ES2334972T3 - Inmunoensayo para medulasina humana y metodo de diagnostico de la esclerosis multiple. - Google Patents
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Abstract
Un método para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en sangre, que se caracteriza por las siguientes etapas (a) y (b): (a) una etapa de romper los leucocitos en una muestra de sangre, poniendo en contacto dicha muestra de sangre con los siguientes líquidos acuosos (i) o (ii) o con una mezcla de los líquidos acuosos (i) y (ii): (i) un líquido acuoso, que contiene 0,05% mol o más, o 0,005% mol o menos de un soluto, que tiene una presión osmótica de 250 mmol/l.H2O (250 mOsm/kg.H2O) o menor, o un líquido acuoso que tiene una presión osmótica de 310 mmol/l.H2O (310 mOsm/kg.H2O) o mayor; (ii) un líquido acuoso, en el que dicho líquido acuoso (ii) es una disolución acuosa de un tensioactivo; y (b) determinar inmunológicamente el contenido en medulasina humana en dicha muestra de sangre mediante un método que comprende poner en contacto la muestra de sangre que contiene dicha medulasina humana liberada de los leucocitos rotos en dicha etapa (a) con un anticuerpo monoclonal antimedulasina humana inmovilizado sobre un vehículo insoluble en presencia de un anticuerpo monoclonal antimedulasina humana marcado para formar un complejo de sandwich, y capturar la medulasina humana sobre un complejo inmunológico marcado mediante una reacción de antígeno-anticuerpo, y después determinar la cantidad de actividad del material marcador en dicho complejo.
Description
Inmunoensayo para medulasina humana y método de
diagnóstico de la esclerosis múltiple.
La presente invención se refiere a un método
para medir inmunológicamente la medulasina humana en sangre y a un
método para diagnosticar la esclerosis múltiple utilizando éste. Con
más detalle, se refiere a un método para medir inmunológicamente la
medulasina humana en sangre que incluyen una etapa de pretratar la
muestra de sangre para medir con precisión el contenido en
medulasina en los granulocitos en la sangre, y a un método para
diagnosticar la esclerosis múltiple utilizando el contenido en
medulasina en sangre.
La medulasina, que es un tipo de serina
proteasa, aparece en granulocitos, etc., y se cree que desempeña
muchos papeles importantes en el mecanismo de defensa, incluyendo
la expresión de la inflamación, en particular la inflamación
crónica. La cantidad de medulasina en los granulocitos aumenta en la
etapa avanzada de una serie de enfermedades inflamatorias crónicas,
y se normaliza en las etapas de remisión. Sin embargo, en pacientes
que padecen esclerosis múltiple se observa que la cantidad de
medulasina aumenta en gran medida unos pocos días antes de la etapa
avanzada, y se normaliza antes de la remisión. La esclerosis
múltiple se caracteriza por una lesión desmielinizada localizada en
la materia blanca del sistema nervioso central y gliosis. Es una
enfermedad inflamatoria grave que avanza con repetidas remisiones y
agravamientos, y en muchos casos provoca la muerte en 10 a 15 años.
La causa de la esclerosis múltiple aún no se ha identificado con
claridad, pero se cree que esta enfermedad es un tipo de enfermedad
autoinmunológica en que los autoanticuerpos atacan al tejido
nervioso tras la estimulación del sistema inmunológico por un virus
o una bacteria. Su diagnóstico es bastante difícil y en la
actualidad se realiza mediante formación de imágenes de resonancia
magnética (MRI) o similares. Sin embargo, un método como MRI
requiere un equipo a gran escala y conocimientos técnicos
especializados para la toma de mediciones y es costoso. Además, los
métodos para ensayar el líquido de la médula ósea presentan el
problema de infligir un gran dolor al paciente. A la luz de estas
circunstancias, ahora se ha desarrollado un método de diagnóstico
sencillo mediante el cual puede realizarse el diagnóstico de la
enfermedad, puede conocerse el estado de la enfermedad y pueden
suponerse sus consecuencias. Como resultado, se ha realizado un
estudio de métodos para medir la actividad de la medulasina en los
granulocitos en sangre, y junto con el desarrollo de un método de
medición inmunológica mediante el cual puede medirse con facilidad,
se ha propuesto la posibilidad de diagnosticar la esclerosis
múltiple según el contenido en medulasina de los granulocitos
en
sangre.
sangre.
