JP4071330B2 - 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法 - Google Patents
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術】
本発明は、抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及び該抗体を利用してヒトメダラシンを測定する免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セリンプロテアーゼの一種であるメダラシンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じていると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性疾患の憎悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性硬化症の患者では憎悪する数日前に著増し、寛解に先行して正常化することが認められている。多発性硬化症は、中枢神経系の白質に限局性の脱髄巣とグリオーシスの出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら進行し、多くは、１０〜１５年の経過で死亡すると云う慢性炎症性の難病であり、原因については、未だ、はっきりとは解明されていないが、ウィルスや細菌が免疫系を刺激して抗体が自らの神経組織を攻撃する自己免疫疾患の一種ではないかと考えられている。また、その診断法はなかなか難しく、核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）等によって行なわれているのが現状であるが、ＭＲＩ等の方法は非常に大がかりな装置を用い、測定操作も熟練を要し、経費もかかるので、簡便な検査で病気の診断、病勢の把握、予後の推定等が行なえる方法の開発が検討されている。このような方法として、血液中の顆粒球メダラシン活性の測定方法が研究され、アポーオルニチン−トランスアミナーゼに対する不活性化能による方法が開発されている。しかし、顆粒球メダラシン活性の酵素化学的方法による測定は非常に煩雑であるので、簡便な免疫学的測定方法の開発が試みられ、ポリクローナル抗体を用いる免疫測定方法が行なわれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ポリクローナル抗体を用いるヒトメダラシンの免疫測定方法は、抗体の反応性が必ずしも充分ではなく、測定時間が長く、測定操作も若干煩雑であり、迅速、簡便にヒトメダラシンを測定できるモノクローナル抗体を用いる免疫測定方法の開発が望まれていたが、本発明は上記事情に鑑みなされたもので、ヒトメダラシンを特異的に認識するモノクローナル抗体を製造し、これを用いてヒトメダラシンを特異的にかつ迅速、簡便に測定する方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を行なった結果、ヒト顆粒球より分離精製したヒトメダラシンで免疫してから採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合により作製したハイブリドーマを培養するケラー−ミルシュタインの方法により抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を製造し、更に、該抗体を利用することによりヒトメダラシンを特異的にかつ迅速、簡便に測定できることを見い出し、本発明に到達したものである。
【０００５】
従って、本発明の第一は、ヒトメダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体に関するものである。
【０００６】
また、本発明の第二は、ヒトメダラシンで免疫した動物（ヒトを除く。）から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により作製したハイブリドーマを培養し、その培養物よりヒトメダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を採取することを特徴とする抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造方法に関するものである。
【０００７】
更に、本発明の第三は、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体と標識抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体とを用い、試料中のヒトメダラシンと抗原抗体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラシンを不溶性担体上に捕捉した後、該錯体中の標識を定量することを特徴とするヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、健常人血液から分離した顆粒球より抽出したヒトメダラシンで免疫した動物（ヒトを除く。）から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合によって作製したハイブリドーマを培地上で培養するか、又は、動物腹腔内に投与して腹水中で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造される。
【０００９】
本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、いわゆる細胞融合によって製造される。即ち、抗原としてヒトメダラシンを用いて免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、これを骨髄腫細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを選択的に増殖させ、該ハイブリドーマから抗体産生ハイブリドーマを検索し、クローニングにより目的とするモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
【００１０】
抗体産生細胞としては、例えばヒトメダラシン又はこれを含有する組成物もしくは細胞を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内或いは腹腔内に約１μｇ〜１ｍｇ／回を１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。
【００１１】
骨髄腫細胞としては、マウス、ラット由来のもの等が使用できる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
【００１２】
細胞融合の方法は任意であるが、例えばダルコッペ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在で混合することにより行なうことができる。
【００１３】
細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択する。次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。
【００１４】
斯くして得られた抗体産生ハイブリドーマを利用して本発明のモノクローナル抗体を製造するには、該ハイブリドーマを適当な培地中又は生体内で培養し、該培養物からモノクローナル抗体を採取することによって行なわれる。就中、モノクローナル抗体を大量に製造するには、該ハイブリドーマを骨髄腫細胞の由来細胞と同種の動物の腹腔内に投与し、その腹水中に本発明のモノクローナル抗体を蓄積させ、該腹水から採取する方法が好ましい。抗体産生ハイブリドーマの腹腔内投与に先だって動物にプリスタン等の鉱物油を投与するのが好ましい。
【００１５】
培養物または腹水からの本発明のモノクローナル抗体の分離は、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体もしくはプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００１６】
斯くして得られた本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドーマの種類により３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２の４種類存在する。これらのモノクローナル抗体は、いずれもグロブリンクラスはＩｇＧで、サブクラスはＩｇＧ1 であり、いずれの抗体も抗原であるヒトメダラシンと特異的に反応する。
【００１７】
