続いての発症に関連した抗原性物質の存在又は濃度を、体液の試料中にて、測定するイムノメトリックアッセイ方法を提供する。この複合体は、体液試料を固定化ＲｈＣ蛋白質と接触させ、続いてＮＲＩｇに対する結合特異性を有する抗体と接触させることによって形成される。本発明のもう１つのアッセイは、捕獲剤としてＮＲＩｇ特異的抗体を使用することを含む。かかるアッセイの例は酵素結合イムノソルベント検定法ＩＥＩＡであり、これはＮＲＩｇに対して特異的であってＮＲＩｇを捕獲するために不活性基質に固定化されたポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いる。次いで、ＮＲＩｇにつき特異的な第２のポリクローナル又はモノクローナル抗体を試料に添加して、第１の抗体に結合したＮＲＩｇの存在を確認しマークする。この第２の抗体は通常のＥＩＡプレートリーダー（例えば、Ｄｙｎａｔｅｃｈ自動ＥＩＡプレートリーダー、ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，バージニア州）による検出に適した酵素で標識される。固体支持体に結合した未標識抗体としてＥＩＡアッセイで使用される抗体及び可溶性標識抗体として使用される抗体は、通常、２以上の異なるモノクローナル抗体、すなわち、単一の抗原部位に対して特異的であってユニークな細胞系に由来するクローンによって別々に産生された各抗体である。好ましい実施形態において、固体支持体に結合した抗体として使用されるモノクローナル抗体は、標識抗体で使用されるモノクローナル抗体であるというよりも異なる細胞系の産物であって、２つのモノクローナル抗体は、相互から離れた部位でＮＲＩｇに結合して抗原への他のものの結合に干渉しないように選択される。ＮＲＩｇの検出に適したＥＩＡアッセイにおいて前記モノクローナル抗体の組を利用するのが便宜であることが判明した。略言すると、このアッセイは以下のごとくに行われる。ａ．ＮＲＩｇにつき特異的な精製ＩｇＭモノクローナル抗体をＥＩＡプレートのウェル中で１時間ないし２４時間インキュベートし、続いてウェルを徹底的に洗浄して全ての未結合抗体を除去することによって、該抗体を該ウェルにコートする。ｂ．ＮＲＩｇ含量につきテストすべき体液を、Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）中で１：５に希釈する。次いで、希釈したテスト検体を３７℃にてＥＩＡプレートの適当なウェル中で１ないし２時間インキュベートするＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで徹底的に洗浄することによっていずれかの又は全ての未結合蛋白質をテストウェルから除去する。ｃ．アッセイ系についてのバックグラウンドを定義するにおいて、健康な個体からの実質数の体液検体をテスト試料中に含ませなければならず、陰性対照として用いる。これは、使用すべき実験条件下でアッセイ系で起こる正常応答の範囲についての情報を提供する。ｄ．ＮＲＩｇにつき特異的な本発明の第２のユニークなモノクローナル抗体はＩｇＧ抗体である。それをＥＩＡプレートの全ての適当なウェルに添加し、３７℃で少なくとも１時間インキュベートする。ｅ．ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで過剰の（未結合）ＩｇＧ抗体を洗い落とし、ペルオキシダーゼ酵素結合ヤギ抗−マウス抗体を全てのテストウェルに添加し、３７ ℃で１時間インキュベートする。ｆ．ＥＩＡプレートを再度徹底的に洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＮＲｏｓｅ，ＨＦｒｉｅｄｍａｎ及びＪＦａｈｅｙ：ＭａｎｕａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Imｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，ＷｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ：ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｒｏｂｉｏｌｏｇｙＰｒｅｓｓ，１０５−１０７頁，１９８６参照）のような適当な酵素基質と共にプレートを３７℃で０．５−１時間インキュベートすることによって、ウェルに結合した酵素活性を測定する。抗原−結合酵素及びその基質の反応によってウェル中で生じた反応生成物の量を、ＴＭＢについての４５０ｎｍのように、特別の酵素−基質反応生成物に適した吸収波長でＥＩＡリーダーで全プレートをスキャンすることによって定量する。ｇ．個々のウェル中の酵素色変化の存在及び強度は、そのウェル中の体液の試料に元来存在するヒトＮＲＩｇの量に直接比例する。かくして、要約すれば、該ＥＩＡアッセイは、工程：（Ａ）ＮＲＩｇに特異的な第１の抗体が不活性基質に結合して固定化第１抗体を形成するのを可能とする条件下で、体液中に不溶な該基質に該第１の抗体を接触させ，（Ｂ）体液試料を固定化第１抗体と接触させて、第１抗体及び試料に存在するいずれかのＮＲＩｇの不溶化複合体を形成させ；（Ｃ）不溶化免疫複合体を、第１抗体によって結合されるものとは異なる抗原部位においてＮＲＩｇに結合する第２の抗体に接触させ（この第２の抗体は標識されているか又は未標識であってよい）、（１）該第２の抗体が標識されている場合は、該不溶化複合体に結合した標識抗体の量又は未反応標識抗体の量を測定し；（２）該第２の抗体が未標識である場合、（ａ）該第２の抗体に特異的にかつそれだけに結合する標識された第３の抗体に該第２の抗体を接触させ、該第２の抗体に結合した標識抗体の量又は未反応標識抗体の量を測定し、次いで、（Ｄ）テスト試料からの不溶化複合体に結合した標識抗体の量を、工程（Ａ） −（Ｃ）に従って調製した陽性又は陰性対象試料からの不溶化複合体に結合した標識抗体の量に関連付けて体液中のテスト試料中におけるＮＲＩｇの存在又は濃度を決定する；ことを含む体液のテスト試料中のＮＲＩｇの存在の判定方法である。加えて、標的ヒトＮＲＩｇ蛋白質は、放射免疫拡散（ＲＩＤ）アッセイによって検出することができる。このアッセイは、体液の同一試料中のミクロアルブミン血症及びＮＲＩｇ双方の同時検出及び定量のために設定される。このアッセイの調製における第１の工程として、適当に希釈された抗体又はＮＲＩｇに対する抗体の組合せを、アッセイ容器の一部中のアガロースゲルに懸濁させ、適当に希釈された抗体又はアルブミンに対する抗体の組合せを別々にアッセイ系のもう１つの一部中のアガロースゲルに懸濁させる。テストすべき体液のアリコットを、異なるアガロースタイプの各々に個々に切断された小壁に適用する。希釈された体液試料がアガロースに拡散するにつれ、体液中の抗原の濃度に比例するウェルの中央からの距離に、沈殿のリングが形成される。先に測定された標準曲線によって、免疫拡散リングの直径を、テストすべき体液中のＮＲＩｇの又はアルブミンの濃度に定量的に関連付けることができる。（ＷＰａｕｌ，ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，第３３８頁，１９８９に議論されているように）寒天中で抗原を沈殿させるそれらの増強された能力のため、ポリクローナル抗体が好ましい。また、本発明の範囲内に含まれるものでは、体液のテスト試料中のＮＲＩｇの存在又は濃度の検出のための阻害アッセイを使用することができる。かかるアッセイにおいて、既知量のＮＲＩｇ及びモノクローナル抗体をＮＲＩｇを含有することが疑われる試料と接触させる。既知抗体及び既知ＮＲＩｇの間の免疫複合体の形成が阻害される程度は、アッセイすべきテスト試料に存在するＮＲＩｇ抗原と競合する量に直接比例する。阻害アッセイの好ましい実施形態において、抗−ＮＲＩｇ抗体は溶液状であり、ＮＲＩｇ抗原は、例えば、赤血球細胞又は目に見える凝集を形成するのを可能とするサイズのラテックス粒子等の不溶性粒子に結合させる。いずれもの競合ＮＲＩｇ抗原の不存在において、溶液に存在する抗−ＮＲＩｇ抗体はＮＲＩｇ−被覆粒子が凝集し、目に見えるクランプ（本発明では、以後、凝集体という）を形成するようにする。ＮＲＩｇ抗原を含有することが疑われる体液のテスト試料を抗−ＮＲＩｇ抗体及び結合したＮＲＩｇ抗原と混合し、凝集体形成の阻害が、抗体と凝集体を形成できない可溶性ＮＲＩｇ抗原との間の複合体化のために起こる。凝集体の減少は、比濁法等の濁度測定技術を用いて測定できる。本発明のアッセイのいずれにおいても、全てのアッセイはＮＲＩｇの存在又は濃度を検出するのに用いることができ、すなわち、それらはＮＲＩｇを各々定性的に又は定量的に検出し又は測定するのに用いることができることが理解されるべきである。かくして、前記及び後記でで用いる「測定」又は「測定する」、及び「検出」及び「検出する」なる用語はアッセイの定性的及び定量的態様を共にカバーすることを意味する。発明の詳細な説明ネフロパシー−関連免疫グロブリン蛋白質（ＮＲＩ）ＮＲＩｇは、当該蛋白質を生じるネフロパシー−関連障害に罹った宿主生物の体液中で上昇したレベルで見出される。それは正常で健康な個人では上昇したレベルでは見出されない。以下の議論は糖尿病を持つ患者での研究に焦点を当てる（これは本発明のネフロパシー−関連蛋白質が発見された病気だったからである）が、本発明を糖尿病のみに限定する意図ではない。