JP3149960B2 - ヒト組織因子を定量する方法 - Google Patents
ヒト組織因子を定量する方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血中のヒト組織因子を
定量するための方法に関するものである。
定量するための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】組織因子は、血液凝固カスケード反応の
引き金を引くタンパク質である。即ち、組織因子が血中
に入ると血中に存在する血液凝固第VII因子（VII）と複
合体を形成し、複合体を形成したVIIは活性化され、そ
れは血液凝固第IX因子（IX）、血液凝固第Ｘ因子（Ｘ）
を活性化する。活性化されたIXはＸを活性化し、活性化
されたＸはプロトロンビンをトロンビンに活性化する。
このようなカスケード反応の結果生じたトロンビンは、
可溶性のフィブリノーゲンを不溶性のフィブリンに変え
ることで血液を凝固させる。このような血液凝固反応を
開始させる組織因子は通常、血中には存在しないが［Th
omas A. Drakeら、Am.J.Pathol. 134, 1087-1092,(198
9)］、何らかの原因で組織因子が血中に出てくると、血
管内で血液を凝固させ、血栓を形成させることが考えら
れる。この場合、もし血中の組織因子の量を高感度に定
量できれば、血栓形成の予知及び血栓症の早期診断、特
に広汎性血管内凝固（ＤＩＣ）の予知・診断が可能とな
る。
引き金を引くタンパク質である。即ち、組織因子が血中
に入ると血中に存在する血液凝固第VII因子（VII）と複
合体を形成し、複合体を形成したVIIは活性化され、そ
れは血液凝固第IX因子（IX）、血液凝固第Ｘ因子（Ｘ）
を活性化する。活性化されたIXはＸを活性化し、活性化
されたＸはプロトロンビンをトロンビンに活性化する。
このようなカスケード反応の結果生じたトロンビンは、
可溶性のフィブリノーゲンを不溶性のフィブリンに変え
ることで血液を凝固させる。このような血液凝固反応を
開始させる組織因子は通常、血中には存在しないが［Th
omas A. Drakeら、Am.J.Pathol. 134, 1087-1092,(198
9)］、何らかの原因で組織因子が血中に出てくると、血
管内で血液を凝固させ、血栓を形成させることが考えら
れる。この場合、もし血中の組織因子の量を高感度に定
量できれば、血栓形成の予知及び血栓症の早期診断、特
に広汎性血管内凝固（ＤＩＣ）の予知・診断が可能とな
る。
【０００３】血中に出てくる組織因子には、一般に、血
球等の細胞存在するものと、細胞から遊離した形で存在
するものとの２通りが考えられ、前者には、白血病細胞
や、ＬＰＳ刺激を受けた単球に存在する組織因子等があ
り、後者には上記細胞の壊れた破片に含まれる組織因
子、白血病細胞からシェディングにより放出される組織
因子［R.Bonaら、Thromb. Res. 48, p487-500 (198
7)］、損傷を受けた組織から血中に流入する組織因子等
がある。
球等の細胞存在するものと、細胞から遊離した形で存在
するものとの２通りが考えられ、前者には、白血病細胞
や、ＬＰＳ刺激を受けた単球に存在する組織因子等があ
り、後者には上記細胞の壊れた破片に含まれる組織因
子、白血病細胞からシェディングにより放出される組織
因子［R.Bonaら、Thromb. Res. 48, p487-500 (198
7)］、損傷を受けた組織から血中に流入する組織因子等
がある。
【０００４】これらの組織因子を定量する場合、細胞に
存在する組織因子に関してはこれらの細胞を分離してそ
の凝固活性を測る方法があり、また、細胞から遊離して
存在する組織因子に関しては、血液から血漿を分離し、
その凝固活性を測定する方法がある［K.Iijimaら, Thro
mb. Haemostas 62, p69 (1989)］。しかしながら、これ
らの組織因子の凝固活性を測定する方法は、操作がいず
れも煩雑であり、さらに血液の凝固機作は非常に複雑で
あることから測定する検体中には他の血液凝固を引き起
こす因子も含まれている可能性も高く、この活性測定法
が組織因子に由来する凝固活性を測定しているという確
証が得られないという問題もある。
存在する組織因子に関してはこれらの細胞を分離してそ
の凝固活性を測る方法があり、また、細胞から遊離して
存在する組織因子に関しては、血液から血漿を分離し、
その凝固活性を測定する方法がある［K.Iijimaら, Thro
mb. Haemostas 62, p69 (1989)］。しかしながら、これ
らの組織因子の凝固活性を測定する方法は、操作がいず
