JPH0875736A

JPH0875736A - ヒト組織因子凝固系インヒビターの定量法

Info

Publication number: JPH0875736A
Application number: JP23953294A
Authority: JP
Inventors: Yuichi Kamikubo; 勇一神窪; Tsuyoshi Hamuro; 強羽室; Sumiyo Takemoto; 澄代嶽本; Takeo Abumiya; 武雄鐙谷; Keiichi Enjoji; 慶一円城寺; Hisao Kato; 久雄加藤
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1994-09-06
Publication date: 1996-03-22

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰ
Ｉ）のうち、遊離型ＴＦＰＩのみを容易に測定すること
が可能な免疫学的定量法を提供する。【構成】遊離型ＴＦＰＩには反応し、リポ蛋白質結合
型ＴＦＰＩには反応しないモノクローナル抗体を用いた
免疫学的測定法による遊離型ＴＦＰＩの定量法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト組織因子凝固系イ
ンヒビター（Tissue Factor Pathway Inhibitor：TFP
I）を定量するための免疫学的測定法に関するものであ
る。さらに、詳細には、その測定法が血漿や尿中等に存
在するリポ蛋白質非結合性のTFPI、すなわち遊離型TFPI
のみを測定する方法である。

【０００２】

【発明の背景及び従来技術】血液凝固は損傷血管からの
異常出血や細菌感染等を防御する重要な生体防御機構で
ある。血液凝固の反応は内因系凝固系と外因系凝固系の
２経路の開始反応を中心としたカスケード反応により構
成され、最終的にフィブリンネットワークを形成する事
によって終了する反応である。近年の血液凝固の開始機
構に関する研究から、組織因子（Tissue Factor：TF）
と活性型第VII因子複合体（TF-F.VIIa）により第X因子
及び第IX因子が活性化される反応、いわゆる外因系凝固
反応が血液凝固の開始反応として非常に重要である事が
明らかにされている［Davie,E.V., Biochem., 30, p103
63 (1991)］。TFは血管損傷やサイトカイン等の刺激に
より、血管内皮細胞、平滑筋細胞や単球/マクロファー
ジ等の細胞に発現される膜蛋白質であり、外因系凝固反
応の実質的開始因子である。

【０００３】一方で、生体にはこれらの凝固反応が過剰
に起こらないように調節している機構も存在している。
その代表的な機構がプロテアーゼインヒビターによる凝
固因子活性の阻害機構である。現在、この阻害機構はイ
ンヒビターの量的及び質的変化が重篤な血栓症を誘発す
る事から、非常に重要視されている。その中で、外因系
凝固反応に対するインヒビターとして、TFPIとヘパリン
活性化アンチトロンビンIIIが知られている。特にTFPI
はTF-F.VIIaに特異的に結合してその活性を効率良く抑
制する事から、ヘパリン活性化アンチトロンビンIII以
上に重要なインヒビターとして位置づけられている［Br
oze,G.J., Blood, 82, p1679 (1993)］。

【０００４】TFPIはアプロチニン等と同じクニッツ型プ
ロテアーゼインヒビターに属し、蛋白構造的には主にク
ニッツ１、クニッツ２、クニッツ３の３つの領域から構
成されており、クニッツ１が活性化第VII因子との結合
部位、クニッツ２が活性化第X因子との結合部位である
事が明かとなっている［Girard,T.J., Nature, 338, p5
18 (1989)］。さらに、最近の報告では、クニッツ３領
域はＣ末端側の塩基性に富む領域と同様に、ヘパリンと
の結合に関与している事が確認されている［Enjyoji,
K., Thromb.Haemostas, 69, p680 (1993)］。生体中のT
FPIは主に血管内皮細胞で合成された後、内皮細胞のヘ
パリン様物質に結合し、血管内腔側の抗血栓作用に重要
な機能を果たしている事が推定されている［Novotny,W.
F., Blood, 78, p394 (1991)］。このヘパリン結合性の
TFPIは血漿中にも存在しているが、この血漿中のTFPIと
血管壁に存在しているヘパリン結合性のTFPIが全く同じ
ものかどうか、さらにこのTFPIがヘパリン様物質からど
のような機序により血漿中に遊離されてくるのかについ
ては、全く明らかにされていない。なお、本特許明細書
中では血漿中に存在しているヘパリン結合性のTFPIを遊
離型TFPI、血管壁に存在しているTFPIをヘパリン結合型
TFPIと区別して称する。また、ヘパリン負荷試験により
血漿中に遊離されるヘパリン結合型TFPIについても、本
明細書中では遊離型TFPIと呼ぶ。

