JP2712018B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はヒトＩ型プロコラー
ゲンＣ末端ペプチド（以下、プロコラーゲンＣ末端と略
記する）に関連したモノクローナル抗体に関する。 【０００２】 【従来の技術】生体内タン白質コラーゲンは主に線維芽
細胞内で、その前駆体プロコラーゲンとして合成され、
分泌時に特異的ペプチダーゼにより、そのＣ末端ペプチ
ドが切断されて完全なタン白分子に変換する。肝線維症
などの種々の線維化症の主な病状は、その組織における
コラーゲンの過剰合成、過剰沈着であり、体内コラーゲ
ン形成の測定は、肝線維症などの種々の線維化症の診
断、あるいは治療の重要な指針となりうるものである。
プロコラーゲンＣ末端はプロコラーゲンから遊離後も、
血中に一定時間存在する。したがって、血中のプロコラ
ーゲンＣ末端量の測定は、組織における線維形成を診断
するという点で臨床検査上重要であり、その簡便で迅速
な定量法の確立が望まれていた。今日まで組織線維化の
診断は、組織生検、尿中及び組織中のヒドロキシプロリ
ン量、血中プロリンヒドロキシラーゼ活性、血中リジン
オキシダーゼ活性の測定などにより行われていたが、操
作が煩雑であり、特異性にも問題があるといった欠点が
あった。更に最近、プロコラーゲンＣ末端に対するウサ
ギ抗血清を用いたラジオイムノアッセイ法が開発された
〔幸田久平、肝臓、第２５巻、第１９２〜２０３頁（１
９８４）〕。この定量法は、あらかじめ放射能で標識さ
れたプロコラーゲンＣ末端と検体を同時にかつ競合的に
抗プロコラーゲンＣ末端抗体に作用させ、約１〜２日間
反応後、抗ウサギＩｇＧ抗体と約１日間反応させて、免
疫沈降物の放射能活性あるいは上清に残存した放射能活
性を測ることにより、検体中のプロコラーゲンＣ末端量
を定量するものである。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】上記のラジオイムノア
ッセイは少なくとも２日間の操作時間を要し、操作の煩
雑さと共に、放射能物質による環境汚染、人体への影響
という点や、目的抗原に対する抗体として抗血清を使用
しているため、その反応性の特異性という点に問題があ
った。また、この抗血清及び放射能標識プロコラーゲン
Ｃ末端を調製するためには、多量のプロコラーゲンＣ末
端を精製しなければならず、この点でも大きな問題を含
んでいた。本発明は、上記従来技術の定量法の問題点を
克服するためになされたものであり、その目的は体液な
どの試料中のプロコラーゲンＣ末端量を免疫学的に定量
する方法、及びそれに使用する定量用キットのために役
立つモノクローナル抗体を提供することにある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明はモノクローナル抗体に関する発明であって、ヒト
Ｉ型プロコラーゲンをバクテリア由来コラゲナーゼで処
理して得られる、分子量約１０万のプロコラーゲンＣ末
端に特異的であることを特徴とする。 【０００５】抗体を調製する際に、その抗原とするプロ
コラーゲンＣ末端はホフマンらの方法〔Ｈ．Ｐ．ホフマ
ン（Ｈ．Ｐ．Hoffman)プロシーディングズ オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ Ｕ．Ｓ．Ａ（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ．Ｓ．
Ａ）、第７３巻、第４３０４〜４３０８頁（１９７
６）〕により、ヒト線維芽細胞の培養ろ液より得ること
ができる。線維芽細胞を血清を含まない培地中で通常２
４時間培養し培養液を集める。プロコラーゲンを含むタ
ン白画分を硫安で沈殿させ、そして以下に例示した実施
例におけるように、酵素処理、カラムクロマトグラフィ
ーによりプロコラーゲンＣ末端を精製する。プロコラー
ゲンＣ末端の分離精製により、その特異的抗体の作製が
可能となる。この精製抗原に対する抗血清は、既に確立
している方法により調製することができる。すなわちウ
サギなどの実験動物に精製したプロコラーゲンＣ末端を
数回にわたって免疫し、そして適当な期間の後、その動
物から血清を抜取ればよい。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）、ウエスタン ブロッティング法などの技術によ
り、特異的抗体が抗血清中に存在することを試験するこ
とができる。しかし、この方法により特異抗体を得るた
めには、免疫に用いる抗原は純度の高い単一のタン白質
でなければならない。また、ウサギやヤギなどの大型の
実験動物を免疫するためには多量の抗原を調製する必要
がある。それ故、従来法により、特異抗体を得ることは
極めて困難であった。 【０００６】 【発明の実施の形態】本発明者らは、従来法により抗プ
ロコラーゲンＣ末端抗体を調製する際のいろいろな問題
点を解決するためにケーラーとミルシュテインの方法
〔Ko¨hler、Milstein、ネーチャー（Nature) 、第２５
６巻、第４７６頁（１９７５）〕を用いている。この方
法を用いることにより、多量の抗原を用意する必要な
く、かつその抗原を絶対的に純粋にまで精製する必要も
なくなる。なぜなら、ヒトＩ型プロコラーゲンを免疫し
た実験動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合させ、
試験管条件下で特異的抗体を産生するクローン細胞を選
択するからである。特に実験動物としてマウスがよく用
