JPH07287014A - アシアログリコプロテインレセプターの測定法及びこれに用いる測定試薬 - Google Patents
アシアログリコプロテインレセプターの測定法及びこれに用いる測定試薬Info
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- JPH07287014A JPH07287014A JP6081268A JP8126894A JPH07287014A JP H07287014 A JPH07287014 A JP H07287014A JP 6081268 A JP6081268 A JP 6081268A JP 8126894 A JP8126894 A JP 8126894A JP H07287014 A JPH07287014 A JP H07287014A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 アシアログリコプロテイン（ＡＧＰＲ）を認
識するモノクローナル抗体を被検体と接触させる免疫測
定法によりＡＧＰＲを測定する方法において、検体希釈
液のpHを５．０〜７とするか又は酵素標識抗体溶液にフ
ェノールを含有せしめるＡＧＰＲの測定法及びこれに用
いる測定用試薬。 【効果】 感度及び精度に優れる。
識するモノクローナル抗体を被検体と接触させる免疫測
定法によりＡＧＰＲを測定する方法において、検体希釈
液のpHを５．０〜７とするか又は酵素標識抗体溶液にフ
ェノールを含有せしめるＡＧＰＲの測定法及びこれに用
いる測定用試薬。 【効果】 感度及び精度に優れる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、肝細胞機能の判定に有
効なアシアログリコプロテインレセプター（以下「ＡＧ
ＰＲ」という）濃度を感度及び精度良く測定する方法、
この方法を用いた治療薬のスクリーニング方法及びこの
方法に用いる測定試薬に関する。
効なアシアログリコプロテインレセプター（以下「ＡＧ
ＰＲ」という）濃度を感度及び精度良く測定する方法、
この方法を用いた治療薬のスクリーニング方法及びこの
方法に用いる測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】肝臓は人体の中で最大の実質臓器であ
り、物質代謝の中心的役割を演じているが、その主たる
機能は、（１）栄養素に関する中間代謝、すなわち腸管
から吸収したあるいは末梢組織から動員した糖・脂肪酸
・アミノ酸の酸化や糖新生、脂質や蛋白の合成、貯蔵な
らびに他臓器や末梢組織への供給、（２）栄養素以外の
各種の蛋白及びその前駆物質の代謝、すなわち体組織構
成蛋白、血清蛋白、肝での代謝に関わる各種の酵素の合
成など、（３）外因性の薬物、内因性のホルモンやアン
モニアなどの代謝産物の解毒、抱合、破壊、不活化、
（４）網内系機能としての異物の摂取、排出、（５）胆
汁生成に伴う排出、消化作用、（６）水、電解質、ビタ
ミン代謝による内部環境の維持など、多岐にわたってい
る。そのために、肝の病変は全身的な物質代謝の異常を
引き起こし、二次的に他臓器の障害を誘発して全身的に
大きな影響を及ぼす。このため、肝疾患における肝機能
を把握することは重要なことである。また、最近の医療
用器具の発達、肝臓切除術の進歩、肝臓の保存液の開発
及び免疫抑制剤の開発に伴い、肝癌における肝臓切除や
肝硬変における肝臓移植が積極的に行われるようになっ
てきている。従って、術後においても、肝機能を把握す
ることは重要である。
り、物質代謝の中心的役割を演じているが、その主たる
機能は、（１）栄養素に関する中間代謝、すなわち腸管
から吸収したあるいは末梢組織から動員した糖・脂肪酸
・アミノ酸の酸化や糖新生、脂質や蛋白の合成、貯蔵な
らびに他臓器や末梢組織への供給、（２）栄養素以外の
各種の蛋白及びその前駆物質の代謝、すなわち体組織構
成蛋白、血清蛋白、肝での代謝に関わる各種の酵素の合
成など、（３）外因性の薬物、内因性のホルモンやアン
モニアなどの代謝産物の解毒、抱合、破壊、不活化、
（４）網内系機能としての異物の摂取、排出、（５）胆
汁生成に伴う排出、消化作用、（６）水、電解質、ビタ
ミン代謝による内部環境の維持など、多岐にわたってい
る。そのために、肝の病変は全身的な物質代謝の異常を
引き起こし、二次的に他臓器の障害を誘発して全身的に
大きな影響を及ぼす。このため、肝疾患における肝機能
を把握することは重要なことである。また、最近の医療
用器具の発達、肝臓切除術の進歩、肝臓の保存液の開発
及び免疫抑制剤の開発に伴い、肝癌における肝臓切除や
肝硬変における肝臓移植が積極的に行われるようになっ
てきている。従って、術後においても、肝機能を把握す
ることは重要である。
【０００３】従来、肝機能検査法としての生化学検査項
目は、「肝機能検査の選択と組み合せの基準」として日
本消化器病学会 肝機能研究班によって提示され（日消
会誌，８５巻，１２１０−１２１４ページ，１９８８
年）内科、外科において広く用いられている。
目は、「肝機能検査の選択と組み合せの基準」として日
本消化器病学会 肝機能研究班によって提示され（日消
会誌，８５巻，１２１０−１２１４ページ，１９８８
年）内科、外科において広く用いられている。
【０００４】外科領域において、小沢らは、肝機能検査
法として、肝ミトコンドリアの機能を無侵襲的にかつよ
り直接的に評価する方法、つまり動脈血中のケトン体比
（ＡＫＢＲ）により評価する方法が優れていることを明
らかしている（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，７
６巻，６９１−６９６ページ，１９７９年）。しかしな
がら、従来の生化学検査項目は、肝特異性が低く肝外因
子に影響されることが少なくない、またＡＫＢＲによる
方法は、採血、検体の扱い、測定、データの解釈に各々
注意すべき事項があり、好適な方法とは言い難い。この
ように、外科領域において、術後の肝障害はかなりの高
い頻度で発生することから、術後の予後の評価を行うこ
とは重要であるが、これに適した検査方法はいまだ見出
されていない。
法として、肝ミトコンドリアの機能を無侵襲的にかつよ
り直接的に評価する方法、つまり動脈血中のケトン体比
（ＡＫＢＲ）により評価する方法が優れていることを明
らかしている（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，７
６巻，６９１−６９６ページ，１９７９年）。しかしな
がら、従来の生化学検査項目は、肝特異性が低く肝外因
子に影響されることが少なくない、またＡＫＢＲによる
方法は、採血、検体の扱い、測定、データの解釈に各々
注意すべき事項があり、好適な方法とは言い難い。この
ように、外科領域において、術後の肝障害はかなりの高
い頻度で発生することから、術後の予後の評価を行うこ
とは重要であるが、これに適した検査方法はいまだ見出
されていない。
【０００５】また、内科領域において新津らは、肝疾患
の診断法として、肝に特異性の高いＡＧＰＲを測定する
方法が適している事を報告している（特開平４−３５６
１９８号公報）。ＡＧＰＲはガラクトース、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン残基を認識するレクチン（Ｍｏｒｅｌ
ｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６巻，１４６１
−１４６７ページ，１９７１年）であり、肝実質細胞膜
表面に存在する肝臓に特異性の高い膜糖蛋白質である
（松浦ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９５巻，８６４
−８７５ページ，１９８２年）。また、ＡＧＰＲのリガ
ンドである125Ｉ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｓｉａｌｏｏｒ
ｏｓｏｍｕｃｏｉｄを用いて、肝実質細胞膜表面上のＡ
ＧＰＲ量が、肝臓障害の程度とともに減少することが明
らかにされている（沢村ら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ
ｌｏｇｙ，８７巻，１２１７−１２２１ページ，１９８
４年）。
の診断法として、肝に特異性の高いＡＧＰＲを測定する
方法が適している事を報告している（特開平４−３５６
１９８号公報）。ＡＧＰＲはガラクトース、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン残基を認識するレクチン（Ｍｏｒｅｌ
ｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６巻，１４６１
−１４６７ページ，１９７１年）であり、肝実質細胞膜
表面に存在する肝臓に特異性の高い膜糖蛋白質である
（松浦ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９５巻，８６４
−８７５ページ，１９８２年）。また、ＡＧＰＲのリガ
ンドである125Ｉ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｓｉａｌｏｏｒ
ｏｓｏｍｕｃｏｉｄを用いて、肝実質細胞膜表面上のＡ
ＧＰＲ量が、肝臓障害の程度とともに減少することが明
らかにされている（沢村ら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ
ｌｏｇｙ，８７巻，１２１７−１２２１ページ，１９８
４年）。
【０００６】しかしながら、従来のＡＧＰＲの測定法
は、検体中のＡＧＰＲを定量測定するのに十分な性能を
有するものとは言えず、肝疾患を適切に診断することは
困難であった。
は、検体中のＡＧＰＲを定量測定するのに十分な性能を
有するものとは言えず、肝疾患を適切に診断することは
困難であった。
【０００７】一方、従来、安全で有効な治療薬をスクリ
ーニングする方法としては、ターゲットとなる培養細胞
又は培養肝細胞への治療薬の影響を各細胞の機能異常、
機能回復等から判断する方法が用いられている。しかし
ながら、培養肝細胞における治療薬の影響の判断は、肝
細胞の物質産生能、代謝、解毒作用等から行われている
もののこれらの機能だけでは肝細胞の機能を十分に把握
しているとは言えず、新たな治療薬の開発においてはこ
れらとは異なった肝細胞の機能である細胞膜、エンドサ
イトーシス等の変化を把握する簡便な方法が望まれてい
た。
ーニングする方法としては、ターゲットとなる培養細胞
又は培養肝細胞への治療薬の影響を各細胞の機能異常、
機能回復等から判断する方法が用いられている。しかし
ながら、培養肝細胞における治療薬の影響の判断は、肝
細胞の物質産生能、代謝、解毒作用等から行われている
もののこれらの機能だけでは肝細胞の機能を十分に把握
しているとは言えず、新たな治療薬の開発においてはこ
れらとは異なった肝細胞の機能である細胞膜、エンドサ
イトーシス等の変化を把握する簡便な方法が望まれてい
た。
【０００８】このように、肝細胞機能を判定するために
ＡＧＰＲの測定法を確立することが求められており、本
出願人はモノクローナル抗体を用いたＡＧＰＲの測定法
を見出し、先に特許出願した（特開平４−３５６１９８
号公報）。しかしながら、より高感度で精度の高いＡＧ
ＰＲの測定法が望まれていた。
ＡＧＰＲの測定法を確立することが求められており、本
出願人はモノクローナル抗体を用いたＡＧＰＲの測定法
を見出し、先に特許出願した（特開平４−３５６１９８
号公報）。しかしながら、より高感度で精度の高いＡＧ
ＰＲの測定法が望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、肝細胞機能、特に肝再生能の把握、アルコール性肝
障害の検出及び治療薬の効果あるいは肝細胞への影響の
判定に有効なＡＧＰＲをより高感度でかつ精度良く測定
するための方法を提供することにある。
は、肝細胞機能、特に肝再生能の把握、アルコール性肝
障害の検出及び治療薬の効果あるいは肝細胞への影響の
判定に有効なＡＧＰＲをより高感度でかつ精度良く測定