れも煩雑であり、さらに血液の凝固機作は非常に複雑で
あることから測定する検体中には他の血液凝固を引き起
こす因子も含まれている可能性も高く、この活性測定法
が組織因子に由来する凝固活性を測定しているという確
証が得られないという問題もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＤＩＣ等の血栓形成の
予知及び血栓症の早期診断に有用と考えられるヒト組織
因子を特異的に、高感度で、しかも簡易に測定できる方
法の開発が望まれている。
予知及び血栓症の早期診断に有用と考えられるヒト組織
因子を特異的に、高感度で、しかも簡易に測定できる方
法の開発が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】このような状況に於て、
本願発明者らは、組織因子に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を作製することに成功し、これを利用して、
血中の組織因子を特異的に、簡便迅速かつ高感度に定量
できる二抗体免疫測定法を完成させた。
本願発明者らは、組織因子に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を作製することに成功し、これを利用して、
血中の組織因子を特異的に、簡便迅速かつ高感度に定量
できる二抗体免疫測定法を完成させた。
【０００７】まず、本発明のモノクローナル抗体および
その調整法について概説する。本発明に基づくモノクロ
ーナル抗体は、ヒト組織因子を認識する。該モノクロー
ナル抗体は、ヒト組織因子を用いてマウスを免疫し、得
られる脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、
得られる融合細胞（ハイブリドーマ）からヒト組織因子
に反応する細胞を選択し、該細胞を培養することにより
調製することができる。
その調整法について概説する。本発明に基づくモノクロ
ーナル抗体は、ヒト組織因子を認識する。該モノクロー
ナル抗体は、ヒト組織因子を用いてマウスを免疫し、得
られる脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、
得られる融合細胞（ハイブリドーマ）からヒト組織因子
に反応する細胞を選択し、該細胞を培養することにより
調製することができる。
【０００８】このハイブリドーマの調製に関しては、Ko
hlerとMilsteinの方法［Nature 256, p495 (1975)］を
基に行う。免疫用マウスとしては、BALB/c系マウス、BA
LB/c系マウスと他系マウスとのF1マウスなどが用いられ
る。免疫はマウス１匹（６〜８週齢、20〜30ｇ）に対し
て抗原タンパク20〜200μｇを用いて２〜３週間ごとに
３〜６回行なう。なお、マウスの飼育及び脾臓細胞の採
取は常法に従う。ミエローマ細胞としては、MOPC-21NS/
1［Nature, 256, p495 (1975)］、SP2/0-Agl4［Nature,
277, p131 (1979)］、S194/5,XXO.8U.l［J. Exp. Me
d., 148, p313 (1978)］等が好適に用いられる。脾臓細
胞とミエローマ細胞は１対１〜10対１の割合で混合し、
融合はNaCl（約0.85％）、ジメチルスルホキシド（10〜
20％(v/v)）および分子量1,000〜6,000のポリエチレン
グリコールを含有するリン酸緩衝液（pH7.2〜7.4）中で
行なう。融合は両細胞の混合物を35〜37℃で１〜３分間
インキュベートすることによって行なう。融合細胞（ハ
イブリドーマ）の選択は、ヒポキサンチン（1.3〜1.4mg
／dl）、アミノプテリン（18〜20μｇ／dl）、チミジン
（375〜4000μｇ／dl）、ストレプトマイシン（50〜100
μｇ／ml）、ペニシリン（50〜100単位／ml）、グルタ
ミン（3.5〜4.0ｇ／ｌ）、牛胎児血清（10〜20％）を含
有する基礎培地を用い、生育してくる細胞として選択す
る。基礎培地としては、動物細胞の培養に一般に使用さ
れているRPMI-1640培地、EagleのMEM培地などが用いら
れる。融合細胞のクローン化は、限界希釈法にて少なく
とも３回繰り返して行なう。
hlerとMilsteinの方法［Nature 256, p495 (1975)］を
基に行う。免疫用マウスとしては、BALB/c系マウス、BA
LB/c系マウスと他系マウスとのF1マウスなどが用いられ
る。免疫はマウス１匹（６〜８週齢、20〜30ｇ）に対し
て抗原タンパク20〜200μｇを用いて２〜３週間ごとに