いられる。例えばＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に線維芽
細胞の培養液より抽出したヒトＩ型プロコラーゲンを免
疫し、４週間後に追加免疫を行い、その３日後にマウス
より脾臓を摘出する。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞
とを、ポリエチレングリコールの作用により融合させ、
そして常法により９６穴プレート中にて培養する。各培
養液の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により特異的抗体を
産生している細胞を選択し、更に限界希釈法によりクロ
ーニングを行い、抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナ
ル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を取得する。これら
のハイブリドーマは培養液中にモノクローナル抗体を分
泌する。市販の無血清培地などを用いてハイブリドーマ
を培養しその上清から硫安塩析などの操作により抗体画
分を得ることができる。また同系のマウス体内にて、ハ
イブリドーマを培養し、その動物の体液より同様の操作
により抗体画分を得ることもできる。 【０００７】これらの抗プロコラーゲンＣ末端抗体は、
不溶化担体に固定化した抗体結合固相物や、酵素との結
合体としての酵素標識抗体として定量用キットに用いら
れる。本発明で使用する抗体は、抗血清又はモノクロー
ナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が特
に適している。例えば、抗プロコラーゲンＣ末端抗体結
合固相物、又は酵素標識抗プロコラーゲンＣ末端抗体に
用いる抗体として、２種の異なる抗プロコラーゲンＣ末
端モノクローナル抗体が使用できる。この場合、両者共
プロコラーゲンＣ末端に対して指向性を示すが、特に、
プロコラーゲンＣ末端の別個のエピトープに対して指向
性を示すものが用いられる。更に、これらの抗体は免疫
グロブリンのまま使用されるに限られず、これらの抗体
をペプシン処理して得られるＦ（ａｂ′）2 、Ｆａｂ′
などのフラグメントとしても用いることができる。これ
らのフラグメントを用いた場合、非特異的吸着を防ぐこ
とができる。 【０００８】すなわち、本発明によるプロコラーゲンＣ
末端の定量法は ａ）検体を抗プロコラーゲンＣ末端抗体又は抗体フラグ
メント結合固相物と、酵素標識抗プロコラーゲンＣ末端
抗体又は抗体フラグメントとに同時に一工程で反応さ
せ、検体中のプロコラーゲンＣ末端を固相化抗体又は抗
体フラグメントと酵素標識抗体又は抗体フラグメントと
の間でサンドウィッチを形成させ ｂ）得られたサンドウィッチ上の酵素を該酵素に特異的
な基質と反応させて酵素活性を測定することよりなる。 抗体結合固相物に用いられる不溶化抗体としては抗体を
結合する能力を有するものが使用可能であり、例えばポ
リスチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロライド、
あるいはポリカーボネート製のマイクロプレート、ビー
ズ、スティック又は試験管などが用いられる。また、酵
素標識抗体は、例えばマレイミド法、ピリジル・ジスル
フィド法などの当業者によりよく知られた方法により酵
素標識して製造される。酵素標識に用いる酵素の例とし
ては、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステ
ラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、チ
ロシナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペル
オキシダーゼ等が挙げられ、中でもアルカリホスファタ
ーゼが好ましい。 【０００９】基質としては、酵素標識に用いた酵素に特
異的な基質であればよい。例えば酵素がアルカリホスフ
ァターゼの場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質
とし、その酵素反応によって生じるｐ−ニトロフェノー
ルの濃度を波長４２０ｎｍにおける吸光度として測定す
ればよい。かくして求められた酵素活性からプロコラー
ゲンＣ末端量を換算し、定量することができる。以上の
とおり、本発明は検体中のプロコラーゲンＣ末端の測定
における新規な定量法を提供するもので、肝硬変などの
組織線維化の診断に利用されるものである。 【００１０】 【実施例】次に本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明は何らこれによって限定されるものではな
い。なお、図１及び図２は、本発明の定量法で使用する
検量線を、４２０ｎｍにおける吸光度（縦軸）とプロコ
ラーゲンＣ末端濃度（ｎｇ／ｍｌ、横軸）との関係で示
したグラフである。 【００１１】実施例１ （１）プロコラーゲンＣ末端抗原の単離 プロコラーゲンＣ末端抽出のために、ヒト胎児肺由来の
線維芽細胞（ＩＭＲ−９０）を１０％牛胎児血清を含む
ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地中にて３７℃
で培養する。細胞が適当な密度に増殖したところで、５
０ｍｇ／リットル アスコルビン酸と２０ｍｇ／リット
ル Ｌ−プロリンを添加した血清無添加のＤＭＥＭ培地
に交換し、２４時間培養した後、培養上清を集めた。こ
の培養上清にタン白質分解酵素阻害剤として２５ｍＭエ
チレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１
０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＮ）、１ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１ｍ
Ｍ ｐ−アミノベンズアミド塩酸を加えたのち、硫酸ア
ンモニウム（１７６ｍｇ／ｍｌ）にてタン白質を塩析沈
殿させた。その沈殿を２Ｍ尿素、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶
解したものをＤＥＡＥセファセルカラムに添加し、同緩
衝液１５０ｍｌと０．２Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液１
５０ｍｌのグラジュエントを用いて溶出し、ＮａＣｌ濃
度０．０５Ｍにて溶出されたピークを集めた。ＳＤＳポ
リアクリルアミド電気泳動によりこのピークがヒトＩ型
プロコラーゲン分画であることを確かめた。このように
して得たヒトＩ型プロコラーゲンと精製バクテリア由来
コラゲナーゼ（シグマ社製、アメリカ）を量比５０：１
にて混合し４℃で２０時間インキュベートし、ヒトＩ型
プロコラーゲン分子中のコラーゲン部分のみの分解を行
った。この分解産物からプロコラーゲンＣ末端の最終的
な精製はバイオ・ゲルＡ−１．５ｍ（バイオ−ラッド社
製−アメリカ）カラムクロマトグラフィーにより行い、
分子量約１０万に相当するピークを精製プロコラーゲン
Ｃ末端分画として収集した。 【００１２】（２）プロコラーゲンＣ末端に対する抗血
清の調製 精製プロコラーゲンＣ末端抗原０．５ｍｇを生理食塩水
０．５ｍｌに溶解し、これに等量の完全フロイント・ア
ジュバントを加え、乳化させた後ウサギ皮下に注射し
た。２週間置きに、同量の抗原を不完全フロイント・ア
ジュバントと乳化させたものを４回皮下注射し、最終免
疫より１０日後にその全血を採血し、６０分間室温で放
置した後、遠心分離することにより抗プロコラーゲンＣ
末端抗体を含有する抗血清を得た。その抗体の特異性と
力価は当業者によりよく知られた方法、すなわちＥＬＩ
ＳＡ法、ウエスタンブロッティング法により確かめた。 【００１３】（３）プロコラーゲンＣ末端に対するモノ
クローナル抗体の調製 精製ヒトＩ型プロコラーゲン５０μｇを生理食塩水０．
１ｍｌに溶解し等量の完全フロイント・アジュバントを
加え乳化させ、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射し
た。４週間後に抗原５０μｇのみを同マウスの腹腔内に
注射した。その３日後にマウスより摘出した脾臓より、
脾臓細胞を得、マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と
細胞数１０：１の比で混合し、５０％ポリエチレングル
コール及び２０％ジメチルスルホキシドの存在下で１分
間放置し、細胞融合を行った。無血清ＤＭＥＭ培地を加
え希釈したのち、遠心分離によりその上清を除き、１０
％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地にて細胞を懸濁し、９６
穴マイクロタイタープレートに１穴当り２×１０4 細胞
となるように分注した。その後１〜３日ごとに培地の半
分量をＨＡＴ培地で交換し、１０〜２０日後に融合細胞
（ハイブリドーマ）の生育してきたウエルの培養上清を
採取し、抗体産生の有無をＥＬＩＳＡ法等により調べ、
プロコラーゲンＣ末端に対する抗体を産生しているハイ
ブリドーマを５株選択した。これらのハイブリドーマに
ついて限界希釈法により２回クローニングを行い、最も
力価の高い抗体を産生するハイブリドーマのクローンと
して、ＰＣ５−５とＰＣ８−７の２株を取得した。これ
らのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体がプ
ロコラーゲンＣ末端と特異的に反応することをウエスタ
ンブロッティングにより確かめた。これらのモノクロー
ナル抗体を大量に得るために、Ｂａｌｂ／ｃマウス腹腔
内に約２×１０7 個のハイブリドーマを注射し、腹水腫
瘍を作らせ、１０日後に腹水を採取し、抗プロコラーゲ
ンＣ末端モノクローナル抗体を取得した。 【００１４】（４）抗体の不溶化担体への結合 （２）で得られた抗血清を常法に従い硫安塩析を行いＤ
ＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィーにより抗プ
ロコラーゲンＣ末端抗体を精製した。得られた抗体を石
川らの方法〔Ｅ．石川（Ｅ．Ishikawa) ，スカンジナビ
アン ジャーナル オブ イムノロジー（Scan. Ｊ．Im
munol.) 、第８巻、第４３頁（１９７８）〕によりペプ
シン処理し、抗体フラグメントＦ（ａｂ′）2 を得た。
この抗体フラグメントを１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．５）に１００μｇ／ｍｌとなるように溶解
し、これにポリスチレンボール（積水化学社製、粒径
６．４ｍｍ）を浸し、４℃にて１８時間インキュベート
して抗体フラグメントをボールに固定化した。これは１
％牛血清アルブミン、０．１％ＮａＮ3 を含むトリス緩
衝生理食塩水（ＴＢＳ）中に４℃にて保存した。 【００１５】（５）アルカリホスファターゼ標識抗プロ
コラーゲンＣ末端モノクローナル抗体の調製 （３）で得られた抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナ
ル抗体（ＰＣ８−７）を含む腹水より常法に従い、抗プ
ロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体（ＰＣ８−７）
を精製し、前記石川らの方法によりモノクローナル抗体
フラグメントＦａｂ′を得た。このようにして得たモノ
クローナル抗体（ＰＣ８−７）フラグメントをＮ−スク
シンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（ジーベンケミカル社
製、東京）を用い、石川らの方法（酵素免疫測定法、第
２版、第９２頁、１９８２年１２月１５日発行、医学書
院）に従ってアルカリホスファターゼ（ベーリンガー社
製、西ドイツ）に結合させた。 【００１６】（６）プロコラーゲンＣ末端の測定 プロコラーゲンＣ末端を含む検体５０μｌを試験管に採
り（４）で調製した抗体固定化ポリスチレンボールを１
個添加し、（５）で調製した酵素標識抗体フラグメント
を０．１％牛血清アルブミン含有ＴＢＳで１μｇ／ｍｌ
に希釈した液を直ちに０．６ｍｌ加え、室温で３０分間
インキュベートする。次いでポリスチレンボールを分取
し、０．１％トウイーン（Tween)２０（半井化学薬品社
製、京都）を含むＴＢＳ２ｍｌで４回洗浄し、基質とし
てｐ−ニトロフェニルリン酸（和光純薬工業社製、大
阪）を１０ｍＭとなるように０．０５Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ９．７，２ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有）で溶解し
た液を０．６ｍｌ添加し、室温で１５分間インキュベー
トする。その後０．１Ｎ ＮａＯＨ２ｍｌを添加し反応
を停止させ、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。測定結果より求めた検量線を図１に示す。 【００１７】実施例２ （１）プロコラーゲンＣ末端抗原の単離 実施例１に準じて行った。 （２）抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体の調
製 実施例１に準じて行った。 （３）抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体の不
溶化担体への結合 実施例１の（４）と同様に行った。すなわち、モノクロ
ーナル抗体（ＰＣ５−５）を含む腹水からモノクローナ
ル抗体（ＰＣ５−５）を精製し、ペプシン処理により抗
体フラグメントＦ（ａｂ′）2 を得た。これを１０ｍＭ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に１００μｇ／ｍ
ｌとなるように溶解し、この溶液中にてポリスチレンボ
ールを４℃で１８時間インキュベートすることにより製
造した。 （４）酵素標識抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル
抗体の調製 実施例１に準じて行った。 （５）プロコラーゲンＣ末端の測定 実施例１に準じて行った。測定結果より求めた検量線を
図２に示す。 【００１８】 【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
り、プロコラーゲンＣ末端量が、１時間で迅速にしかも
５μｇ／ｍｌという高感度で定量することが可能となっ
た。
ゲンＣ末端ペプチド（以下、プロコラーゲンＣ末端と略
記する）に関連したモノクローナル抗体に関する。 【０００２】 【従来の技術】生体内タン白質コラーゲンは主に線維芽
細胞内で、その前駆体プロコラーゲンとして合成され、
分泌時に特異的ペプチダーゼにより、そのＣ末端ペプチ
ドが切断されて完全なタン白分子に変換する。肝線維症
などの種々の線維化症の主な病状は、その組織における
コラーゲンの過剰合成、過剰沈着であり、体内コラーゲ
ン形成の測定は、肝線維症などの種々の線維化症の診
断、あるいは治療の重要な指針となりうるものである。
プロコラーゲンＣ末端はプロコラーゲンから遊離後も、
血中に一定時間存在する。したがって、血中のプロコラ
ーゲンＣ末端量の測定は、組織における線維形成を診断
するという点で臨床検査上重要であり、その簡便で迅速
な定量法の確立が望まれていた。今日まで組織線維化の
診断は、組織生検、尿中及び組織中のヒドロキシプロリ
ン量、血中プロリンヒドロキシラーゼ活性、血中リジン
オキシダーゼ活性の測定などにより行われていたが、操
作が煩雑であり、特異性にも問題があるといった欠点が
あった。更に最近、プロコラーゲンＣ末端に対するウサ
ギ抗血清を用いたラジオイムノアッセイ法が開発された
〔幸田久平、肝臓、第２５巻、第１９２〜２０３頁（１
９８４）〕。この定量法は、あらかじめ放射能で標識さ
れたプロコラーゲンＣ末端と検体を同時にかつ競合的に
抗プロコラーゲンＣ末端抗体に作用させ、約１〜２日間
反応後、抗ウサギＩｇＧ抗体と約１日間反応させて、免
疫沈降物の放射能活性あるいは上清に残存した放射能活
性を測ることにより、検体中のプロコラーゲンＣ末端量
を定量するものである。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】上記のラジオイムノア
ッセイは少なくとも２日間の操作時間を要し、操作の煩
雑さと共に、放射能物質による環境汚染、人体への影響
という点や、目的抗原に対する抗体として抗血清を使用
しているため、その反応性の特異性という点に問題があ
