JPH08211054A - 抗体、抗体作製方法及び免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高感度にハプテンの量を測定できる抗体の提
供と該抗体を用いた免疫学的測定方法の提供。 【構成】 ハプテンと該ハプテンに反応する抗体からな
る免疫複合体を用いて免疫することを特徴とする抗体作
製方法及び該抗体又は該抗体を用いる免疫学的測定方
法。ハプテン及びハプテンの修飾体に反応する第１の抗
体と該ハプテンとの免疫複合体には反応するが、第１の
抗体と該ハプテンの修飾体との免疫複合体には反応しな
いことを特徴とする抗体又は該抗体を用いる免疫学的測
定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、それ自身では免疫原性
がない低分子化合物（ハプテン）を担体（通常蛋白質の
ような高分子化合物）と結合させた形で動物に対して免
疫感作をおこなうことにより当該ハプテン部分に対する
抗体作製方法及び該抗体を用いた免疫学的測定方法に関
する。さらに詳しくは、２抗体を用いる、いわゆるサン
ドイッチアッセイ、又は凝集法による免疫学的測定方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】低分子化合物（ハプテン）はその分子量
の小ささから抗原決定基を通常１〜２ケしか持たない。
また、２つある場合も、それぞれの抗原決定基が隣接し
ているため、蛋白質等を測定する際に一般的に用いられ
ている２抗体法（いわゆるサンドイッチアッセイ）を行
うことが出来ない。そのためハプテンの場合には標識抗
原または固相化した抗原との競争反応によるいわゆる競
合法を採用している。

【０００３】また、同様に、抗原物質が一価抗原である
低分子化合物（ハプテン）を測定する免疫凝集法はハプ
テンを蛋白質等に多数結合させたいわゆるポリハプテン
を用いた「凝集阻害法」と呼ばれる方法により行われて
いる。

【０００４】ハプテンを測定することのできる競合法
は、サンドイッチ法と異なり抗原と反応する抗体を１種
類のみ用いることにより測定するため抗体の特異性が非
常に厳格に要求される。すなわち、サンドイッチ法では
２種類の抗体により抗原を“はさむ”ため双方の抗体の
共通反応物質のみが検出されるのに対し、競合法では１
種類の抗体が反応する物質は全て検出対象に含まれてし
まうからである。

【０００５】ハプテンを測定する競合法は、被検液中の
ハプテンを測定するために競合対象とするハプテン、お
よび抗体の３者の濃度関係により測定感度が大きく影響
を受けていた。例えば固相化抗原と標識化抗体を用いる
「標識抗体法」の場合で説明すると、前述３者のうち被
検液中ハプテンを測定するために調整可能な固相化抗原
濃度、標識化抗体濃度はいずれも高すぎるほど測定対象
ハプテンの検出感度は低下する。特に固相化抗原の濃度
の影響は大きく、その他の測定条件にもよるが固相の抗
原濃度を10倍高めるとハプテンの検出感度は1/10程度に
なってしまう。従って、常に至適条件下で安定して測定
を行う上で問題があった。また、測定対象物（ハプテ
ン）の濃度に対してシグナルの直線性が得られ難く、濃
度域によるデータのばらつきが異なるという問題があっ
た。

【０００６】また、検出感度の点においても競合法はサ
ンドイッチ法より数オーダー低いことが指摘（エンザイ
ム・イムノアッセイ：R.H.BURDON等編：東京化学同人，
10頁）されている。

【０００７】凝集法においても、凝集素としてのポリハ
プテンを用いる必要があるがその分子中の結合ハプテン
量により凝集の挙動が異なるため安定した凝集性能を維
持するためには安定したハプテンの結合数を示すポリハ
プテンを調製することが重要であったが同時に困難もあ
った。また、そのポリハプテン量を増やしすぎると被検
液中のハプテンが存在しないにも関わらず見かけ上凝集
が抑制されたような挙動を示すことがあった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ハプテンの場合にも２
抗体法と同様な方法により検出するか、‘競合的’にで
はなく‘付加的’に反応を行うことが出来れば濃度に対
する直線性をはじめ上記の問題はすべて解決することに
着目し、従来不可能とされたハプテンの２抗体測定法に
よる測定が本発明により可能になった。

【０００９】従って、本発明の目的は、分子量の小さい
ハプテンを、低濃度で効率よく定量できる抗体の作製方
法を提供し、かつ該抗体を用いた免疫学的測定方法の提
供にある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、以
下の構成により解決される。

【００１１】１） ハプテンと該ハプテンに反応する抗
体からなる免疫複合体を用いて免疫することを特徴とす
る抗体作製方法。

【００１２】２） ハプテンと該ハプテンに反応する抗
体からなる免疫複合体に対して反応し、該ハプテンに反
応する抗体には反応しないことを特徴とする抗体。

【００１３】３） 前記ハプテンに反応する抗体がモノ
クローナル抗体であることを特徴とする前記２記載の抗
体。

【００１４】４） 前記免疫複合体に対して反応する抗
体がモノクローナル抗体であることを特徴とする前記２
記載の抗体。

【００１５】５） 前記ハプテンに反応する抗体および
前記免疫複合体に対して反応する抗体がいずれもモノク
ローナル抗体であることを特徴とする前記２記載の抗
体。

【００１６】６） 前記ハプテンに反応する第１の抗体
を固相に吸着し、次いで該ハプテンを含む被検液を接触
させて該ハプテンを結合させた後、前記２乃至５のいず
れか１項に記載の抗体を反応させ前記２、３、４又は５
記載の抗体を検出することを特徴とする免疫学的測定方
法。

【００１７】７） ハプテンとハプテンに反応する第１
の抗体からなる免疫複合体の被検液を、前記２乃至５の
いずれか１項に記載された抗体を吸着した固相と接触、
反応させた後第１の抗体を検出することにより該ハプテ
ンを検出することを特徴とする免疫学的測定方法。

【００１８】８） ハプテン及びハプテンの修飾体に反
応する第１の抗体と該ハプテンとの免疫複合体には反応
するが、第１の抗体と該ハプテンの修飾体との免疫複合
体には反応しないことを特徴とする抗体。