本発明の範囲内には、この蛋白質が形成されるいずれの病気も含まれる。この新規なＮＲＩｇ蛋白質が出現する病気の中には血管硬化症に関連するものがある。これらの病気は糖尿病、高血圧、及びとりわけアミロイドーシスのようなリウマチ病のいくつかである。「血管硬化症」とは、生物学的病巣の部位で起こる生物学的修復過程の間にコラーゲン及び繊維芽細胞を身体が析出する場合に起こる微小血管形成のいずれの生理学的瘢痕及び妨害も意味する。ＮＲＩｇの特徴罹患率本発明のＮＲＩｇ蛋白質は末期病の糸球体硬化症を持つ全ての糖尿病患者の尿中で高濃度で起こることが判明している。また、ミクロアルブミン血症及びほぼ１５年以上の病気継続を持つ糖尿病患者、慢性高血圧を持つ患者及び金療法を受けている慢性関節リウマチを持つ患者のような腎臓病を発症する高い危険性がある患者において高頻度であることも判明している。また、予測されないことには、ＮＲＩｇは、腎臓病又はミクロアルブミン血症の臨床的実験室的証拠のない糖尿病のほぼ２０％の尿で見出されている（範囲、Ｉ型糖尿病の２１％及び１１型糖尿病の１９％）；これらの患者におけるＮＲＩｇの出現は、臨床的に検出できない初期ネフロパシーが存在するいい指標となろう。これは、患者の尿中のアルブミンのレベルが正常な低レベルからマクロレベルまで増大するにつれ、それらの尿中にＮＲＩｇを持つ患者のパーセンテージも、末期腎臓病の危険の増大と正確に平行して、劇的に増大することを示すデータによって支持される。従って、ＮＲＩｇは明白な腎臓病の切迫した発症の価値あるプリディクターであるようである。異なるレベルのアルブミン血症の、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病患者及び高血圧を持つ患者におけるＮＲＩｇの分布頻度を表１にまとめ、そこでは、正常レベルから「マクロ」レベルまでのアルブミン血症の増加は末期腎臓病を発症する大いに増大した危険性に直接対応する。＊この実験における全ての高血圧患者は最低８年続いた慢性高血圧を有していた。全てのものは正規の臨床訪問にて無作為に選択した。最も重要なことには、腎臓移植を受けた糖尿病患者の尿中のＮＲＩｇの上昇したレベルは、同種移植における低下した腎臓機能の初期徴候に正確に相関し、それにより、切迫する腎臓不全及び／又は拒絶のプリディクターとして有用である。アルブミン及び全免疫グロブリン（Ｉｇ）を尿中に出現させる濾過機構からは独立した選択的濾過機構によってＮＲＩｇは尿中に出現する；すなわち、腎臓の損傷又は病気は尿を隠さないで侵入させるという単純な理由で、濾過糸球体に存在するのとは反対に、ＮＲＩｇは、ＮＲＩｇ蛋白質に対する特異的受容体を介して血液から腎臓の濾過糸球体に能動的に輸送される。従って、選択的濾過のため、ＮＲＩｇの尿中濃度は同一ドナーからの血清に見出されるＮＲＩｇのレベルと相関せず、また尿中の全（受動的に分泌された）Ｉｇの濃度にも相関しない。ＮＲＩｇは、血清ならびに尿中の免疫複合体で検出されている。しかしながら、ＮＲＩｇの検出可能な血清レベルは丁度前記したごとく腎臓病の存在を予測するのに有用ではなく、他方、尿中のＮＲＩｇの検出可能なレベルは腎臓病を予測するものであった。物理的特徴ＮＲＩｇは分子量ほぼ１５０ｋＤａのユニークなヒト球状蛋白質であって、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）として知られている球状糖蛋白質のクラスにある。いくつかのヒトＩｇＧサブタイプの各々にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれることが見出されている。（他の免疫グロブリンを含めた）他の球状蛋白質上では発現されない抗原決定基（エピトープ）をユニークに発現する。従って、ＮＲＩｇは、ＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ−１０４９０によって産生されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ−１０４９１によって産生されるモノクローナル抗体、及びウマ由来免疫複合体結合ＲｈＣ蛋白質とのその反応性によって区別される。後記にて示すごとく、ＮＲＩｇは前記した試薬のいずれか１つに結合するか、あるいは前記した試薬の２又は３に同時に結合する。ＮＲＩｇの化学的還元は、ＮＲＩｇ分子の折り畳み解除を引き起こし、その結果、ＡＴＣＣハブノドーマ細胞系ＨＢ−１０４９２からのモノクローナルＩｇＧ抗体との結合の喪失となり；これは、これらのモノクローナル抗体が、ＮＲＩｇ分子の折り畳み形状によって決定されるエピトープに結合していることを示す。ＡＴＣＣハブノドーマ細胞系ＨＢ−１０４９０からのモノクローナルＩｇＭ抗体の結合はＮＲＩｇのかかる化学的還元によって変化されない。ＮＲＩｇは安定であって、−２０℃で少なくとも２４ヶ月貯蔵凍結された尿試料で測定することができる。ＮＲＩｇの同定ＡＴＣＣハブノドーマ細胞系番号ＨＢ−１０４９０によって産生されたモノクローナル抗体でプロブーブした、腎臓病を持つ患者からの尿のウェスタンブロットは、市販の抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ及びＨ及びＬ鎖特異的）でも同定された１５０ｋＤａバンドを示し、これは、ＮＲＩｇの免疫グロブリン性質を確認する。さらに、プロテイン−Ｇアフィニティーカラムは、ＡＴＣＣハブノドーマ細胞系番号ＨＢ−１０４９０及びＨＢ−１０４９１からのモノクローナル抗体によって認識されるネフロパシー−関連ＮＲＩｇ蛋白質に結合した（すなわち、それを捕獲した）。プロテイン−Ｇカラムに結合した蛋白質が選択的に溶出されると、前記モノクローナル抗体を用いるウェステンブロットによって検出されるごとく、これらのカラムからの溶出物は１５０ｋＤａ蛋白質を含有した。本発明で有用なハブノドーマ−由来モノクローナル抗体はユニークであって、開発するのに３年を要した。これらの抗体を産生するネズミハイブリドーマ細胞系は、ＧＫｏｈｌｅｒ及びＣＭｉｌｓｔｅｉｎによって議論され、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４７４、１９７５で報告されているプロセスによって得ることができた。ハイブリドーマ細胞系本発明のプロセスにおいて、動物（好ましくはマウス又はラット）をＮＲＩｇ抗原を含有する調製物で免疫化する；これは、血清からの循環免疫複合体を含有する調製物、又は高濃度のＮＲＩｇを分泌する患者の尿から単離した精製ＮＲＩｇの調製物であり得る。ＮＲＩｇ免疫原の最初のイン・ビトロ投与から５週間以上後に、免疫原の第２投与量を与える。もし抗原の第２投与量をほぼ３週間より早く投与すると、免疫化反応は当該動物で消失するであろう。ハイブリドーマ産生モノクローナル抗体は、２つの細胞タイプ：１）免疫化動物から得られ、それ自体は組織のそれのような人工的環境では非常に短時間しか生きられない（プラズマ細胞と呼ばれる）抗体産生リンパ球；及び２）抗体を作成しないが非常によく増殖する能力を有し、「限定されない」期間組織培養基中にある骨髄腫細胞と呼ばれるリンパ系腫瘍細胞の体細胞融合によって生じる。融合プロセスで使用される骨髄腫細胞は、失われた酵素を供する正常な抗体産生プラズマ細胞と融合した骨髄腫細胞のみが細胞培養の選択的条件下で生き残るように、（プリン−合成酵素欠乏等）薬物−感受性マーカーにつき選択された細胞系変異体である。首尾よく融合した細胞ハイブリッドの選択用の通常細胞培養基は、化学物質ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地である（普通、「ＨＡＴ」培地と呼ばれる）。この選択培地では、未融合骨髄腫親細胞は死滅し、未融合プラズマ親細胞はそれらの短時間寿命のため結局は死滅し、融合したハイブリッド細胞は無限に増殖する。細胞融合で利用される骨髄腫細胞系は、ＧＫｏｈｌｒ及びＣＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６）によって記載されているごとくＢＡＬＢ／ｃマウスＭＯＰＣ−２１骨髄腫に由来する。骨髄脛細胞系はＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１として同定される。融合は、抗体産生プラズマ細胞ないしは骨髄腫細胞を含有する単核細胞の懸濁液を培養基中で混合し、細胞懸濁液を遠心して細胞ペレットを形成することによって行われる。次いで、ペレット中の細胞をポリエトレングリコールであり得る融合剤を含有する増殖培地中でインキュベートする。融合を行うための適した技術はＥＨａｒｌｏｗ及びＤＬａｎｅによる「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１３９−２４３頁，１９８８」と題された教科書に記載されている。次いで、ＮＲＩｇ上の抗原決定基のみに向けられた抗体を合成し分泌するハイブリドーマを培養して、比較的安定した遺伝構成を持つ連続的増殖細胞系を確立する。得られた種々の細胞系をクローン化して、培養からの細胞が単一の細胞のみに由来したことを確認する。細胞系又はクローンを、細胞培養容器中で、又は同遺伝子型もしくは免疫欠陥宿主中でイン・ビボにて無限で増殖させ、ＮＲＩｇ抗原に対するモノクローナル抗体を分泌させる。次いで、通常の沈殿、イオン交換又はアフィニティークロマトグラフィーを含み得る手法によって、抗体を培養細胞の上清流体から、又は組織適合宿主動物の腹水流体から回収する。