従って、本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を利用することによりヒトメダラシンを免疫学的に測定することができる。本発明のモノクローナル抗体を利用してヒトメダラシンを測定する方法は任意であるが、不溶性担体に固定化した該モノクローナル抗体に標識化抗原の存在で試料中の抗原を反応させる競合法、又は不溶性担体に固定化した該モノクローナル抗体に試料中の抗原を反応させて捕捉した後標識化した該モノクローナル抗体を反応させて抗体−抗原−抗体からなるサンドイッチ錯体を形成させるサンドイッチ法等が好適に用いられる。このサンドイッチ法による酵素免疫測定方法においては、サンドイッチ錯体を形成させるためには不溶性担体に固定化した固定化抗体と標識化抗体とは抗原に対する反応部位が異なることが必要であり、従って、一般的にはエピトープの異なるモノクローナル抗体の組み合わせを用いて測定系を構成するが、本発明のモノクローナル抗体２Ｅ０４においては同一のモノクローナル抗体を固定化抗体及び標識抗体に用いてもヒトメダラシンの免疫学的測定系を構成することが可能であった。これはヒトメダラシンが分子内に同一アミノ酸配列を有するエピトープを有するためである。これらの測定方法に使用される不溶性担体としては、ポリスチレン等のプラスチック製ビーズ、又はマイクロプレート等が挙げられる。標識化抗体の標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが有利である。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質としては、フルオレッセインイソシアネート、フィコビリプロテイン等、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等、放射性物質としては 125Ｉ、 131Ｉ、 111Ｉｎ、 99mＴｃ等を非限定的に挙げることができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、及び発光剤等が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素等を用い、発色剤として２，２’−アジノジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等、蛍光剤としては４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等、発光剤としてはルミノール類等、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合には、基質として４−ニトロフェニルホスフェート、４−メチルウムベリフェリルホスフェート、コルチゾール−２１−ホスフェート等、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４（３''−β−Ｄ−ガラクトシルオキシフェニル）−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）等を用いることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、参考例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例等に限定されるものではない。
尚、実施例中の％は重量％を意味する。
【００１９】
［参考例１］
健常人血液４００ｍｌに、デキストラン（分子量２００，０００〜３００．０００）の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン水溶液＝２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき混ぜてから、４〜８℃の温度で約１時間静置した後、沈殿した赤血球を上清と分離し、この上清を１５，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、この白血球に１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、１ｍＭｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）を含むｐＨ7.0 の１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＫＢ）からなる抽出用液を加えて、攪拌下に３７℃の温度で２０分間インキュベートした後、１５秒間超音波破砕機にかけて完全に細胞を破砕し、更に、３７℃の温度で２０分間インキュベートしてから、４℃の温度において１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を採取し、この上清を蒸留水に対して透析し、沈渣は上記と同様の操作を数回繰り返して抽出を行なった。次いで、この抽出液を５０ｍＭＰＫＢ（ｐＨ6.0 ）で平衡化したＣＭ−セファロースゲルカラムに通した後、同じ緩衝液で洗浄してから、１ＭＰＫＢ（ｐＨ6.0 ）で吸着物を溶出し、溶出液を蒸留水に対して一晩透析して脱塩してから、コロジオン膜で濃縮することにより、精製ヒトメダラシン１．５ｍｇが得られた。
【００２０】
［実施例１］
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造
（１）抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合によるハイブリドーマの作製
参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に５０μｇ／匹の量で投与した。そして、４週間後にこのマウスに初回と同様の方法で追加免疫を行ない、７日後に血中に抗体量が増大したことを確認した後、更に、その７日後に最終免疫として抗原を腹腔に５０μｇ／匹の量で投与した。一方、２０％の牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ中で、マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を継代培養しておき、最終免疫の３日後、このマウスから脾臓細胞を採取して、これをポリエチレングリコール４０００を用いてＰ３Ｕ１と細胞融合させた。細胞融合後、培地を１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジンを添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）に置換して９６穴マイクロプレートに撒き、２〜３週間選択培養することにより脾臓細胞とミエローマ細胞との融合体であるハイブリドーマが得られた。
【００２１】
（２）抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマのスクリーニング
次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）でスクリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ用のマイクロプレートに吸着させ、ｐＨ7.4 の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行なった後、ハイブリドーマ培養液５０μｌをこのマイクロプレートに添加して１時間放置してから、ハイブリドーマ培養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ標識山羊抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体の２μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液１００μｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。次いで、この酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した後、０．０５％ＡＢＴＳ及び０．００３４％過酸化水素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を２００μｌ添加して発色させることにより抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマを選別した。
【００２２】
（３）抗体産生株のクローニング及びモノクローナル抗体の作製