【００１９】９） 前記８記載の第１の抗体がＦc部分
を欠落した抗体であることを特徴とする前記８記載の抗
体。

【００２０】10） 前記８又は９記載の第１の抗体がモ
ノクローナル抗体であることを特徴とする前記８又は９
記載の抗体。

【００２１】11） ハプテン及びハプテンの修飾体に反
応する第１の抗体を固相化した後、被検液中の該ハプテ
ンとを反応させ、次いで、過剰量の前記ハプテン修飾体
および標識化された前記８、９又10記載の抗体を反応さ
せた後、固相化された前記８、９又10記載の抗体を検出
することにより該ハプテンを検出することを特徴とする
免疫学的測定方法。

【００２２】12） 標識化されたハプテン及びハプテン
の修飾体に反応する第１の抗体と被検液中の該ハプテン
とを反応させた後、過剰量の該ハプテン修飾体および固
相化された前記８、９又10記載の抗体を反応させた後、
固相化された前記第１の抗体を検出することにより該ハ
プテンを検出することを特徴とする免疫学的測定方法。

【００２３】13） 不溶性担体粒子に吸着もしくは結合
させたハプテン及びハプテン修飾体に反応する第１の抗
体と被検液中の該ハプテンと反応させた後、過剰量の該
ハプテン修飾体および前記８、９又10記載の抗体を反応
させた後、前記８、９又10記載の抗体に反応する抗体を
添加して不溶性担体粒子の凝集を起こし、その凝集度合
いを測定することにより該ハプテンを検出することを特
徴とする免疫学的測定方法。

【００２４】14） ハプテン及びハプテン修飾体に反応
する第１の抗体と被検液中の該ハプテンを反応させた
後、過剰量の該ハプテン修飾体および不溶性担体粒子に
吸着もしくは結合させた前記８、９又10記載の抗体を反
応させ、次いで、該第１の抗体に反応する抗体を添加す
ることにより不溶性担体粒子の凝集を起こし、その凝集
度合いを測定することにより該ハプテンを検出すること
を特徴とする免疫学的測定方法。

【００２５】本発明において、分子量の小ささからハプ
テンに対して抗体は１カ所しか反応する部位を持たない
場合であっても、ハプテンが抗体と結合した状態であれ
ばその結合しているハプテンに対して第２の抗体が反応
することが出来ることを見いだした。

【００２６】ハプテンに対する抗体を例えば通常の方法
（ハプテンをキャリアー蛋白質に結合して免疫感作して
抗血清からポリクローナル抗体を分離するか、または脾
臓細胞を取り出して同種動物のミエローマ細胞と融合し
てモノクローナル抗体を分離する。）により作製し（以
下第１の抗体）、該第１の抗体と抗原との免疫複合体を
形成させた状態で新たに免疫感作を行い、該第１の抗体
と結合した抗原に対して反応し、当該第１の抗体自身に
は反応しない抗体（以下第２の抗体）を分離する。この
場合免疫複合体を免疫感作する場合には通常のアジュバ
ントを用いても良いが免疫複合体を解裂させない為に静
脈注射または、脾臓に直接注射する等の方法を採ること
が好ましい。また、第１の抗体、第２の抗体はモノクロ
ーナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても
良いが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。

【００２７】こうして得られた第１の抗体と第２の抗体
とを用いて以下のような測定系によりハプテン分子を定
量することが可能となった。すなわち、第１の抗体とハ
プテンを反応させた後該免疫複合体と第２の抗体とを反
応させ、｛第１の抗体-ハプテン-第２の抗体｝の複合体
を検出することによりハプテンを定量する。

【００２８】詳細な態様を示すと、例えば、第１の方法
としては、第１の抗体を固相に固定化してハプテンを含
む被検液と接触させてハプテンを結合させた後第２の抗
体を反応させる。第２の抗体を直接または間接に標識化
しておくことにより当業者に知られた方法により固相に
結合したハプテンを定量することが出来る。標識をシグ
ナルに変換する方法は当業者に知られているところであ
る。標識は直接抗体に結合させる、または、ビオチン・
アビジン系を用いて結合させる、第２の抗体に反応する
抗体に結合させることにより間接的に標識物質を結合さ
せることもできる。標識化合物は当然にＨＲＰなどの酵
素を用いても良いし、放射性元素を用いても良いし、ま
たその他当業者に知られる方法により行うことが出来
る。

【００２９】第２の方法としては、第１の抗体をハプテ
ンを含む被検液中に加えて第１の抗体とハプテンの免疫
複合体を形成させ、次いで該複合体を含む被検液を固相
化した第２の抗体に接触させる。次いで、直接または間
接に標識化された第１の抗体を検出することによりハプ
テンの定量を行う。標識物質は前述と同様であり、標識
は、例えば予め標識しておいた（酵素あるいは放射性元
素）標識化抗体を用いることもできるし、ビオチン化標
識した第１抗体を用いることもできる。また、第１抗体
はハプテンと反応させる段階では標識されてないものを
用い、第２抗体-ハプテンを介して固相化された時点で
第１の抗体に反応する物質（例えば抗「第１抗体」抗
体）を標識化しておいたものを反応させて検出を行って
も良い。

【００３０】このように、ハプテン測定においても、本
発明を用いることにより２抗体法が可能となり競合法よ
りも高感度に測定することが可能となった。また、第２
の方法によればハプテンに対して十分に特異的な抗体が
作製されない場合（交差反応性が確認される場合）にお
いても第２の抗体が、交差反応物質（例えばハプテン類
似物質）と第１の抗体との免疫複合体に対してハプテン
と第１の抗体との免疫複合体のより反応性が高いものを
用いることによって測定の特異性を向上させることが可
能である。

【００３１】また、本発明の別の態様として、抗体が分
子量の小さいハプテンに反応した場合その抗体分子上の
抗原反応部位近傍はあまり立体障害を受けないので、ハ
プテン修飾体（例えばハプテンに蛋白質のような高分子
を結合させたもの）と抗体を反応させ、その抗体分子上
の抗原決定部位近傍は大きな立体障害を付与する。すな
わち、第１の抗体を測定対象のハプテンと反応させた
後、未反応抗体をハプテン修飾体でブロックして第２の
抗体を第１の抗体のハプテン結合部位近傍に反応させる
ことにより、サンドイッチ様の‘付加的’とすることが
出来る。