するための方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み本発明
者らは鋭意研究を行った結果、ＡＧＰＲを認識するモノ
クローナル抗体を被検体と接触させて免疫測定を行う
際、検体希釈液のpHを５．０〜７にするか、又は酵素標
識抗体溶液にフェノールを含有せしめれば、ＡＧＰＲを
高感度かつ高精度で測定できることを見出し、本発明を
完成した。更に、この方法を用い、培養肝細胞から放出
される培養上清中のＡＧＰＲを測定すれば、容易に治療
薬のスクリーニングを行うことができることを見出し、
本発明を完成した。
者らは鋭意研究を行った結果、ＡＧＰＲを認識するモノ
クローナル抗体を被検体と接触させて免疫測定を行う
際、検体希釈液のpHを５．０〜７にするか、又は酵素標
識抗体溶液にフェノールを含有せしめれば、ＡＧＰＲを
高感度かつ高精度で測定できることを見出し、本発明を
完成した。更に、この方法を用い、培養肝細胞から放出
される培養上清中のＡＧＰＲを測定すれば、容易に治療
薬のスクリーニングを行うことができることを見出し、
本発明を完成した。
【００１１】すなわち、本発明は、ＡＧＰＲを認識する
モノクローナル抗体を被検体と接触させる免疫測定法に
よりＡＧＰＲを測定する方法において、検体希釈液のpH
を５．０〜７にすることを特徴とするＡＧＰＲの測定法
の第一の発明、ＡＧＰＲを認識するモノクローナル抗体
を被検体と接触させる免疫測定法によりＡＧＰＲを測定
する方法において、酵素標識抗体溶液にフェノールを含
有せしめることを特徴とするＡＧＰＲの測定法の第二の
発明、これらのいずれか又は双方の測定法により培養肝
細胞から放出される培養上清中のＡＧＰＲを測定するこ
とを特徴とする治療薬のスクリーニング方法の第三の発
明、並びにＡＧＰＲを認識するモノクローナル抗体及び
フェノールを含有するＡＧＰＲの測定試薬の第四の発明
を提供するものである。
モノクローナル抗体を被検体と接触させる免疫測定法に
よりＡＧＰＲを測定する方法において、検体希釈液のpH
を５．０〜７にすることを特徴とするＡＧＰＲの測定法
の第一の発明、ＡＧＰＲを認識するモノクローナル抗体
を被検体と接触させる免疫測定法によりＡＧＰＲを測定
する方法において、酵素標識抗体溶液にフェノールを含
有せしめることを特徴とするＡＧＰＲの測定法の第二の
発明、これらのいずれか又は双方の測定法により培養肝
細胞から放出される培養上清中のＡＧＰＲを測定するこ
とを特徴とする治療薬のスクリーニング方法の第三の発
明、並びにＡＧＰＲを認識するモノクローナル抗体及び
フェノールを含有するＡＧＰＲの測定試薬の第四の発明
を提供するものである。
【００１２】本発明に用いられるＡＧＰＲを認識するモ
ノクローナル抗体（以下、「抗ＡＧＰＲモノクローナル
抗体」という）は、例えば次のようにして製造すること
ができる。
ノクローナル抗体（以下、「抗ＡＧＰＲモノクローナル
抗体」という）は、例えば次のようにして製造すること
ができる。
【００１３】免疫原としてのＡＧＰＲは、公知の方法、
例えばＢａｅｎｚｉｎｇｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２５５巻，４６０７−４６１３
ページ，１９８０年）の方法に従って、ヒト剖検肝によ
り調製することができる。すなわち、インフォームド・
コンセントを得たヒト剖検肝をホモジナイズし、遠心分
離にて肝細胞膜画分を集め、この画分１容に対し、コー
ルドアセトン９容程度を加えた後、不溶物をアセトンパ
ウダーとして濾過回収する。このアセトンパウダーから
界面活性剤を含む緩衝液によりＡＧＰＲを抽出し、この
抽出液に塩化カルシウムを加え、次いでＤ−ガラクトー
ス−アガロースゲルを用いたアフィニティクロマトグラ
フィーに付せば、精製されたＡＧＰＲを得ることができ
る。
例えばＢａｅｎｚｉｎｇｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２５５巻，４６０７−４６１３
ページ，１９８０年）の方法に従って、ヒト剖検肝によ
り調製することができる。すなわち、インフォームド・
コンセントを得たヒト剖検肝をホモジナイズし、遠心分
離にて肝細胞膜画分を集め、この画分１容に対し、コー
ルドアセトン９容程度を加えた後、不溶物をアセトンパ
ウダーとして濾過回収する。このアセトンパウダーから
界面活性剤を含む緩衝液によりＡＧＰＲを抽出し、この
抽出液に塩化カルシウムを加え、次いでＤ−ガラクトー
ス−アガロースゲルを用いたアフィニティクロマトグラ
フィーに付せば、精製されたＡＧＰＲを得ることができ
る。
【００１４】抗ＡＧＰＲモノクローナル抗体は、上記Ａ
ＧＰＲを免疫原として使用し、既知の細胞融合手段によ
って調製することができる。すなわち、ＡＧＰＲをフロ
インドの完全アジュバント、あるいは結核菌の精製アジ
ュバントであるトレハロースジミコール酸及び低毒性リ
ピッドＡを最適濃度に調製したアジュバント（リビ−ア
ジュバントシステム）等の適当なアジュバントに乳濁
し、これを数週間おきにマウスの腹腔、皮下又は静脈に
数回繰り返し免疫する。一定期間後、マウスの脾臓細胞
をとり出し、これと、ヒポキサンチン−グアニン−ホス
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ-）あ
るいはチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ-）の様な適切なマ
ーカーを持つマウス骨髄腫細胞とをポリエチレングリコ
ール処理することによって多様なハイブリドーマ細胞を
得る。このハイブリドーマ細胞の培養上清中に産出され
た抗体のＡＧＰＲに対する反応性に基づいて、抗ＡＧＰ
Ｒモノクローナル抗体を作るハイブリドーマをスクリー
ニングすることができる。目的のハイブリドーマを単ク
ローンとするため、９６穴のマイクロウエルにフィーダ
ーレイヤーとして正常な脾臓細胞又は胸腺細胞を１０6
個／ウエル蒔いた上にハイブリドーマを１穴に１〜１０
個となるように蒔き、生育してくるクローンについて再
びスクリーニングを行う。このサブクローニングを繰り
返すことにより、単一性のハイブリドーマを得ることが
できる。
ＧＰＲを免疫原として使用し、既知の細胞融合手段によ
って調製することができる。すなわち、ＡＧＰＲをフロ
インドの完全アジュバント、あるいは結核菌の精製アジ
ュバントであるトレハロースジミコール酸及び低毒性リ
ピッドＡを最適濃度に調製したアジュバント（リビ−ア
ジュバントシステム）等の適当なアジュバントに乳濁
し、これを数週間おきにマウスの腹腔、皮下又は静脈に
数回繰り返し免疫する。一定期間後、マウスの脾臓細胞
をとり出し、これと、ヒポキサンチン−グアニン−ホス
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ-）あ
るいはチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ-）の様な適切なマ
ーカーを持つマウス骨髄腫細胞とをポリエチレングリコ
ール処理することによって多様なハイブリドーマ細胞を
得る。このハイブリドーマ細胞の培養上清中に産出され
た抗体のＡＧＰＲに対する反応性に基づいて、抗ＡＧＰ
Ｒモノクローナル抗体を作るハイブリドーマをスクリー
ニングすることができる。目的のハイブリドーマを単ク
ローンとするため、９６穴のマイクロウエルにフィーダ
ーレイヤーとして正常な脾臓細胞又は胸腺細胞を１０6
個／ウエル蒔いた上にハイブリドーマを１穴に１〜１０
個となるように蒔き、生育してくるクローンについて再
びスクリーニングを行う。このサブクローニングを繰り
返すことにより、単一性のハイブリドーマを得ることが
できる。
【００１５】ハイブリドーマを培養する培地としては、
ハイブリドーマの培養に適した培地であれば良く、好適
には、ＲＰＭＩ １６４０に牛胎児血清、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとスト
レプトマイシン）を含む培地が用いられる。また、培養
は、例えば５重量％（以下単に「％」という）ＣＯ2濃
度、３７℃の条件下で３日間行うのが好ましい。
ハイブリドーマの培養に適した培地であれば良く、好適
には、ＲＰＭＩ １６４０に牛胎児血清、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとスト
レプトマイシン）を含む培地が用いられる。また、培養
は、例えば５重量％（以下単に「％」という）ＣＯ2濃
度、３７℃の条件下で３日間行うのが好ましい。
【００１６】モノクローナル抗体は、こうして選抜され
たハイブリドーマより動物細胞培養の技術、又はマウス
腹腔内での培養技術で得た培養液上清又はマウス腹水を
硫安塩析、イオン交換樹脂及び分子篩ゲルを用いたカラ
ムクロマトグラフィー、プロテインＡ及びプロテインＧ
を用いるアフィニティクロマトグラフィー等により精製
することができる。得られたモノクローナル抗体の特異
性は、例えばウエスタンブロッティング法により確認す
ることができる。
たハイブリドーマより動物細胞培養の技術、又はマウス
腹腔内での培養技術で得た培養液上清又はマウス腹水を
硫安塩析、イオン交換樹脂及び分子篩ゲルを用いたカラ
ムクロマトグラフィー、プロテインＡ及びプロテインＧ
を用いるアフィニティクロマトグラフィー等により精製
することができる。得られたモノクローナル抗体の特異
性は、例えばウエスタンブロッティング法により確認す
ることができる。
【００１７】ヒト検体中のＡＧＰＲを定量するために
は、このようにして得られるモノクローナル抗体の１種
又は２種以上を用いて免疫学的測定法を実施すれば良
い。免疫学的測定法としてはオクタロニー法、一次元免
疫拡散法、免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラテックス免
疫測定法、ラジオイムノアッセイ、フロロイムノアッセ
イなどを利用することができる。例えば酵素免疫測定法
を使用する場合には、抗ＡＧＰＲモノクローナル抗体の
いずれかを適当な緩衝液中で不溶性担体に固定化して不
溶化抗体とし、別の抗ＡＧＰＲモノクローナル抗体を酵
素で標識し、これらを被検体と反応させ、第二の抗体に
結合させた酵素の活性を測ることにより、ヒトＡＧＰＲ
を測定することができる。
は、このようにして得られるモノクローナル抗体の１種
又は２種以上を用いて免疫学的測定法を実施すれば良
い。免疫学的測定法としてはオクタロニー法、一次元免
疫拡散法、免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラテックス免
疫測定法、ラジオイムノアッセイ、フロロイムノアッセ
イなどを利用することができる。例えば酵素免疫測定法
を使用する場合には、抗ＡＧＰＲモノクローナル抗体の
いずれかを適当な緩衝液中で不溶性担体に固定化して不
溶化抗体とし、別の抗ＡＧＰＲモノクローナル抗体を酵
素で標識し、これらを被検体と反応させ、第二の抗体に
結合させた酵素の活性を測ることにより、ヒトＡＧＰＲ
を測定することができる。
【００１８】ここで使用する不溶性担体としては、ポリ
スチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの各種合
成高分子、ガラス、シリコン、不溶性多糖（架橋デキス
トラン、ポリサッカライド）などが好ましく、これらの
担体は球状、棒状、微粒子等の形状で、あるいは試験
管、マイクロプレートなどの形態で用いることができ
る。なお、不溶化抗体作成の条件としては、球状、棒
状、試験管、マイクロプレートの形態の場合又は微粒子
の形態の場合、抗体濃度は各々１〜１０μg ／ml又は１
〜１０mg／ml、緩衝溶液はリン酸緩衝液、グリシン緩衝
液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などの弱酸性からアルカ
リ性のものを用い、反応時間は室温又は４℃で、１時間
〜７２時間で調製することが好ましい。この後の洗浄に
用いる洗浄液の組成は、５〜１００mM濃度のリン酸緩衝
液、トリス緩衝液等のpH６〜８の弱酸〜弱アルカリを用
いることが好ましい。更に、非特異反応を回避するた