本発明によって得られたハイブリドーマはＩｇＭ抗体又はＩｇＧ抗体いずれかを産生でき、後者は多価である。「ＴＭＤＮＭ３」としてＯｍａｈａのＵｎｕｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｅｂｒａｓｋａＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒで同定された細胞系培養はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１０４９０が与えられている。この細胞系はＩｇＭイソタイプのモノクローナル抗体を産生し、この抗体はＮＲＩｇ蛋白質上の決定基と高い親和性をもって反応する。加えて、「ＴＭＤＮＧ２」としてＵｎｕｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｅｂｒａｓｋａＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒで同定された細胞系培養はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１０４９１が与えられている。この細胞系はＩｇＧ１イソタイプのモノクローナル抗体を産生し、このＩｇＧ抗体はＮＲＩｇ蛋白質上の決定基と高い親和性をもって反応する。本発明により、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１０４９０及び番号ＨＢ−１０４９１、ならびにメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたこれらのハイブリドーマ細胞系から直接的に（例えば、反復された娘細胞由来培養）又は間接的に（例えば、後記にて定義するいずれかの「第２世代」由来培養）を問わずそれらの子孫が提供される。また、本発明により、前記ハイブリドーマ細胞及びそれらの子孫に由来するいずれかのｍＲＮＡ及びいずれかのＤＮＡ分子、ならびにこれらのｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡ分子の使用に由来し得るいずれかの遺伝子工学産物が提供される。かかる産物は、限定されるものではないが、いずれのモノクローナル抗体及びそれらの抗原産生断片も含み、また原核細胞及び／又は真核細胞宿主生物、又はかかる宿主生物のいずれかの組合せを用いて前記ポリクローナル、モノクローナル、又はキメラ抗体又はその抗体断片を生じさせることを含むプロセス特に含めたいずれかの遺伝子工学プロセスにおいてこれらのｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡ分子を使用することによって生成し得るいずれのキメラ抗体又はその抗体断片も含む。遺伝子工学作成の抗原−結合抗体断片の生産方法の例はＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１，１９８９に開示されたものである。「キメラ抗体」なる用語は、抗体分子の異なる部分が、少なくとも２つの遺伝的に異なる宿主生物から得られた遺伝情報によってコードされる遺伝的工学作成抗体分子を意味する。例えば、キメラ抗体は、抗体分子の抗原結合部位を除く全ての構造をコードするヒト遺伝子配列を採取し、それらを、抗体分子の高度に特異的な抗原結合部位につきコードするマウス遺伝子配列と組み合わせることによって構築することができる。組み合わせたヒト／マウス遺伝情報は、適当な生きた宿主生物に導入されると、遺伝子工学作成のキメラ抗体を作成するようにその生きた生物に指示する。子孫の「間接的」誘導とは、種々の通常の抗原結合アフィニティー手法のいずれかによって、ａ）ＮＲＩｇに特異的なポリクローナル抗体、及び／又はｂ）ＮＲＩｇ上の抗原決定基に特異的な新しいモノクローナル抗体を産生するのに使用できる新しい（又は「第２世代」）ハイブリドーマの開発で有用な免疫リンパ球いずれを生成するために動物における免疫原として新たに単離されたＮＲＩｇを用い、患者由来の尿のようなＮＲＩｇ含有体液の新しい試料からのＮＲＩｇ蛋白質を単離するためにモノクローナル抗体（例えば、ＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系ＨＢ −１０４９０及び／又はＨＢ−１０４９１によって産生されたもの）を使用するいずれのプロセスも意味する。ＡＴＣＣ細胞系から直接得られた子孫を培養しサブクローンすることによって、あるいは前記したごとく「第２世代」ハイブリドーマを調製することによって、あるいは前記したような遺伝子工学手法によって開発されたかを問わず、ＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系番号ＨＢ−１０４９０又はＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系番号ＨＢ−１０４９１から得られた全てのハイブリドーマ抗体産生細胞系を網羅するのが本出願人の意図するところである。モノクローナル抗体本発明の免疫原性ＮＲＩｇ糖蛋白質はポリクローナル及びモノクローナル抗体の生産を誘導するのに有用なユニークな免疫原性決定基を発現する。従って、かかる抗体はそれらの抗原決定基に特異的に結合させるのに有用である。本発明の１つの実施形態において、本発明のヒト・ネフロパシー−関連球状蛋白質（ＮＲＩｇ）上の抗原決定基のみに向けられる結合の特異性を呈する異なるイソタイプの２つの抗体を含むモノクローナル抗体の組が提供される。該組の１つの抗体は免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）イソタイプのマクログロブリン抗体である。この抗体は、分子当たり５対の抗−ＮＲＩｇ結合部位（合計して１０の抗原結合部位）を有する５量体であり、ＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ −１０４９０によって産生される。該組のもう１つの抗体は、分子当たり１対の抗−ＮＲＩｇ結合部位（合計した２つの抗原結合部位）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）イソタイプの抗体である。このＩｇＧモノクローナル抗体はＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ−１０４９１によって産生される。前記モノクローナル抗体は非常に高い親和性をもって、すなわち、少なくとも１０９リットル／モルの結合親和性定数でもってＮＲＩｇに結合する。「高い親和性」及び「少なくとも１０９リットル／モルの結合親和性定数」なる用語は相互に交換して使用できる。この免疫反応性結合についての親和性定数は未だ直接的には測定されていないが、非常に高いことが知られている。というのは、ＮＲＩｇ蛋白質の及びいずれかの前記モノクローナル抗体の結合によって形成されたいずれの免疫複合体も、モノクローナル抗体及びＮＲＩｇが実質的に分離されるためにはほとんど変性条件に暴露しなければならないからである。本発明の高−アフィニティー抗体産生貯蔵細胞系の利用性を仮定すれば、本発明の該蛋白質に対する新しい及び同等の抗体は、「第２世代」抗体の調製としても知られている「抗体ゼロックシング」と呼ばれるプロセスを含む手法によって調製できることは当業者に明らかであろう（Ｍｕｒａｎｏら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ４８：４５８８−４５９６、１９８８）。従って、ＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系番号ＨＢ−１０４９０から、又はＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系番号ＨＢ−１０４９１から直接的に又は間接的に由来する全てのポリクローナル及びモノクローナル抗体を網羅するのが本出願人の意図するところである。ＮＲＩｇに対する「第２世代」抗体の単離は以下のものと実質的に同等の免疫学的手法を含む。１．前記ＡＴＣＣ培養の１つから直接的に又は間接的に得られた抗体を不活性基材に結合させ、それにより、該抗体をその基材に固定化し、アフィニティーマトリックスを作成し、これを用いて、ネフロパシーを持つ患者からの尿のような、ＮＲＩｇを含有することが疑われる生物学的溶液からＮＲＩｇを捕獲し単離すること；２．ＮＲＩｇ−含有生物学的流体を抗体被覆基材とをインキュベーションし、このインキュベーションの間、ＮＲＩｇを、アフィニティーマトリックスに特異的に吸着させ、固定化抗体に堅固に結合したままにする。任意および全ての非結合蛋白質は、抗体被覆基材から簡単に洗い流され、アフィニティーマトリックスに結合したＮＲＩｇ蛋白質のみが残り；３．アフィニティーマトリックスからのＮＲＩｇを溶出し、その後標準の実験室手順によって濃縮し、動物の免疫化に使用される標準手順によって別の宿主（マウスまたはラットのような）に注射し；４．このような免疫化動物宿主（マウスまたはラットのような）の脾臓から得た抗体産生血漿細胞を単離し、ハイブリドーマの生成のための標準融合手順を使用することによってこれらの血漿細胞と「不変」骨髄腫細胞とを融合し；５．