【００３２】ハプテンに対する抗体を例えば通常の方法
（ハプテンをキャリアー蛋白質に結合して免疫感作して
抗血清からポリクローナル抗体を分離するか、または脾
臓細胞を取り出して同種動物のミエローマ細胞と融合し
てモノクローナル抗体を分離する。）により作製する
（以下第１の抗体）。第１の抗体は第２の抗体の免疫原
となることからモノクローナル抗体であることが好まし
い。第２の抗体は例えば以下のようにして得られる。上
述の操作により得た第１の抗体を精製して動物に免疫を
行う。この場合、第１の抗体はＦab部分を含んでいれば
フラグメントであっても良い。第２の抗体がポリクロー
ナル抗体である場合は、免疫感作の結果得られた抗血清
を例えば当業者において知られる方法（陰イオン交換カ
ラム等）によりIgG画分のみを精製した後、ハプテンと
結合した第１の抗体を固定化したアフィニティ・カラム
に吸着した画分を、続いてハプテン修飾体と結合した第
１の抗体のアフィニティ・カラムに通過させて通過した
画分を「第２の抗体」として用いることが出来る。第２
の抗体についてもモノクローナル抗体が好ましく用いら
れる。第２の抗体がモノクローナル抗体である場合に
は、例えば通常の方法により細胞融合を行いハイブリド
ーマを樹立し、第１の抗体とハプテンとの結合体には反
応し第１の抗体とハプテン修飾体との結合体には反応し
ない抗体を産生するウェルからハイブリドーマのクロー
ンを分離して、当該ハイブリドーマをInvitro、また
は、In vivoで培養して常法により抗体を分離し、「第
２の抗体」とすることが出来る。

【００３３】こうして得られた第１の抗体と第２の抗体
とを用いて以下のような測定系によりハプテン分子を定
量することが可能となった。すなわち、第１の抗体とハ
プテンを反応させた後、ハプテン修飾体を充分量反応さ
せた後、または同時に、第２の抗体とを反応させ、｛第
１の抗体-第２の抗体｝の複合体を検出することにより
ハプテンを定量する。

【００３４】詳細な態様を示すと、例えば、第１の方法
としては、第１の抗体を固相に固定化してハプテンを含
む被検液と接触させてハプテンを結合させた後、過剰量
のハプテン修飾体と第２の抗体を反応させる。第２の抗
体を直接または間接に標識化しておくことにより当業者
に知られた方法により固相に結合したハプテンを定量す
ることが出来る。標識をシグナルに変換する方法は当業
者に知られているところである。標識は直接抗体に結合
させる、または、ビオチン・アビジン系を用いて結合さ
せる、第２の抗体に反応する抗体に結合させることによ
り間接的に標識物質を結合させることもできる。標識化
合物は当然にＨＲＰなどの酵素を用いても良いし、放射
性元素を用いても良いし、またその他当業者に知られる
方法により行うことが出来る。

【００３５】第２の方法としては、直接または間接に標
識化された第１の抗体をハプテンを含む被検液中に加え
て第１の抗体とハプテンの免疫複合体を形成させた後、
過剰量のハプテン修飾体と当該複合体を含む被検液を固
相化した第２の抗体に接触させる。次いで、直接または
間接に標識化された第１の抗体を検出することによりハ
プテンの定量を行う。標識物質は前述と同様であり、標
識は、例えば予め標識しておいた（酵素あるいは放射性
元素）標識化抗体を用いることもできるし、ビオチン化
した第１抗体を用いることもできる。ビオチン化した第
１抗体を用いた場合は標識化アビジン、または標識化ス
トレプトアビジンを用いればよい。また、第１抗体はハ
プテンと反応させる段階では標識されてないものを用
い、第２抗体-ハプテンを介して固相化された時点で第
１の抗体に反応する物質（例えば抗「第１抗体」抗体）
を標識化しておいたものを反応させて検出を行っても良
い。

【００３６】この方法によりハプテンを測定することに
より競合法よりも高感度に、かつ安定に測定することが
可能となった。

【００３７】また、凝集法については上述の標識化した
ものを検出する代わりに不溶性担体粒子の凝集度を検出
することにより目的を達せられる。凝集法においては、
第１の抗体がＦc部分を欠落したものであることが好ま
しい。

【００３８】本発明において、ハプテンとしてはどのよ
うなものでも可能であり、例えば生理機能を有すると考
えられているビオプテリンなどが挙げられる。本発明の
ハプテンは、必ずしも１つのエピトープのみを有するも
のに限定されない。複数のエピトープを有するものであ
っても適用できるが、エピトープが１つのみのハプテン
が好ましい。

【００３９】

【実施例】以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行
うが、これにより限定されるものではない。

【００４０】実施例１ 第１の抗体の作製 ＢＳＡ(シグマ社製)50mgを6.25mlのリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）に溶解し、50％グルタルアルデヒド（Ｇ
Ａ）溶液25μlを加えて４℃で４時間撹拌して反応させ
た。これをセファデックスＧ−25(ファルマシア社製)カ
ラム（10×100mm）にかけてグルタルアルデヒド結合Ｂ
ＳＡ10mgを得た。これをビオプテリン（ＢＰ）(アルド
リッチ社製)2.0mgと混合して４℃で一晩反応させた。反
応終了後、１Ｍグリシン，0.1Ｍトリスを含む水溶液を1
50μl添加して更に一晩放置後、ＰＢＳで十分に透析し
てＢＳＡ−ＧＡ−ＢＰを得た。

【００４１】これを200μｇ／mlのＰＢＳ溶液として完
全フロインドアジュバントと等量混合しエマルジョンに
してＢＡＬＢ／ｃ系マウス（雌、８週令）に腹腔投与
し、再度３週間後に同一免疫原と不完全フロインドアジ
ュバントを用いて同様に腹腔投与により免疫感作を行っ
た。この投与の２週間後に採血して酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）により抗体価を測定して陽性であることを確
認した後、ＰＢＳに溶解したＢＳＡ−ＧＡ−ＢＰ試料30
0μｇを静脈注射した。３日後、該マウスより脾臓を無
菌的に摘出し、細胞融合を行った。