【０００５】さらに、人血漿中にはその遊離型TFPIに加
え、リポ蛋白質に結合したTFPI（リポ蛋白質結合型TFP
I）も存在し、それらは主に超低密度リポ蛋白質（VLD
L）、低密度リポ蛋白質（LDL）、高密度リポ蛋白質（HD
L）に結合して存在している［Novotny,W.F., J.Biol.Ch
em., 264, p18832 (1989)］。TFPIとリポ蛋白質との結
合の生理的意義や形成機序については十分に明らかにさ
れていないが、最近、遺伝子組換え技術により大量にTF
PIが調製できるようになった事から、これらを用いた研
究により、TFPIとリポ蛋白質との結合様式が一部明かと
なった。その結果、TFPIのＣ末端側の塩基性に富む領域
がその結合に関与している事が報告されている［Valent
in,S., Blood Coag.Fibrinolysis, 4, p713 (1993)］。

【０００６】以上により、血管内にはヘパリン結合型TF
PI、遊離型TFPI、リポ蛋白質結合型TFPIの少なくとも３
種のTFPIが存在し、さらに詳細には血漿中に遊離型TFPI
とリポ蛋白質結合型TFPIが存在し、血管壁にヘパリン結
合型TFPIが存在していると考えられている。血管内での
それぞれの量比は、血管壁のヘパリン結合型TFPI量が測
定出来ないため正確な量は不明だが、ヘパリン投与によ
り血中に遊離されてくるTFPI量から類推すると、血管壁
のヘパリン結合型TFPIがリポ蛋白質結合型及び血漿中の
遊離型TFPIに比べて、約２倍から１０倍多く存在してい
ると考えられている。さらに、TF-F.VIIa（活性型第VII
因子複合体）に対する抗凝固活性の比較研究から、ヘパ
リン結合型および遊離型TFPIがリポ蛋白質結合型TFPIよ
りも強い抗凝固活性を持っている事も明らかにされてい
る［Lindahl,AK.,Blood Coag. Fibrinolysis, 2, p713
(1991)］。よって、血管内ではこのヘパリン結合型及
び遊離型TFPIがより重要な機能を果たしていると考えら
れている。