検出、およびＮＲＩｇ上で抗原原生決定基に指向されたモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞培養をクローニングする。これらの新たに誘導されたハイブリドーマクローンは、「第二世代」モノクローナル抗体と示されるモノクローナル抗体を分泌し、これらの抗体は、ＮＲＩｇ上で抗原を結合する特異性について、ＡＴＣＣハイブリドーマ・セルラインＨＢ−１０４９０およびＨＢ−１０４９１によって産生される抗体に実質的に等しい。ＮＲＩｇのアッセイ以下の実施例によって示される通り、ＮＲＩｇは、二重抗体サンドイッチＥＩＡアッセイ、ＮＲＩｇを捕捉するのにモノクローナル抗体の代わりにＲｈＣを使用したＥＩＡ、およびラジカル免疫拡散（ＲＩＤ）アッセイを含めた多数の様々なアッセイで体液のサンプルで検出される。これらの実施例で、溶液中の百分率として試薬の内容物は、特に記載しない限り、溶液の液量当たりの重量を意味する（例えば、１％溶液は、１００ｍｌの溶媒当たり１グラムの試薬に等しい）。実施例１体液から得たＮＲＩｇ肝障害関連蛋白質の単離およびＮＲＩｇへのモノクローナル抗体の産生以下の実施例は、本発明の新規ＮＲＩｇ蛋白質がどのように確認されるか、腎臓疾患を有する個人の血清のような選択された体液から続いて単離されるかを例示する。それは、どのように本発明の特別なモノクローナル抗体が発生されるかをも例示する。ＮＲＩｇは、それ自身免疫原生分子であるので、最終段階の腎臓疾患に罹った患者の血清で見られる循環免疫複合体（ＣＩＣ）の構成成分として最初に単離された。血清は、腎臓透析中の６名の患者の各々から得られた。１０名のタイプＩおよび６名のタイプＩＩの糖尿病患者が、区別なくこの研究に含まれた。全ては、わずかに２年間の腎臓透析下にあり、それらの血清中の免疫複合体のレベルを上昇した（５倍の正常値の低さから２０倍の正常値までの範囲内）。ＣＩＣを、ＲｈＣの固相法によって単離し、既定の患者から得た全ての単離複合体は、１つの容器に貯蔵され、冷凍された。同様に、糖尿病に完全に関連しない疾患に罹っているか、または正常で健全な個人である１６名の「対照」個人の血清から得たＣＩＣは、固相ＲｈＣ法によって単離され、上述の通り個々に貯蔵され、冷凍された。これらの複合体を単離する上で記述された固相ＲｈＣ法は、基本的に以下の通りに行われた。ＲｈＣ免疫複合体を捕捉する蛋白質は、ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８に可溶化され、その各ウエルはおよそ直径３５ｍｍ、深さ１２ｍｍ（ＦａｌｃｏｎＰｌａｓｔｉｃｓ第３０４６号、ＬｉｎｃｏｌｎＰａｒｋ、ＮＪのＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬａｂｗａｒｅから入手）である、６穴培養プレートの穴の各々の平面のプラスチック製表面に固定化した。各個別の患者（糖尿病または「対照」のいずれか）から得た５ｍｌの血清を、トリス／ツイーン緩衝液、ｐＨ８（すなわち、５ｍｌ血清＋２０ｍｌ緩衝液）で１：５に希釈し、各希釈血清サンプルの１ｍｌを、個々の提供者当たり総数２５ウエルを利用して（患者当たり５プレート）別々のＲｈＣ被覆ウエルに載せた。３７℃で１時間湿潤チャンバーでインキュベートした後、希釈血清を各ウエルから分液し、そのウエルをトリス／ツイーン緩衝液で繰返し洗浄して、あらゆる未結合蛋白質を除去し、プレート上にＲｈＣに結合したＣＩＣのみを残した。樹脂上にＲｈＣによって捕捉された、血清由来のＣＩＣを、水中の０．１％酢酸０．５ｍｌで、３７℃で１５分間溶出させた。代わりに、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する４Ｍ尿素を、同じ時間と温度で、結合ＣＩＣを溶出するのに使用した。既定提供者から得た２５穴の各々から溶出したＣＩＣを、その後貯蔵し、２０００分子量遮断を示すＡｍｉｃｏｎの濾材（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ０１９１５）のＡｍｉｃｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで透析によって濃縮した。その後、各提供者から得た貯蔵し濃縮したＣＩＣを、使用するまで冷凍した。ＣＩＣの混合液から抗原を特異的に同定し、単離するために、強力な腎臓障害関連蛋白質のためのアフィニティー試薬として使用できる抗体を製造することが決められた。糖尿病患者から得られた複合体中の抗原に特異性のある抗体を製造するために、最初に、対照の非糖尿病提供者から単離された免疫複合体で動物宿主を寛容化し、それによって全免疫複合体で生じる共通の構成成分でマウスを寛容化させることが計画された。これを行うために、１６名の対照の非糖尿病の提供者から得たアリコート量のＣＩＣを、別々に解凍し、その後懸濁液に貯蔵し、この貯蔵の対照ＣＩＣから得た１００ｕｇの蛋白質を抽出物を、０日目で５つのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜腔（腹部領域）に注射した。２４時間後（１日目）、免疫化した動物に、対照ＣＩＣに曝すことによって活性化した全ての免疫リンパ球に結合し、殺す化合物であるシクロホスファミドを注射させた。シクロホスファミド（体重の５０ｕｇ／ｋｇで）を、対照ＣＩＣに曝すことによって活性化された全てのリンパ球が宿主動物から排除されることを確実にするために、３日目、再度５日目に与えた。３週間動物を休ませた後、これらの寛容化動物を、糖尿病の個人から得たＣＩＣで免疫化した。この材料中の「正常」と定義されるものと「正常でない」ものを「前選択」することによる結果に偏りをもたせないことが重要であるので、糖尿病のＣＩＣ貯蔵からいわゆる「正常」蛋白質を除くための吸収は、動物の免疫化でそれらの複合体を使用する前には行われない。全ての１６名の糖尿病患者からアリコート量のＣＩＣを貯蔵させ、正確に２００ｕｇのこの貯蔵ＣＩＣ混合液を、各動物の首の後ろで皮下に完全フロイントアジュバントと一緒に注射し２週間後、これらの動物を、不完全フロイントアジュバント中の正確に１００ｕｇの糖尿病ＣＩＣで追加刺激した。７日後、その動物を虚血させ、それらの脾臓を、ＧＫｏｈｌｅｒおよびＣＭｉｌｓｔｅｉｎの標準ハイブリドーマ融合法に使用した（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７、１９７５）。融合の結果として生成されたハイブリドーマのスクリーニングは、それらが、「アルブスチックス（Ａｌｂｕｓｔｉｘ）」のディップスチックアッセイ（すなわち、それらの尿中３００ｕｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの蛋白質の範囲で）１＋から２＋までの範囲にある安定した巨大タンパク尿症を示すことによって測定されるときに、臨床的に腎臓障害が確認されている６名の糖尿病患者から得た尿の蛋白質で被覆されたＥＩＡプレート上でのそれらの反応性によって陽性ハイブリドーマを同定するために設定された。ＥＩＡプレートは、ｐＨ９．６重炭酸塩緩衝液中で１ウエル当たり最終濃度１ｕｇの尿蛋白質を用いて、標準融合物で被覆された。その腎臓障害が、糖尿病に関連しない７名の対照患者（４名の患者は、胸部癌腫のシスプラチン治療のために、化学的に誘導された腎臓障害を示し、３名は、狼瘡のために、糸球体腎炎を示した）から得た尿を使用した同様の方法で被覆されたＥＩＡプレートを使用したネガティブスクリーニングが設定された。５回の別々の融合実験後発生された８０００以上の別々のハイブリドーマ生成ウエルをスクリーニングした後、糖尿病ＣＩＣ被覆ＥＩＡウエルと反応性を示すが、対照ＣＩＣ被覆ＥＩＡウエルとは反応性を示さない総量１２個の混合ハイブリッド培養物を、さらなる研究およびクローニングを見越して、選択し、冷凍した。対照ＣＩＣより糖尿病について最も高い程度の特異性を示したこれらの培養物の４つを、限定希釈分析の標準法によって続いてクローン化させた。４つの混合ハイブリドーマ培養物から得られたクローン化ハイブリッドについて４０００以上の別々のスクリーニング試験を行い、その試験から、糖尿病由来のＣＩＣと高いアフィニティー結合を示すが、対照ＣＩＣとは結合しないモノクローナル抗体を産生する２つのハイブリドーマ・セルラインを選択した。これらのハイブリドーマの一方は、ＩｇＭ抗体を産生し、他方は、ＩｇＧ１抗体を産生した。これらのモノクローナル抗体が指向された、貯蔵糖尿病由来のＣＩＣの分子構造中の特定の標的抗体は、まだ知られていなかった。肝臓疾患を有する糖尿病患者から得た多数の尿中の蛋白質は、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって物理的に分離され、その後ウエスタン・ブロッティングと呼ばれる方法で、両方の抗体を用いて調べた。抗体は、市販の抗ヒトＩｇＧ抗体（ＦｃおよびＨ、およびＬ鎖特異性）で特異的に同定されもしたおよそ１５０，０００ダルトンの分子量を示すゲル上のバンドを同定した。さらに、唯一免疫グロブリンＧ分子のみが接着するプロテイン−Ｇアフィニティーカラムが、糖尿病の尿から、両方のモノクローナル抗体によって認識される蛋白質を捕捉した。最後に、これらのプロテイン−Ｇカラムから溶出物は、ウエスタン・ブロット上でモノクローナル抗体で検出される１５０ｋＤａ蛋白質を含有した。実施例２本発明のＮＲＩｇ腎臓障害関連蛋白質に対するポリクローナル抗体の製造免疫物質を生きた宿主に導入したとき、宿主の免疫系は、その物質上で認識可能な部位の全てに対する抗体を産生することによって応答する。