３〜６回行なう。なお、マウスの飼育及び脾臓細胞の採
取は常法に従う。ミエローマ細胞としては、MOPC-21NS/
1［Nature, 256, p495 (1975)］、SP2/0-Agl4［Nature,
277, p131 (1979)］、S194/5,XXO.8U.l［J. Exp. Me
d., 148, p313 (1978)］等が好適に用いられる。脾臓細
胞とミエローマ細胞は１対１〜10対１の割合で混合し、
融合はNaCl（約0.85％）、ジメチルスルホキシド（10〜
20％(v/v)）および分子量1,000〜6,000のポリエチレン
グリコールを含有するリン酸緩衝液（pH7.2〜7.4）中で
行なう。融合は両細胞の混合物を35〜37℃で１〜３分間
インキュベートすることによって行なう。融合細胞（ハ
イブリドーマ）の選択は、ヒポキサンチン（1.3〜1.4mg
／dl）、アミノプテリン（18〜20μｇ／dl）、チミジン
（375〜4000μｇ／dl）、ストレプトマイシン（50〜100
μｇ／ml）、ペニシリン（50〜100単位／ml）、グルタ
ミン（3.5〜4.0ｇ／ｌ）、牛胎児血清（10〜20％）を含
有する基礎培地を用い、生育してくる細胞として選択す
る。基礎培地としては、動物細胞の培養に一般に使用さ
れているRPMI-1640培地、EagleのMEM培地などが用いら
れる。融合細胞のクローン化は、限界希釈法にて少なく
とも３回繰り返して行なう。
【０００９】ハイブリドーマを通常の動物細胞の培養と
同様にして培養すれば、その結果培地中に本発明の抗体
を得ることができる。例えば、2〜5×106のハイブリド
ーマをストレプトマイシン（50〜100μｇ／ml）、ペニ
シリン（50〜100単位／ml）、グルタミン（3.5〜4.0g/
l）、牛胎児血清（10〜20％）を含有するRPMI-1640培地
10〜20mlを用い、フラスコ内で５％CO2存在下、35〜37
℃、３〜７日間培養することによって培養液中に抗体が
分泌、蓄積される。また、該ハイブリドーマをブリスタ
ン処理のヌードマウスまたはBALB/cマウスの腹腔内に移
植して増殖させることにより腹水中に本発明の抗体を蓄
積させることができる。すなわち、これらのマウス腹腔
内にブリスタン0.5〜1mlを接種し、その後２〜３週目に
腹腔に５×106〜１×107個のハイブリドーマを移植す
る。通常７〜１０日後に腹水が蓄積し、これを採取す
る。培養物および腹水中のモノクローナル抗体は、アフ
ィゲルプロテインＡ MAPS-IIキット（Bio-Rad社）を用
いたアフィニティークロマトグラフィーの手段等により
蓄積される。得られたモノクローナル抗体のイムノグロ
ブリンサブクラスの同定はゲル内沈降反応により行った
結果、IgG1-κであった。
同様にして培養すれば、その結果培地中に本発明の抗体
を得ることができる。例えば、2〜5×106のハイブリド
ーマをストレプトマイシン（50〜100μｇ／ml）、ペニ
シリン（50〜100単位／ml）、グルタミン（3.5〜4.0g/
l）、牛胎児血清（10〜20％）を含有するRPMI-1640培地
10〜20mlを用い、フラスコ内で５％CO2存在下、35〜37
℃、３〜７日間培養することによって培養液中に抗体が
分泌、蓄積される。また、該ハイブリドーマをブリスタ
ン処理のヌードマウスまたはBALB/cマウスの腹腔内に移
植して増殖させることにより腹水中に本発明の抗体を蓄
積させることができる。すなわち、これらのマウス腹腔
内にブリスタン0.5〜1mlを接種し、その後２〜３週目に
腹腔に５×106〜１×107個のハイブリドーマを移植す
る。通常７〜１０日後に腹水が蓄積し、これを採取す
る。培養物および腹水中のモノクローナル抗体は、アフ
ィゲルプロテインＡ MAPS-IIキット（Bio-Rad社）を用
いたアフィニティークロマトグラフィーの手段等により
蓄積される。得られたモノクローナル抗体のイムノグロ
ブリンサブクラスの同定はゲル内沈降反応により行った
結果、IgG1-κであった。
【００１０】本願発明のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ HTF-K14およびHTF-K180は、工業技術院
微生物工業研究所（微工研）に受託番号第11945号（FER
M-P11945）および受託番号第11946号（FERM-P11946）と
してそれぞれ寄託されている。
ハイブリドーマ HTF-K14およびHTF-K180は、工業技術院
微生物工業研究所（微工研）に受託番号第11945号（FER
M-P11945）および受託番号第11946号（FERM-P11946）と
してそれぞれ寄託されている。