【０００７】近年、いくつかの研究グループから、血漿
中のTFPI量を測定する事で、各種の血栓症発症とTFPIと
の関連、さらに早期診断法としてのTFPIの有用性に関す
る検討が報告されてきた［Novotny,W.F., Blood, 78, p
387 (1991)］。しかし、血漿中のTFPIがリポ蛋白質結合
型や遊離型で存在し、かつその存在量や比活性に違いが
ある事から、totalのTFPI量を測定する方法ではどの型
のTFPIがどのように変化したのかが全くわからず、血漿
中のTFPIの動態変化と病態発症との関連を明確にするま
でには到らなかった。そこで、現在はそれぞれの型のTF
PIを別々に定量して、TFPIの動態変化を解析する必要が
あると考えられている。そのため血漿中のTFPIを予めゲ
ルろ過や超遠心分離によりそれぞれの型に分別し、その
後活性や免疫学的測定法により定量する方法が用いられ
るようになった［Abumiya,T., Arterioscler Thromb.,
14, p483 (1994)］。その結果、この方法により、生理
的に重要な機能をもつと考えられる遊離型及びヘパリン
結合型TFPIがリポ蛋白質結合型TFPIと分離して測定する
事が可能となり、臨床的にも癌患者での遊離型TFPIの増
加［Lindahl,AK., Blood Coag.Fibrinolysis, 3, p713
(1992)］と高脂血症での遊離型TFPIの減少［粉川他、動
脈硬化 21, p111 (1993)］が確認された事から、遊離型
TFPI量と病態発症との関連性を示唆する成績が得られる
ようになった。この癌とTFPIの関連性及びTFPI値上昇の
機序については、十分に明らかにされていないが、癌病
態の発症に伴う血管内皮細胞の障害等によってもたらさ
れたのではないかと推定されている。よって、この癌や
高脂血症の病態のように、この方法はさらに多くの疾患
で遊離型及びヘパリン結合型TFPI量と各病態との関連性
を明らかにし、病態発症の診断法として、非常に有用な
方法を提供しうると考えられる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前述したように、ゲル
ろ過や超遠心分離法との併用法が、遊離型TFPIとリポ蛋
白質結合型TFPIと分別して測定する際に、非常に有用で
ある事が近年明らかとなった。しかし、実際の方法には
いくつかの重要な問題点がまだ残されている。その問題
点とは、(1)TFPIの活性、抗原測定法に加え、ゲルろ過
や超遠心分離操作を行なう必要があるため、操作数が多
く、非常に煩雑である。そのため、多量の検体を迅速に
測定する事が出来ない。(2)ゲルろ過や超遠心分離操作
に多くの時間が必要である事から、操作中にTFPIの分解
などの性状変化が生じる可能性があるという事である。
特に、(2)の問題はゲルろ過の条件の違いに起因して、T
FPIの実測値に変化が生じ、臨床評価等において統一的
見解をうるのに支障をきたす可能性もある。よって、測
定法としては簡便で、かつ再現性のよい測定法の開発が
絶体不可欠であると考えられる。もし、これが可能にな
れば、TFPIを測定することによる種々の臨床診断の確立
に大きな道を開くことになると考えられる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】このような状況におい
て、本発明者らは前述の問題点を解決するために鋭意研
究し、ゲルろ過や超遠心分離操作を併用せずに、免疫測
定法により遊離型TFPIのみを測定する方法を完成させ
た。具体的には、遊離型TFPIには反応するがリポ蛋白質
結合型TFPIには反応しないモノクローナル抗体を用いる
事で、その測定が可能となったのである。本測定法を完
成させるに当たっては、まず上述の目的に合う抗体を確
実に選択する必要があるため、本発明者らは、予めリポ
蛋白質とTFPIの結合様式及びその機序に関する基礎研究
を行ない、これに基づくことにより、本発明のモノクロ
ーナル抗体を確立することに成功した。

【００１０】まず、その結合様式を推定するに至った実
験について概説する。一般的に、蛋白質の機能領域を推
定する場合には、(１)該蛋白質を分解酵素や化学的方法
により限定分解して得られるポリペプチドを用いて検討
する、(２)遺伝子組換え技術によりアミノ酸組成を換え
た変異体を作製し、機能との関連を検討する方法が良く
用いられる。今回は、ヒドロキシルアミンによる限定分
解法を用いた。なお、今回の検討に用いるTFPIは人血漿
から遊離型TFPIを調製する事が非常に困難なので、特願
平5-188746号に記載された方法に準じて、ヒトTFPIのcD
NAを導入したCHO細胞からの組換えTFPI（rTFPI）を用い
た。但し、Ｃ端側の塩基性領域の影響を否定するため
に、Ｃ端領域の欠如した分解型rTFPIをその材料とし
た。この方法により、TFPI分子からクニッツ１〜２領域
とクニッツ３領域の２つの領域が調製可能となる。その
後、分解を受けていないインタクトrTFPI及び得られる
領域をリポ蛋白質もしくはLDL、HDLと反応させ、ゲルろ
過や超遠心法、電気泳動法によりその結合性を確認し
た。その結果、インタクトrTFPIは、リポ蛋白質との十
分な結合を示す一方で、クニッツ１〜２とクニッツ３の
いずれの領域もリポ蛋白質との結合性を殆ど示さなかっ
た。よって、TFPIとリポ蛋白質との結合にはTFPIのＣ端
側の塩基性領域が不可欠であることがさらに支持され
た。