Sin embargo, se ha observado el fenómeno de que,
cuando se realiza la medición después de diluir la muestra de
sangre con un medio acuoso en un método para medir inmunológicamente
la medulasina humana, la medición se realiza sin haber llevado a
cabo un tratamiento para expulsar completamente la medulasina
presente en el granulocito hacia el exterior del granulocito, y la
reproducibilidad de los valores medidos no es buena y da lugar a
variaciones en los valores medidos. Por consiguiente, se ha deseado
el desarrollo de un método para medir inmunológicamente la cantidad
de medulasina humana en sangre con una buena reproducibilidad.
Con respecto a la cuestión de si la esclerosis
múltiple puede diagnosticarse basándose en la cantidad de medulasina
en sangre, este criterio requiere la inspección de cantidades
considerables de datos clínicos. Sin embargo, hasta la fecha no ha
existido este tipo de datos y, además, ha sido difícil realizar un
diagnóstico preciso debido a la dificultad para obtener un valor
medido preciso de medulasina en los granulocitos en sangre, debido
a la gran variación de los valores medidos. Por consiguiente, el
diagnóstico de la esclerosis múltiple basándose en la cantidad de
medulasina en la sangre ha sido difícil.
Además, Aoki et al. (1984), Annals of
Neurology, 15, 245-249, "Medullasin Activity in
Granulocytes of Patients with Multiple Sclerosis", describen un
método para determinar la actividad enzimática de medulasina en
granulocitos maduros que son purificados, estabilizados, sonicados
y analizados.
Además, Aoki et al. (1988), Clinica
Chimica Acta, 178, 193-204, "Enzym Immunoassay of
Medullasin in Peripheral Blood", describen un método de
inmunoensayo enzimático para la determinación de la cantidad de
medulasina con esferas de poliestireno revestidas con IgG
antimedulasina de conejo. Según Aoki et al., los niveles de
medulasina en la sangre periférica de pacientes con esclerosis
múltiple son elevados.
Comenzando a partir de Aoki et al.
(1988), un problema técnico de la presente invención ha sido
encontrar un método inmunológico mejorado para la determinación de
la medulasina en sangre y un método mejorado para el diagnóstico de
la esclerosis múltiple.
Este problema se resuelve mediante un método
para medir inmunológicamente la medulasina según la reivindicación
1, y mediante un método para diagnosticar la esclerosis múltiple
según la reivindicación 7.
\newpage
Por consiguiente, los inventores de la presente
invención han realizado investigaciones a fondo para resolver el
problema descrito anteriormente. Como resultado, han descubierto que
la medulasina humana en sangre puede medirse de forma precisa con
una buena reproducibilidad midiendo inmunológicamente la medulasina
humana utilizando anticuerpos antimedulasina humana después de
romper completamente los leucocitos mediante el tratamiento de la
muestra de sangre con un líquido acuoso que incluye un hemolisado o
un líquido acuoso que tenga una presión osmótica específica
diferente de la presión osmótica de la sangre humana.
Además, con el establecimiento de dicho método
para medir de forma precisa la medulasina humana con una buena
reproducibilidad, los inventores de la presente invención han
advertido que el tamaño y los cambios en el contenido medido de
medulasina humana en la muestra de sangre están muy relacionados con
la aparición de la esclerosis múltiple y su alcance, etc. Basándose
en estos descubrimiento se ha llegado a la presente invención.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere a un método para medir inmunológicamente el contenido en
medulasina humana en la sangre según la reivindicación 1.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a un método para diagnosticar la esclerosis múltiple según
la reivindicación 7.
La figura 1 es una curva de calibración para
medir la medulasina humana, preparada representando gráficamente la
absorbancia medida por el inmunoensayo enzimático descrito en el
ejemplo 2 como una función de la concentración del antígeno.
La figura 2 es una curva de calibración para
medir la medulasina humana, preparada representando gráficamente la
absorbancia medida por el inmunoensayo enzimático descrito en el
ejemplo 3 como una función de la concentración del antígeno.
La figura 3 muestra los valores de medulasina
humana en muestras de sangre (\mug/10^{8} granulocitos)
representados gráficamente por separado para individuos normales,
pacientes que padecen esclerosis múltiple, y pacientes que padecen
enfermedades nerviosas no inflamatorias.
La figura 4 muestra los valores de medulasina
humana en muestras de sangre (\mug/10^{8} granulocitos)
representados gráficamente por separado para hombres y mujeres que
padecen esclerosis múltiple.