【００１１】当該モノクローナル抗体を利用したサンド
イッチ二抗体免疫測定法を構築することにより血中組織
因子の簡易定量が可能となり、従来の活性測定法による
組織因子の測定法にあった煩雑さを克服し、さらに測定
における特異性を高めることが可能となる。
イッチ二抗体免疫測定法を構築することにより血中組織
因子の簡易定量が可能となり、従来の活性測定法による
組織因子の測定法にあった煩雑さを克服し、さらに測定
における特異性を高めることが可能となる。
【００１２】サンドイッチ二抗体免疫測定法の構築につ
いては特に制限されず、既存の免疫測定技術を応用する
ことが可能であるが、標識の手段としては、例えば酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍
光免疫測定法（ＦＩＡ）および発光免疫測定法（ＬＩ
Ａ）等の方法が好適に選択され得る。
いては特に制限されず、既存の免疫測定技術を応用する
ことが可能であるが、標識の手段としては、例えば酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍
光免疫測定法（ＦＩＡ）および発光免疫測定法（ＬＩ
Ａ）等の方法が好適に選択され得る。
【００１３】本発明の免疫測定方法は、血中に遊離した
組織因子のみならず、細胞に存在する組織因子を測定す
ることも可能である。その場合には、測定の対象となる
検体を界面活性剤で処理することにより、細胞に存在す
る組織因子を可溶化し、これを本発明の免疫測定法に処
することにより容易に細胞に存在する全組織因子を定量
することが可能となる。 界面活性剤としては、通常の
ものが使用されるが、例えばTriton X-100等がその好ま
しい一例として挙げられる。また、一般に、本発明のよ
うな免疫測定法においては、このように測定対象となる
検体を界面活性剤等で処理すると測定感度が低下するこ
とがあるが、本発明のモノクローナル抗体を利用した免
疫測定法においては、そのような障害が確認されなかっ
た。以下、本発明の理解を深めるために実施例に沿って
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
組織因子のみならず、細胞に存在する組織因子を測定す
ることも可能である。その場合には、測定の対象となる
検体を界面活性剤で処理することにより、細胞に存在す
る組織因子を可溶化し、これを本発明の免疫測定法に処
することにより容易に細胞に存在する全組織因子を定量
することが可能となる。 界面活性剤としては、通常の
ものが使用されるが、例えばTriton X-100等がその好ま
しい一例として挙げられる。また、一般に、本発明のよ
うな免疫測定法においては、このように測定対象となる
検体を界面活性剤等で処理すると測定感度が低下するこ
とがあるが、本発明のモノクローナル抗体を利用した免
疫測定法においては、そのような障害が確認されなかっ
た。以下、本発明の理解を深めるために実施例に沿って
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００１４】
【実施例１】ヒト組織因子の調製 ヒト組織因子（ＴＦ）は、ヒト胎盤をアセトンで処理し
乾燥させたアセトンパウダー（acetone powder）をTBS
（pH7.5）／5mM EDTAで２回洗浄した後、２％Triton X-
100／40 mM Tris(pH8.2)でＴＦを抽出し、それに終濃度
5mMのCaCl2を加えたものをVIIa-アガロースカラム（5mg
VIIa/mlゲル, 0.9×15cm）にかけ、TBS（pH7.5）／0.5
% Luburol/5mM CaCl2で洗浄後、TBS／0.05% Luburol/1M
NaCl／2.5mM EDTAで溶出することにより調製した。
乾燥させたアセトンパウダー（acetone powder）をTBS
（pH7.5）／5mM EDTAで２回洗浄した後、２％Triton X-
100／40 mM Tris(pH8.2)でＴＦを抽出し、それに終濃度
5mMのCaCl2を加えたものをVIIa-アガロースカラム（5mg
VIIa/mlゲル, 0.9×15cm）にかけ、TBS（pH7.5）／0.5
% Luburol/5mM CaCl2で洗浄後、TBS／0.05% Luburol/1M
NaCl／2.5mM EDTAで溶出することにより調製した。
【００１５】(1)マウス免疫感作 8〜12週齢のBALB/cマウス群を使用した。各群に前記調
製法記載の方法で調製したヒト組織因子を免疫感作し
た。免疫感作は腹腔内経路で３回接種した後、静脈内経
路で１回接種するものとし、０日目にフロイントの完全