った。また、この抗血清及び放射能標識プロコラーゲン
Ｃ末端を調製するためには、多量のプロコラーゲンＣ末
端を精製しなければならず、この点でも大きな問題を含
んでいた。本発明は、上記従来技術の定量法の問題点を
克服するためになされたものであり、その目的は体液な
どの試料中のプロコラーゲンＣ末端量を免疫学的に定量
する方法、及びそれに使用する定量用キットのために役
立つモノクローナル抗体を提供することにある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明はモノクローナル抗体に関する発明であって、ヒト
Ｉ型プロコラーゲンをバクテリア由来コラゲナーゼで処
理して得られる、分子量約１０万のプロコラーゲンＣ末
端に特異的であることを特徴とする。 【０００５】抗体を調製する際に、その抗原とするプロ
コラーゲンＣ末端はホフマンらの方法〔Ｈ．Ｐ．ホフマ
ン（Ｈ．Ｐ．Hoffman)プロシーディングズ オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ Ｕ．Ｓ．Ａ（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ．Ｓ．
Ａ）、第７３巻、第４３０４〜４３０８頁（１９７
６）〕により、ヒト線維芽細胞の培養ろ液より得ること
ができる。線維芽細胞を血清を含まない培地中で通常２
４時間培養し培養液を集める。プロコラーゲンを含むタ
ン白画分を硫安で沈殿させ、そして以下に例示した実施
例におけるように、酵素処理、カラムクロマトグラフィ
ーによりプロコラーゲンＣ末端を精製する。プロコラー
ゲンＣ末端の分離精製により、その特異的抗体の作製が
可能となる。この精製抗原に対する抗血清は、既に確立
している方法により調製することができる。すなわちウ
サギなどの実験動物に精製したプロコラーゲンＣ末端を
数回にわたって免疫し、そして適当な期間の後、その動
物から血清を抜取ればよい。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）、ウエスタン ブロッティング法などの技術によ
り、特異的抗体が抗血清中に存在することを試験するこ
とができる。しかし、この方法により特異抗体を得るた
めには、免疫に用いる抗原は純度の高い単一のタン白質
でなければならない。また、ウサギやヤギなどの大型の
実験動物を免疫するためには多量の抗原を調製する必要
がある。それ故、従来法により、特異抗体を得ることは
極めて困難であった。 【０００６】 【発明の実施の形態】本発明者らは、従来法により抗プ
ロコラーゲンＣ末端抗体を調製する際のいろいろな問題
点を解決するためにケーラーとミルシュテインの方法
〔Ko¨hler、Milstein、ネーチャー（Nature) 、第２５
６巻、第４７６頁（１９７５）〕を用いている。この方
法を用いることにより、多量の抗原を用意する必要な
く、かつその抗原を絶対的に純粋にまで精製する必要も
なくなる。なぜなら、ヒトＩ型プロコラーゲンを免疫し
た実験動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合させ、
試験管条件下で特異的抗体を産生するクローン細胞を選
択するからである。特に実験動物としてマウスがよく用
いられる。例えばＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に線維芽
細胞の培養液より抽出したヒトＩ型プロコラーゲンを免
疫し、４週間後に追加免疫を行い、その３日後にマウス
より脾臓を摘出する。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞
とを、ポリエチレングリコールの作用により融合させ、
そして常法により９６穴プレート中にて培養する。各培
養液の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により特異的抗体を
産生している細胞を選択し、更に限界希釈法によりクロ
ーニングを行い、抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナ
ル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を取得する。これら
のハイブリドーマは培養液中にモノクローナル抗体を分
泌する。市販の無血清培地などを用いてハイブリドーマ
を培養しその上清から硫安塩析などの操作により抗体画
分を得ることができる。また同系のマウス体内にて、ハ
イブリドーマを培養し、その動物の体液より同様の操作
により抗体画分を得ることもできる。 【０００７】これらの抗プロコラーゲンＣ末端抗体は、
不溶化担体に固定化した抗体結合固相物や、酵素との結
合体としての酵素標識抗体として定量用キットに用いら
れる。本発明で使用する抗体は、抗血清又はモノクロー
ナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が特
に適している。例えば、抗プロコラーゲンＣ末端抗体結
合固相物、又は酵素標識抗プロコラーゲンＣ末端抗体に
用いる抗体として、２種の異なる抗プロコラーゲンＣ末
端モノクローナル抗体が使用できる。この場合、両者共
プロコラーゲンＣ末端に対して指向性を示すが、特に、
プロコラーゲンＣ末端の別個のエピトープに対して指向
性を示すものが用いられる。更に、これらの抗体は免疫
グロブリンのまま使用されるに限られず、これらの抗体
をペプシン処理して得られるＦ（ａｂ′）2 、Ｆａｂ′