め、５０〜２００mM濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム及び０．０１〜０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅ
ｅｎ ２０、ＮＰ−４０などを添加することが好まし
い。また、酵素反応の阻害剤を除くため、０．１〜５mM
濃度のキレート剤（ＥＤＴＡ等）を加えてもよい。
スチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの各種合
成高分子、ガラス、シリコン、不溶性多糖（架橋デキス
トラン、ポリサッカライド）などが好ましく、これらの
担体は球状、棒状、微粒子等の形状で、あるいは試験
管、マイクロプレートなどの形態で用いることができ
る。なお、不溶化抗体作成の条件としては、球状、棒
状、試験管、マイクロプレートの形態の場合又は微粒子
の形態の場合、抗体濃度は各々１〜１０μg ／ml又は１
〜１０mg／ml、緩衝溶液はリン酸緩衝液、グリシン緩衝
液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などの弱酸性からアルカ
リ性のものを用い、反応時間は室温又は４℃で、１時間
〜７２時間で調製することが好ましい。この後の洗浄に
用いる洗浄液の組成は、５〜１００mM濃度のリン酸緩衝
液、トリス緩衝液等のpH６〜８の弱酸〜弱アルカリを用
いることが好ましい。更に、非特異反応を回避するた
め、５０〜２００mM濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム及び０．０１〜０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅ
ｅｎ ２０、ＮＰ−４０などを添加することが好まし
い。また、酵素反応の阻害剤を除くため、０．１〜５mM
濃度のキレート剤（ＥＤＴＡ等）を加えてもよい。
【００１９】本発明で使用する酵素標識抗体は公知の方
法によって作成することができ、例えば中根らの方法
（Ｎａｋａｎｅ Ｐ．Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｈｉｓｔｏ
ｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，２２，１０８４−１０８
９，１９７４）あるいは石川らの方法（マレイミド法：
「酵素免疫測定法 第３版」医学書院）に従い、断片化
していない免疫グロブリン分子をそのままか、あるいは
必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解して
Ｆ（ａｂ’）2 、又はＦａｂ’とした後、酵素で標識す
ることができる。標識に使用する酵素としては、ペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられ
る。酵素標識抗体溶液の組成は、固相化抗体に結合した
抗原と酵素標識抗体の種類により、それぞれ反応に適し
た条件（pH、緩衝液、蛋白質、塩、界面活性剤など）を
適宜設定すればよい。例えば、緩衝液濃度、組成及びpH
としては、１０〜５００mM（特に１０〜５０mM）濃度の
リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＥＳ・ＢｉｓＴｒｉ
ｓ・ＡＣＥＳ・ＢＥＳ・ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ’ｓ緩
衝液などのpH６〜８の弱酸〜弱アルカリ（特にpH６．５
〜７．５のＢＥＳ）性のものが挙げられる。
法によって作成することができ、例えば中根らの方法
（Ｎａｋａｎｅ Ｐ．Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｈｉｓｔｏ
ｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，２２，１０８４−１０８
９，１９７４）あるいは石川らの方法（マレイミド法：
「酵素免疫測定法 第３版」医学書院）に従い、断片化
していない免疫グロブリン分子をそのままか、あるいは
必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解して
Ｆ（ａｂ’）2 、又はＦａｂ’とした後、酵素で標識す
ることができる。標識に使用する酵素としては、ペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられ
る。酵素標識抗体溶液の組成は、固相化抗体に結合した
抗原と酵素標識抗体の種類により、それぞれ反応に適し
た条件（pH、緩衝液、蛋白質、塩、界面活性剤など）を
適宜設定すればよい。例えば、緩衝液濃度、組成及びpH
としては、１０〜５００mM（特に１０〜５０mM）濃度の
リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＥＳ・ＢｉｓＴｒｉ
ｓ・ＡＣＥＳ・ＢＥＳ・ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ’ｓ緩
衝液などのpH６〜８の弱酸〜弱アルカリ（特にpH６．５
〜７．５のＢＥＳ）性のものが挙げられる。
【００２０】本発明において酵素標識抗体溶液には、全
組成中に０．００１〜０．２％、特に０．０１〜０．１
％のフェノールを添加すると、反応が促進されると共に
酵素標識抗体の安定化を図ることができ好ましい。
組成中に０．００１〜０．２％、特に０．０１〜０．１
％のフェノールを添加すると、反応が促進されると共に
酵素標識抗体の安定化を図ることができ好ましい。
【００２１】また、酵素標識抗体溶液には、更に非特異
反応の回避及び安定化の目的のため、０．１〜１０％、
特に０．１〜０．５％のＢＳＡ、低脂肪ミルク、ゼラチ
ン等の蛋白質、２０〜１０００mM、特に５０〜２００mM
の塩化ナトリウム、塩化カリウム等の電解質、０．０１
〜０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎ
Ｐ−４０等の界面活性剤等を添加することが好ましい。
反応の回避及び安定化の目的のため、０．１〜１０％、
特に０．１〜０．５％のＢＳＡ、低脂肪ミルク、ゼラチ
ン等の蛋白質、２０〜１０００mM、特に５０〜２００mM
の塩化ナトリウム、塩化カリウム等の電解質、０．０１
〜０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎ
Ｐ−４０等の界面活性剤等を添加することが好ましい。
【００２２】標識物質が酵素である場合には、その活性
を測定するために基質、必要により発色剤が用いられ
る。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基
質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ−フェニレ
ンジアミン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンチ
ジン、２，２′−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸）アンモニウム塩等、酵素にアルカリフ
ォスファターゼを用いる場合は基質として、ｐ−ニトロ
フェニルフォスフェート、３−（４−メトキシスピロ
｛１，２−ジオキセタン−２′，３−トリシクロ−
〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル
フォスフェート：ＡＭＰＰＤ等、酵素にβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼを用いる場合は基質として、β−Ｄ−ガラク
トピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド等、酵素にグルコースオキシダーゼ
を用いる場合はペルオキシダーゼの共存下で基質とし
て、β−Ｄ−グルコース、発色剤としてペルオキシダー
ゼを用いることができる。
を測定するために基質、必要により発色剤が用いられ
る。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基
質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ−フェニレ
ンジアミン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンチ
ジン、２，２′−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸）アンモニウム塩等、酵素にアルカリフ
ォスファターゼを用いる場合は基質として、ｐ−ニトロ
フェニルフォスフェート、３−（４−メトキシスピロ
｛１，２−ジオキセタン−２′，３−トリシクロ−
〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル
フォスフェート：ＡＭＰＰＤ等、酵素にβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼを用いる場合は基質として、β−Ｄ−ガラク
トピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド等、酵素にグルコースオキシダーゼ
を用いる場合はペルオキシダーゼの共存下で基質とし
て、β−Ｄ−グルコース、発色剤としてペルオキシダー
ゼを用いることができる。
【００２３】本発明測定法に用いる検体希釈液は、その
pHが５．０〜７、好ましくは５．５〜６．５の範囲であ
ることが必要である。このpH値が５．０未満又は７を超
えると測定感度が下がり好ましくない。被検体希釈液の
組成は上記pH範囲内で固相化抗体と抗原の種類により、
各種緩衝液等を用いて適宜決定すればよい。ここで用い
られる緩衝液としては、例えば２０〜５００mM（好まし
くは５０〜２００mM）濃度のクエン酸緩衝液、マレイン
酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ・ＢｉｓＴｒｉｓ・Ａ
ＣＥＳ・ＢＥＳ等のＧｏｏｄ’ｓ緩衝液が挙げられる。
更に、非特異反応の回避及び安定化の目的のため、０．
１〜１０％（好ましくは１〜５％）ＢＳＡ、低脂肪ミル
ク、ゼラチンなどの蛋白質；２０〜１０００mM（好まし
くは５０〜２００mM）塩化ナトリウム、塩化カリウムな
どの電解質；０．０１〜０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、
Ｔｗｅｅｎ ２０、ＮＰ−４０などの界面活性剤等を添
加することが好ましい。
pHが５．０〜７、好ましくは５．５〜６．５の範囲であ
ることが必要である。このpH値が５．０未満又は７を超
えると測定感度が下がり好ましくない。被検体希釈液の
組成は上記pH範囲内で固相化抗体と抗原の種類により、
各種緩衝液等を用いて適宜決定すればよい。ここで用い
られる緩衝液としては、例えば２０〜５００mM（好まし
くは５０〜２００mM）濃度のクエン酸緩衝液、マレイン
酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ・ＢｉｓＴｒｉｓ・Ａ
ＣＥＳ・ＢＥＳ等のＧｏｏｄ’ｓ緩衝液が挙げられる。
更に、非特異反応の回避及び安定化の目的のため、０．
１〜１０％（好ましくは１〜５％）ＢＳＡ、低脂肪ミル
ク、ゼラチンなどの蛋白質；２０〜１０００mM（好まし
くは５０〜２００mM）塩化ナトリウム、塩化カリウムな
どの電解質；０．０１〜０．１％のＴｗｅｅｎ ８０、
Ｔｗｅｅｎ ２０、ＮＰ−４０などの界面活性剤等を添
加することが好ましい。
【００２４】免疫反応は、先ず第一反応で、不溶化抗体
に被検体を接触させ、抗原を結合させて不溶化抗体−抗
原複合体とし、第二反応で、これに酵素標識抗体を結合
させて不溶化抗体−抗原−酵素標識抗体複合体とするこ
とによって行われる。そして得られた複合体の酵素活性
を測定することによって、被検体中の抗原（ヒトＡＧＰ