【００４２】（ＥＬＩＳＡ法）ＢＳＡの代わりにＫＬＨ
(ピアス社製)を用いて同様にして調製したＫＬＨ−ＧＡ
−ＢＰを96穴マイクロタイタープレートに５μｇ／mlの
濃度のＰＢＳ溶液として50μlづつ添加した。４℃で一
晩静置した。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ・ＰＢを150
μlづつ添加して37℃で１時間ブロッキングを行った。
その後当該液を除去して、採血したマウスの抗血清を１
％ＢＳＡ・ＰＢＳにより1000倍から段階希釈して（細胞
融合の結果得られたハイブリドーマの培養上清の抗体価
を測定する場合は、培養上清を原液または適当倍率に希
釈して）50μlづつ添加して37℃で１時間反応させた。
この際、当該液中にＢＰを10μｇ／mlの濃度で加えたも
のも並行して行う。反応終了後ＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰ
標識化ウサギ抗マウスＩｇ(カッペル社製)を１％ＢＳＡ
・ＰＢＳにより希釈して添加し、室温で１時間反応させ
た。その後、溶液を除去し、ＰＢＳで充分に洗浄した
後、基質として濃度1.5mg／mlのo-フェニレンジアミン
を溶解したクエン酸・リン酸緩衝液(pＨ5.0)(0.02％H₂O
₂を含む)を各ウェルに100μlづつ添加し発色させた。９
Ｎ硫酸50μlを各ウェルに加えて発色反応を停止し、波
長492nmの吸光度をマイクロプレトリーダーＭＰＲＡ４
(東ソー社製)を用いて測定した。

【００４３】（細胞融合）免疫されたマウスから脾臓を
無菌的に摘出し、ステンレスメッシュにより単細胞にほ
ぐし、脾細胞の1/5量のマウスミエローマ細胞株Ｐ３×6
3−Ag８−653細胞とＲＰＭＩ1640培地(日水製薬製)を混
合し遠心分離後、細胞のペレットに50％ポリエチレング
リコール1500(べーリンガー社製)を加え、融合操作を行
った。その後徐々にＰＲＭＩ1640液で希釈し遠心分離に
より上清を除去した融合細胞を、20％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を加えたＨＡＴ培地（0.01mMヒポキサンチン、1.6
μＭチミジン、0.04μＭアミノプテリンを含むＲＰＭＩ
1640培地）に懸濁し、96穴マイクロプレートに１ウェル
あたり１×10⁵個の細胞をまき込み５％CO₂下37℃で培養
した。

【００４４】２週間後、コロニー生育ウェル培養上清を
用いてＥＬＩＳＡ法によりBPに反応するウェルをスクリ
ーニングした。スクリーニングした抗体産生コロニーの
うちの一つを限界希釈法によりクローニングを３回行い
安定した抗体産生クローンＭＢ386を得た。

【００４５】（モノクローナル抗体の精製）クローン化
したハイブリドーマＭＢ386について10％ＦＣＳを加え
たＲＰＭＩ1640培地で培養し、遠心分離（200ｇ，５分
間）してＲＰＭＩ1640培地で洗浄して再度遠心分離した
後ＲＰＭＩ1640で１×10⁷個／mlの濃度に懸濁した。こ
れを７日前にあらかじめプリスタン（2,6,10,14-テトラ
メチルペンタデカン）を注射しておいたＢＡＬＢ／ｃ系
マウスの腹腔に0.5mlづつ接種した。約２週間後、腹部
の膨張したマウスから腹水を採取し、遠心分離（200
ｇ，５分間）により細胞を除去した後、これを硫酸アン
モニアムを加えて50％飽和溶液とし、沈澱を分離してＰ
ＢＳに溶解した。

【００４６】これを３Ｍ塩化カリウムを含む1.5Ｍグリ
シン緩衝液(pＨ8.0)で十分に透析し、プロテインＡカラ
ム（20mm×５mm）(ファルマシア社製)にアプライして十
分に吸着させた後３Ｍチオシアン酸カリウムを含むグリ
シン緩衝液で溶出した。

【００４７】（モノクローナル抗体の特徴づけ）モノク
ローナル抗体の抗体クラスとサブクラスは、マウスモノ
クローナル・サブ-アイソタイピングキット(AMERICAN Q
UALEX社製)を使用して決定した。その結果、得られたモ
ノクローナル抗体ＭＢ386はIgG１と決定された。

【００４８】また、同様の方法によりＢＰに反応するモ
ノクローナル抗体ＭＢ703を得た。

【００４９】第２の抗体の作製 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（雌、８週齢）をジエチルエーテ
ルを用いて麻酔をかけた後左上腹部を剃毛した後、表皮
を約15mm切開した。内皮を透して脾臓部分に前述の第１
のモノクローナル抗体ＭＢ386を２mgとＢＰ１mgをＰＢ
Ｓ１mlに溶解し、200μlを接種した後、縫合した。４〜
５日後、該マウスより脾臓を摘出し前述と同様に細胞融
合を行った。

【００５０】２週間後、コロニー生育ウェル培養上清を
用いてELISA法によりBPに反応するウェルをスクリーニ
ングした。即ち、96穴マイクロタイタープレート(ヌン
ク社製)の各ウェルに、ＰＢＳに希釈した抗マウス・イ
ムノグロブリン（Ａ＋Ｍ＋Ｇ）(ザイメット社製)を５μ
ｇ／mlの濃度で50μlづつ分注し、４℃で一晩吸着し
た。該液を除去した後１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含むＰＢＳ（以下１％ＢＳＡ・ＰＢＳ）を100μlづつ
添加し37℃で１時間ブロッキングを行った。ＢＳＡ溶液
を除去した後、抗体を含む液（即ち、培養上清）50μl
を加え、37℃で１時間インキュベートした。

【００５１】別に、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下
ＨＲＰ）(ベーリンガー・マンハイム社製：グレード，
ＲＺ＝3.0、250IU／ml)５mgを蒸留水0.5mlに溶解し、メ
タ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO₄：和光純薬工業製)を蒸
留水0.5mlに溶解し、これらを混合して室温で反応させ
た。20分後、エチレングリコール(和光純薬工業製)を10
μl加えて反応を停止させた。あらかじめ２mMクエン酸
緩衝液(pＨ3.5)で平衡化しておいたSephadexＧ−25(フ
ァルマシア社製：φ１×５cm)に当該反応液を通して脱
塩し、濃度6.5mg／mlのＨＲＰ溶液0.5mlを得た。これを
前記モノクローナル抗体ＭＢ386(４mg／ml)のリン酸緩
衝生理食塩水(以下ＰＢＳ)(pＨ7.4)の溶液1.0mlと透析
チューブ中にて混合し、100mM炭酸緩衝液(pＨ9.5)で透
析しながら室温で4.5時間反応した。反応終了後、反応
液に１Ｍグリシン溶液100μlを添加し、次いで１mgのシ
アノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH₃CN：シグマ社製)を
添加して、４℃で15時間反応し、ＰＢＳで透析してＨＲ
Ｐ標識化したモノクローナル抗体ＭＢ386−ＨＲＰを得
た。