この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。このハイブリドーマを、夫々、プリスタン投与ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に５０％飽和硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰＢＳに溶解させ、３Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ7.8 ）に対して透析してから、プロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）にかけた後、吸着した抗体を０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）で溶出し中和して精製することにより３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２からなる４種類のモノクローナル抗体を得た。
【００２３】
（４）モノクローナル抗体の性質
［ウェスタンブロッティング法］
モノクローナル抗体に特異的な抗原をウェスタンブロッティング（Westernblotting ）法を用いて固定した。
先ず、ヒト顆粒球由来メダラシンをLaemmli の方法によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、電解液バッファーに２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１９２ｍＭグリシン及び２０％メタノールを含む溶液を用い、電圧傾斜が７Ｖ／ｃｍ、２時間の条件でスラブゲルから蛋白をニトロセルロースシートへ移した。次に、ニトロセルロースシートの各レーンを切り離し、一方のシートをアミドブラックで蛋白染色し、他方は次の様な酵素免疫アッセイを行なった。即ち、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング処理した後、１次抗体としてマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を加え、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識山羊抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体を加えて反応させ、洗浄してから、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（０．７×１０3 Ｍ）／ニトロブルーテトラゾリウム塩（０．７×１０3 Ｍ）を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ9.5 ）からなる基質溶液を加えて発色させることにより、４種のマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、ヒト顆粒球由来メダラシンを認識することが確認された。
【００２４】
［インヒビション・アッセイ法］
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対して、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼを反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法により、いずれの２つの組み合わせにおいてもビオチン化抗体の反応量に変化がないことより、４種のモノクローナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部位）を認識することが確認された。
【００２５】
［実施例２］
ヒトメダラシンの免疫学的測定方法Ｉ
（１）モノクローナル抗体固定化ビーズの調製
ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してから、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）１０μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ水溶液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られた。
【００２６】
（２）ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体の調製
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）１．０ｍｇ／ｍｌを含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメチルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温度で３０分間反応させる。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００２７】
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０分間反応させる。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ4.5 ）でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に濃縮する。次に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ4.5 ）１ｍｌを添加して、２５℃の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分が得られた。
【００２８】
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（SEPRACOR社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体が得られた。
【００２９】
（３）ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免疫測定方法
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン（標準物質）０，１，１０，１００，２００ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液５０μｌとＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、０．０５％ＡＢＴＳ及び０．００３４％過酸化水素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を４００μｌずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３０分間インキュベートした後、反応停止剤として０．１Ｎシュウ酸水溶液を１ｍｌずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４２０ｎｍの波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対してプロットすることにより、同一のモノクローナル抗体を固定化抗体及び酵素標識抗体として用い、図１に示されるような濃度依存性の良い検量線が得られた。
【００３０】
［実施例３］
ヒトメダラシンの免疫学的測定方法II
（１）モノクローナル抗体固定化ビーズの調製
ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してから、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（３Ｆ０３）１０μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ水溶液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られた。
【００３１】
（２）ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免疫測定方法
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（３Ｆ０３）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン（標準物質）０，１，１０，１００，２００ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液５０μｌとＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、０．０５％ＡＢＴＳ、及び０．００３４％過酸化水素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を４００μｌずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３０分間インキュベートした後、反応停止剤として０．１Ｎシュウ酸水溶液を１ｍｌずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４２０ｎｍの波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２に示されるような濃度依存性の良い検量線が得られた。