Ｒ）の量を測定することができる。
に被検体を接触させ、抗原を結合させて不溶化抗体−抗
原複合体とし、第二反応で、これに酵素標識抗体を結合
させて不溶化抗体−抗原−酵素標識抗体複合体とするこ
とによって行われる。そして得られた複合体の酵素活性
を測定することによって、被検体中の抗原（ヒトＡＧＰ
Ｒ）の量を測定することができる。
【００２５】本発明においては、酵素標識抗体溶液にフ
ェノールを含有せしめ、かつ検体希釈液のpHを５．０〜
７にして測定すると、より高感度で精度良くＡＧＰＲの
濃度を測定することができる。
ェノールを含有せしめ、かつ検体希釈液のpHを５．０〜
７にして測定すると、より高感度で精度良くＡＧＰＲの
濃度を測定することができる。
【００２６】上記のＡＧＰＲの測定法を用いた治療薬の
スクリーニングは、例えば肝細胞として初代培養肝細
胞、肝細胞株及び薬物等でダメージを与えた肝細胞等を
用い、各薬物の添加及び無添加の状態で肝細胞から培養
上清中に放出されるあるいは肝細胞中の物質を比較する
ことにより行うことができる。例えば培養上清中（血清
を含む含まない両方の培地が利用できる）のＡＧＰＲ量
を測定することにより、肝細胞が活動している状態での
膜の流動性、細胞膜物質のターンオーバー及びエンドサ
イトーシスに関連する細胞内機構の働きなどを把握でき
る。
スクリーニングは、例えば肝細胞として初代培養肝細
胞、肝細胞株及び薬物等でダメージを与えた肝細胞等を
用い、各薬物の添加及び無添加の状態で肝細胞から培養
上清中に放出されるあるいは肝細胞中の物質を比較する
ことにより行うことができる。例えば培養上清中（血清
を含む含まない両方の培地が利用できる）のＡＧＰＲ量
を測定することにより、肝細胞が活動している状態での
膜の流動性、細胞膜物質のターンオーバー及びエンドサ
イトーシスに関連する細胞内機構の働きなどを把握でき
る。
【００２７】
【発明の効果】本発明のＡＧＰＲの測定法によれば、Ａ
ＧＰＲを高感度で精度良く測定することができる。
ＧＰＲを高感度で精度良く測定することができる。
【００２８】従って、本発明の測定法は肝細胞の状態の
把握に有用であり、特に、肝切除術に関連して肝再生の
状態の把握、アルコール性の肝障害検出、インビトロに
おいて薬物刺激による肝細胞膜の流動性、肝細胞膜成分
のターンオーバーの変化から肝細胞の機能変化の把握な
どを容易に行うことができる。
把握に有用であり、特に、肝切除術に関連して肝再生の
状態の把握、アルコール性の肝障害検出、インビトロに
おいて薬物刺激による肝細胞膜の流動性、肝細胞膜成分
のターンオーバーの変化から肝細胞の機能変化の把握な
どを容易に行うことができる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００３０】参考例１ ＡＧＰＲの精製：インフォームド・コンセントを得たヒ
ト剖検肝（胃癌で亡くなった患者）１８０ｇを細かく切
り、５mM ＥＤＴＡ、１mM フェニルメチルスルホニル
フルオライドを含む５０mM トリス塩酸緩衝液（以下
「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ」という）（pH７．８，洗浄液１）
で洗浄した後、洗浄液１の９００mlを用いてポリトロン
ブレンダーにてホモジナイズした。懸濁液を８００×
ｇ、１０分間遠心し、上清を１００，０００×ｇ、９０
分間遠心した。得られたペレットを精製水にて再懸濁
後、９倍量のコールドアセトンを加え、濾過にてアセト
ンパウダーを回収した。回収したアセトンパウダー２０
ｇを、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．８）で洗浄後、０．４Ｍ ＫＣｌ、１％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．８）３００mlで抽出した。抽出液を１，２
００×ｇ、１５分間遠心し、上清を回収し、終濃度２５
mMになるようにＣａＣｌ2 を添加した後、Ｄ−ガラクト
ース−アガロースゲルに吸着させた。ＡＧＰＲは１．２
５Ｍ ＮａＣｌを含む２０mM 酢酸アンモニウム（pH
５．１）にて溶出し、精製を行った。精製ＡＧＰＲの純
度は約９０％であり、ローリー法の変法による蛋白定量
により、濃度は１３０μg ／mlであった。
ト剖検肝（胃癌で亡くなった患者）１８０ｇを細かく切
り、５mM ＥＤＴＡ、１mM フェニルメチルスルホニル
フルオライドを含む５０mM トリス塩酸緩衝液（以下
「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ」という）（pH７．８，洗浄液１）
で洗浄した後、洗浄液１の９００mlを用いてポリトロン
ブレンダーにてホモジナイズした。懸濁液を８００×
ｇ、１０分間遠心し、上清を１００，０００×ｇ、９０
分間遠心した。得られたペレットを精製水にて再懸濁
後、９倍量のコールドアセトンを加え、濾過にてアセト
ンパウダーを回収した。回収したアセトンパウダー２０
ｇを、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．８）で洗浄後、０．４Ｍ ＫＣｌ、１％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．８）３００mlで抽出した。抽出液を１，２
００×ｇ、１５分間遠心し、上清を回収し、終濃度２５
mMになるようにＣａＣｌ2 を添加した後、Ｄ−ガラクト
ース−アガロースゲルに吸着させた。ＡＧＰＲは１．２
５Ｍ ＮａＣｌを含む２０mM 酢酸アンモニウム（pH
５．１）にて溶出し、精製を行った。精製ＡＧＰＲの純
度は約９０％であり、ローリー法の変法による蛋白定量
により、濃度は１３０μg ／mlであった。
【００３１】参考例２ モノクローナル抗体の調製：（１）免疫 参考例１で精製したＡＧＰＲの２０μg を１回の免疫に
使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュバントを
用い、追加免疫ではフロインドの完全アジュバント及び
不完全アジュバントの１：１の混合液を使用した。ＡＧ
ＰＲ１００μlとフロインドのアジュバント１００μl
を混合し、得られたエマルジョン２００μl を１回の免
疫につき１匹のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスの腹腔に注射
し、４回免疫を２週間間隔で繰り返した。また、フロイ
ンドのアジュバントの他、フナコシより市販されている
リビ−アジュバントシステムの変法により免疫を行っ
た。本免疫エマルジョンの作成は次の操作により行っ
た。すなわち、ポッターホモジナイザーを使用し、グラ
インダーチューブに精製ＡＧＰＲ２０μg を加え、窒素
を吹き付けて乾固させ、更に、クロロホルム：メタノー
ル＝４：１の混合液に溶解しているトレハロースジミコ
ール酸（ＴＤＭ）及びモノリン酸リピッドＡ（ＭＰＬ）
を加え、窒素を吹き付け乾固させた。本チューブにスク
アレン４μl を加え、スリーワンモーターにセットした
テフロン棒にて抗原、アジュバント及びスクアレンを
１，２００rpm で３分間混合した。その後、０．２％
Ｔｗｅｅｎ ８０、０．７２％ ＮａＣｌを含む１３mM
リン酸緩衝液（pH７．２）２００μl を加え、１，２
００rpm で４分間混合し、免疫エマルジョンを作成し
た。得られたエマルジョン２００μl を１回の免疫につ
き１匹のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス腹腔に注射し、４回免
疫を２週間間隔で繰り返した。なお、初回免疫ではＴＤ
Ｍ５０μg 、ＭＰＬ５０μg を、追加免疫ではＴＤＭ５
０μg 、ＭＰＬ５μg を使用した。この２方法により免
疫したマウスの眼底静脈から採血し、抗体価をＥＬＩＳ
Ａ法で測定して、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合
に使用した。
使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュバントを
用い、追加免疫ではフロインドの完全アジュバント及び
不完全アジュバントの１：１の混合液を使用した。ＡＧ
ＰＲ１００μlとフロインドのアジュバント１００μl
を混合し、得られたエマルジョン２００μl を１回の免
疫につき１匹のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスの腹腔に注射
し、４回免疫を２週間間隔で繰り返した。また、フロイ
ンドのアジュバントの他、フナコシより市販されている
リビ−アジュバントシステムの変法により免疫を行っ
た。本免疫エマルジョンの作成は次の操作により行っ
た。すなわち、ポッターホモジナイザーを使用し、グラ
インダーチューブに精製ＡＧＰＲ２０μg を加え、窒素
を吹き付けて乾固させ、更に、クロロホルム：メタノー
ル＝４：１の混合液に溶解しているトレハロースジミコ
ール酸（ＴＤＭ）及びモノリン酸リピッドＡ（ＭＰＬ）
を加え、窒素を吹き付け乾固させた。本チューブにスク
アレン４μl を加え、スリーワンモーターにセットした
テフロン棒にて抗原、アジュバント及びスクアレンを
１，２００rpm で３分間混合した。その後、０．２％
Ｔｗｅｅｎ ８０、０．７２％ ＮａＣｌを含む１３mM
リン酸緩衝液（pH７．２）２００μl を加え、１，２
００rpm で４分間混合し、免疫エマルジョンを作成し
た。得られたエマルジョン２００μl を１回の免疫につ
き１匹のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス腹腔に注射し、４回免
疫を２週間間隔で繰り返した。なお、初回免疫ではＴＤ
Ｍ５０μg 、ＭＰＬ５０μg を、追加免疫ではＴＤＭ５
０μg 、ＭＰＬ５μg を使用した。この２方法により免
疫したマウスの眼底静脈から採血し、抗体価をＥＬＩＳ
Ａ法で測定して、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合
に使用した。
【００３２】（２）細胞融合 ４回目の免疫から１ケ月後、生理食塩水２００μl に希
釈した精製ＡＧＰＲ２０μg をマウス腹腔に注射し、そ
の３日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓を
ＲＰＭＩ １６４０培地中、ピンセット及びスライドグ
ラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。こ
れを１，５００rpm で５分間遠心して脾細胞を集め、更
に同培地で洗浄、遠心した。最終的に１５％牛胎児血清
（ＦＣＳ）を含む同培地２mlを加え、脾細胞懸濁液を調
製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ／臭化
エチジュウム溶液（各０．１mgをＰＢＳ１mlに溶解）と
懸濁液を１：１で混ぜ、蛍光顕微鏡下で数えた。生きた
脾細胞１０8 個と、予め培養しておいた対数増殖期のマ
ウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１
４の１０7 個を混合した後、１，５００rpm で５分間遠
心した。上清を除去後、細胞をよく解きほぐした後、Ｇ
ＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコ
ース：２ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ4：１．４１ｇ，ＮａＨ2ＰＯ4
・２Ｈ2Ｏ：０．７８ｇを精製水１ｌに溶解したもの）
にて懸濁し、１，５００rpm で５分間遠心を行い、細胞
の洗浄を行った。同洗浄を繰り返した後、５０％（ｗ／
ｖ）のポリエチレングリコール１５４０を含むＧＫＮ溶
液０．５mlを徐々に加え、静かに１分間攪拌した。これ
にＧＫＮ溶液１０mlを徐々に静かに加えて反応を停止さ
せ、１，５００rpm で５分間遠心した。得られた細胞を
１５％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０の３０mlに浮