【００５２】ＭＢ386−ＨＲＰと抗原（ハプテン）とし
てのＢＰの最終濃度がそれぞれ１μｇ／ml及び50μｇ／
mlとなるように添加して37℃で１時間反応させた溶液、
又はＭＢ386−ＨＲＰを１％ＢＳＡ・ＰＢＳで希釈して
１μlとした溶液を、それぞれ50μlづつ添加したものを
37℃で２時間反応した。反応終了後ＰＢＳで洗浄し、Ｈ
ＲＰ標識化ウサギ抗マウスＩｇ(カッペル社製)を１％Ｂ
ＳＡ・ＰＢＳにより希釈して添加し、室温で１時間反応
させた。その後、溶液を除去し、ＰＢＳで充分に洗浄し
た後、基質として濃度1.5mg／mlのo-フェニレンジアミ
ンを溶解したクエン酸・リン酸緩衝液(pＨ5.0)(0.02％H
₂O₂を含む)を各ウェルに100μlづつ添加し発色させた。
９Ｎ硫酸50μlを各ウェルに加えて発色反応を停止し、
波長492nmの吸光度をマイクロプレトリーダーＭＰＲＡ
４(東ソー社製)を用いて測定した。

【００５３】この結果、ハプテンを含む溶液にて発色し
てハプテンを含まない溶液において発色しないウェルを
選択し、特に前者のシグナルが強く後者のシグナルが全
くないウェルを選択して３回クローニングを繰り返して
安定な抗体産生株ＭＥ216を得た。

【００５４】（モノクローナル抗体の精製）クローンＭ
Ｅ216について10％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ1640培地で
培養し、遠心分離（200ｇ，５分間）してＲＰＭＩ1640
培地で洗浄して再度遠心分離した後ＲＰＭＩ1640で１×
10⁷個／mlの濃度に懸濁した。これを７日前にあらかじ
めプリスタン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）
を注射しておいたＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔に0.5ml
づつ接種した。約２週間後、腹部の膨張したマウスから
腹水を採取し、遠心分離（200ｇ，５分間）により細胞
を除去した後、これを硫酸アンモニアムを加えて50％飽
和溶液とし、沈澱を分離してＰＢＳに溶解した。

【００５５】これを３Ｍ塩化カリウムを含む1.5Ｍグリ
シン緩衝液(pＨ8.0)で十分に透析し、プロテインＡカラ
ム（20mm×５mm）(ファルマシア社製)にアプライして十
分に吸着させた後３Ｍクエン酸緩衝液で溶出した。

【００５６】（モノクローナル抗体の特徴づけ）モノク
ローナル抗体の抗体クラスとサブクラスは、マウスモノ
クローナル・サブ-アイソタイピングキット(AMERICAN Q
UALEX社製)を使用して決定した。その結果、得られたモ
ノクローナル抗体ＭＥ216はIgG１と決定された。

【００５７】実施例２ モノクローナル抗体ＭＢ386を濃度５μｇ／mlにＰＢＳ
で希釈して、96穴マイクロタイタープレート(ヌンク社
製)に100μlづつ加えて４℃で一晩吸着させた。これを
ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を200μl
づつ加えて37℃で１時間静置してブロッキングしてから
液を除去した。次に、１％ＢＳＡ・ＰＢＳにＢＰを０，
0.1，0.3，0.9，2.7，8.1μｇ／ml添加したもの、健常
者尿をＰＢＳで２倍に希釈したものをそれぞれ各ウェル
に加えて37℃で１時間反応した。反応終了後ＰＢＳで十
分に洗浄した後、ＭＥ216を実施例１と同様にしてペル
オキシダーゼ標識したＭＥ216−ＨＲＰ（１％ＢＳＡ・
ＰＢＳで2000倍希釈）を50μlづつ各ウェルに加え、室
温で１時間反応させた。次いで溶液を除去し、ＰＢＳで
充分に洗浄した後、基質として濃度1.5mg／mlのo-フェ
ニレンジアミンを溶解したクエン酸・リン酸緩衝液(pＨ
5.0)(0.02％H₂O₂を含む)を各ウェルに100μlづつ添加し
発色させた。９Ｎ硫酸50μlを各ウェルに加えて発色反
応を停止し、波長492nmの吸光度をマイクロプレトリー
ダーＭＰＲＡ４(東ソー社製)を用いて測定した。その結
果を図１に示す。

【００５８】実施例３ ＭＢ386を0.1MNaHCO₃，pＨ8.3で透析し、1.0mg／mlの濃
度に調整した。次にビオチン-スクシンイミドエステル
(ベーリンガーマンハイム社製)をジメチルスルホキシド
に溶解し1.0mg／mlとして、すばやくビオチン／抗体比
＝240μl／mlで混合して室温で４時間放置した。反応終
了後、当該反応液をＰＢＳにて透析し、ビオチン化標識
ＭＢ386（ＭＢ386−ＢＴ）とした。

【００５９】ＭＢ386−ＢＴ（20μｇ／ml）50μlを、１
％ＢＳＡ・ＰＢＳにＢＰを０，0.1，0.3，0.9，2.7，8.
1μｇ／ml添加したもの及び健常者尿をＰＢＳで２倍に
希釈したもの（それぞれ100μl）と混合し、37℃で１時
間反応した。一方、ＭＥ216を濃度５μｇ／mlにＰＢＳ
で希釈して、96穴マイクロタイタープレート(ヌンク社
製)に100μlづつ加えて４℃で一晩吸着させた。これを
ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を200μl
づつ加えて37℃で１時間静置してブロッキングしてから
液を除去した。ここへ、前述のＭＢ386−ＢＴとＢＰを
含む液との反応物を50μlづつ添加して、37℃で１時間
反応させた。反応終了後反応液を除去して、ＨＲＰ標識
化アビジン(ＥＹラボラトリーズ社製)５mg／mlを１％Ｂ
ＳＡ・ＰＢＳで5000倍希釈したものを50μlづつ添加し
て室温で１時間反応した。溶液を除去し、ＰＢＳで充分
に洗浄した後、基質として濃度1.5mg／mlのo-フェニレ
ンジアミンを溶解したクエン酸・リン酸緩衝液(pＨ5.0)
(0.02％H₂O₂を含む)を各ウェルに100μlづつ添加し発色
させた。９Ｎ硫酸50μlを各ウェルに加えて発色反応を
停止し、波長492nmの吸光度をマイクロプレトリーダー
ＭＰＲＡ４(東ソー社製)を用いて測定した。その結果を
図２に示す。