宿主体中の多くの異なる部位から得た多くの様々な抗体産生細胞は、それによりそれらが活性化された免疫原生物質の一部に対する抗体を生成するものであり、各抗体産生クローンは、外来物質上で唯一１つの抗原原生エピトープに対する抗体の１つのタイプのみを生成する。免疫原生物質についての異なるアフィニティーおよび特異性の抗体の広範な範囲の生成で生じる免疫化宿主によるこの非常に広範な応答は、ポリクローナル抗体応答と呼ばれる。ＮＲＩｇについてのイムノメトリックアッセイが、標的抗原の免疫沈降が必要とされる放射状免疫拡散（ＲＩＤ）アッセイでのように、ハイブリドーマ産生モノクローナル抗体でよりもポリクローナル抗体でより効果的に行われうる状況がある。以下の予測例は、どのようにポリクローナル抗体が、本発明のＮＲＩｇ腎臓障害関連蛋白質に対して、ウサギまたはニワトリのいずれかで育成されるかを例示する。宿主としてのウサギ。実施例１で概説された方法を使用して得られた精製ＮＲＩｇは、０．８ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２中に４００ｕｇ蛋白質を含む溶液として製造され、同量の完全フロイント・アジュバント（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩのＤｉｆｃｏ）で十分に混合され、均質な乳様の白色懸濁液が得られるまで超音波処理される。２３ゲージの針を具備した１ｍｌシリンジを使用して、同量の０．２ｍｌを、大形のニュージーランド白色ウサギの各足の頂部にある筋肉塊に注射する。この手順を３回繰り返す。一回目の注射は、２週間後、２回目と３回目のブースター接種は、１回目のブースター接種でのＮＲＩｇと同じ量、および２回目と３回目のブースター接種での抗原の半分の量を使用して、４週間の間隔で行われた。これらのブースター接種の各々は、使用されたアジュバントに対する過敏ショック反応を誘発するのを避け、筋肉内注射の部位に肉芽腫が形成するのを避けるために、不完全フロイント・アジュバントで製造される。免疫化手段の進行を監視するために、血液サンプルは、免疫化（これから、対照、バックグランドの血清サンプルが得られる）の始まる直前、その後、この日程で各々が免疫化される直前に宿主ウサギから取出される。３番目のブースター注射（免疫化ブロトコールの１０週の初めに投与された）後、動物を、その間に、宿主ウサギの抗体応答が、主としてＩｇＧ抗体を産生するものに成熟するものである、さらに４から８週間休ませる。さらに、産生されるべきＩｇＧ抗体のアフィニティーは、ブースター注射継続の数、当初の免疫化照射が増加した後の時間で明らかに増加する。免疫化日程の第１４週で、その後、免疫ウサギは、試験用の血清サンプルを得るために混合され、その後、不完全フロイント・アジュバント中のＮＲＩｇ（４つの注射部位の間で平等に分配された１００ｕｇ抗原）のブースター接種を与えた。１週間後、５０ｍｌの血液が、その動物の耳の縁の血管から取出されて、この発明のＮＲＩｇ蛋白質に対して指向された、高濃度の高アフィニティーＩｇＧ抗体を含むおよそ２５ｍｌの免疫血清の量を供する。注意して、この多量の血液は、必要である限り長く同じ提供動物から１月ごとに取出すことができる。この方法で調製されたウサギのポリクローナル抗体は、本発明のヒトＮＲＩｇ蛋白質上の抗原部位について高い結合アフィニティーを示すのみでなく、そのポリクローナル由来のため、ヒトの組織および体液で見られる全てのヒトＩｇＧ抗体分子に共通する多くの抗原性部位についての高い結合アフィニティーを示す。ＮＲＩｇ蛋白質に特有の抗原に特異性があるポリクローナル・ウサギ抗血清を製造するために、できるだけ多くの共通の抗原に対する抗体を取除く必要がある。これを行うために、ウサギのポリクローナル抗血清を、ヒト・ポリクローナル免疫グロブリン（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙのヒト・コーンフラクションＩＩのような）であるアフィニティーカラムを通したカラムクロマトグラフィーによって濾過した。ヒト免疫グロブリン分子で見られる共通抗原に対するウサギ抗体は、カラムに結合を残し、一方、ＮＲＩｇ上の抗原原生エピトープに対する抗体が、カラムを通過し、溶出物に収集され、それは、その後、２０００の分子量を遮断するアミコンの超濾過材で透析することによって濃縮される。このアフィニティー・クロマトグラフィー法は、ウサギのポリクローナル抗血清が、もはや正常なヒトＩｇＧ標品（コーンフラクションＩＩのような）と反応しないが、ＥＩＡアッセイでＮＲＩｇと反応を続けるまで繰返された。この点で、ポリクローナル抗血清を、再度アミコン超濾過によって濃縮し、その後、残る抗ＮＲＩｇ抗体の濃度およびアフィニティーを測定するために試験する。宿主としてのニワトリ。哺乳類蛋白質に対するポリクローナル抗体の代替源としてニワトリを使用することは、記載されている（Ｐｏｌｓｏｎら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ９：４９５−５１４、１９９０；Ｇｒａｓｓｍａｎら、ＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌ４：２５２８−２５３２、１９９０）。免疫化後、ポリクローナル抗体は、トリ宿主の卵黄に高濃度で見られる。Ｇａｓｓｍａｎらによると、特異的抗体の源としてニワトリを使用することの利点は、１月にニワトリで産生される抗体の量が、ウサギで産生されるものより約１８倍であるということである。２０から３０ｕｇの哺乳類蛋白質は、ニワトリに優れた免疫応答を誘導するのに十分である。ＮＲＩｇ抗原は、０．１ＭＮａＣｌを含有する０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で、７５０ｕｌの最終量まで希釈され、同量の完全フロイント・アジュバント（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）のＤｉｆｃｏ）で超音波処理することによって乳化される。十分に混合された懸濁液（１．５ｍｌ）を、ブラウン・ワーレンまたはホワイト・レグホーン卵抱雌鳥の胸部筋肉に、２つの部位で注射する。完全フロイント・アジュバントで上に記載される通り乳化された、ＮＲＩｇ蛋白質の追加の注射を、最初の注射後、１２日目および２０日目に投与した。免疫した宿主の卵を、毎日収集し、印をつけ、使用するまで４０℃で保存した。特異的抗−ＮＲＩｇ抗体は免疫化後ほぼ２０日で卵黄に出現し、３０日後にプラトーに達し、少なくとも８１日まで高いままでいるはずである。免疫グロブリン数グラムを、１の免疫化雌ニワトリからの６０個の多さの卵から抽出することができる。卵黄免疫グロブリンから特異的抗−ＮＲＩｇ抗体を単離するには、製造業者の指示（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に従ってＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂに精製蛋白質を結合させる（カラム当たり０．２ｍｇ蛋白質）。該カラム（０．５ｍｌ）に１０ｍｇの精製ニワトリ卵黄免疫グロブリン（正確にＧａｓｓｍａｎらによって報告されているように単離）を負荷し、製造業者の指示に従って溶出させる。ほぼ１００ないし１３０ｍｇの特異的抗体がニワトリ卵黄免疫グロブリン数グラムから得ることができる。実施例３酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＩＡ）においてＮＲＩｇを捕獲し同定するモノクローナル抗体の能力以下の実施例は、ＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系番号ＨＢ−１０４９０によって産生され、固体マトリックスに結合したモノクローナル抗体が小容量の尿からＮＲＩｇを捕獲できたこと、及びＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系番号ＨＢ−１０４９１によって産生され、酵素マーカーで標識されたモノクローナル抗体が、第１の抗体に結合したＮＲＩｇを、サンドイッチタイプのＥＩＡアッセイで特異性をもって同定できたことを示す。ＥＩＡアッセイプレートこのＥＩＡで使用する好ましいアッセイプレートは、Ｄｙｎａｔｅｃｈ（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌ１ｙ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）によって製造された平坦底部を持つ９６−ウェルの「Ｉｍｍｕｌｏｎ−２」ミクロテストプレートであった。モノクローナル抗体精製ＮＲＩｇ蛋白質上で発現されたユニークな抗原決定基に対して、ネズミ宿主において、２つのモノクローナル抗体を生起させた。１つのモノクローナル抗体はマクログロブリンＩｇＭイソタイプのものであり、ＡＴＣＣ受託番号１０４９０を有するハイブリドーマ細胞系によって産生され；第２のモノクローナル抗体はガンマグロブリンＩｇＧイソタイプのものであり、ＡＴＣＣ受託番号１０４９１を有するハイブリドーマ細胞系によって産生された。両抗体は非常に高い親和性をもってＮＲＩｇ標的分子に結合し（すなわち、＞１０９リットル／モル）、同一分子上の異なるエピトープを明らかに認識する。