【００３２】
［実施例４］
酵素免疫測定方法による臨床検体中のメダラシンの測定
健常人及び多発性硬化症患者血液を採取して凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その１０μｌを採取しＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）２ｍｌ中に加えて均一に混合して検体溶液とした後、その１０μｌを試験管に添加し、これに２．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）４０μを加えて希釈し、次いで、この試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）もしくは（３Ｆ０３）を固定化したビーズ各１個とＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行なった後、分光光度計を用いて４２０ｎｍの波長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求めた。その結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度は、測定法Ｉ及びＩＩにより健常人が夫々１０．０μｇ／ｍｌ及び９．６μｇ／ｍｌであり、多発性硬化患者が夫々３７．３μｇ／ｍｌ及び３５．８μｇ／ｍｌであった。
【００３３】
【発明の効果】
顆粒球に存在するセリンプロテアーゼの一種であるメダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を製造することにより、ヒトメダラシンの免疫学的測定を迅速、簡便に行なうことが可能となり、更に、慢性炎症性疾患、特に多発性硬化症の血液診断等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２記載の酵素免疫測定方法（測定法Ｉ）を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシン測定用の検量線である。
【図２】実施例３記載の酵素免疫測定方法（測定法II）を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシン測定用の検量線である。
【発明の属する技術】
本発明は、抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及び該抗体を利用してヒトメダラシンを測定する免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セリンプロテアーゼの一種であるメダラシンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じていると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性疾患の憎悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性硬化症の患者では憎悪する数日前に著増し、寛解に先行して正常化することが認められている。多発性硬化症は、中枢神経系の白質に限局性の脱髄巣とグリオーシスの出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら進行し、多くは、１０〜１５年の経過で死亡すると云う慢性炎症性の難病であり、原因については、未だ、はっきりとは解明されていないが、ウィルスや細菌が免疫系を刺激して抗体が自らの神経組織を攻撃する自己免疫疾患の一種ではないかと考えられている。また、その診断法はなかなか難しく、核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）等によって行なわれているのが現状であるが、ＭＲＩ等の方法は非常に大がかりな装置を用い、測定操作も熟練を要し、経費もかかるので、簡便な検査で病気の診断、病勢の把握、予後の推定等が行なえる方法の開発が検討されている。このような方法として、血液中の顆粒球メダラシン活性の測定方法が研究され、アポーオルニチン−トランスアミナーゼに対する不活性化能による方法が開発されている。しかし、顆粒球メダラシン活性の酵素化学的方法による測定は非常に煩雑であるので、簡便な免疫学的測定方法の開発が試みられ、ポリクローナル抗体を用いる免疫測定方法が行なわれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ポリクローナル抗体を用いるヒトメダラシンの免疫測定方法は、抗体の反応性が必ずしも充分ではなく、測定時間が長く、測定操作も若干煩雑であり、迅速、簡便にヒトメダラシンを測定できるモノクローナル抗体を用いる免疫測定方法の開発が望まれていたが、本発明は上記事情に鑑みなされたもので、ヒトメダラシンを特異的に認識するモノクローナル抗体を製造し、これを用いてヒトメダラシンを特異的にかつ迅速、簡便に測定する方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を行なった結果、ヒト顆粒球より分離精製したヒトメダラシンで免疫してから採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合により作製したハイブリドーマを培養するケラー−ミルシュタインの方法により抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を製造し、更に、該抗体を利用することによりヒトメダラシンを特異的にかつ迅速、簡便に測定できることを見い出し、本発明に到達したものである。
【０００５】
従って、本発明の第一は、ヒトメダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体に関するものである。
【０００６】
また、本発明の第二は、ヒトメダラシンで免疫した動物（ヒトを除く。）から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により作製したハイブリドーマを培養し、その培養物よりヒトメダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を採取することを特徴とする抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造方法に関するものである。
【０００７】
更に、本発明の第三は、不溶性担体に固定化した抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体と標識抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体とを用い、試料中のヒトメダラシンと抗原抗体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラシンを不溶性担体上に捕捉した後、該錯体中の標識を定量することを特徴とするヒトメダラシンの免疫学的測定方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、健常人血液から分離した顆粒球より抽出したヒトメダラシンで免疫した動物（ヒトを除く。）から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合によって作製したハイブリドーマを培地上で培養するか、又は、動物腹腔内に投与して腹水中で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造される。
【０００９】
本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、いわゆる細胞融合によって製造される。即ち、抗原としてヒトメダラシンを用いて免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、これを骨髄腫細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを選択的に増殖させ、該ハイブリドーマから抗体産生ハイブリドーマを検索し、クローニングにより目的とするモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