【００６０】比較例１ モノクローナル抗体ＭＢ386を濃度５μｇ／mlにＰＢＳ
で希釈して、96穴マイクロタイタープレート(ヌンク社
製)に100μlづつ加えて４℃で一晩吸着させた。これを
ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を200μl
づつ加えて37℃で１時間静置してブロッキングしてから
液を除去した。次に、１％ＢＳＡ・ＰＢＳにＢＰを０，
0.1，0.3，0.9，2.7，8.1μｇ／ml添加したもの、健常
者尿をＰＢＳで２倍に希釈したものをそれぞれＨＲＰ標
識したＢＰと同時に各ウェルに加えて室温で１時間反応
した。溶液を除去し、ＰＢＳで充分に洗浄した後、基質
として濃度1.5mg／mlのo-フェニレンジアミンを溶解し
たクエン酸・リン酸緩衝液(pＨ5.0)(0.02％H₂O₂を含む)
を各ウェルに100μlづつ添加し発色させた。９Ｎ硫酸50
μlを各ウェルに加えて発色反応を停止し、波長492nmの
吸光度をマイクロプレトリーダーＭＰＲＡ４(東ソー社
製)を用いて測定した。

【００６１】実施例３の結果（ＢＰ濃度0.54μｇ／ml）
は実施例２により得られた結果（ＢＰ濃度0.53μｇ／m
l）と実質的に一致するが、比較例１では健常尿中のＢ
Ｐ値が異なり、ＢＰ濃度0.62μｇ／mlであった。これは
ＭＥ216がＭＢ386と反応したＢＰに対して特異性を有す
る抗体であるのに対して、ＭＢ386抗体はネオプテリン
に対する交差反応性（約15％）があり、なお約15％の交
差反応性は消去されていないことを示す。しかし、本発
明の請求項７記載の方法を行うことにより、実施例３で
示すように、約15％の交差反応性は完全に消去される。
したがって、本発明の２抗体法を用いた実施例３に示す
測定方法を行うことにより、単一の抗体では特異性が充
分でない場合であっても、第２抗体との併用による改善
が出来るという効果もあることが示された。

【００６２】実施例４ （ハプテン修飾体の作製）ハプテン修飾体は免疫原に用
いたＢＳＡ−ＧＡ−ＢＰ（実施例１）を利用した。

【００６３】第２の抗体の作製 実施例１で得た第１のモノクローナル抗体ＭＢ386を２m
gとＢＰ１mgをＰＢＳ１mlに溶解し、実施例１と同様に
脾臓免疫注射法により免疫感作を行い、次いで実施例１
と同様に細胞融合を行い以下に示す方法によりスクリー
ニングを行った。

【００６４】96穴マイクロタイタープレート(ヌンク社
製)の各ウェルに、ＰＢＳに希釈した抗マウス・イムノ
グロブリン（Ａ＋Ｍ＋Ｇ）(ザイメット社製)を５μｇ／
mlの濃度で50μlづつ分注し、４℃で一晩吸着した。該
液を除去した後１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む
ＰＢＳ（以下１％ＢＳＡ・ＰＢＳ）を100μlづつ添加し
37℃で１時間ブロッキングを行った。ＢＳＡ溶液を除去
した後、抗体を含む液（即ち、培養上清）50μlを加
え、37℃で１時間インキュベートした。実施例１と同様
にＨＲＰ標識化したモノクローナル抗体ＭＢ386（ＭＢ3
86−ＨＲＰ）２μｇ／mlに抗原（ハプテン）としてのＢ
Ｐを最終濃度50μｇ／mlとなるように添加して37℃で１
時間反応させた溶液、ＭＢ386−ＨＲＰ２μｇ／mlに、
ハプテン修飾体としてのＢＳＡ−ＧＡ−ＢＰを最終濃度
100μｇ／mlとなるように添加して37℃で１時間反応さ
せた溶液をそれぞれ50μlづつ添加したものを37℃で２
時間反応した。その後、溶液を除去し、ＰＢＳで充分に
洗浄した後、基質として濃度1.5mg／mlのo-フェニレン
ジアミンを溶解したクエン酸・リン酸緩衝液(pＨ5.0)
(0.02％H₂O₂を含む)を各ウェルに100μlづつ添加し発色
させた。９Ｎ硫酸50μlを各ウェルに加えて発色反応を
停止し、波長492nmの吸光度をマイクロプレトリーダー
ＭＰＲＡ４(東ソー社製)を用いて測定した。

【００６５】この結果、ハプテンを含む溶液にて発色し
てハプテン修飾体を含む液において発色しないウェルを
選択し、特に前者のシグナルが強く後者のシグナルが全
くないウェルを選択して３回クローニングを繰り返して
安定な抗体産生株ＭＣ951を得た。

【００６６】クローン化したハイブリドーマＭＣ951に
ついて10％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ1640培地で培養し、
遠心分離（200ｇ，５分間）してＲＰＭＩ1640培地で洗
浄して再度遠心分離した後ＲＰＭＩ1640で１×10⁷個／m
lの濃度に懸濁した。これを７日前にあらかじめプリス
タン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）を注射し
ておいたＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔に0.5mlづつ接種
した。約２週間後、腹部の膨張したマウスから腹水を採
取し、遠心分離（200ｇ，５分間）により細胞を除去し
た後、これを硫酸アンモニアムを加えて50％飽和溶液と
し、沈澱を分離してＰＢＳに溶解した。