などのフラグメントとしても用いることができる。これ
らのフラグメントを用いた場合、非特異的吸着を防ぐこ
とができる。 【０００８】すなわち、本発明によるプロコラーゲンＣ
末端の定量法は ａ）検体を抗プロコラーゲンＣ末端抗体又は抗体フラグ
メント結合固相物と、酵素標識抗プロコラーゲンＣ末端
抗体又は抗体フラグメントとに同時に一工程で反応さ
せ、検体中のプロコラーゲンＣ末端を固相化抗体又は抗
体フラグメントと酵素標識抗体又は抗体フラグメントと
の間でサンドウィッチを形成させ ｂ）得られたサンドウィッチ上の酵素を該酵素に特異的
な基質と反応させて酵素活性を測定することよりなる。 抗体結合固相物に用いられる不溶化抗体としては抗体を
結合する能力を有するものが使用可能であり、例えばポ
リスチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロライド、
あるいはポリカーボネート製のマイクロプレート、ビー
ズ、スティック又は試験管などが用いられる。また、酵
素標識抗体は、例えばマレイミド法、ピリジル・ジスル
フィド法などの当業者によりよく知られた方法により酵
素標識して製造される。酵素標識に用いる酵素の例とし
ては、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステ
ラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、チ
ロシナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペル
オキシダーゼ等が挙げられ、中でもアルカリホスファタ
ーゼが好ましい。 【０００９】基質としては、酵素標識に用いた酵素に特
異的な基質であればよい。例えば酵素がアルカリホスフ
ァターゼの場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質
とし、その酵素反応によって生じるｐ−ニトロフェノー
ルの濃度を波長４２０ｎｍにおける吸光度として測定す
ればよい。かくして求められた酵素活性からプロコラー
ゲンＣ末端量を換算し、定量することができる。以上の
とおり、本発明は検体中のプロコラーゲンＣ末端の測定
における新規な定量法を提供するもので、肝硬変などの
組織線維化の診断に利用されるものである。 【００１０】 【実施例】次に本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明は何らこれによって限定されるものではな
い。なお、図１及び図２は、本発明の定量法で使用する
検量線を、４２０ｎｍにおける吸光度（縦軸）とプロコ
ラーゲンＣ末端濃度（ｎｇ／ｍｌ、横軸）との関係で示
したグラフである。 【００１１】実施例１ （１）プロコラーゲンＣ末端抗原の単離 プロコラーゲンＣ末端抽出のために、ヒト胎児肺由来の
線維芽細胞（ＩＭＲ−９０）を１０％牛胎児血清を含む
ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地中にて３７℃
で培養する。細胞が適当な密度に増殖したところで、５
０ｍｇ／リットル アスコルビン酸と２０ｍｇ／リット
ル Ｌ−プロリンを添加した血清無添加のＤＭＥＭ培地
に交換し、２４時間培養した後、培養上清を集めた。こ
の培養上清にタン白質分解酵素阻害剤として２５ｍＭエ
チレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１
０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＮ）、１ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１ｍ
Ｍ ｐ−アミノベンズアミド塩酸を加えたのち、硫酸ア
ンモニウム（１７６ｍｇ／ｍｌ）にてタン白質を塩析沈
殿させた。その沈殿を２Ｍ尿素、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶
解したものをＤＥＡＥセファセルカラムに添加し、同緩
衝液１５０ｍｌと０．２Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液１
５０ｍｌのグラジュエントを用いて溶出し、ＮａＣｌ濃
度０．０５Ｍにて溶出されたピークを集めた。ＳＤＳポ
リアクリルアミド電気泳動によりこのピークがヒトＩ型
プロコラーゲン分画であることを確かめた。このように
して得たヒトＩ型プロコラーゲンと精製バクテリア由来
コラゲナーゼ（シグマ社製、アメリカ）を量比５０：１
にて混合し４℃で２０時間インキュベートし、ヒトＩ型
プロコラーゲン分子中のコラーゲン部分のみの分解を行
った。この分解産物からプロコラーゲンＣ末端の最終的
な精製はバイオ・ゲルＡ−１．５ｍ（バイオ−ラッド社
製−アメリカ）カラムクロマトグラフィーにより行い、
分子量約１０万に相当するピークを精製プロコラーゲン
Ｃ末端分画として収集した。 【００１２】（２）プロコラーゲンＣ末端に対する抗血
清の調製 精製プロコラーゲンＣ末端抗原０．５ｍｇを生理食塩水
０．５ｍｌに溶解し、これに等量の完全フロイント・ア
ジュバントを加え、乳化させた後ウサギ皮下に注射し
た。２週間置きに、同量の抗原を不完全フロイント・ア
ジュバントと乳化させたものを４回皮下注射し、最終免
疫より１０日後にその全血を採血し、６０分間室温で放
置した後、遠心分離することにより抗プロコラーゲンＣ
末端抗体を含有する抗血清を得た。その抗体の特異性と
力価は当業者によりよく知られた方法、すなわちＥＬＩ