【００１０】
抗体産生細胞としては、例えばヒトメダラシン又はこれを含有する組成物もしくは細胞を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内或いは腹腔内に約１μｇ〜１ｍｇ／回を１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。
【００１１】
骨髄腫細胞としては、マウス、ラット由来のもの等が使用できる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
【００１２】
細胞融合の方法は任意であるが、例えばダルコッペ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在で混合することにより行なうことができる。
【００１３】
細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択する。次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。
【００１４】
斯くして得られた抗体産生ハイブリドーマを利用して本発明のモノクローナル抗体を製造するには、該ハイブリドーマを適当な培地中又は生体内で培養し、該培養物からモノクローナル抗体を採取することによって行なわれる。就中、モノクローナル抗体を大量に製造するには、該ハイブリドーマを骨髄腫細胞の由来細胞と同種の動物の腹腔内に投与し、その腹水中に本発明のモノクローナル抗体を蓄積させ、該腹水から採取する方法が好ましい。抗体産生ハイブリドーマの腹腔内投与に先だって動物にプリスタン等の鉱物油を投与するのが好ましい。
【００１５】
培養物または腹水からの本発明のモノクローナル抗体の分離は、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体もしくはプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００１６】
斯くして得られた本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドーマの種類により３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２の４種類存在する。これらのモノクローナル抗体は、いずれもグロブリンクラスはＩｇＧで、サブクラスはＩｇＧ1 であり、いずれの抗体も抗原であるヒトメダラシンと特異的に反応する。
【００１７】
従って、本発明の抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を利用することによりヒトメダラシンを免疫学的に測定することができる。本発明のモノクローナル抗体を利用してヒトメダラシンを測定する方法は任意であるが、不溶性担体に固定化した該モノクローナル抗体に標識化抗原の存在で試料中の抗原を反応させる競合法、又は不溶性担体に固定化した該モノクローナル抗体に試料中の抗原を反応させて捕捉した後標識化した該モノクローナル抗体を反応させて抗体−抗原−抗体からなるサンドイッチ錯体を形成させるサンドイッチ法等が好適に用いられる。このサンドイッチ法による酵素免疫測定方法においては、サンドイッチ錯体を形成させるためには不溶性担体に固定化した固定化抗体と標識化抗体とは抗原に対する反応部位が異なることが必要であり、従って、一般的にはエピトープの異なるモノクローナル抗体の組み合わせを用いて測定系を構成するが、本発明のモノクローナル抗体２Ｅ０４においては同一のモノクローナル抗体を固定化抗体及び標識抗体に用いてもヒトメダラシンの免疫学的測定系を構成することが可能であった。これはヒトメダラシンが分子内に同一アミノ酸配列を有するエピトープを有するためである。これらの測定方法に使用される不溶性担体としては、ポリスチレン等のプラスチック製ビーズ、又はマイクロプレート等が挙げられる。標識化抗体の標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが有利である。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質としては、フルオレッセインイソシアネート、フィコビリプロテイン等、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等、放射性物質としては 125Ｉ、 131Ｉ、 111Ｉｎ、 99mＴｃ等を非限定的に挙げることができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、及び発光剤等が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素等を用い、発色剤として２，２’−アジノジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等、蛍光剤としては４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等、発光剤としてはルミノール類等、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合には、基質として４−ニトロフェニルホスフェート、４−メチルウムベリフェリルホスフェート、コルチゾール−２１−ホスフェート等、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４（３''−β−Ｄ−ガラクトシルオキシフェニル）−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）等を用いることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、参考例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例等に限定されるものではない。
尚、実施例中の％は重量％を意味する。
【００１９】
［参考例１］
健常人血液４００ｍｌに、デキストラン（分子量２００，０００〜３００．０００）の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン水溶液＝２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき混ぜてから、４〜８℃の温度で約１時間静置した後、沈殿した赤血球を上清と分離し、この上清を１５，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、この白血球に１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、１ｍＭｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）を含むｐＨ7.0 の１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＫＢ）からなる抽出用液を加えて、攪拌下に３７℃の温度で２０分間インキュベートした後、１５秒間超音波破砕機にかけて完全に細胞を破砕し、更に、３７℃の温度で２０分間インキュベートしてから、４℃の温度において１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を採取し、この上清を蒸留水に対して透析し、沈渣は上記と同様の操作を数回繰り返して抽出を行なった。次いで、この抽出液を５０ｍＭＰＫＢ（ｐＨ6.0 ）で平衡化したＣＭ−セファロースゲルカラムに通した後、同じ緩衝液で洗浄してから、１ＭＰＫＢ（ｐＨ6.0 ）で吸着物を溶出し、溶出液を蒸留水に対して一晩透析して脱塩してから、コロジオン膜で濃縮することにより、精製ヒトメダラシン１．５ｍｇが得られた。
【００２０】
［実施例１］
抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の製造
（１）抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合によるハイブリドーマの作製