【００６７】これを３Ｍ塩化カリウムを含む1.5Ｍグリ
シン緩衝液(pＨ8.0)で十分に透析し、プロテインＡカラ
ム（20mm×５mm）(ファルマシア社製)にアプライして十
分に吸着させた後３Ｍチオシアン酸カリウムを含むグリ
シン緩衝液で溶出した。

【００６８】（モノクローナル抗体の特徴づけ）モノク
ローナル抗体の抗体クラスとサブクラスは、マウスモノ
クローナル・サブ-アイソタイピングキット(AMERICAN Q
UALEX社製)を使用して決定した。その結果、得られたモ
ノクローナル抗体ＭＣ951はIgG１と決定された。

【００６９】実施例５ モノクローナル抗体ＭＢ386を濃度５μｇ／mlにＰＢＳ
で希釈して、96穴マイクロタイタープレート(ヌンク社
製)に100μlづつ加えて４℃で一晩吸着させた。これを
ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を200μl
づつ加えて37℃で１時間静置してブロッキングしてから
液を除去した。次に、１％ＢＳＡ・ＰＢＳにＢＰを０，
0.1，0.3，0.9，2.7，8.1μｇ／ml添加したもの、健常
者尿をＰＢＳで２倍に希釈したものをそれぞれ各ウェル
に加えて37℃で１時間反応した。反応終了後ＰＢＳで十
分に洗浄した後、ＢＳＡ−ＧＡ−ＢＰ50μｇ／mlを含む
ＭＣ951を実施例１と同様にしてペルオキシダーゼ標識
したＭＣ951−ＨＲＰ（１％ＢＳＡ・ＰＢＳで1500倍希
釈）を50μlづつ各ウェルに加え、室温で１時間反応さ
せた。溶液を除去し、ＰＢＳで充分に洗浄した後、基質
として濃度1.5mg／mlのo-フェニレンジアミンを溶解し
たクエン酸・リン酸緩衝液(pＨ5.0)(0.02％H₂O₂を含む)
を各ウェルに100μlづつ添加し発色させた。９Ｎ硫酸50
μlを各ウェルに加えて発色反応を停止し、波長492nmの
吸光度をマイクロプレトリーダーＭＰＲＡ４(東ソー社
製)を用いて測定した。その結果を図３に示す。

【００７０】実施例６ ＭＢ386を0.1MNaHCO₃，pＨ8.3で透析し、1.0mg／mlの濃
度に調整した。次にビオチン-スクシンイミドエステル
(ベーリンガーマンハイム社製)をジメチルスルホキシド
に溶解し1.0mg／mlとして、すばやくビオチン／抗体比
＝240μl／mlで混合して室温で４時間放置した。反応終
了後、当該反応液をＰＢＳにて透析し、ビオチン化標識
ＭＢ386（ＭＢ386−ＢＴ）とした。

【００７１】ＭＢ386−ＢＴ（20μｇ／ml）50μlを、１
％ＢＳＡ・ＰＢＳにＢＰを０，0.1，0.3，0.9，2.7，8.
1μｇ／ml添加したもの及び健常者尿をＰＢＳで２倍に
希釈したもの（それぞれ100μl）と混合し、37℃で１時
間反応した。一方、ＭＣ951を濃度５μｇ／mlにＰＢＳ
で希釈して、96穴マイクロタイタープレート(ヌンク社
製)に150μlづつ加えて４℃で一晩吸着させた。これを
ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を200μl
づつ加えて37℃で１時間静置してブロッキングしてから
液を除去した。ここへ、200μｇ／mlのＢＳＡ−ＧＡ−
ＢＰを50μlづつ加えて、更に、前述のＭＢ386−ＢＴと
ＢＰを含む液との反応物を50μlづつ添加して、37℃で
１時間反応させた。反応終了後反応液を除去して、ＨＲ
Ｐ標識化アビジン(ＥＹラボラトリーズ社製)５mg／mlを
１％ＢＳＡ・ＰＢＳで5000倍希釈したものを50μlづつ
添加して室温で１時間反応した。反応終了後、溶液を除
去し、ＰＢＳで充分に洗浄した後、基質として濃度1.5m
g／mlのo-フェニレンジアミンを溶解したクエン酸・リ
ン酸緩衝液(pＨ5.0)(0.02％H₂O₂を含む)を各ウェルに10
0μlづつ添加し発色させた。９Ｎ硫酸50μlを各ウェル
に加えて発色反応を停止し、波長492nmの吸光度をマイ
クロプレトリーダーＭＰＲＡ４(東ソー社製)を用いて測
定した。その結果を図４に示す。

【００７２】実施例７ ＭＢ386を酵素免疫測定法第三版（石川栄治ら編：医学
書院）86頁の方法に従い調製したＦ(ab')₂をＰＢＳに溶
解（100μｇ／ml）して500μlとし、0.87μmラテックス
(積水化学工業社製、「試薬用ラテックス品番Ｎ−080」
をＧＢＳ（グリシン緩衝液：0.05Mグリシン、pＨ8.2／
0.15M NaCl0.01％NaN₃）で希釈して0.1％濃度としたラ
テックス懸濁液を３mlと混合して30分間室温で放置して
抗体を吸着させた。更に、該懸濁液中に２％ＢＳＡ・Ｐ
ＢＳ溶液３mlを添加して室温で30分間静置した後、該ラ
テックス粒子を3000rpmで遠心分離してＰＢＳで洗浄し
て、0.2％のＭＢ386固定化粒子懸濁液とした。該懸濁液
200μlと、ＢＰを１％ＢＳＡ・ＰＢＳで希釈してそれぞ
れ濃度0.1μｇ／mlとした溶液200μlを混合して37℃で1
0分間静置した。次にＢＳＡ−ＧＡ−ＢＰ20μｇ／mlの
濃度で含むＭＣ951（20μｇ／ml）の１％ＢＳＡ・ＰＢ
Ｓ溶液を100μl添加して37℃で20分間反応した。次いで
ウサギ抗マウスＩｇ（Fc）抗体(ザイメット社製)を100
μｇ／ml添加して静置した。20分後凝集の度合いを目視
により観察したところ、ＢＰ濃度０μｇ／mlの溶液の方
は凝集が見られないのに対しＢＰ濃度１μｇ／mlの方で
は凝集反応が確認された。