遊し、ＨＡＴ培地（１０-4Ｍヒポキサンチン、４×１０
-7Ｍアミノプテリン、１．５×１０-5Ｍチミジン及び１
５％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地）及びフィダ
ー細胞が含まれる（１ウエル当り２００μl ）９６穴マ
イクロカルチャープレート３枚に、１ウエル当り０．１
mlづつ分注し、３７℃、５％ 炭酸ガス培養器中で培養
した。１０日後に全てのウエルで融合細胞の増殖を確認
した。
釈した精製ＡＧＰＲ２０μg をマウス腹腔に注射し、そ
の３日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓を
ＲＰＭＩ １６４０培地中、ピンセット及びスライドグ
ラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。こ
れを１，５００rpm で５分間遠心して脾細胞を集め、更
に同培地で洗浄、遠心した。最終的に１５％牛胎児血清
（ＦＣＳ）を含む同培地２mlを加え、脾細胞懸濁液を調
製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ／臭化
エチジュウム溶液（各０．１mgをＰＢＳ１mlに溶解）と
懸濁液を１：１で混ぜ、蛍光顕微鏡下で数えた。生きた
脾細胞１０8 個と、予め培養しておいた対数増殖期のマ
ウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１
４の１０7 個を混合した後、１，５００rpm で５分間遠
心した。上清を除去後、細胞をよく解きほぐした後、Ｇ
ＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコ
ース：２ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ4：１．４１ｇ，ＮａＨ2ＰＯ4
・２Ｈ2Ｏ：０．７８ｇを精製水１ｌに溶解したもの）
にて懸濁し、１，５００rpm で５分間遠心を行い、細胞
の洗浄を行った。同洗浄を繰り返した後、５０％（ｗ／
ｖ）のポリエチレングリコール１５４０を含むＧＫＮ溶
液０．５mlを徐々に加え、静かに１分間攪拌した。これ
にＧＫＮ溶液１０mlを徐々に静かに加えて反応を停止さ
せ、１，５００rpm で５分間遠心した。得られた細胞を
１５％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０の３０mlに浮
遊し、ＨＡＴ培地（１０-4Ｍヒポキサンチン、４×１０
-7Ｍアミノプテリン、１．５×１０-5Ｍチミジン及び１
５％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地）及びフィダ
ー細胞が含まれる（１ウエル当り２００μl ）９６穴マ
イクロカルチャープレート３枚に、１ウエル当り０．１
mlづつ分注し、３７℃、５％ 炭酸ガス培養器中で培養
した。１０日後に全てのウエルで融合細胞の増殖を確認
した。
【００３３】（３）抗ＡＧＰＲ抗体産生ハイブリドーマ
の選択とクローン化 培養上清中の抗ＡＧＰＲ抗体の存在の有無をＥＬＩＳＡ
法で測定した。すなわち、精製ＡＧＰＲを固相化した９
６穴マイクロプレートを用いてスクリーニングを行っ
た。詳細には、ＡＧＰＲを、０．７２％ ＮａＣｌを含
む１３mM リン酸緩衝液（pH７．２；ＰＢＳ）で希釈し
て０．２μg ／mlに調製し、５０μl ／ウエルの割合で
９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置し
た。これを１％ ウシ血清アルブミン、０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（pH７．２；ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ）で３回洗浄した。各プレートの各ウエルに培養上清
５０μl を加え、３７℃で１時間保温した。次いで、Ｐ
ＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１，０００倍に希
釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ
部位に特異的，ヤギ由来）を５０μl 加え、３７℃で１
時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄後、１１mM オ
ルトフェニレンジアミン、０．０２％ 過酸化水素水を
含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）を５０μl ／
ウエル加えて室温で３０分間反応させた後、４．５Ｍ
硫酸を５０μl ／ウエル加えて反応を停止させた。この
反応において、５５０nmでの吸光度が高い結果を示した
上清を得たウエルを選択した。
の選択とクローン化 培養上清中の抗ＡＧＰＲ抗体の存在の有無をＥＬＩＳＡ
法で測定した。すなわち、精製ＡＧＰＲを固相化した９
６穴マイクロプレートを用いてスクリーニングを行っ
た。詳細には、ＡＧＰＲを、０．７２％ ＮａＣｌを含
む１３mM リン酸緩衝液（pH７．２；ＰＢＳ）で希釈し
て０．２μg ／mlに調製し、５０μl ／ウエルの割合で
９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置し
た。これを１％ ウシ血清アルブミン、０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（pH７．２；ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ）で３回洗浄した。各プレートの各ウエルに培養上清
５０μl を加え、３７℃で１時間保温した。次いで、Ｐ
ＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１，０００倍に希
釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ
部位に特異的，ヤギ由来）を５０μl 加え、３７℃で１
時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄後、１１mM オ
ルトフェニレンジアミン、０．０２％ 過酸化水素水を
含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）を５０μl ／
ウエル加えて室温で３０分間反応させた後、４．５Ｍ
硫酸を５０μl ／ウエル加えて反応を停止させた。この
反応において、５５０nmでの吸光度が高い結果を示した
上清を得たウエルを選択した。
【００３４】ＥＬＩＳＡで陽性のウエルについては、ウ
エスタンブロットにおいて他の動物由来のＡＧＰＲとの
反応性を確認し、交差反応を示すモノクローナル抗体の
選択を行った。すなわち、上記ＡＧＰＲの精製に従い、
ウサギ、ラット（ＳＤ）、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の肝
臓よりアセトンパウダーを調製し、その抽出液を４−２
０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、１ウエル当り１０μ
l アプライした。これらサンプルを電気泳動後、陽極液
１：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、２０％ メタノール；陽極液
２；２５mM Ｔｒｉｓ、２０％ メタノール；陰極液：
２５mM Ｔｒｉｓ、４０mM ε−アミノ−ｎ−カプロン
酸、２０％ メタノールの緩衝液を用いたセミドライブ
ロティングにて８０mA、１時間でポリビニリデンジフル
オライド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。ＰＶＤＦ膜は、１
０％ スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩ブロッ
キングした後、今回得た各モノクローナル抗体を反応さ
せた。転写膜を短冊状に切り、短冊当り各ハイブリドー
マの培養上清５００μl を室温で１時間反応させた後、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ
Ｔ）で３回洗浄し、１％ ウマ血清を含むＰＢＳで２０
０倍に希釈したビオチン標識抗マウスＩｇＧウマ抗体５
００μl を室温で１時間反応させた。更に、ＰＢＳＴで
３回洗浄後、ＰＢＳで５０倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識アビジンＤＨ−ビオチン５００μl を室温で３０
分間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄後、５０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）１００mlにジアミノベンチジ
ン２５mg、過酸化水素２０μl を含む基質液を加え酵素
反応を行った。バンドが確認でき次第、水洗にて反応停
止を行った。その結果は表１に示すとおりであり、得ら
れたモノクローナル抗体がヒトＡＧＰＲと反応すること
を確認するとともに、他の動物由来のＡＧＰＲとも交差
反応を示すことを確認した。
エスタンブロットにおいて他の動物由来のＡＧＰＲとの
反応性を確認し、交差反応を示すモノクローナル抗体の
選択を行った。すなわち、上記ＡＧＰＲの精製に従い、
ウサギ、ラット（ＳＤ）、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の肝
臓よりアセトンパウダーを調製し、その抽出液を４−２
０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、１ウエル当り１０μ
l アプライした。これらサンプルを電気泳動後、陽極液
１：０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、２０％ メタノール；陽極液
２；２５mM Ｔｒｉｓ、２０％ メタノール；陰極液：
２５mM Ｔｒｉｓ、４０mM ε−アミノ−ｎ−カプロン
酸、２０％ メタノールの緩衝液を用いたセミドライブ
ロティングにて８０mA、１時間でポリビニリデンジフル
オライド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。ＰＶＤＦ膜は、１
０％ スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩ブロッ
キングした後、今回得た各モノクローナル抗体を反応さ
せた。転写膜を短冊状に切り、短冊当り各ハイブリドー
マの培養上清５００μl を室温で１時間反応させた後、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ
Ｔ）で３回洗浄し、１％ ウマ血清を含むＰＢＳで２０
０倍に希釈したビオチン標識抗マウスＩｇＧウマ抗体５
００μl を室温で１時間反応させた。更に、ＰＢＳＴで
３回洗浄後、ＰＢＳで５０倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識アビジンＤＨ−ビオチン５００μl を室温で３０
分間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄後、５０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）１００mlにジアミノベンチジ
ン２５mg、過酸化水素２０μl を含む基質液を加え酵素
反応を行った。バンドが確認でき次第、水洗にて反応停
止を行った。その結果は表１に示すとおりであり、得ら
れたモノクローナル抗体がヒトＡＧＰＲと反応すること
を確認するとともに、他の動物由来のＡＧＰＲとも交差
反応を示すことを確認した。
【００３５】
【表１】
【００３６】次に、単クローン化は限界希釈法で行っ