炭酸塩／炭酸水素塩コーティング緩衝液最終濃度０．０１５Ｍまでの炭酸水素ナトリウム及び最終濃度０．０３５Ｍまでの炭酸一ナトリウムを含有するこの緩衝液は以下のごとくに調製した；０．７８グラムの炭酸水素ナトリウム及び１．４５グラムの炭酸一ナトリウムを脱イオン水５００ｍｌに添加した。最終溶液のｐＨは９．６である。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液温和な洗剤を含有する緩衝液をＥＩＡアッセイの洗浄工程で使用する場合、蛋白質間の非特異的相互作用が示される。この緩衝液は以下の最終濃度：０．００２Ｍリン酸一ナトリウム、０．００８Ｍリン酸二ナトリウム（無水物）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０洗剤の試薬を含有する。この緩衝液は、０．２８ｇのリン酸一ナトリウム、１．１３ｇのリン酸二ナトリウム（無水物）、８．７７ｇの塩化ナトリウム、及び０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ− ２０を１リットルの脱イオン水中で混合することによって調製した。徹底的に混合して全ての塩を溶解させた後、ｐＨを中性に調整した（ｐＨ７．０−７．２）。ジエタノールアミン緩衝液９７ｍｌのジエタノールアミン及び１００ｍｇの塩化マグネシウムを８００ｍｌの脱イオン水に添加した。これに、ｐＨが９．８になるまで１Ｍ塩酸数滴を添加し、しかる後、脱イオン水を最終容量１リットルまで添加した。この光感受性緩衝液を使用するまで４℃で暗所で保存した。アッセイ用のホスファターゼ基質リン酸パセニトロフェニルニナトリウム塩はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯから５ｍｇ錠剤として入手した（Ｓｉｇｍａ１０４ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＴａｂｌｅｔｓ）。使用するこの基質を調製するには、１つのホスファターゼ基質錠剤を、暗所で、時々温和に混合しつつ、５ｍｌの冷ジエタノールアミン緩衝液に徹底的に溶解させた。錠剤が十分に溶解した後、使用直前に溶液を室温まで加温した。アルカリ性ホスファターゼ結合抗体マウスＩｇＧのＦｃ断片に対して特異的に向けられた結合を持つアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギＩｇＧ抗体はＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから購入した。ＥＩＡアッセイ手法バックグラウンドＡＢｘバッチ抽出ブロトコル（ＪＴＢａｋｅｒのＰｒｏｄｒｕｇｓｆｏｒＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙカタログ，１９８８−８９の１２１−１２３頁；ＪＴＢａｋｅｒＣｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮｅｗＪｅｒｓｅy)を用いることによって、ＡＴＣＣ細胞系ＨＢ−１０４９０からのモノクローナル抗体をハイブリドーマ組織培養流体から精製した。該ＡＢｘマトリックスは４０ミクロンのサイズであった（４０μｍ「Ｐｒｅｐｓｃａｌｅ」ＡＢｘと命名）。モノクローナル抗体を炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液に１０μｇ／ｍｌに希釈した。また、ＨＢ−１０４９０からのＩｇＭ抗体は、４０％硫酸アンモニウム溶液中での沈殿、続いてのリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）に対する透析によって腹水流体から精製した。次いで、透析した溶液をプロテイン−Ｇカラム（ＧｅｎｅｘＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に通して、腹水流体に含有されたいずれの汚染ネズミＩｇＧ分子も除去した。次いで、カラム溶出物を収集し、炭酸塩／炭酸水素塩コーティング緩衝液中に１μｇ／ｍｌまで希釈した。ＨＢ−１０４９０からの希釈抗体１００μｌをＥＩＡプレートの各ウェルに添加し、該プレートを被覆し、３７℃でインキュベートした。２時間後、該プレートをインキュベーターから取り出し、直ちに使用するか、あるいは使用２日前まで室温で保存した。該プレートのウェルを各々ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で５分間にて２回洗浄した。ＥＩＡプレートの各ウェルに、１００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液を添加し、続いて、別の適当なウェルに２５μｌの尿検体を添加した。各検体を三連でテストした。ウェル中の溶液を、プレートを数回穏やかにたたくことによって混合し、プレートを被覆し、３７℃でインキュベートした。３７℃での１．５時間後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液で２回洗浄した（洗浄当たり５分間）。ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１０４９１からのモノクローナル抗体は、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢｘバッチ抽出ブロトコル（ＪＴＢａｋｅｒＣｏｍｐａｎｙ）によって精製し、（ＮＲｏｓｅ，ＨＦｒｉｅｄｍａｎ及びＪＦａｈｅｙ，ＭａｎｕａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ：ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＰｒｅｓｓ，１７−１９頁，１９８６に概説されているように）標準的な放射免疫拡散分によって測定されるごとく、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液中に２．５−３．０μｇ／ｍｌまで希釈した。このＩｇＧ抗体１００μｌをＥＩＡプレートの各ウェルに添加し、プレートを被覆し、次いで、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄溶液としてＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液を用い、プレートを各々５分間で２回再度洗浄した。酵素結合ヤギ抗−マウス抗体をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液に１：５０００まで希釈し、１００μｌをＥＩＡプレートの各ウェルに添加し、その後、プレートを被覆し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で各々１分間にて２回再度洗浄した。次いで、各ウェルに１００μｌの新たに調製した基質（３，３’−ジアミノベンジジン）を添加し、続いて３７℃で正確に１時間インキュベートした。各ウェル中の第２抗体に結合した酵素結合ヤギ抗マウス抗体の量に比例する、各ウェル中での発色の量は、４０５ｎｍの吸収波長に設定した「ＥＩＡプレートリーダー」と呼ばれる自動分光計（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）でプレートをスキャンすることによって定量した。各個々のウェルについてプリントアウトした光学密度（Ｏ．Ｄ．）読みは、そのウェル中の試料溶液によって吸収された光の量に直接比例する数であった；すなわち、Ｏ．Ｄ．が高くなるにつれ、分析すべきウェル中の流体によって吸収される光の量は大きくなった。さらに、ウェル中で吸収された光の量はそのウェル中で元来結合したＮＲＩｇの量に直接比例した。従って、ウェルについてのＯＤ読みが高くなるにつれ、体液のその試料中のＮＲＩｇの量は高くなった。表２に示すごとく、患者からの、及び健康な個体からの尿中でのＥＩＡＯ．Ｄ．測定の範囲は劇的であった。例えば、正常で健康な個体の尿は０．２００の低い読みを超えないＯ．Ｄ．範囲を有した一方で、進行した全き腎臓病に罹った患者からの尿は２．５００ないし３．０００の範囲の高いＯ．Ｄ．範囲を有した。その間において、（それらの尿中での臨床的に検出可能な蛋白質の存在によって定義される）種々の段階のネフロパシーを持つ患者は０．２２０ないし２．７５０の範囲のＥＩＡＯ．Ｄ．読みを有した。従って、ＮＲＩｇについてのＥＩＡにおける陽性読みは０．２を超えるいずれかのＯ．Ｄ．測定であると判断された。ＮＲＩｇ陽性ＥＩＡはＯ．Ｄ．＞０．２００と定義される。ａＯ．Ｄ．＝三連で検定した検体からの任意単位での平均値ＮＲＩｇについての陽性アッセイを構成するものが何かを決定したが、臨床的に確認されたネフロパシーを有する個体の尿でこのＮＲＩｇが生じた頻度を決定するのが重要であった。表３に示すごとく、確立されたネフロパシー又は末期腎臓病（ＥＳＲＤ）を持つ３３の糖尿病患者につき、ＮＲＩｇは尿の１００％中の上昇したレベルで検出可能であった。本発明のネフロパシー−関連ＮＲＩｇ蛋白質はＩｇＧイソタイプの免疫グロブリンであるので、共通するＩｇＧ血清蛋白質が尿検体で見出される頻度を測定し、一旦それがなされたら、ネフロパシー−関連ＮＲＩｇ蛋白質の存在が臨床的に確認されたネフロパシーを持つ患者からの尿中におけるこの広い範疇のＩｇＧの存在にとにかく相関したかを決定するのが重要であった。