ＳＡ法、ウエスタンブロッティング法により確かめた。 【００１３】（３）プロコラーゲンＣ末端に対するモノ
クローナル抗体の調製 精製ヒトＩ型プロコラーゲン５０μｇを生理食塩水０．
１ｍｌに溶解し等量の完全フロイント・アジュバントを
加え乳化させ、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射し
た。４週間後に抗原５０μｇのみを同マウスの腹腔内に
注射した。その３日後にマウスより摘出した脾臓より、
脾臓細胞を得、マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と
細胞数１０：１の比で混合し、５０％ポリエチレングル
コール及び２０％ジメチルスルホキシドの存在下で１分
間放置し、細胞融合を行った。無血清ＤＭＥＭ培地を加
え希釈したのち、遠心分離によりその上清を除き、１０
％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地にて細胞を懸濁し、９６
穴マイクロタイタープレートに１穴当り２×１０4 細胞
となるように分注した。その後１〜３日ごとに培地の半
分量をＨＡＴ培地で交換し、１０〜２０日後に融合細胞
（ハイブリドーマ）の生育してきたウエルの培養上清を
採取し、抗体産生の有無をＥＬＩＳＡ法等により調べ、
プロコラーゲンＣ末端に対する抗体を産生しているハイ
ブリドーマを５株選択した。これらのハイブリドーマに
ついて限界希釈法により２回クローニングを行い、最も
力価の高い抗体を産生するハイブリドーマのクローンと
して、ＰＣ５−５とＰＣ８−７の２株を取得した。これ
らのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体がプ
ロコラーゲンＣ末端と特異的に反応することをウエスタ
ンブロッティングにより確かめた。これらのモノクロー
ナル抗体を大量に得るために、Ｂａｌｂ／ｃマウス腹腔
内に約２×１０7 個のハイブリドーマを注射し、腹水腫
瘍を作らせ、１０日後に腹水を採取し、抗プロコラーゲ
ンＣ末端モノクローナル抗体を取得した。 【００１４】（４）抗体の不溶化担体への結合 （２）で得られた抗血清を常法に従い硫安塩析を行いＤ
ＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィーにより抗プ
ロコラーゲンＣ末端抗体を精製した。得られた抗体を石
川らの方法〔Ｅ．石川（Ｅ．Ishikawa) ，スカンジナビ
アン ジャーナル オブ イムノロジー（Scan. Ｊ．Im
munol.) 、第８巻、第４３頁（１９７８）〕によりペプ
シン処理し、抗体フラグメントＦ（ａｂ′）2 を得た。
この抗体フラグメントを１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．５）に１００μｇ／ｍｌとなるように溶解
し、これにポリスチレンボール（積水化学社製、粒径
６．４ｍｍ）を浸し、４℃にて１８時間インキュベート
して抗体フラグメントをボールに固定化した。これは１
％牛血清アルブミン、０．１％ＮａＮ3 を含むトリス緩
衝生理食塩水（ＴＢＳ）中に４℃にて保存した。 【００１５】（５）アルカリホスファターゼ標識抗プロ
コラーゲンＣ末端モノクローナル抗体の調製 （３）で得られた抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナ
ル抗体（ＰＣ８−７）を含む腹水より常法に従い、抗プ
ロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体（ＰＣ８−７）
を精製し、前記石川らの方法によりモノクローナル抗体
フラグメントＦａｂ′を得た。このようにして得たモノ
クローナル抗体（ＰＣ８−７）フラグメントをＮ−スク
シンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（ジーベンケミカル社
製、東京）を用い、石川らの方法（酵素免疫測定法、第
２版、第９２頁、１９８２年１２月１５日発行、医学書
院）に従ってアルカリホスファターゼ（ベーリンガー社
製、西ドイツ）に結合させた。 【００１６】（６）プロコラーゲンＣ末端の測定 プロコラーゲンＣ末端を含む検体５０μｌを試験管に採
り（４）で調製した抗体固定化ポリスチレンボールを１
個添加し、（５）で調製した酵素標識抗体フラグメント
を０．１％牛血清アルブミン含有ＴＢＳで１μｇ／ｍｌ
に希釈した液を直ちに０．６ｍｌ加え、室温で３０分間
インキュベートする。次いでポリスチレンボールを分取
し、０．１％トウイーン（Tween)２０（半井化学薬品社
製、京都）を含むＴＢＳ２ｍｌで４回洗浄し、基質とし
てｐ−ニトロフェニルリン酸（和光純薬工業社製、大
阪）を１０ｍＭとなるように０．０５Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ９．７，２ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有）で溶解し
た液を０．６ｍｌ添加し、室温で１５分間インキュベー
トする。その後０．１Ｎ ＮａＯＨ２ｍｌを添加し反応
を停止させ、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。測定結果より求めた検量線を図１に示す。 【００１７】実施例２ （１）プロコラーゲンＣ末端抗原の単離 実施例１に準じて行った。 （２）抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体の調