La figura 5 muestra los valores de medulasina
humana en muestras de sangre (\mug/10^{8} granulocitos)
representados gráficamente por separado para pacientes que padecen
esclerosis múltiple de diferentes edades.
A continuación se describirá la invención con
más detalle. Las realizaciones preferidas de la presente invención
incluyen (1) y (2) a continuación.
(1) En primer lugar, se proporciona un método
para medir inmunológicamente el contenido en medulasina humana en
sangre, que incluye:
(a) una etapa de romper los leucocitos en una
muestra de sangre diluyendo dicha muestra de sangre con los
siguientes líquidos acuosos (i) o (ii) o con una mezcla de los
líquidos acuosos (i) y (ii):
(i) un líquido acuoso, que contiene 0,05% mol o
más, o 0,005% mol o menos de un soluto, que tiene una presión
osmótica de 250 mmol/l\cdotH_{2}O (250 mOsm/kg\cdotH_{2}O) o
menor, o un líquido acuoso que tiene una presión osmótica de 310
mmol/l\cdotH_{2}O (310 mOsm/kg\cdotH_{2}O) o mayor;
(ii) un líquido acuoso, en el que dicho líquido
acuoso (ii) es una disolución acuosa de un tensioactivo;
(b) una etapa de capturar la medulasina humana
sobre un complejo inmunológico marcado poniendo en contacto la
muestra de sangre que contiene dicha medulasina humana liberada de
los leucocitos rotos en la etapa (a) con un anticuerpo monoclonal
antimedulasina humana inmovilizado sobre un vehículo insoluble en
presencia de un anticuerpo monoclonal antimedulasina humana marcado
para formar un complejo de "sandwich" mediante una reacción de
antígeno-anticuerpo;
(c) una etapa de medir la actividad del material
marcador en el complejo obtenido en la etapa (b).
(2) También se proporciona un método para
diagnosticar la esclerosis múltiple que incluye:
(a) una etapa de romper los leucocitos en una
muestra de sangre diluyendo dicha muestra de sangre con los
siguientes líquidos acuosos (i) o (ii) o con una mezcla de los
líquidos acuosos (i) y (ii):
(i) un líquido acuoso, que contiene 0,05% mol o
más, o 0,005% mol o menos de un soluto, que tiene una presión
osmótica de 250 mmol/l\cdotH_{2}O (250 mOsm/kg\cdotH_{2}O) o
menor, o un líquido acuoso que tiene una presión osmótica de 310
mmol/l\cdotH_{2}O (310 mOsm/kg\cdotH_{2}O) o mayor;
(ii) un líquido acuoso, en el que dicho líquido
acuoso (ii) es una disolución acuosa de un tensioactivo;
(b) una etapa de capturar la medulasina humana
sobre un complejo inmunológico marcado poniendo en contacto la
muestra de sangre que contiene dicha medulasina humana liberada de
los leucocitos rotos en la etapa (a) con un anticuerpo
antimedulasina humana inmovilizado sobre un vehículo insoluble en
presencia de un anticuerpo antimedulasina humana marcado para
formar un complejo de "sandwich" mediante una reacción de
antígeno-anticuerpo;
(c) una etapa de medir la actividad del material
marcador en el complejo obtenido en la etapa (b);
(d) una etapa de observar el tamaño y/o los
cambios en el contenido de medulasina humana en la muestra de
sangre obtenidos a partir de los valores para la cantidad de
material marcador obtenidos en la etapa (c); y
(e) diagnosticar la aparición y/o el alcance de
la esclerosis múltiple a partir de la observación de los resultados
obtenidos en la etapa (d).
La mayoría de la medulasina humana en la muestra
de sangre que se va a medir en la presente invención aparece dentro
de los granulocitos, que son un componente de los leucocitos
existentes en la sangre y, por tanto, romper completamente los
granulocitos para liberar toda la medulasina hacia el exterior de la
membrana celular antes de la medición es un requisito fundamental
para obtener mediciones precisas. Por consiguiente, si este
requisito no se cumple totalmente existirán grandes variaciones en
las mediciones y sólo pueden obtenerse datos medidos con una baja
reproducibilidad.
Los métodos en que puede pensarse para romper
completamente los leucocitos en la muestra de sangre son métodos
mecánicos, métodos que emplean ondas de ultrasonido y métodos que
implican congelación y descongelación repetidas. Sin embargo, los
inventores de la presente invención han descubierto, como resultado
de amplias investigaciones, que el siguiente método es muy eficaz
como método práctico que produce mediciones de gran precisión y que
puede llevarse a cabo con relativa facilidad comparado con los
métodos mencionados anteriormente.