【００１１】次に、本発明に用いるモノクローナル抗体
およびその調製法について概説する。本発明に基づくモ
ノクローナル抗体はヒトrTFPIをマウスに免疫して得ら
れる脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得
られる融合細胞（ハイブリドーマ）からヒトrTFPIに反
応する細胞を選択し、該細胞を培養することにより調製
する事ができる。このハイブリドーマの調製に関して
は、KohlerとMilsteinの方法［Nature, 256, p495 (197
5)］に準じて行なう。免疫用のマウスとしては、BALB/C
系マウスを用いる。免疫はマウス１匹（６週令）に対し
てTFPI抗原20μg〜40μgを用いて２〜３週間毎に５回行
ない、マウスの飼育及び脾臓細胞の採取は常法に従う。
ミエローマ細胞は、p3X63Ag8-U1等が好適に用いられ
る。脾臓細胞とミエローマ細胞は1対1〜10対1の割合で
混合し、融合はNaCl(0.85%)、ジメチルスルホキシド（1
0％〜20％（V/V)）及び分子量1,000〜6,000のポリエチ
レングリコールを含有するリン酸緩衝液（pH7.2〜pH7.
4)中で行なう。融合は両細胞の混合物を35℃〜37℃で1
〜5分間インキュベートする事によって行なう。融合細
胞は、ヒポキサンチン（1.3〜1.4mg/dl）、アミノプテ
リン（18〜20μg/ml）、チミジン（375〜4000μg/m
l）、ストレプトマイシン（50〜100μg/ml）、ペニシリ
ン（50〜100単位／ml）、グルタミン（3.5〜4.0μg/
l）、牛胎児血清（10〜20%）を含有する基礎培地を用い
て成育してくる細胞を選択する。基礎培地としては、一
般的に動物細胞の培養に用いられているRPMI-1640培
地、EagleのMEM培地などが用いられる。融合細胞のクロ
ーン化は、限界希釈法にて少なくとも２回繰り返して行
なう。ハイブリドーマを通常の動物細胞の培養と同様に
して培養すれば、その結果培地中に本発明の抗体を得る
事ができる。また、該ハイブリドーマをプリスタン処理
のヌードマウスまたはBALB/Cマウスの腹腔内に移植して
増殖させる事により腹水中からも本発明の抗体を得る事
ができる。最終的に、本発明のモノクローナル抗体は培
養物及び腹水中から、プロテインＡを結合させたゲルを
用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製
し、単一成分として調製できる。本発明法に用いる抗体
を選択する場合には、遊離型TFPIとの結合性とリポ蛋白
質結合型TFPIとの結合性を比較して選択する事が望まし
い。具体的には、該抗体の結合性をrTFPIを固相化した
マイクロプレートとリポ蛋白質結合型rTFPIを固相化し
たマイクロプレートの両者で比較する事で、rTFPIには
結合するが、リポ蛋白質結合型rTFPIには結合しない抗
体を選択する。この様にして調製されたモノクローナル
抗体の中で、最も好ましい抗体の１例として、本発明者
らが調製したハイブリドーマHTFPI-K9の産生するモノク
ローナル抗体が挙げられる。この抗体のイムノグロブリ
ンサブクラスはゲル内沈降反応によりIgG1-κである事
が確認された。本発明のこのような抗体は、TFPIのクニ
ッツ３領域を特異的に認識する性質を有するモノクロー
ナル抗体である。

【００１２】このような本願発明に最も好適なモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマHTFPI-K9は、工業
技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-14467
として寄託されている。当該モノクローナル抗体を利用
したサンドイッチ免疫測定法を構築することにより、遊
離型（ヘパリン負荷試験等により血漿中に遊離されるヘ
パリン結合型TFPIを含む）TFPIのみを測定する簡易定量
法が可能となり、従来の組み合わせ法にあった煩雑さや
再現性の悪さを克服し、さらに測定における特異性を著
しく高めることが可能となる。

【００１３】サンドイッチ免疫測定法の構築については
特に制限されず、既存の免疫測定技術を応用することが
可能であるが、検出法の手段としては、酵素免疫測定法
（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FI
A）及び発光免疫測定法（LIA）等の方法が好適に選択さ
れる。二抗体によるサンドイッチ免疫測定法の場合には
本発明の抗体以外に、もう１種他の抗体を用いる必要が
あるが、その抗体としては、ヒトTFPIに反応する抗体で
あれば特に限定されず、望ましくは本発明抗体と認識部
位の異なるモノクローナル抗体や特異性の高いポリクロ
ーナル抗体が好適である。