アジュバント存在下、１４日目にフロイントの不完全ア
ジュバント存在下、２８日目にフロイントの不完全アジ
ュバント存在下、４５日目にアジュバント非存在下でそ
れぞれ20μｇの抗原ヒト組織因子を接種した。
製法記載の方法で調製したヒト組織因子を免疫感作し
た。免疫感作は腹腔内経路で３回接種した後、静脈内経
路で１回接種するものとし、０日目にフロイントの完全
アジュバント存在下、１４日目にフロイントの不完全ア
ジュバント存在下、２８日目にフロイントの不完全アジ
ュバント存在下、４５日目にアジュバント非存在下でそ
れぞれ20μｇの抗原ヒト組織因子を接種した。
【００１６】(2)細胞融合およびハイブリドーマの培養 最終免疫の３日後に、常法によりマウスから脾臓細胞を
採取した。脾臓細胞をミエローマ細胞p3X63Ag8-U1と細
胞数１対５の割合で混合して、遠心処理（1200rpm／５
分）して上清を除き、沈澱した細胞壊を充分ほぐした
後、攪拌しながら、１mlの混合液［ポリエチレングリコ
ール-4000(２ｇ)、ＭＥＭ(２ml) 、ジメチルスルホキシ
ド］に加えた。 ５分間37℃にてインキュベートした
後、液の全量が50mlになるようにゆっくりとＭＥＭを加
えた。遠心分離後（900 rpm／５分）、上清を除き、ゆ
るやかに細胞をほぐした。これに正常培地（RPMI-1640
培地に牛胎児血清10％を加えたもの）100mlを加え、メ
スピペットを用いて緩やかに細胞を懸濁した。
採取した。脾臓細胞をミエローマ細胞p3X63Ag8-U1と細
胞数１対５の割合で混合して、遠心処理（1200rpm／５
分）して上清を除き、沈澱した細胞壊を充分ほぐした
後、攪拌しながら、１mlの混合液［ポリエチレングリコ
ール-4000(２ｇ)、ＭＥＭ(２ml) 、ジメチルスルホキシ
ド］に加えた。 ５分間37℃にてインキュベートした
後、液の全量が50mlになるようにゆっくりとＭＥＭを加
えた。遠心分離後（900 rpm／５分）、上清を除き、ゆ
るやかに細胞をほぐした。これに正常培地（RPMI-1640
培地に牛胎児血清10％を加えたもの）100mlを加え、メ
スピペットを用いて緩やかに細胞を懸濁した。
【００１７】懸濁液を24穴の培養プレートに分注し（1m
l／穴）、５％の炭酸ガスを含む培養器中で、温度37℃
で24時間培養した。次に、１ml／穴のＨＡＴ培地［正常
培地にヒポキサンチン(1×10-4 M)）,チミジン(1.5×10
-3 M)及びアミノプテリン(4×10-7 M)］を加え、さらに
24時間培養した。その後２日間、24時間毎に、1mlの培
養上清を同量のＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリ
ンを除く）と交換し、前記と同様にして10〜14日間培養
した。コロニー状に生育した融合細胞（約300個）の認
められたそれぞれの穴について、1mlの培養上清を同量
のＨＴ培地と交換し、その後２日間、24時間毎に同様の
交換を行った。ＨＴ培地で３〜４日培養した後、培養上
清の一部を採り以下に述べるスクリーニング法にて目的
のハイブリドーマを選別した。
l／穴）、５％の炭酸ガスを含む培養器中で、温度37℃
で24時間培養した。次に、１ml／穴のＨＡＴ培地［正常
培地にヒポキサンチン(1×10-4 M)）,チミジン(1.5×10
-3 M)及びアミノプテリン(4×10-7 M)］を加え、さらに
24時間培養した。その後２日間、24時間毎に、1mlの培
養上清を同量のＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリ
ンを除く）と交換し、前記と同様にして10〜14日間培養
した。コロニー状に生育した融合細胞（約300個）の認
められたそれぞれの穴について、1mlの培養上清を同量
のＨＴ培地と交換し、その後２日間、24時間毎に同様の
交換を行った。ＨＴ培地で３〜４日培養した後、培養上
清の一部を採り以下に述べるスクリーニング法にて目的
のハイブリドーマを選別した。
【００１８】(3)ハイブリドーマのスクリーニング 目的のハイブリドーマの選別には下記のＥＩＡ法、ウエ
スタン・ブロット法を組み合わせて行った。
スタン・ブロット法を組み合わせて行った。
【００１９】ＥＩＡ法 96穴のマイクロテストプレートに前記のごとく調製した
ヒト組織因子（蛋白質濃度0.5μg／ml）を50μl／穴で
加え、37℃で１時間インキュベートすることにより固相
化した。さらに４％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液
250μlを加え同様にインキュベートしてマスキングを行
った。このようにして作製したヒト組織因子固相化プレ