(1) En primer lugar, un método para tratar una
muestra de sangre con un líquido acuoso que tiene una presión
osmótica diferente de la de la sangre; y
(2) en segundo lugar, un método para tratar una
muestra de sangre con un líquido acuoso que comprende un hemolisado
que es un producto farmacéutico con el que puede romperse la
membrana celular de los granulocitos bajo condiciones suaves.
La presión osmótica de la sangre humana está en
el intervalo de aproximadamente 280 a 290 mmol/l\cdotH_{2}O
(280 a 290 mOsm/kg\cdotH_{2}O) y, por tanto, resulta difícil,
por ejemplo, romper completamente los granulocitos en la sangre
utilizando un líquido acuoso que tenga una presión osmótica de 250 a
310 mmol/l\cdotH_{2}O (250 a 310 mOsm/kg\cdot
H_{2}O).
H_{2}O).
Por consiguiente, la ruptura completa de los
granulocitos en sangre humana puede lograrse diluyendo la sangre
con un líquido acuoso que tenga una presión osmótica menor que 250
mmol/l\cdotH_{2}O (250 mOsm/kg\cdotH_{2}O), o un líquido
acuoso que tenga una presión osmótica mayor que 310
mmol/l\cdotH_{2}O (310 mOsm/kg\cdotH_{2}O).
Los líquidos acuosos de este tipo que pueden
utilizarse incluyen agua pura que puede incluir disolventes
orgánicos solubles en agua, y disoluciones acuosas y disoluciones
tampón que sean líquidos acuosos que tengan una concentración
extremadamente alta o una concentración extremadamente baja de un
soluto que consiste en una sustancia soluble en agua, como sales de
ácidos inorgánicos, sales de ácidos orgánicos, azúcares, alcoholes
de azúcares, aminoácidos y proteínas, y que tengan una presión
osmótica que pueda romper completamente los granulocitos. De forma
específica, el cloruro de sodio, los fosfatos de sodio, etc., son
sales de ácidos inorgánicos preferidas, y el acetato de sodio, el
citrato de sodio, etc., son sales de ácidos orgánicos preferidas.
Además, la glucosa y el sorbitol, etc., son los azúcares y los
alcoholes de azúcares preferidos. Las disoluciones acuosas que
tienen una concentración extremadamente alta del soluto descrito
anteriormente contienen 0,05% mol o más, preferiblemente 0,1% mol o
más del soluto, mientras que las disoluciones acuosas que tienen una
concentración extremadamente baja del soluto descrito anteriormente
contienen 0,005% mol o menos, preferiblemente 0,001% mol o menos. La
cantidad del líquido acuoso utilizado es de 50 a 100.000 veces la
de la muestra de sangre, en términos de unidades de volumen,
preferiblemente de 100 a 10.000 veces, y más preferiblemente de 500
a 2000 veces.
Además, el método para tratar la muestra de
sangre con un medio acuoso que incluya el hemolisado mencionado
anteriormente también se prefiere. Los ejemplos específicos no
limitantes de hemolisados son tensioactivos catiónicos, como sales
de ácido graso superior, arilsulfonatos de alquilo, sulfonatos de
alquilo y ésteres de ácido alquilsulfónico; tensioactivos
aniónicos, como sales de alquilpiridinio, sales de
alquiltrimetilamonio, y alquilpolioxietilenaminas; tensioactivos no
iónicos, como polioxietilén alquilfenil éteres, polioxietilén
alquil éteres y ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitán;
tensioactivos anfóteros, como alquilbetaínas; tensioactivos
naturales, como saponina, lecitina y ácido cólico; y biocomponentes,
como complementos y veneno de serpiente, toxina de abeja y una
enzima como proteasa. Estos hemolisados pueden utilizarse en forma
de un líquido acuoso que tenga del 0,0001% al 10% en peso,
preferiblemente del 0,001% al 5% en peso, y preferiblemente en
particular del 0,005% al 1% en peso. El medio líquido acuoso puede
ser, por ejemplo, agua o un medio mixto que comprenda agua y un
disolvente orgánico soluble en agua. La cantidad del líquido acuoso
utilizado es de 50 a 100000 veces, preferiblemente de 100 a 10000
veces, y más preferiblemente de 500 a 2000 veces la de la muestra
de sangre en términos de unidades de volumen.