ａ長年の糖尿病、マクロ蛋白質血症、上昇した血清クレアチニン、上昇した血中尿素窒素（ＢＵＮ）表４中のデータによると、免疫グロブリンは、テストした１９２のＩ型糖尿病患者のうち７９の尿（＝４１％）、及びテストした１６４のＩＩ型糖尿病患者のうち５０の尿（＝３０％）に存在した。（腎臓病のレベルの直接的インジケーターであるべき）尿に存在する」アルブミンの量のような単一のネフロパシー−関連危険因子がやはり尿試料の評価に因子化されると、表４のデータは、（尿中のアルブミンのより高いレベルによって示されごとく）ネフロパシーがより進行するにつれ、それらの尿試料でＩｇＧが同時に見出されるのがより普通となることを示す。しかしながら、極端な蛋白質血症の場合においてさえ（尿１ｍｌ当たりアルブミン＞２００μｇ）、患者の６６％のみがそれらの尿においてＩｇＧの上昇したレベルを有していた（すなわち、４μｇ／ｍｌを超える）ことに注意すべきである。従って、それ自体、尿におけるＩｇＧの存在はネフロパシーの存在又は程度の有用なインジケーターではない。ａＩｇＧ濃度が４μｇ／ｍｌより大きい場合に、尿はＩｇＧにつき陽性であるとみなされた。ＮＲＩｇはＩｇＧ分子のクラスにあるので、表４に表されたＩｇＧ−陽性尿の例の多くが如何に検出可能なレベルのＮＲＩｇを同時に含有したかを測定するのが重要であった。表５のＥＩＡデータによると、それらの尿中にＩｇＧを持つ７９のＩ型及びＩＩ型患者のほぼ半分がそれらの尿中にやはりＮＲＩｇを有した。しかしながら、それらがやはり有するアルブミンのレベルのさらなるネフロパシー−関連危険因子に従ってこれらのＩｇＧ−陽性尿検体をカテゴリー化すると、非常に劇的な観察がなされた；マクロアルブミン血症を持つ全てのＩ型及びＩＩ型糖尿病の９０％を超えるものがやはりそれらの尿中にＮＲＩｇを有した。異なるレヘルのアルブミンでのＩｇＧ−陽性尿におけるＮＲＩｇの生成予期せぬことに、腎臓病又はミクログロブリン血症の臨床的実験室的証拠なく患者のほぼ２０％の尿に上昇したレベルのＮＲＩｇも見出された（範囲、Ｉ型糖尿病の２５％及びＩＩ型糖尿病の１７％）；これらの患者におけるＮＲＩｇの出現は、臨床的に検出不可能な初期ネフロパシーが存在したことを示すようであった。これは、患者の尿中のアルブミンのレベルが正常の低レベルからマクロレベルまで増大するにつれて、それらの尿中にＮＲＩｇを持つ患者のパーセンテージは、末期腎臓病の危険性の増大と正確に平行して、やはり劇的に増大したことを示すデータによって支持された。従って、ＮＲＩｇは、明白な腎臓病の初期発生の価値あるプリディクターであるようであった。異なるレベルのアルブミン血症の、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病患者、及び高血圧を持つ患者におけるＮＲＩｇの分布頻度は表６にまとめ、ここに、正常レベルから「マクロ」レベルへのアルブミン血症の増加は末期腎臓病を発症する大いに増大した危険性に直接的に対応する。＊この実験における全ての高血圧患者は最低８年間続く慢性高血圧を有していた。全ては正規の臨床訪問にて無作為に選択した。これらのデータは、尿中のＮＲＩｇの存在が、アルブミン血症の程度のようなただ１つのさらなる危険因子と同時に測定されると、ＮＲＩｇはこの個体におけるネフロパシーの程度の非常に有用なインジケーターとなったことを示す。患者をネフロパシーに罹りやすくする糖尿病における非常に重要な因子は、その患者が糖尿病を有した時間の長さである。Ｉ型糖尿病患者におけるＮＲＩｇの発生を病気の持続と比較し、また尿中に存在するアルブミンの量とも比較した。これは重要である。というのは、糖尿病患者における腎臓病の臨床的証拠は、典型的には、糖尿病の約１５年持続の後に起こること、及びミクロアルブミン血症は患者を末期腎臓病を発生する高危険群に追い込むことが知られているからである。表７に示すごとく、ＮＲＩｇ−陽性患者の頻度は蛋白質血症のレベルとは無関係に糖尿病の持続に従って増大した。ミクロアルブミン血症を有する糖尿病患者群において、ＮＲＩｇの頻度は、５年未満の持続を有したものについての１４％から１５−２０年病気を有した後のものについてのほとんど６０％間で増加した。それらの尿中にアルブミンを有しなかったＮＲＩｇ−陽性糖尿病の最高のパーセンテージは、６−１０年の病気持続を有したに過ぎない患者で生じた。ＮＲＩｇの頻度は、２０年の糖尿病を有した後でさえ蛋白質血症を発症しなかった２８患者のたった７％まで低下した；この範疇の糖尿病は腎臓病の低発生率しか有しないことが知られている。この群におけるＮＲＩｇ−陽性尿の低発生率はこの後者の点に一致する。正常な尿アルブミンを有するＮＲＩｇ−陽性患者はミクロアルブミン血症に、そして結局は末期腎臓病まで進行することを証明する不十分なデータが現時点ではある。しかしながら、現在利用できるデータは、尿中のＮＲＩｇの発生は腎臓病のマーカーであって、糖尿病集団におけるその罹患率は疫学的罹患率研究から予測されたネフロパシー−関連「マーカー蛋白質」についての結果と一致することを示す。これらのデータは図１のグラフにまとめる。実線は疫学的研究から予測された糖尿病の異なる持続におけるアルブミン血症の頻度を表す。グラフは、１０−１５年持続の間に、全てのＩ型糖尿病のほぼ５０−６０％がミクロアルブミン血症を発症するであろうことを示す。ミクロアルブミン血症を発症する患者のうち、ほぼ７０％が、尿中に分泌されるアルブミンのかなり高いレベルによって特徴付けられるであろうより進行したネフロパシー（マクロアルブミン血症）に向けて進行するであろう。生憎と、１５−２０年間糖尿病を有した、及びマクロアルブミン血症を発症した患者の９０％が末期腎臓病を発症するであろう。糖尿病の異なる持続における、及び蛋白質血症の異なるレベルにおける本研究でのＩ型糖尿病におけるＮＲＩｇの頻度はハッチを施した棒によって図１に示される。棒の頂部の数は腎臓病が進行する場合の所与の持続におけるＮＲＩｇ−陽性患者のパーセントである。それらの糖尿病の持続と比較した、ＩＩ型糖尿病患者におけるＮＲＩｇの発生を示すデータは、Ｉ型患者につき前記で示したものと同様であり、表８に示す。腎臓機能に関連するいくつかの因子を同時に考慮すると、尿中のＮＲＩｇの存在とネフロパシーの存在との間の相関は極端に強くなった。例えば、血清クレアチニンのレベルを尿中のアルブミンのパーセントに加えて考慮すると、表９のデータが得られた：ａ５のＮＲＩｇ−陰性患者、２は癌のために化学療法を受けていた血清中のクレアチニンのレベル、尿中のアルブミンのレベル、及び患者が高血圧を経験しつつあるか否かのような、腎臓機能に関連する３以上の因子を同時に分析することが可能であり、また望ましくさえある。これらの因子を患者の尿に見出されるＮＲＩｇの量についての情報と一緒に評価しそれに関連付けることによって、表１０に示すように、これらの高危険因子の間の劇的な結合が見出された。実施例４固相ＥＩＡアッセイにおいてＮＲＩｇを捕獲し同定する最初の工程としての新規ＲｈＣ免疫複合体−捕獲蛋白質の使用以下の実施例では、前記実施例３で概説したＥＩＡアッセイの工程ａで使用したＩｇＭモノクローナル抗体の代わりに免疫複合体−結合蛋白質ＲｈＣで置き換えた。この主要修飾及び後記するいくつかの他の修飾を除き、ＥＩＡの残りは、デュアル・モノクローナル抗体サンドイッチアッセイを用いてＮＲＩｇの検出につき実施例３に記載したものと同様に行った。ＲｈＣ蛋白質「ＲｈＣ」という新規免疫複合体−捕獲試薬はウマ血清から得られ、米国特許第４，７８３，５２８号に詳細に記載されており、その全内容をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。５０ｍＭトリス（無塩基）、１×１０−３Ｍエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、及び０．５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）よりなる最終ｐＨが８．０−８．２の貯蔵溶液中２０ｍｇ／ｍｌにて、ＲｈＣのストック溶液を調製した。このストック溶液を０．２ミクロン限外濾過フィルターを通す濾過によって滅菌し、次いで、４℃で保存した（凍結無し）。使用直前に、ストックＲｈＣをトリスコーティング緩衝液中で２０μｇ／ｍｌまで希釈した。トリスコーティング緩衝液この特別の緩衝溶液は、Ｉｍｍｕｌｏｎ−２ミクロテストプレート（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の平坦なウェル底部にＲｈＣ蛋白質を満足できるように結合させるのに必須である。緩衝液は、以下の塩、１×１０−３ＭＥＤＴＡ及び０．１５ＭＮａＣｌを脱イオン水に溶解させて正確に５０ｍＭトリス緩衝液の最終濃度とする（無塩基形態）ことによって作成した。この溶液のｐＨは混合後には調整せず、ぼ９．４−９．５であった。ＲｈＣ溶液でのＥＩＡプレートのコーティング２０μｇＲｈＣ／ｍｌのＲｈＣ溶液の正確に１００μｌをＩｍｍｕ１ｏｎ− ２ＥＩＡプレートの各ウェルに入れ、室温（ほぼ２５℃）で１８時間（一昼夜）インキュベートした。室温でのインキュベーションは必須である。何故ならば、４℃又は３７℃いずれかにおけるこのＲｈＣ溶液でのＥＩＡプレートのコーティングは効果的ではないからである。