製 実施例１に準じて行った。 （３）抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体の不
溶化担体への結合 実施例１の（４）と同様に行った。すなわち、モノクロ
ーナル抗体（ＰＣ５−５）を含む腹水からモノクローナ
ル抗体（ＰＣ５−５）を精製し、ペプシン処理により抗
体フラグメントＦ（ａｂ′）2 を得た。これを１０ｍＭ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に１００μｇ／ｍ
ｌとなるように溶解し、この溶液中にてポリスチレンボ
ールを４℃で１８時間インキュベートすることにより製
造した。 （４）酵素標識抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル
抗体の調製 実施例１に準じて行った。 （５）プロコラーゲンＣ末端の測定 実施例１に準じて行った。測定結果より求めた検量線を
図２に示す。 【００１８】 【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
り、プロコラーゲンＣ末端量が、１時間で迅速にしかも
５μｇ／ｍｌという高感度で定量することが可能となっ
た。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のモノクローナル抗体を用いる定量法で
使用する検量線を、４２０ｎｍでの吸光度とプロコラー
ゲンＣ末端量との関係で示したグラフである。 【図２】本発明のモノクローナル抗体を用いる定量法で
使用する検量線を、４２０ｎｍでの吸光度とプロコラー
ゲンＣ末端量との関係で示したグラフである。
使用する検量線を、４２０ｎｍでの吸光度とプロコラー
ゲンＣ末端量との関係で示したグラフである。 【図２】本発明のモノクローナル抗体を用いる定量法で
使用する検量線を、４２０ｎｍでの吸光度とプロコラー
ゲンＣ末端量との関係で示したグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ
33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ヒトＩ型プロコラーゲンをバクテリア由来コラゲナ
ーゼで処理して得られる、分子量約１０万のヒトＩ型プ
ロコラーゲンＣ末端ペプチドに特異的であることを特徴
とするモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8147819A JP2712018B2 (ja) | 1996-05-20 | 1996-05-20 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8147819A JP2712018B2 (ja) | 1996-05-20 | 1996-05-20 | モノクローナル抗体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60254873A Division JP2603822B2 (ja) | 1985-11-15 | 1985-11-15 | ヒトｉ型プロコラーゲンｃ末端ペプチドの定量用キツト |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08325295A JPH08325295A (ja) | 1996-12-10 |
| JP2712018B2 true JP2712018B2 (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=15438951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8147819A Expired - Fee Related JP2712018B2 (ja) | 1996-05-20 | 1996-05-20 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2712018B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0913692A1 (en) * | 1997-10-31 | 1999-05-06 | Bayer Ag | An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide |
| KR100444393B1 (ko) * | 2001-10-15 | 2004-08-16 | 주식회사 하림 | ＯＡｃＧＤ３Ｓ 유전자의 상향조절된 발현의 확인을 통한간 섬유증 진단용 키트 |
| KR101787485B1 (ko) * | 2015-12-30 | 2017-11-15 | 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 | 재조합 picp 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 항체의 제조방법 |
-
1996
- 1996-05-20 JP JP8147819A patent/JP2712018B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08325295A (ja) | 1996-12-10 |
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