た。すなわち、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウ
スの胸腺細胞を、１ウエル当り１０6個／０．２mlづつ
分注した９６穴マイクロカルチャープレートに、特異抗
体陽性ウエル中のハイブリドーマを１０個／mlとなるよ
うに希釈したものを０．１mlずつ分注した。培地は初回
はＨＡＴ培地を、２回目はＨＴ培地を、３回目以降は１
５％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０を用い、３７
℃、５％ 炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。ＥＬ
ＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈
法による単クローン化操作を各３回繰り返した。その結
果、抗ＡＧＰＲ−モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ２４株を確立した。
た。すなわち、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウ
スの胸腺細胞を、１ウエル当り１０6個／０．２mlづつ
分注した９６穴マイクロカルチャープレートに、特異抗
体陽性ウエル中のハイブリドーマを１０個／mlとなるよ
うに希釈したものを０．１mlずつ分注した。培地は初回
はＨＡＴ培地を、２回目はＨＴ培地を、３回目以降は１
５％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０を用い、３７
℃、５％ 炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。ＥＬ
ＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈
法による単クローン化操作を各３回繰り返した。その結
果、抗ＡＧＰＲ−モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ２４株を確立した。
【００３７】参考例３ モノクローナル抗体の分離及び精製：参考例２の方法に
よって得た抗ＡＧＰＲ−モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマをマウス腹腔内で培養してモノクローナル抗体
を得た。前処理として、８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの
腹腔内に０．５mlのブリスタン（２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン）を投与した。８日後、０．
５mlのＲＰＭＩ １６４０培地に浮遊したハイブリドー
マ４〜１５（×１０5個）を、このマウスの腹腔内に投
与した。投与後９日目から腹水を繰り返し採取してプー
ルした。集めた腹水は３，０００rpm で１０分間遠心分
離を行い、細胞等の不溶物を除去した。上清部分に等容
の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一
夜、４℃に放置して得られた沈澱を遠心分離によって回
収した。沈澱を２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH
８．０）に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに透析内容物を吸着させ
た後、同緩衝液中、０−０．３ＭのＮａＣｌ直線濃度勾
配で溶出させ精製抗体を得た。
よって得た抗ＡＧＰＲ−モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマをマウス腹腔内で培養してモノクローナル抗体
を得た。前処理として、８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの
腹腔内に０．５mlのブリスタン（２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン）を投与した。８日後、０．
５mlのＲＰＭＩ １６４０培地に浮遊したハイブリドー
マ４〜１５（×１０5個）を、このマウスの腹腔内に投
与した。投与後９日目から腹水を繰り返し採取してプー
ルした。集めた腹水は３，０００rpm で１０分間遠心分
離を行い、細胞等の不溶物を除去した。上清部分に等容
の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一
夜、４℃に放置して得られた沈澱を遠心分離によって回
収した。沈澱を２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH
８．０）に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに透析内容物を吸着させ
た後、同緩衝液中、０−０．３ＭのＮａＣｌ直線濃度勾
配で溶出させ精製抗体を得た。
【００３８】参考例４ モノクローナル抗体組み合せの選定：参考例３で得られ
た精製モノクローナル抗体の内、参考例２（３）のスク
リーニングで発色値の低かった抗体、ウエスタンブロッ
ティングで反応性が類似していた抗体及びサブクラスが
γ２ｂであった抗体を除き、固相化抗体として３０２０
１、３０２０２、３０２０３、３０２０４、３０２０
８、３０２１４、３０２１５、３０２１６、３０２１
８、３０２１９、３０２２０、３０２２１、３０２２
２、３０２２５を、酵素標識抗体として３０２０１、３
０２０２、３０２０３、３０２０８、３０２１０、３０
２１４、３０２１６、３０２１８、３０２１９、３０２
２０、３０２２１、３０２２２、３０２２５を選択して
ＥＬＩＳＡを行い、ＡＧＰＲ測定に適した組み合せの選
定を行った。抗体の酵素標識は参考例６に従い、精製Ｉ
ｇＧを用いて行った。
た精製モノクローナル抗体の内、参考例２（３）のスク
リーニングで発色値の低かった抗体、ウエスタンブロッ
ティングで反応性が類似していた抗体及びサブクラスが
γ２ｂであった抗体を除き、固相化抗体として３０２０
１、３０２０２、３０２０３、３０２０４、３０２０
８、３０２１４、３０２１５、３０２１６、３０２１
８、３０２１９、３０２２０、３０２２１、３０２２
２、３０２２５を、酵素標識抗体として３０２０１、３
０２０２、３０２０３、３０２０８、３０２１０、３０
２１４、３０２１６、３０２１８、３０２１９、３０２
２０、３０２２１、３０２２２、３０２２５を選択して
ＥＬＩＳＡを行い、ＡＧＰＲ測定に適した組み合せの選
定を行った。抗体の酵素標識は参考例６に従い、精製Ｉ
ｇＧを用いて行った。
【００３９】固相化用の抗体をＰＢＳで希釈して２μg
／mlに調製し、５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイク
ロプレートに分注し、４℃で一夜放置した。これを１％
ウシ血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０
を含むＰＢＳ pH７．２（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄
した。各プレートの各ウエルに、４倍希釈したヒト血清
あるいは１０倍希釈したヒト肝癌細胞株の細胞溶解液５
０μl を加え、４℃で一晩反応させた。次いで、ＰＢＳ
で３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１００倍に希釈した各
酵素標識モノクローナル抗体を５０μl 加え、４℃で一
晩反応させた。これをＰＢＳで５回洗浄後、１１mM オ
ルトフェニレンジアミン、０．０２％過酸化水素水を含
むクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）を５０μl ／ウ
エル加え、室温で３０分間反応させた後、４．５Ｍ 硫
酸を５０μl ／ウエル加えて反応を停止させ、４９２nm
の吸光度を測定した。その結果を表２及び３に示す。
／mlに調製し、５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイク
ロプレートに分注し、４℃で一夜放置した。これを１％
ウシ血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０
を含むＰＢＳ pH７．２（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄
した。各プレートの各ウエルに、４倍希釈したヒト血清
あるいは１０倍希釈したヒト肝癌細胞株の細胞溶解液５
０μl を加え、４℃で一晩反応させた。次いで、ＰＢＳ
で３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１００倍に希釈した各
酵素標識モノクローナル抗体を５０μl 加え、４℃で一
晩反応させた。これをＰＢＳで５回洗浄後、１１mM オ
ルトフェニレンジアミン、０．０２％過酸化水素水を含
むクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）を５０μl ／ウ
エル加え、室温で３０分間反応させた後、４．５Ｍ 硫
酸を５０μl ／ウエル加えて反応を停止させ、４９２nm
の吸光度を測定した。その結果を表２及び３に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】参考例５ 固相化プレートの作成：参考例３の方法によって精製し
た抗ＡＧＰＲ−モノクローナル抗体（３０２２０）をＮ
ＵＮＣ社のマイクロプレートに固相化した。すなわち、
１５０mM ＮａＣｌを含む５０mMの炭酸緩衝液（pH９．
６）に、３０２２０が２μg ／mlとなるように希釈し、
１ウエル当り１００μl を加え、４℃で３時間インキュ
ベイションした。溶液を吸引除去後、１％ ＢＳＡ及び
５％ シュクロースを含むリン酸緩衝液（pH７．２）を
１ウエル当り３００μl 加え、室温で１時間インキュベ
イションした後、溶液を吸引除去し、オートドライデシ
ケーターにて室温で一晩乾燥させ、抗体固相化プレート
を作成した。
た抗ＡＧＰＲ−モノクローナル抗体（３０２２０）をＮ
ＵＮＣ社のマイクロプレートに固相化した。すなわち、
１５０mM ＮａＣｌを含む５０mMの炭酸緩衝液（pH９．
６）に、３０２２０が２μg ／mlとなるように希釈し、
１ウエル当り１００μl を加え、４℃で３時間インキュ
ベイションした。溶液を吸引除去後、１％ ＢＳＡ及び
５％ シュクロースを含むリン酸緩衝液（pH７．２）を
１ウエル当り３００μl 加え、室温で１時間インキュベ
イションした後、溶液を吸引除去し、オートドライデシ
ケーターにて室温で一晩乾燥させ、抗体固相化プレート
を作成した。
【００４３】参考例６ 酵素標識抗体の作成：抗体を標識する酵素として西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用い、中根らの方法
（Ｎａｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅ
ｍ．２２：１０８４，１９７４年）に従って標識した。
すなわち、Ｆ（ａｂ’）2に断片化した３０２０１モノ
クローナル抗体の２８０nmにおける吸光度で５OD相当を
０．２Ｍ炭酸緩衝液（pH９．５）で透析し、コロジオン
バックで約１mlにまで濃縮した。ＨＲＰ５mgを１mlの精
製水に溶かし、０．１Ｍ ＮａＩＯ4 ７５μl を加
え、室温で２０分間攪拌し、これを１mM 酢酸緩衝液
（pH４．０）に対して透析し、pHを４程度に下げた。
０．２Ｍ 炭酸緩衝液（pH９．５）を１００μl 加えて
pHを９付近にし、前記のモノクローナル抗体溶液と混合
して室温で２時間攪拌し、Ｆ（ａｂ’）2とＨＲＰの標
識を行った。４mg／ml ＮａＢＨ4 １００μl を加え
ることにより反応を停止させた後、ＦＰＬＣを用いたゲ
ル濾過法によりＦ（ａｂ’）2−ＨＲＰの精製を行っ
た。
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用い、中根らの方法
（Ｎａｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅ
ｍ．２２：１０８４，１９７４年）に従って標識した。
すなわち、Ｆ（ａｂ’）2に断片化した３０２０１モノ
クローナル抗体の２８０nmにおける吸光度で５OD相当を
０．２Ｍ炭酸緩衝液（pH９．５）で透析し、コロジオン
バックで約１mlにまで濃縮した。ＨＲＰ５mgを１mlの精
製水に溶かし、０．１Ｍ ＮａＩＯ4 ７５μl を加
え、室温で２０分間攪拌し、これを１mM 酢酸緩衝液
（pH４．０）に対して透析し、pHを４程度に下げた。
０．２Ｍ 炭酸緩衝液（pH９．５）を１００μl 加えて
pHを９付近にし、前記のモノクローナル抗体溶液と混合
して室温で２時間攪拌し、Ｆ（ａｂ’）2とＨＲＰの標
識を行った。４mg／ml ＮａＢＨ4 １００μl を加え
ることにより反応を停止させた後、ＦＰＬＣを用いたゲ
ル濾過法によりＦ（ａｂ’）2−ＨＲＰの精製を行っ
た。
【００４４】実施例１ 各処方での反応性比較：検体希釈液及び酵素標識抗体溶
液として次の（１）〜（４）のものを用いた場合につい
て、反応性を比較した。 （１）検体希釈液及び酵素標識抗体溶液が処方１（１％
ＢＳＡ，１２３Mm ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ ２０を含む１３mMリン酸緩衝液；pH７．２）の場
合、（２）検体希釈液が処方２（２％ ＢＳＡ，１５０
mM ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１０
０mM リン酸緩衝液；pH６．２）であり、酵素標識抗体
溶液がフェノールを含まない処方３（０．１％ ＢＳ
Ａ，１５０mM ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２
０を含む２０mM ＢＥＳ緩衝液；pH７．０）の場合、
（３）検体希釈液が処方１であり、酵素標識抗体溶液が
フェノールを含む処方１（０．１％ ＢＳＡ，１２３mM
ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．１％
フェノールを含む１３mM リン酸緩衝液；pH７．２）
の場合、（４）検体希釈液が処方２であり、酵素標識抗
体溶液が０．１％フェノールを含む処方３の場合。すな
わち、精製ＡＧＰＲが２５、１２．５、５、２．５ng／
mlとなるように各緩衝液で希釈し、参考例５で作成した
固相化プレートに１ウエル当り２００μlを加え、室温
で一晩反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄後、２８０nmに
おける吸光度が１mOD となるように各緩衝液で希釈した
酵素標識抗体を１ウエル当り１００μl 添加し、室温で
１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、基質溶液
（１１mM オルトフェニレンジアミン、０．０２％ 過
酸化水素を含むクエン酸緩衝液；pH５．０）を１ウエル
当り１００μl 加え、室温で１０分間反応させた後、
１．５Ｎ 硫酸を１ウエル当り１００μl 加え、４９２
nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定
した。その結果を図１に示す。
液として次の（１）〜（４）のものを用いた場合につい
て、反応性を比較した。 （１）検体希釈液及び酵素標識抗体溶液が処方１（１％
ＢＳＡ，１２３Mm ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ ２０を含む１３mMリン酸緩衝液；pH７．２）の場
合、（２）検体希釈液が処方２（２％ ＢＳＡ，１５０
mM ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１０
０mM リン酸緩衝液；pH６．２）であり、酵素標識抗体
溶液がフェノールを含まない処方３（０．１％ ＢＳ
Ａ，１５０mM ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２
０を含む２０mM ＢＥＳ緩衝液；pH７．０）の場合、
（３）検体希釈液が処方１であり、酵素標識抗体溶液が
フェノールを含む処方１（０．１％ ＢＳＡ，１２３mM
ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．１％
フェノールを含む１３mM リン酸緩衝液；pH７．２）
の場合、（４）検体希釈液が処方２であり、酵素標識抗
体溶液が０．１％フェノールを含む処方３の場合。すな
わち、精製ＡＧＰＲが２５、１２．５、５、２．５ng／
mlとなるように各緩衝液で希釈し、参考例５で作成した
固相化プレートに１ウエル当り２００μlを加え、室温
で一晩反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄後、２８０nmに
おける吸光度が１mOD となるように各緩衝液で希釈した
酵素標識抗体を１ウエル当り１００μl 添加し、室温で
１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、基質溶液
（１１mM オルトフェニレンジアミン、０．０２％ 過
酸化水素を含むクエン酸緩衝液；pH５．０）を１ウエル
当り１００μl 加え、室温で１０分間反応させた後、
１．５Ｎ 硫酸を１ウエル当り１００μl 加え、４９２
nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定
した。その結果を図１に示す。
【００４５】図１の結果から明らかなように、検体希釈
液をpH６．２にした場合及び／又は酵素標識抗体溶液に
フェノールを含有せしめた場合には、より高感度にＡＧ
ＰＲ濃度を測定することができる。
液をpH６．２にした場合及び／又は酵素標識抗体溶液に
フェノールを含有せしめた場合には、より高感度にＡＧ
ＰＲ濃度を測定することができる。
【００４６】実施例２ 同時再現性及び日差再現性：参考例５にて調製した固相
化プレート、検体希釈液（２％ ＢＳＡ、１５０mMＮａ
Ｃｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１００mM
リン酸緩衝液；pH６．２）及び２８０nmにおける吸光度
が１mOD の酵素標識抗体を含む溶液（０．１％ ＢＳ
Ａ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２
０、０．１％フェノールを含む２０mM ＢＥＳ緩衝液；
pH７．０）を用い、各濃度の血清を４倍希釈して測定し
た時の本測定系の同時再現性及び日差再現性を測定し
た。すなわち、４倍希釈した各濃度の血清を１ウエル当
り２００μl 加え、室温で一晩反応させた。以下の操作
は、実施例１と同様に行った。同時再現性及び日差再現
性の結果を表４に示した。そのバラツキはＡＧＰＲ濃度
により異なり、それぞれ４〜１４％、７〜１４％であっ
た。
化プレート、検体希釈液（２％ ＢＳＡ、１５０mMＮａ
Ｃｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１００mM
リン酸緩衝液；pH６．２）及び２８０nmにおける吸光度
が１mOD の酵素標識抗体を含む溶液（０．１％ ＢＳ
Ａ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２
０、０．１％フェノールを含む２０mM ＢＥＳ緩衝液；
pH７．０）を用い、各濃度の血清を４倍希釈して測定し
た時の本測定系の同時再現性及び日差再現性を測定し
た。すなわち、４倍希釈した各濃度の血清を１ウエル当
り２００μl 加え、室温で一晩反応させた。以下の操作
は、実施例１と同様に行った。同時再現性及び日差再現
性の結果を表４に示した。そのバラツキはＡＧＰＲ濃度
により異なり、それぞれ４〜１４％、７〜１４％であっ
た。
【００４７】
【表４】
【００４８】実施例３ 添加回収試験：実施例２と同様にして、各濃度の精度Ａ
ＧＰＲを添加した血清を４倍希釈して測定した時の本測
定系の回収試験を行った。その結果を表５に示した。回
収率は、９３〜９９％であった。
ＧＰＲを添加した血清を４倍希釈して測定した時の本測
定系の回収試験を行った。その結果を表５に示した。回
収率は、９３〜９９％であった。
【００４９】
【表５】
【００５０】実施例４ フェノール添加試験：実施例１で用いた検体希釈液（処
方２）で１２．５ng／mlとなるように希釈したＡＧＰＲ
溶液を参考例５にて調製した固相化プレートに１ウエル
当り２００μl 加え室温で一晩反応させた。ＰＢＳＴで
３回洗浄後、各濃度（０％，０．００１％，０．０１
％，０．０５％，０．１％）のフェノール及び２８０nm
における吸光度が１mOD の酵素標識抗体を含む酵素標識
抗体溶液を１ウエル当り１００μl 加え室温で１時間反
応させた。以下の操作は実施例１に従って行った。結果
を表６に示す。
方２）で１２．５ng／mlとなるように希釈したＡＧＰＲ
溶液を参考例５にて調製した固相化プレートに１ウエル
当り２００μl 加え室温で一晩反応させた。ＰＢＳＴで
３回洗浄後、各濃度（０％，０．００１％，０．０１
％，０．０５％，０．１％）のフェノール及び２８０nm
における吸光度が１mOD の酵素標識抗体を含む酵素標識
抗体溶液を１ウエル当り１００μl 加え室温で１時間反
応させた。以下の操作は実施例１に従って行った。結果
を表６に示す。
【００５１】
【表６】
【００５２】実施例５ 肝臓切除術後のＡＧＰＲ測定：参考例５に順じ、ラット
及びヒトのＡＧＰＲと反応する３０２０８−モノクロー
ナル抗体を固相化したプレート、検体希釈液（２％ Ｂ
ＳＡ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ
２０を含む１００mM リン酸緩衝液；pH６．２）及び２
８０nmにおける吸光度が１mOD の酵素標識抗体を含む溶
液（０．１％ＢＳＡ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ フェノールを含む２０
mM ＢＥＳ緩衝液pH７．０）を用い、ラット肝臓の７０
％を切除した後の血清を４倍希釈して測定を行った。ラ
ットは術後、順調に生育した。詳細については、実施例
２に準じて測定を行った。その結果を図２に示した。良
好な経過を取ったラットでは術後にＡＧＰＲ値の上昇が
認められ（図２中、３）、肝再生の状態を把握している
と考えられた。
及びヒトのＡＧＰＲと反応する３０２０８−モノクロー
ナル抗体を固相化したプレート、検体希釈液（２％ Ｂ
ＳＡ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ
２０を含む１００mM リン酸緩衝液；pH６．２）及び２
８０nmにおける吸光度が１mOD の酵素標識抗体を含む溶
液（０．１％ＢＳＡ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ フェノールを含む２０
mM ＢＥＳ緩衝液pH７．０）を用い、ラット肝臓の７０
％を切除した後の血清を４倍希釈して測定を行った。ラ
ットは術後、順調に生育した。詳細については、実施例
２に準じて測定を行った。その結果を図２に示した。良
好な経過を取ったラットでは術後にＡＧＰＲ値の上昇が
認められ（図２中、３）、肝再生の状態を把握している
と考えられた。
【００５３】実施例６ 肝疾患検体のＡＧＰＲ測定：健常者２３８例、アルコー
ル性肝硬変９例、ウイルス性肝硬変１９例、ウイルス性
慢性活動性肝炎２３例の血清を用い、ＡＧＰＲ量を測定
した。測定法は実施例２に従って行い、その結果を表７
に示した。
ル性肝硬変９例、ウイルス性肝硬変１９例、ウイルス性
慢性活動性肝炎２３例の血清を用い、ＡＧＰＲ量を測定
した。測定法は実施例２に従って行い、その結果を表７
に示した。
【００５４】
【表７】
【００５５】表７の結果より、アルコール性肝硬変の血
清は、ＡＧＰＲ濃度が高いことが認められた。
清は、ＡＧＰＲ濃度が高いことが認められた。