体液試料の希釈及び全てのプレートの洗浄のための緩衝液（＝希釈／洗浄緩衝液）希釈／洗浄緩衝溶液は、以下の物質：２０ｍＭトリス緩衝液（トリスの無塩基形態を含有）、０．１５ＭＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０洗剤を脱イオン水に示した最終濃度まで溶解させることによって調製した。この溶液のｐＨは濃塩酸（ＨＣｌ）で正確にｐＨ８．０まで調整した。この緩衝液は、固相ＲｈＣによってプレート上に捕獲されたいずれのＮＲＩｇもマークするのに使用される酵素結合モノクローナル抗体を希釈するのにも使用された。抗体ＲｈＣを用いるＥＩＡ手法ａ）ＮＲＩｇを捕獲する目的で、ＥＩＡプレートウェルに固定化した第１抗体の代わりにＲｈＣで置き換え；ｂ）全ての試料の希釈及び全てのプレートの洗浄で使用した緩衝溶液は丁度記載した希釈／洗浄緩衝液であり；及びｃ）最終の酵素−基質発色反応は、前記実施例３の正規のＥＩＡで使用した６０分間の代わりに、正確に３０分間、３７℃でアッセイプレートをインキュベートすることによって発色させた；以外は実施例３のプロセスに従った。＊＊これらの試料は、以下の対照値：Ｏ．Ｄ．捕獲：０．１０８±０．０２４（範囲０．０８４−０．２１２）；ＲｈＣ捕獲では：０．０９９±０．０２４（範囲０．０６８−−０．１３３）を生じた２５の正常で健康なドナーの群から得られた尿をテストするにおいて得られた正常光学密度（Ｏ．Ｄ．）の範囲内にある。従って、ＩｇＭ捕獲アッセイについての陰性値の上限は０．２００のＯ．Ｄ．であった；ＲｈＣ捕獲アッセイでは、それは０．２２６のＯ．Ｄ．であった。これらのデータは、９３糖尿病患者のこの群からの尿中の検出可能なＮＲＩｇのレベルの変動を明らかにする。表１１の脚注に示したごとくこれらのアッセイで確立された正常値を用い、ＩｇＭ捕獲アッセイを用いて、６７／９３糖尿病がそれらの尿中でＮＲＩｇの上昇したレベルを有し、他方、この数はＲｈＣ捕獲アッセイを用いて場合には６６／９３であったと判断された。この総じての一致は優れたものであった。しかしながら、個々の尿試料をテストする場合は、どれくらいの頻度で２つのアッセイアプローチが試料間で一致するのかを測定するのは重要であった。表１２に示すごとく、一致は優れたものであった。＊年齢は１６−６０歳の範囲である；全ては臨床的に健康な個体であった。糖尿病の尿検体はモノクローナル抗体捕獲アッセイでの結果の広い範囲（＞．１９９ないし＞３．０）を表すように選択し、病気の重症度及び持続に基づいては選択しなかった。実施例５体液中のＮＲＩｇを同定し定量する放射免疫拡散アッセイにおける抗−ＮＲＩ抗体の使用単一放射免疫拡散（ＲＩＤ）の技術は、例えば、アルブミン、免疫グロブリン及び他の血清又は尿蛋白質を含めた種々の可溶性蛋白質の定量的測定として依然頻繁に使用される。以下の予測実施例は、前記実施例２で概説した手法に従って作成したポリクローナル抗−ＮＲＩｇ抗体が、ＲＩＤアッセイで測定して、体液のミクロ試料に含有されたＮＲＩｇに結合しそれを特異的に同定する能力を示す。ここではポリクローナル抗体での使用つき記載するが、ＮＲＩｇについてのＲＩＤアッセイは、注目する抗原に対する１以上のモノクローナル抗体を含有するゲルで容易に実施できることを当業者に明らかである。好ましい実施形態において、ＲＩＤアッセイプレートは、個々のテストセクションを有するように設計し、この各々は、同一の体液に同時に含有され得る注目する区別される蛋白質マーカー（例えば、ＮＲＩｇ、アルブミン及びアデノシンデアミナーゼ結合蛋白質）の同時かつ定量的検出で有用な別のアガロースゲル中に抗体を含有する。かかる平行アッセイは、腎臓病の非常に初期の検出のための異なるタイプの有用性間の比較及び関連付けを可能とする。２ｍＭ乳酸カルシウム及び０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有する１６ｍＭバルビタールナトリウム溶液（ｐＨ８．０）１００ｍｌ中で７５０ｍｇの乾燥アガロース粉末（ＥＥＯ（−Ｍｒ）０．１０、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｍｐａｎｙ，ＦａｉｒＬａｗｎ，ＮＪ）を混合することによって、０．７５％（重量／容量）アガロース溶液を調製する（ＭｃＤｏｎａｌｄら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８６：１６５−１６８．１９９０）。このストックアガロース溶液は満足する結果でもってリン酸緩衝化セーライン中で調製することもできる。この混合物を１２０℃で３０分間オートクレーブ処理して、溶液を滅菌し、かつアガロース粉末を溶解させた。該液状溶液を水浴に入れ、正確に５２℃まで冷却し、その時点で、等容量の予め加温した（５２℃）希釈抗−ＮＪ）抗血清と徹底的に混合する。アルブミンさのような注目する他の蛋白質に対する抗体を含有するさらなるアガロース溶液を同様に調製する。アガロース／抗体混合物を注意深く予め加温したゲルフレームに注ぎ、気泡を回避し、室温までゆっくりと冷却する。該ゲルは室温（ほぼ２５℃）で固化し、被覆し、使用するまで冷蔵庫中で保存する。使用直前に、標準対照試料のテストならびに体液試料のテストを可能とするセンター間の１．５ｃｍの距離において、十分数の２．５ｍｍ孔を各アガロースゲルに明瞭に刻む。テストすべき各体液試料からの正確に５μｌ容量を注意深く適当な数の別のウェルに入れる。全ての標準及び試料溶液の容量は正確に同一である。次いで、該プレートを、最も濃い陽性対照標準についての沈殿の可視リングが拡大して停止するまで、すなわちサイズがそのプラトーに達するまで室温の湿潤チャンバー中で２４時間及び４８時間インキュベートする。この時点で、ゲルで観察される種々の対照及びテストリングの各々の直径を、マイクロメータースケールを含む低出力接眼レンズを用い、直角方向で２回測定する；直角方向の２回の測定はリングの生成のいずれの不規則性（非円性）をも補うものである。次いで、各リング直径についての２回の測定を平均し、ＲＩＤアッセイでの各ウェルにつき記録する。算術グラフ用紙上で、既知の陽性−対照標準の濃度をＸ（水平）軸にプロットし、標準の直径の二乗（Ｄ２）をＹ（垂直）軸にプロットする；半対数紙上で、標準の濃度を対数軸にプロットし、平均直径（二乗しない）を算術軸にプロットする。スムーズな曲線が点群に適合し、標準曲線を形成し、これは（１の軸の）蛋白質濃度を（グラフの他の軸に示した）アッセイのアガロースゲル中の沈殿リングの直径に関係付ける。尿の各テスト試料におけるＮＲＩｇの正確な濃度を、次いで、そのテスト試料についてのリングの直径を標準曲線上に位置させ、グラフの下方（Ｘ）軸に読み落としてその試料の正確な蛋白質濃度を得ることによって決定する。ＲＩＤアッセイの異なる部分で同時に測定された種々の蛋白質の濃度を比較し、次いで、これらの蛋白質の検出可能性及び濃度と、テストした体液のドナーにおけるネフロパシーの程度との間の関係付けを行う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．天然又は精製ヒトＮＲＩｇ糖蛋白質に特異的に結合し、ＮＲＩｇ上の抗原決定基に特異的に結合し、該抗原決定基はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）ハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ−１０４９０又はその子孫によって、又はＡＴＣＣハイブリドーマ細胞系受託番号ＨＢ−１０４９１又はその子孫によって産生されたモノクローナル抗体との反応性によって定義されることを特徴とする全抗体又はその抗体断片。２．ヒトＮＲＩｇ糖蛋白質、抗体−抗体複合体に結合した請求項１記載の抗−ＮＲＩｇ抗体を含有する抗体−抗体複合体を含み、該抗体は溶液中で自由であるか、又は不活性基材に固定化されていることを特徴とする新規組成物。３．動物から体液の試料を収集し；次いで、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１０４９０又はＡＴＣＣ番号ＨＢ−１０４９１に特異的に結合する抗原決定基でＩｇＧ免疫グロブリンの存在につき検定することを含み、該抗原決定基はネフロパシーの発症の可能性と関連付けられることを特徴とする動物におけるネフロパシーの発症の可能性を検出する方法。４．動物から体液の試料を収集し；ネフロパシーの発症の可能性と関連付けられる抗原性部位を持つＩｇＧ免疫グロブリンに特異的に結合するモノクローナル抗体に該試料を接触させ、該抗原性部位はＡＴＣＣ番号ＨＢ−１０４９０又はＡＴＣＣ番号ＨＢ−１０４９１によって産生されたモノクローナル抗体に特異的に結合することを特徴とし；次いで、該試料中に存在する該抗原決定基で該ＩｇＧの量を定量することを特徴する動物においてネフロパシーの発症の可能性を検出する方法。５．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１０４９０。６．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１０４９０によって産生されたモノクローナル抗体。７．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１０４９１。８．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１０４９１によって産生されたモノクローナル抗体。