ートに細胞融合法によって得られたハイブリドーマおよ
びクローニング後のハイブリドーマの培養上清を加えて
37℃で１時間インキュベート後、ＰＢＳで３回洗浄し、
ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液
（カッペル社製、1000倍希釈）を100μl／穴加えた。37
℃で１時間インキュベート後、ＰＢＳにて５回洗浄し、
その後ＯＰＤＡ基質溶液を加え、常法により発現させ、
その吸光度を波長492nmにて測定した。こうしてヒト組
織因子と反応するハイブリドーマクローンを選択した。
ヒト組織因子（蛋白質濃度0.5μg／ml）を50μl／穴で
加え、37℃で１時間インキュベートすることにより固相
化した。さらに４％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液
250μlを加え同様にインキュベートしてマスキングを行
った。このようにして作製したヒト組織因子固相化プレ
ートに細胞融合法によって得られたハイブリドーマおよ
びクローニング後のハイブリドーマの培養上清を加えて
37℃で１時間インキュベート後、ＰＢＳで３回洗浄し、
ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液
（カッペル社製、1000倍希釈）を100μl／穴加えた。37
℃で１時間インキュベート後、ＰＢＳにて５回洗浄し、
その後ＯＰＤＡ基質溶液を加え、常法により発現させ、
その吸光度を波長492nmにて測定した。こうしてヒト組
織因子と反応するハイブリドーマクローンを選択した。
【００２０】ウエスタンブロッティング法 ヒト組織因子を12％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳
動し、ゲルをニトロセルロース膜に乗せてヒト組織因子
を膜上に移行させ、膜を0.4〜0.5cm幅に切断した。各断
片をハイブリドーマ培養上清に浸し、37℃で２時間イン
キュベートした。その後、細片をＰＢＳで３回洗浄した
後、ビオチン標識抗マウスIgG（TAGO社製）の1:750希釈
液中で２時間保温した。細片をＰＢＳで３回洗浄後、西
洋わさびペルオキシダーゼを結合させたアビジン（シグ
マ社製）（1000倍希釈）に浸し、１時間保温した。ＰＢ
Ｓで３回洗浄後、4-クロロ-1-ナフトールを用いる発色
試薬（Bio-Rad社製）で発現させ、ヒト組織因子の発色
バンドを示すハイブリドーマを選びクローニングした。
クローニング後のハイブリドーマクローンについても同
様の手法で選別した。
動し、ゲルをニトロセルロース膜に乗せてヒト組織因子
を膜上に移行させ、膜を0.4〜0.5cm幅に切断した。各断
片をハイブリドーマ培養上清に浸し、37℃で２時間イン
キュベートした。その後、細片をＰＢＳで３回洗浄した
後、ビオチン標識抗マウスIgG（TAGO社製）の1:750希釈
液中で２時間保温した。細片をＰＢＳで３回洗浄後、西
洋わさびペルオキシダーゼを結合させたアビジン（シグ
マ社製）（1000倍希釈）に浸し、１時間保温した。ＰＢ
Ｓで３回洗浄後、4-クロロ-1-ナフトールを用いる発色
試薬（Bio-Rad社製）で発現させ、ヒト組織因子の発色
バンドを示すハイブリドーマを選びクローニングした。
クローニング後のハイブリドーマクローンについても同
様の手法で選別した。
【００２１】上記の選別方法によって、ヒト組織因子と
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
が67クローン得られた。これらの産生するモノクローナ
ル抗体のヒト組織因子に対する親和力と、クリスクロス
法によるエピトープの関係を調べ、二抗体法によってヒ
ト組織因子の抗原量を定量するための最適なモノクロー
ナル抗体の組み合せを検討した。その結果、本発明の測
定法に用いるモノクローナル抗体としては、ヒト組織因
子ペプチドのアミノ末端から数えて１７５番目のアミノ
酸から２１９番目のアミノ酸までのペプチド領域に存在
するエピトープのうち、異なるエピトープを認識する２
種のモノクローナル抗体が適していることが見いだされ
た。さらに、そのようなモノクローナル抗体としては、
ハイブリドーマHTF-K14及びHTF-K180から産生される２
種のモノクローナル抗体を組み合わせると最も高感度に
測定できることが判った。
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
が67クローン得られた。これらの産生するモノクローナ
ル抗体のヒト組織因子に対する親和力と、クリスクロス
法によるエピトープの関係を調べ、二抗体法によってヒ