【００１４】以下、本発明の理解を深めるために実施例
に添って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。

【００１５】

【実施例１】ヒトrTFPIの調製ヒトrTFPI（組換えTFPI）はヒトTFPIのcDNAを導入したC
HO細胞の培養上清から、Pedersen等の方法［Pedersen,
A.H., J.Biol.Chem., 265, p16786 (1990)］に従って精
製した。具体的な方法としては、ヘパリンゲル（Pharma
cia−LKB）によるアフィニティークロマトグラフィー、
MonoQ HR5/5カラム（Pharmacia−LKB）とMonoS HR5/5カ
ラム（Pharmacia−LKB）によるイオン交換クロマトグラ
フィーを用いた。なお、得られたrTFPIは、アミノ酸配
列分析やSDS-PAGE等の分析より、分解を受けていないイ
ンタクトrTFPIが殆どであったが、一部Ｃ端の塩基性領
域を欠如した分解型rTFPIも含まれていた。

【００１６】ヒトrTFPIの断片化の方法ヒト分解型rTFPIからクニッツ１〜２、クニッツ３領域
の２種のポリペプチドを調製するために、Balian等の方
法［Balian,G., Biochem., 11, p3798 (1972)］に従っ
てヒドロキシルアミン処理を行なって、アスパラギン15
2番目〜グリシン153番目の間で限定分解し、クニッツ１
〜２領域とクニッツ３領域とを分離した。そして、ヘパ
リンゲルによるアフィニティ−クロマトグラフィーを行
ない、非吸着画分からクニッツ１〜２領域、吸着画分か
らクニッツ３領域を単離した。得られたそれぞれの領域
のポリペプチドは、アミノ酸分析及びアミノ酸配列分析
を行ない、各々の領域である事を確認した。

【００１７】リポ蛋白質とrTFPI及び関連ポリペプチド
との結合性の検討リポ蛋白質とインタクトrTFPI及びTFPI由来ポリペプチ
ドとの結合性はゲルろ過により確認した。今回の検討で
は、リポ蛋白質としてLDLを用い、インタクトrTFPI及び
TFPI由来ポリペプチドは¹²⁵Iで標識化したものを用い
た。実際には、まずLDLと¹²⁵I-TFPI及び各領域のポリペ
プチドをプロテアーゼインヒビター（DFP）共存下で4℃
において12時間反応させ、その後LDL結合TFPIと非結合
のTFPIをゲルろ過（セファクリルS-200ゲル）により分
離し、結合量を定量する方法で行なった。その結果、図
１に示すように、インタクトrTFPIは十分な結合性を示
したが、クニッツ３等のポリペプチドは殆ど結合しなか
った。この事より、リポ蛋白質との結合において、TFPI
のＣ端側の塩基性領域が非常に重要である事が明かとな
った。

【００１８】

【実施例２】マウスの免疫感作 rTFPI投与によるマウスの免疫感作は腹腔内経路で４回
接種した後、最終免疫として静脈内経路で１回接種し
た。実際に、腹腔内投与として、０日目及び14日目にフ
ロイントの完全アジュバンド存在下、28日目及び42日目
にフロイントの不完全アジュバンド下で、20μgのrTFPI
を投与した。最終免疫の静脈投与は57日目にアジュバン
ド非存在下で40μgのrTFPIを投与した。