参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に５０μｇ／匹の量で投与した。そして、４週間後にこのマウスに初回と同様の方法で追加免疫を行ない、７日後に血中に抗体量が増大したことを確認した後、更に、その７日後に最終免疫として抗原を腹腔に５０μｇ／匹の量で投与した。一方、２０％の牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ中で、マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を継代培養しておき、最終免疫の３日後、このマウスから脾臓細胞を採取して、これをポリエチレングリコール４０００を用いてＰ３Ｕ１と細胞融合させた。細胞融合後、培地を１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジンを添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）に置換して９６穴マイクロプレートに撒き、２〜３週間選択培養することにより脾臓細胞とミエローマ細胞との融合体であるハイブリドーマが得られた。
【００２１】
（２）抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマのスクリーニング
次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）でスクリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ用のマイクロプレートに吸着させ、ｐＨ7.4 の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行なった後、ハイブリドーマ培養液５０μｌをこのマイクロプレートに添加して１時間放置してから、ハイブリドーマ培養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ標識山羊抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体の２μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液１００μｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。次いで、この酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した後、０．０５％ＡＢＴＳ及び０．００３４％過酸化水素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を２００μｌ添加して発色させることにより抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマを選別した。
【００２２】
（３）抗体産生株のクローニング及びモノクローナル抗体の作製
この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。このハイブリドーマを、夫々、プリスタン投与ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に５０％飽和硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰＢＳに溶解させ、３Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ7.8 ）に対して透析してから、プロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）にかけた後、吸着した抗体を０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）で溶出し中和して精製することにより３Ｆ０３、３Ｇ０３、２Ｅ０４、及び１Ｇ１２からなる４種類のモノクローナル抗体を得た。
【００２３】
（４）モノクローナル抗体の性質
［ウェスタンブロッティング法］
モノクローナル抗体に特異的な抗原をウェスタンブロッティング（Westernblotting ）法を用いて固定した。
先ず、ヒト顆粒球由来メダラシンをLaemmli の方法によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、電解液バッファーに２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１９２ｍＭグリシン及び２０％メタノールを含む溶液を用い、電圧傾斜が７Ｖ／ｃｍ、２時間の条件でスラブゲルから蛋白をニトロセルロースシートへ移した。次に、ニトロセルロースシートの各レーンを切り離し、一方のシートをアミドブラックで蛋白染色し、他方は次の様な酵素免疫アッセイを行なった。即ち、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング処理した後、１次抗体としてマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を加え、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識山羊抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ特異抗体を加えて反応させ、洗浄してから、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（０．７×１０3 Ｍ）／ニトロブルーテトラゾリウム塩（０．７×１０3 Ｍ）を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ9.5 ）からなる基質溶液を加えて発色させることにより、４種のマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体は、ヒト顆粒球由来メダラシンを認識することが確認された。
【００２４】
［インヒビション・アッセイ法］
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対して、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼを反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法により、いずれの２つの組み合わせにおいてもビオチン化抗体の反応量に変化がないことより、４種のモノクローナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部位）を認識することが確認された。
【００２５】
［実施例２］
ヒトメダラシンの免疫学的測定方法Ｉ
（１）モノクローナル抗体固定化ビーズの調製
ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してから、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）１０μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ水溶液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られた。
【００２６】
（２）ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体の調製
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）１．０ｍｇ／ｍｌを含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメチルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温度で３０分間反応させる。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００２７】
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０分間反応させる。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ4.5 ）でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に濃縮する。次に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ4.5 ）１ｍｌを添加して、２５℃の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分が得られた。
【００２８】
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（SEPRACOR社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体が得られた。
【００２９】
（３）ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免疫測定方法