ト組織因子の抗原量を定量するための最適なモノクロー
ナル抗体の組み合せを検討した。その結果、本発明の測
定法に用いるモノクローナル抗体としては、ヒト組織因
子ペプチドのアミノ末端から数えて１７５番目のアミノ
酸から２１９番目のアミノ酸までのペプチド領域に存在
するエピトープのうち、異なるエピトープを認識する２
種のモノクローナル抗体が適していることが見いだされ
た。さらに、そのようなモノクローナル抗体としては、
ハイブリドーマHTF-K14及びHTF-K180から産生される２
種のモノクローナル抗体を組み合わせると最も高感度に
測定できることが判った。
【００２２】(4)モノクローナル抗体の製造 ブリスタン処理した８週齢BALB/c雌マウスに前記実施例
で得られたハイブリドーマHTF-K14、5×106個／匹を腹
腔内投与した。10〜21日目後に腹水病が発現された。マ
ウスから腹水を採り、3000rpm／５分の遠心分離により
固形形成を除去した後、アフィゲルプロテインＡ ＭＡ
ＰＳ-IIキット（Bio-Rad社製）を用いたアフィニティー
クロマトグラフィにて精製した。
で得られたハイブリドーマHTF-K14、5×106個／匹を腹
腔内投与した。10〜21日目後に腹水病が発現された。マ
ウスから腹水を採り、3000rpm／５分の遠心分離により
固形形成を除去した後、アフィゲルプロテインＡ ＭＡ
ＰＳ-IIキット（Bio-Rad社製）を用いたアフィニティー
クロマトグラフィにて精製した。
【００２３】
【実施例２】本発明のモノクローナル抗体を用いたヒト組織因子測定
方法 96穴のマイクロテストプレートに本願発明のモノクロー
ナル抗体（HTF-K14）を40μｇ／mlの濃度で50μl／穴加
え、37℃で１時間インキュベートすることにより固相化
した。さらに、４％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液25
0μlを加え、同様にインキュベートしてマスキングを行
った。このようにして作製した固相化プレートに検体を
加え、37℃で１時間インキュベート後、0.1％ Tween20
／PBSで３回洗浄し、マレイミド法によりＨＲＰを標識
した本願発明のモノクローナル抗体（HTF-K180）を0.5n
g／mlの濃度で100μl／穴加えた。37℃で１時間インキ
ュベート後、0.1％ Tween20／PBSにて５回洗浄し、その
後ＯＰＤＡ基質溶液を加え、常法により発色させ、その
吸光度を波長492nmにて測定した。上記方法に従って精
製された組織因子をＴＢＳに混合して測定した検量線を
第１図に示す。尚、この検量線作成に用いた同じ濃度の
組織因子をヒト血漿に混合し同様に測定した場合にも、
第１図に示した検量線と同じ結果が得られた。
方法 96穴のマイクロテストプレートに本願発明のモノクロー
ナル抗体（HTF-K14）を40μｇ／mlの濃度で50μl／穴加
え、37℃で１時間インキュベートすることにより固相化
した。さらに、４％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液25
0μlを加え、同様にインキュベートしてマスキングを行
った。このようにして作製した固相化プレートに検体を
加え、37℃で１時間インキュベート後、0.1％ Tween20
／PBSで３回洗浄し、マレイミド法によりＨＲＰを標識
した本願発明のモノクローナル抗体（HTF-K180）を0.5n
g／mlの濃度で100μl／穴加えた。37℃で１時間インキ
ュベート後、0.1％ Tween20／PBSにて５回洗浄し、その
後ＯＰＤＡ基質溶液を加え、常法により発色させ、その
吸光度を波長492nmにて測定した。上記方法に従って精
製された組織因子をＴＢＳに混合して測定した検量線を
第１図に示す。尚、この検量線作成に用いた同じ濃度の
組織因子をヒト血漿に混合し同様に測定した場合にも、
第１図に示した検量線と同じ結果が得られた。
【００２４】細胞に存在する組織因子を測定する場合に
は、組織因子を産生しているRet-1細胞に等量の２％Tri
ton X-100／ＴＢＳ／5mM ＥＤＴＡを検体に加え、これ
を検体として本発明の測定方法に処した。その結果を第
２図に示す。この結果、血中の細胞に存在している組織
因子が、ごく微量の場合にもこれを正確に検出、定量す
ることが可能であることがわかる。
は、組織因子を産生しているRet-1細胞に等量の２％Tri
ton X-100／ＴＢＳ／5mM ＥＤＴＡを検体に加え、これ
を検体として本発明の測定方法に処した。その結果を第
２図に示す。この結果、血中の細胞に存在している組織
因子が、ごく微量の場合にもこれを正確に検出、定量す