【００１９】細胞融合及びハイブリドーマの培養最終免疫の３日後に、常法によりマウスから脾臓細胞を
採取した。脾臓細胞をミエローマ細胞p3X63Ag8-U1と細
胞数 1対10の割合で混合して、遠心分離（1200rpm/５
分）して上清を除き、沈殿した細胞塊を十分ほぐした
後、攪拌しながら１mlの45%ポリエチレングリコール-40
00 を含むRPMI-1640培地に加えた。37℃で５分間インキ
ュベートした後、液の全量が50mlになるようにRPMI-164
0培地を加え、その後遠心分離して（900rpm/５分）、上
清を除き緩やかに細胞をほぐした。これに、ヒポキサン
チン（1×10^-4M）、アミノプテリン（4×10^-7M）、チミ
ジン（1.5×10^-3M）と10%牛胎児血清を含むRPMI-1640培
地（HAT培地）100mlを加え、メスピペットを用いて細胞
を懸濁した。懸濁後、液を96欠の培養プレートに3×10⁵
の細胞数で分注し（200μl／穴）、５％の炭酸ガスを含
む培養器中で培養した。培養開始後、まず３日目に培養
上清の半量をHAT培地で交換し、その後も２〜３日の間
隔で半量ずつ培地交換を繰り返し、計９日間HAT培地で
培養した。その後は、10%牛胎児血清を含むRPMI-1640培
地のみで半量ずつ培地交換して培養を続け、培養上清の
一部をとって、以下に述べる方法でスクリーニングを行
なった。

【００２０】ハイブリドーマのスクリーニングとモノク
ローナル抗体の調製目的のハイブリドーマの最初の選別には、下記のEIA法
を用いた。その方法は、まず96欠のマイクロプレートに
前記の如く調製したrTFPI（蛋白濃度0.1μg/ml）を100
μl／穴で加え、37℃で1時間インキュベートする事によ
り固相化した。さらに、4倍希釈したブロックエース
（大日本製薬）溶液200μlを同様にインキュベートして
マスキングを行なった。このようにして作製したrTFPI
固相化プレートにハイブリドーマの培養上清を加えて37
℃で１時間インキュベート後、PBS-Tween緩衝液で洗浄
し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体
溶液（ダコ社、1000倍希釈）を100μl/穴で加えた。そ
して、37℃で1時間インキュベート後、PBS-Tween緩衝液
で洗浄し、その後OPDA基質溶液を加えて発色させた。発
色量は波長490nmにて吸光度を測定し、定量化した。こ
うしてrTFPIと反応するハイブリドーマクローンを選別
した。

【００２１】上記の選別法によって、ヒトrTFPIと反応
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが複
数クローン得られた。さらにその中で最終的に、本発明
に用いる抗体を選択すべく、リポ蛋白質結合型rTFPIを
固相化したマイクロプレートでリポ蛋白質結合型rTFPI
に結合しない抗体を選択した。その結果、ハイブリドー
マHTFPI-K9の1クローンが特に好ましい抗体産生細胞と
して選択された。そして、得られたハイブリドーマHTFP
I-K9についてはプリスタン処理したBALB/C系マウスに腹
腔内投与し、腹水からモノクローナル抗体を大量に精製
した。精製法はプロテインＡゲル（Pharmacia−LKB）に
よるアフィニティ−クロマトグラフィーで常法に従って
行なった。

【００２２】ハイブリドーマHTFPI-K9から産生されるモ
ノクローナル抗体の性状解析として、ヒトrTFPIへの親
和性の解析を行なった。その結果、rTFPI(蛋白濃度：50
0ng/ml, 100μl)を固相化したマイクロプレートへの該
抗体の結合性を指標に親和性を算出したところ、解離定
数が３nMと非常に高い親和性を持っている事が確認され
た。

【００２３】rTFPIに対する特異ポリクローナル抗体の
調製 rTFPIに対するポリクローナル抗体を調製するために、
常法に従い、フロイントの完全アジュバンドと混合した
rTFPIを２〜３週間の間隔でウサギ等のヒト以外の動物
種に皮下投与し、抗血清を調製した。抗rTFPI免疫グロ
ブリンは抗血清からプロテインＡゲル（Pharmacia−LK
B）によるアフィニティ−クロマトグラフィーで常法に
従って精製した。さらに、免疫グロブリン画分からrTFP
Iに対する特異抗体を調製するために、rTFPIを結合させ
たゲル（２mgTFPI/mlゲル）によるアフィニティ−クロ
マトグラフィーを行なった。rTFPIを結合させたゲルはB
rCN化活性化ゲル（Pharmacia−LKB）とrTFPIを反応させ
て調製した。なお、得られた特異抗体はウエスタンブロ
ッティングの結果より、クニッツ１〜２とクニッツ３の
どの領域とも結合する事が明かとなった。