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン（標準物質）０，１，１０，１００，２００ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液５０μｌとＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、０．０５％ＡＢＴＳ及び０．００３４％過酸化水素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を４００μｌずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３０分間インキュベートした後、反応停止剤として０．１Ｎシュウ酸水溶液を１ｍｌずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４２０ｎｍの波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対してプロットすることにより、同一のモノクローナル抗体を固定化抗体及び酵素標識抗体として用い、図１に示されるような濃度依存性の良い検量線が得られた。
【００３０】
［実施例３］
ヒトメダラシンの免疫学的測定方法II
（１）モノクローナル抗体固定化ビーズの調製
ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してから、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（３Ｆ０３）１０μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ水溶液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られた。
【００３１】
（２）ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免疫測定方法
マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（３Ｆ０３）を固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン（標準物質）０，１，１０，１００，２００ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液５０μｌとＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、０．０５％ＡＢＴＳ、及び０．００３４％過酸化水素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.6 ）を４００μｌずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３０分間インキュベートした後、反応停止剤として０．１Ｎシュウ酸水溶液を１ｍｌずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４２０ｎｍの波長の吸光度を測定し、これを標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２に示されるような濃度依存性の良い検量線が得られた。
【００３２】
［実施例４］
酵素免疫測定方法による臨床検体中のメダラシンの測定
健常人及び多発性硬化症患者血液を採取して凍結保存した試料を室温に戻して融解させ、その１０μｌを採取しＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）２ｍｌ中に加えて均一に混合して検体溶液とした後、その１０μｌを試験管に添加し、これに２．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ7.4 ）４０μを加えて希釈し、次いで、この試験管にマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）もしくは（３Ｆ０３）を固定化したビーズ各１個とＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（２Ｅ０４）０．２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液３５０μｌを試験管に充填して３７℃の温度で３０分間インキュベートした。次に、前述の検量線を作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行なった後、分光光度計を用いて４２０ｎｍの波長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃度を求めた。その結果、検体血液中のヒトメダラシン濃度は、測定法Ｉ及びＩＩにより健常人が夫々１０．０μｇ／ｍｌ及び９．６μｇ／ｍｌであり、多発性硬化患者が夫々３７．３μｇ／ｍｌ及び３５．８μｇ／ｍｌであった。
【００３３】
【発明の効果】
顆粒球に存在するセリンプロテアーゼの一種であるメダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を製造することにより、ヒトメダラシンの免疫学的測定を迅速、簡便に行なうことが可能となり、更に、慢性炎症性疾患、特に多発性硬化症の血液診断等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２記載の酵素免疫測定方法（測定法Ｉ）を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシン測定用の検量線である。
【図２】実施例３記載の酵素免疫測定方法（測定法II）を用いてヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシン測定用の検量線である。
Claims (5)
- ヒトメダラシンで免疫した動物（ヒトを除く。）から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により作製したハイブリドーマを培養し、その培養物より採取され、試料中のヒトメダラシンを特異的に認識する抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化し、固定化抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体と標識化抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体とを用い、試料中のヒトメダラシンと抗原抗体反応によりサンドイッチ錯体を形成させてヒトメダラシンを不溶性担体上に捕捉した後、該錯体中の標識を定量することからなるヒトメダラシンの免疫学的測定方法であって、前記ヒトメダラシンが、ヒト顆粒球由来のものであり、分子内に同一のアミノ酸配列のエピトープを有し、該ヒトメダラシンを認識する前記固定化される抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体と標識化される抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体が同一のものであり、前記の同一のアミノ酸配列のエピトープを認識するものであることを特徴とするヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
- 前記ヒトメダラシンの免疫学的測定方法が、多発性硬化症の検査のための同症患者から採取した血液中のヒトメダラシン含有量の測定に利用可能な測定方法である請求項１に記載のヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
- 前記抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の免疫グロブリンのクラスがＩｇＧである請求項１記載のヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
- 前記抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体がマウス由来の抗体である請求項１記載のヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
- 前記標識化抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の標識物質が、ペルオキシダーゼ酵素である請求項１記載のヒトメダラシンの免疫学的測定方法。
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