ることが可能であることがわかる。
【００２５】これらの結果、本測定方法によれば血漿中
のヒト組織因子が１ng／mlの濃度まで測定できることが
確認され、本願発明のモノクローナル抗体を用いた二抗
体測定法の有用性が立証された。
のヒト組織因子が１ng／mlの濃度まで測定できることが
確認され、本願発明のモノクローナル抗体を用いた二抗
体測定法の有用性が立証された。
【第１図】実施例２における、本発明の二抗体免疫測定
法により測定したヒト組織因子の検量線を示す。
法により測定したヒト組織因子の検量線を示す。
【第２図】実施例２における、検体を２％Triton処理し
たものを本発明の二抗体免疫測定法により測定した場合
の測定結果を示す。
たものを本発明の二抗体免疫測定法により測定した場合
の測定結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 平２−216054（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−275359（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−44253（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/577 G01N 33/531
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒト組織因子に特異的な２種の異なるモ
ノクローナル抗体を用いたサンドイッチ二抗体免疫測定
法により検体中のヒト組織因子の量を直接測定する方法
において、当該２種のモノクローナル抗体が、微工研菌
寄第１１９４５号のHTF-K14及び微工研菌寄第１１９４
６号のHTF-K180から産生される抗体であることを特徴と
するヒト組織因子の測定方法。 - 【請求項２】 前記第（１）項の測定方法を行う前に、
測定対象となる検体を界面活性剤により処理し、検体中
の細胞に存在するヒト組織因子を可溶化し検体液中に遊
離させる工程を含む前記第（１）項記載の測定方法。 - 【請求項３】 前記２種のモノクローナル抗体が、ヒト
組織因子ペプチドのアミノ末端から数えて１７５番目の
アミノ酸から２１９番目のアミノ酸までのペプチド領域
に存在する異なるエピトープを認識する抗体である前記
第（１）項記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02525691A JP3149960B2 (ja) | 1991-01-24 | 1991-01-24 | ヒト組織因子を定量する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02525691A JP3149960B2 (ja) | 1991-01-24 | 1991-01-24 | ヒト組織因子を定量する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05172811A JPH05172811A (ja) | 1993-07-13 |
| JP3149960B2 true JP3149960B2 (ja) | 2001-03-26 |
Family
ID=12160937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02525691A Expired - Fee Related JP3149960B2 (ja) | 1991-01-24 | 1991-01-24 | ヒト組織因子を定量する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3149960B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA109633C2 (uk) | 2008-12-09 | 2015-09-25 | Антитіло людини проти тканинного фактора | |
| CN111012921A (zh) | 2010-06-15 | 2020-04-17 | 根马布股份公司 | 针对组织因子的人抗体药物缀合物 |
-
1991
- 1991-01-24 JP JP02525691A patent/JP3149960B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05172811A (ja) | 1993-07-13 |
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