El método inmunológico de medir la medulasina
humana se realiza con la muestra de sangre líquida diluida acuosa
obtenida mediante el tratamiento de una muestra de sangre con el
líquido acuoso (i) o el líquido acuoso (ii) descritos
anteriormente, y en que los granulocitos se han roto completamente.
El método comprende una etapa de reacción inmunológica en que la
muestra para la medición se pone en contacto con un anticuerpo
antimedulasina humana en presencia de un antígeno o un anticuerpo
marcados para capturar la medulasina humana como un complejo
inmunológico marcado, a través de una reacción de
antígeno-anticuerpo; y una etapa de detección, en
que el complejo inmunológico producido de esta manera se mide
utilizando el material marcador presente en su molécula. Cualquier
método puede utilizarse para la reacción de
antígeno-anticuerpo en la etapa de reacción
inmunológica.
Los ejemplos no limitantes de los métodos que
pueden utilizarse incluyen:
(1) un método de "sandwich" en que un
anticuerpo marcado se hace reaccionar con el antígeno en la muestra
de sangre que se va medir, después de capturarlo con un anticuerpo
inmovilizado sobre un vehículo insoluble;
(2) un método de dos anticuerpos en que se
emplea un anticuerpo derivado de un animal, diferente del anticuerpo
inmovilizado sobre el vehículo insoluble en el método de
"sandwich", y en que un segundo anticuerpo marcado con
respecto a este anticuerpo también se hace reaccionar con el
complejo de "sandwich" producido;
(3) un método de competición en que el antígeno
en la muestra de sangre que se va a medir se hace reaccionar con un
anticuerpo inmovilizado sobre un vehículo insoluble en presencia de
un antígeno marcado con la enzima peroxidasa;
(4) un método de
aglutinación-precipitación en que la muestra de
sangre que incluye el antígeno que se va a medir se trata con un
anticuerpo marcado que reacciona específicamente con éste para
producir una aglutinación-precipitación, y después
se detecta el material marcador en el complejo inmunológico separado
mediante separación con centrifugación; y
(5) un método de biotina-avidina
en que una avidina marcada se hace reaccionar con un anticuerpo
marcado con biotina.
Cuando se emplea un vehículo insoluble en el
método de medir inmunológicamente la medulasina humana según la
presente invención, los ejemplos de este vehículo insoluble incluyen
compuestos poliméricos como poliestireno, polietileno,
polipropileno, poliéster, poliacrilonitrilo, resinas de flúor,
dextrano reticulado, y polisacáridos, así como vidrio, metales,
partículas magnéticas y combinaciones de éstos. El vehículo
insoluble puede utilizarse, por ejemplo, en diversas formas, como
bandejas, esferas, fibras, varillas, discos, recipientes, células,
microplacas y tubos de ensayo. Puede utilizarse cualquier método
para inmovilizar los antígenos o los anticuerpos a estos vehículos
insolubles. Por ejemplo, pueden utilizarse métodos de adsorción
física, métodos de unión covalente y métodos de unión iónica.
Pueden emplearse anticuerpos de cualquier clase
de inmunoglobulinas en el método para medir inmunológicamente la
medulasina humana según la presente invención, pero el uso de
anticuerpos de clase IgG se prefiere. Es posible utilizar
anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales, pero se
prefieren los anticuerpos monoclonales. Éstos pueden utilizarse,
por ejemplo, en forma de un anticuerpo entero o como fragmentos,
como F(ab')_{2} y Fab. Los anticuerpos pueden obtenerse a
partir de cualquier fuente, pero el uso de anticuerpos derivados de
ratones, ratas, conejos, vacas, cabras, pollos, etc. se
prefiere.