【００２４】次に、２抗体法によってTFPI抗原を測定す
るための最適な抗体の組み合わせを検討した。その結
果、本発明の測定法に用いる抗体の組み合わせとして、
ハイブリドーマHTFPI-K9からのモノクローナル抗体と他
のハイブリドーマからのモノクローナル抗体、もしくは
rTFPIに対するポリクローナル抗体の組み合わせが好適
であった。なお、他のハイブリドーマからのモノクロー
ナル抗体の使用は特別には限定されないが、クリスクロ
ス法によるエピトープの関係を検討して選択する事が必
要である。その結果、本該抗体と猿TFPIで作製したモノ
クローナル抗体(ハイブリドーマMTFPI-K270)［Kamei,
S., J.Biochem., 115, p708 (1994)］（工業技術院生命
工学工業技術研究所寄託番号FERM P-14468）の組み合
わせがクリスクロス法により最適である事が明かとな
り、ポリクローナル抗体と同様に、２抗体による高感度
のサンドイッチEIAも可能であった。

【００２５】

【実施例３】本発明のモノクローナル抗体と特異ポリクローナル抗体
を用いたヒトTFPIの測定法 96穴のマイクロププレートに本願発明のモノクローナル
抗体（HTFPI-K9）を10μg/mlの濃度で50μl加え、室温
で２時間以上インキュベートする事により固相化した。
さらに、４倍希釈したブロックエース溶液200μlを加
え、同様にインキュベートしてマスキングした。このよ
うにして調製したプレートに、0.1% BSA（牛血清アルブ
ミン）を含むTBS緩衝液で希釈した検体を50μl加え、室
温で２時間以上インキュベートした。その後、0.05% Tw
eenと0.5M NaClを含むTBS緩衝液で３回洗浄し、次に２
次抗体として10μg/mlの濃度のウサギ抗rTFPIポリクロ
ーナル抗体を50μl添加して、同様にインキュベートし
た。反応終了後、再度洗浄し、検出用抗体としてHRPを
標識した抗ウサギポリクローナル抗体（ダコ社、3000倍
希釈）を100μl加え、同様な条件でインキュベートし
た。インキュベート後、プレートを洗浄し、OPDA基質を
添加して常法により発色させた。発色量は３N H₂SO₄で
反応を停止後、波長490nmでの吸光度を測定した。以上
の方法に従って、吸光度とrTFPI濃度の関連を調べた結
果が図２である。この図より、rTFPIの各濃度に依存し
た吸光度の増加が見られた。なお、このEIAでの測定結
果を基に、既知のrTFPI濃度を用いて正常ヒト血漿中のr
TFPI量を算出すると、28.9ng/mlとなり、以前報告され
た約100ng/ml［Novotny,W.F., Blood, 78, p387 (199
1)］に比較して非常に低い値となった。

【００２６】本EIA法の特異性の検討 rTFPI中の本EIAによる認識部位を調べるために、TFPI由
来のクニッツ１〜クニッツ２、クニッツ３領域のポリペ
プチドを各々測定した。その結果、図３に示すようにTF
PI中のクニッツ３領域だけが濃度依存的に吸光度が増加
したが、クニッツ１〜クニッツ２領域は全く検出出来な
かった。よって、本EIAの認識部位は固相化に使用した
モノクローナル抗体の特性に従い、TFPI中のクニッツ３
領域であることが確認された。