【００５６】実施例７ 肝細胞培養上清中のＡＧＰＲ測定：ヒト肝癌細胞株（Ｈ
ｅｐＧ２）を、１０％ ＦＣＳを含むＭＥＭ培地を用い
てシャーレで培養後、コンフルエントになった時に培養
上清を除き、細胞を同培地で洗浄後、エタノール１００
mMを添加又は無添加で、３７℃で培養した。０．５、
１、２、３、４、５時間後に培養上清中（２００μl を
用いて）のＡＧＰＲ量を測定した。抗原の反応後の測定
方法については実施例２と同様に行った。結果を図３に
示す。
ｅｐＧ２）を、１０％ ＦＣＳを含むＭＥＭ培地を用い
てシャーレで培養後、コンフルエントになった時に培養
上清を除き、細胞を同培地で洗浄後、エタノール１００
mMを添加又は無添加で、３７℃で培養した。０．５、
１、２、３、４、５時間後に培養上清中（２００μl を
用いて）のＡＧＰＲ量を測定した。抗原の反応後の測定
方法については実施例２と同様に行った。結果を図３に
示す。
【図１】pHの相違及びフェノールの有無による反応性を
比較した図である。
比較した図である。
【図２】肝臓切除後のＡＧＰＲの変化を示す図である。
【図３】肝細胞培養上清中のＡＧＰＲの変化を示す図で
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 矢後 弘和 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一化 学薬品株式会社東京研究所内 (72)発明者 花田 尚 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一化 学薬品株式会社東京研究所内 (72)発明者 牛澤 幸司 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一化 学薬品株式会社東京研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 アシアログリコプロテインレセプターを
認識するモノクローナル抗体を被検体と接触させ、免疫
測定法によりアシアログリコプロテインレセプターを測
定する方法において、検体希釈液のpHを５．０〜７にす
ることを特徴とするアシアログリコプロテインレセプタ
ーの測定法。 - 【請求項２】 アシアログリコプロテインレセプターを
認識するモノクローナル抗体を被検体と接触させ、免疫
測定法によりアシアログリコプロテインレセプターを測
定する方法において、酵素標識抗体溶液にフェノールを
含有せしめることを特徴とするアシアログリコプロテイ
ンレセプターの測定法。 - 【請求項３】 アシアログリコプロテインレセプターを
認識するモノクローナル抗体を被検体と接触させ、免疫
測定法によりアシアログリコプロテインレセプターを測
定する方法において、酵素標識抗体溶液にフェノールを
含有せしめ、かつ検体希釈液のpHを５．０〜７にするこ
とを特徴とするアシアログリコプロテインレセプターの
測定法。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載のアシ
アログリコプロテインレセプターの測定法により肝細胞
から放出される培養上清中のアシアログリコプロテイン
レセプターを測定することを特徴とする治療薬のスクリ
ーニング方法。 - 【請求項５】 アシアログリコプロテインレセプターを
認識するモノクローナル抗体及びフェノールを含有する
アシアログリコプロテインレセプターの測定試薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08126894A JP3345507B2 (ja) | 1994-04-20 | 1994-04-20 | アシアログリコプロテインレセプターの測定法及びこれに用いる測定試薬 |
| DE69533586T DE69533586T2 (de) | 1994-04-20 | 1995-04-19 | Verfahren zum testen eines asialoglycoproteinrezeptors und testreagenz dafür |
| PCT/JP1995/000770 WO1995029403A1 (fr) | 1994-04-20 | 1995-04-19 | Methode de dosage du recepteur de l'asialoglycoproteine et reactif de dosage prevu a cet effet |
| AT95916013T ATE278193T1 (de) | 1994-04-20 | 1995-04-19 | Verfahren zum testen eines asialoglycoproteinrezeptors und testreagenz dafür |
| EP95916013A EP0757250B1 (en) | 1994-04-20 | 1995-04-19 | Method of assaying asialoglycoprotein receptor and assay reagent therefor |
| US08/722,153 US5843677A (en) | 1994-04-20 | 1995-04-19 | Method of assaying asialoglycoprotein receptor and assay reagent therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08126894A JP3345507B2 (ja) | 1994-04-20 | 1994-04-20 | アシアログリコプロテインレセプターの測定法及びこれに用いる測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07287014A true JPH07287014A (ja) | 1995-10-31 |
| JP3345507B2 JP3345507B2 (ja) | 2002-11-18 |
Family
ID=13741621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08126894A Expired - Lifetime JP3345507B2 (ja) | 1994-04-20 | 1994-04-20 | アシアログリコプロテインレセプターの測定法及びこれに用いる測定試薬 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5843677A (ja) |
| EP (1) | EP0757250B1 (ja) |
| JP (1) | JP3345507B2 (ja) |
| AT (1) | ATE278193T1 (ja) |
| DE (1) | DE69533586T2 (ja) |
| WO (1) | WO1995029403A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020034492A (ja) * | 2018-08-31 | 2020-03-05 | 東洋紡株式会社 | 生体試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法 |
| WO2023249294A1 (ko) * | 2022-06-20 | 2023-12-28 | 부산대학교 산학협력단 | Tsg-6를 유효성분으로 함유하는 간 재생 촉진 또는 간 기능 회복용 약학 조성물 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0956380A (ja) * | 1995-08-21 | 1997-03-04 | Tonen Corp | アシアロ糖蛋白質受容体誘導体及びその使用 |
| CN1300312C (zh) * | 2004-08-23 | 2007-02-14 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 靶向去唾液酸糖蛋白受体的抗乙型肝炎病毒反义寡核苷酸的结构和用途 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU147368A1 (ru) * | 1961-03-07 | 1961-11-30 | Ю.И. Пивоваров | Статический магнитный элемент пам ти |
| DE3509238A1 (de) * | 1985-03-14 | 1986-09-18 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Stabilisierung der aktivitaet von peroxidase in loesung |
| US4828983A (en) * | 1986-07-10 | 1989-05-09 | Eastman Kodak Company | Use of phenols and anilines to increase the rate of peroxidase catalyzed oxidation of leuco dyes |
| JP3018111B2 (ja) * | 1991-05-17 | 2000-03-13 | 第一化学薬品株式会社 | モノクローナル抗体及びアシアログリコプロテインレセプターの測定法 |
-
1994
- 1994-04-20 JP JP08126894A patent/JP3345507B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-19 EP EP95916013A patent/EP0757250B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-19 WO PCT/JP1995/000770 patent/WO1995029403A1/ja active IP Right Grant
- 1995-04-19 DE DE69533586T patent/DE69533586T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-19 AT AT95916013T patent/ATE278193T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-04-19 US US08/722,153 patent/US5843677A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020034492A (ja) * | 2018-08-31 | 2020-03-05 | 東洋紡株式会社 | 生体試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法 |
| WO2023249294A1 (ko) * | 2022-06-20 | 2023-12-28 | 부산대학교 산학협력단 | Tsg-6를 유효성분으로 함유하는 간 재생 촉진 또는 간 기능 회복용 약학 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1995029403A1 (fr) | 1995-11-02 |
| EP0757250A1 (en) | 1997-02-05 |
| ATE278193T1 (de) | 2004-10-15 |
| EP0757250B1 (en) | 2004-09-29 |
| EP0757250A4 (en) | 2003-06-11 |
| DE69533586D1 (de) | 2004-11-04 |
| US5843677A (en) | 1998-12-01 |
| JP3345507B2 (ja) | 2002-11-18 |
| DE69533586T2 (de) | 2006-02-16 |
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