【００７３】実施例８ ＭＣ951を酵素免疫測定法第三版（石川栄治ら編：医学
書院）ｐ86の方法に従い調製したＦ(ab')₂をＰＢＳに溶
解（100μｇ／ml）して500μlとし、0.87μmラテックス
(積水化学工業社製、「試薬用ラテックス品番Ｎ−080」
をＧＢＳ（グリシン緩衝液）で希釈して0.1％濃度とし
たラテックス懸濁液を３mlと混合して30分間室温で放置
して抗体を吸着させた。更に、該懸濁液中に２％ＢＳＡ
・ＰＢＳ溶液３mlを添加して室温で30分間静置した後、
該ラテックス粒子を3000rpmで遠心分離してＰＢＳで洗
浄して、0.2％のＭＢ386固定化粒子懸濁液とした。ＢＰ
を１％ＢＳＡ・ＰＢＳで希釈してそれぞれ濃度0.1μｇ
／mlとした溶液100μlとＭＢ386（20μｇ／ml）の１％
ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を100μl添加して37℃で10分間反応
した。この反応混合液200μlとＢＳＡ−ＧＡ−ＢＰ20μ
ｇ／mlの濃度で含む１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を100μlを
上述のラテックス懸濁液200μlに添加して37℃で20分間
反応した。次いでウサギ抗マウスＩｇ（Fc）抗体(ザイ
メット社製)を100μｇ／ml添加して静置した。20分後凝
集の度合いを目視により観察したところ、ＢＰ濃度０μ
ｇ／mlの溶液の方は凝集が見られないのに対しＢＰ濃度
１μｇ／mlの方では凝集反応が確認された。

【００７４】

【発明の効果】本発明により、低濃度のハプテンを効率
よく定量的に測定できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の請求項２〜５記載の抗体を用い、請求
項６記載の方法によりハプテン抗原を測定した場合の抗
原濃度と吸光度の関係を示す図である。

【図２】本発明の請求項２〜５記載の抗体を用い、請求
項７記載の方法によりハプテン抗原を測定した場合の抗
原濃度と吸光度の関係を示す図である。

【図３】本発明の請求項８〜10記載の抗体を用い、請求
項11記載の方法によりハプテン抗原を測定した場合の抗
原濃度と吸光度の関係を示す図である。

【図４】本発明の請求項８〜10記載の抗体を用い、請求
項12記載の方法によりハプテン抗原を測定した場合の抗
原濃度と吸光度の関係を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/543 ５８１ Ａ 33/577 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ハプテンと該ハプテンに反応する抗体か
   らなる免疫複合体を用いて免疫することを特徴とする抗
   体作製方法。
2. 【請求項２】 ハプテンと該ハプテンに反応する抗体か
   らなる免疫複合体に対して反応し、該ハプテンに反応す
   る抗体には反応しないことを特徴とする抗体。
3. 【請求項３】 前記ハプテンに反応する抗体がモノクロ
   ーナル抗体であることを特徴とする請求項２記載の抗
   体。
4. 【請求項４】 前記免疫複合体に対して反応する抗体が
   モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２記
   載の抗体。
5. 【請求項５】 前記ハプテンに反応する抗体および前記
   免疫複合体に対して反応する抗体がいずれもモノクロー
   ナル抗体であることを特徴とする請求項２記載の抗体。
6. 【請求項６】 前記ハプテンに反応する第１の抗体を固
   相に吸着し、次いで該ハプテンを含む被検液を接触させ
   て該ハプテンを結合させた後、請求項２乃至５のいずれ
   か１項に記載の抗体を反応させ請求項２、３、４又は５
   記載の抗体を検出することを特徴とする免疫学的測定方
   法。
7. 【請求項７】 ハプテンとハプテンに反応する第１の抗
   体からなる免疫複合体の被検液を、請求項２乃至５のい
   ずれか１項に記載された抗体を吸着した固相と接触、反
   応させた後第１の抗体を検出することにより該ハプテン
   を検出することを特徴とする免疫学的測定方法。
8. 【請求項８】 ハプテン及びハプテンの修飾体に反応す
   る第１の抗体と該ハプテンとの免疫複合体には反応する
   が、第１の抗体と該ハプテンの修飾体との免疫複合体に
   は反応しないことを特徴とする抗体。
9. 【請求項９】 請求項８記載の第１の抗体がＦc部分を
   欠落した抗体であることを特徴とする請求項８記載の抗
   体。
10. 【請求項１０】 請求項８又は９記載の第１の抗体がモ
    ノクローナル抗体であることを特徴とする請求項８又は
    ９記載の抗体。
11. 【請求項１１】 ハプテン及びハプテンの修飾体に反応
    する第１の抗体を固相化した後、被検液中の該ハプテン
    とを反応させ、次いで、過剰量の前記ハプテン修飾体お
    よび標識化された請求項８、９又10記載の抗体を反応さ
    せた後、固相化された請求項８、９又10記載の抗体を検
    出することにより該ハプテンを検出することを特徴とす
    る免疫学的測定方法。
12. 【請求項１２】 標識化されたハプテン及びハプテンの
    修飾体に反応する第１の抗体と被検液中の該ハプテンと
    を反応させた後、過剰量の該ハプテン修飾体および固相
    化された請求項８、９又10記載の抗体を反応させた後、
    固相化された前記第１の抗体を検出することにより該ハ
    プテンを検出することを特徴とする免疫学的測定方法。
13. 【請求項１３】 不溶性担体粒子に吸着もしくは結合さ
    せたハプテン及びハプテン修飾体に反応する第１の抗体
    と被検液中の該ハプテンと反応させた後、過剰量の該ハ
    プテン修飾体および請求項８、９又10記載の抗体を反応
    させた後、請求項８、９又10記載の抗体に反応する抗体
    を添加して不溶性担体粒子の凝集を起こし、その凝集度
    合いを測定することにより該ハプテンを検出することを
    特徴とする免疫学的測定方法。
14. 【請求項１４】 ハプテン及びハプテン修飾体に反応す
    る第１の抗体と被検液中の該ハプテンを反応させた後、
    過剰量の該ハプテン修飾体および不溶性担体粒子に吸着
    もしくは結合させた請求項８、９又10記載の抗体を反応
    させ、次いで、該第１の抗体に反応する抗体を添加する
    ことにより不溶性担体粒子の凝集を起こし、その凝集度
    合いを測定することにより該ハプテンを検出することを
    特徴とする免疫学的測定方法。