【００２７】遊離型TFPIとリポ蛋白質結合型TFPIの分別
測定法本発明のEIA法が遊離型TFPIのみを測定しているかどう
かを調べるために、ヒト血漿検体を予めゲルろ過法によ
り遊離型TFPIとリポ蛋白質結合型TFPIとを分離しておい
てから、それぞれのTFPI量を測定する事で検討した。な
お、比較としてSandset等の方法［Sandset,PM., Thromb
Re, 47, p389 (1987)］に準じて、各型のTFPI活性量も
合わせて測定した。ゲルろ過は１M NaClを含むTBS緩衝
液で平衡化したSuperdex200HRカラム（Pharmacia−LK
B）を用いて行なった。その結果、図4に示したゲルろ過
の溶出パターンの結果より、遊離型TFPIについては活性
と抗原の両方が測定出来、その値がほぼ一致する事が判
明した。しかし、リポ蛋白質結合型TFPIについては活性
のみが測定でき、抗原量については全く測定出来なかっ
た。このことから、本発明のEIA法はヒト血漿中のTFPI
の中で遊離型TFPIのみを測定する方法として、非常に有
用である事が明かとなった。よって、この方法は血漿中
の遊離型TFPIの測定において、ゲルろ過等の分離操作を
行なわずに、非常に簡便でかつ信頼性の高い測定法を提
供するものである。

【００２８】本発明のモノクローナル抗体とモノクロー
ナル抗体MTFPI-K270を用いた測定法本発明のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体での
測定法と同じ方法で、固相化プレートの作製および検体
との反応を行なった後洗浄し、マレイミド法によりHRP
を標識したモノクローナル抗体（MTFPI-K270）を0.71μ
g/mlの濃度で100μl加えた。37℃で1時間インキュベー
ト後、0.05% Tweenと0.5M NaClを含むTBS緩衝液で洗浄
し、その後OPDA基質を添加して常法により発色させた。
吸光度は波長490nmにて測定した。その結果、図２と同
様にrTFPIの各濃度に依存した吸光度の増加が見られた
事から、この方法は遊離型TFPIの測定において、ポリク
ローナル抗体のEIAと比較して、より簡便で、かつ迅速
な測定を可能にすると考えられた。

【００２９】以上の結果をまとめると、ハイブリドーマ
HTFPI-K9からのモノクローナル抗体と他のハイブリドー
マからのモノクローナル抗体（例えば、MTFPI-K270）、
もしくはrTFPIに対するポリクローナル抗体の組み合わ
せによる免疫測定法は、血液等に存在するTFPIの内、遊
離型TFPIのみを測定する方法として非常に有用である事
が立証された。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１における、リポ蛋白質とrTFPI及び
クニッツ３領域との結合性を示すゲルろ過の溶出パター
ンを示す。

【図２】実施例３における、本発明のモノクローナル
抗体と特異ポリクローナル抗体を用いたEIAにより測定
したヒトrTFPIの検量線を示す。

【図３】実施例３における、本発明のモノクローナル
抗体と特異ポリクローナル抗体を用いたEIAによりTFPI
由来のクニッツ１−クニッツ２、クニッツ３領域のポリ
ペプチドを測定した結果を示す。

【図４】実施例３における、本発明のEIAがヒト血漿
中に存在している遊離型TFPIとリポ蛋白質結合型TFPIを
分別して測定出来る方法である事を示す結果。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者円城寺慶一大阪府吹田市青山３丁目50 Ｄ11−210 (72)発明者加藤久雄大阪府吹田市青山３丁目50 Ｄ12−110

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遊離型TFPI（ヒト組織因子凝固系インヒ
ビター）には反応するがリポ蛋白質結合型TFPIには反応
しないモノクローナル抗体を用いることを特徴とする遊
離型TFPIの免疫学的定量法。
【請求項２】該モノクローナル抗体が、TFPIのクニッ
ツ３領域に対して特異的に反応する抗体である請求項１
の定量法。
【請求項３】該モノクローナル抗体が、遺伝子組換え
技術により調製されたrTFPIを免疫抗原として用いて調
製されたマウスモノクローナル抗体である請求項１の定
量法。
【請求項４】２抗体法によるサンドイッチ免疫測定法
である請求項１の定量法。
【請求項５】２抗体法によるもう片方の抗体が、抗TF
PIポリクローナル抗体である請求項４の定量法。
【請求項６】２抗体法によるもう片方の抗体が、請求
項１に記載されたモノクローナル抗体とは認識部位の異
なるモノクローナル抗体である請求項４の定量法。
【請求項７】該モノクローナル抗体が、ハイブリドー
マHTFPI-K9の産生する抗体である請求項２の定量法。