Después, es preferible utilizar enzimas,
sustratos fluorescentes, sustancias luminiscentes y sustancias
radiactivas, etc. como material marcador para la medición en la
etapa de detectar el complejo inmunológico marcado de medulasina
humana capturada de esta manera. Los ejemplos no limitantes incluyen
enzimas, como peroxidasa, fosfatasa alcalina, y
\beta-D-galactosidasa; sustancias
fluorescentes, como isocianato de fluoresceína y ficobiliproteínas;
sustancias luminiscentes, como luminoles, dioxetanos y sales de
acridinio; y sustancias radiactivas, como ^{125}I, ^{131}I,
^{111}In y ^{99m}Tc. Cuando se emplea una enzima como material
marcador, se emplea un sustrato y, si se requiere, un agente
colorante, un agente fluorescente o un agente luminiscente para
medir su actividad. Si se emplea la peroxidasa como enzima puede
utilizarse peróxido de hidrógeno, etc. como sustrato, sal de amonio
del ácido
2,2'-azinodi[3-etilbenzotiazolinsulfónico]
(ABTS), ácido 5-aminosalicílico,
o-fenilendiamina,
4-aminoantipirina,
3,3',5,5'-tetrametilbencidina, etc. como agente
colorante, ácido 4-hidrofenilacético, ácido
3-(4-hidroxifenil)propiónico, etc. como
agente fluorescente, y luminoles, complejos de transporte de carga
de lucigenina como agente luminiscente (por ejemplo, se hace
referencia a la publicación internacional nº WO00/09626). Además,
si se emplea la fosfatasa alcalina como enzima, puede utilizarse
4-nitrofenilfosfato,
4-metilumbeliferilfosfato,
cortisol-21-fosfato, etc. como
sustrato; si se emplea
\beta-D-galactosidasa como
enzima, puede utilizarse
2-nitrofenil-\beta-D-galactósido,
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactósido,
3-(2'-spiroadamantan)-4-metoxi-4-(3''-\beta-D-galactosiloxifenil)-1,2-dioxetano
(AMPGD), etc. como sustrato.
Un anticuerpo policlonal preferido que puede
utilizarse en el método para medir inmunológicamente la medulasina
humana es un material separado como el componente de anticuerpo a
partir de un antisuero sanguíneo antimedulasina humana obtenido
mediante la inmunización de un animal según un método convencional
que emplea medulasina humana como antígeno. Por ejemplo, se emplean
preferiblemente anticuerpos policlonales antimedulasina humana de
cabra y anticuerpos policlonales antimedulasina humana de conejo.
Los anticuerpos monoclonales que pueden utilizarse en la presente
invención y un método para su producción se describen en detalle en
el documento
JP 11151085.
JP 11151085.
Concretamente, el anticuerpo monoclonal
antimedulasina humana que puede utilizarse en el método para medir
inmunológicamente la medulasina humana según la presente invención
se produce cultivando hibridomas en un medio de cultivo, habiéndose
preparado dichos hibridomas mediante fusión celular entre células de
mieloma y células productoras de anticuerpos recuperadas a partir
de un animal inmunizado con medulasina humana extraída de
granulocitos separados de la sangre de un individuo normal, y
recuperando el anticuerpo monoclonal del cultivo, o mediante
administración intraperitoneal de los hibridomas a un animal,
haciendo proliferar los hibridomas en líquido ascítico, y
recuperando el anticuerpo monoclonal del líquido ascítico.
Pueden producirse hibridomas productores de
anticuerpos monoclonales antimedulasina humana mediante un método
de fusión celular. Es decir, los hibridomas productores de
anticuerpos monoclonales deseados pueden obtenerse recuperando
células productoras de anticuerpos de un animal inmunizado con
medulasina humana, fusionando las células productoras de
anticuerpos con células de mieloma, haciendo proliferar
selectivamente los hibridomas obtenidos, seleccionando los
hibridomas productores de anticuerpos a partir de los hibridomas
obtenidos, y clonando los hibridomas seleccionados.
Los ejemplos de las células productoras de
anticuerpos descritas anteriormente incluyen células de bazo,
células de nodo linfático, linfocitos B y similares, que se
obtienen a partir de un animal inmunizado con medulasina humana, o
células o una composición que contenga medulasina humana. Los
ejemplos del animal que se va a inmunizar son ratones, ratas,
conejos, cabras, ovejas y caballos. La inmunización puede
realizarse, por ejemplo, mediante la administración subcutánea,
intramuscular o intraperitoneal de medulasina humana a un animal a
una dosis de aproximadamente 1 \mug a 1 mg durante 1 a 2 veces
mensuales a lo largo de un periodo de 1 a 6 meses. La recolección
de las células productoras de anticuerpos puede realizarse de 2 a 4
días después de la inmunización
final.
final.
Las células de mieloma pueden originarse de
ratón, rata, etc. Se prefiere que las células productoras de
anticuerpos y las células de mieloma se deriven del mismo tipo de
animal.
Puede emplearse cualquier método para fusionar
las células; no existen limitaciones. Por ejemplo, puede realizarse
mezclando las células productoras de anticuerpos y las células de
mieloma en un medio, como medio de Eagle modificado de Dulbecco
(DMEM) en presencia de un acelerador de la fusión, como
polietilenglicol.
Después de la operación de la fusión celular,
los hibridomas pueden seleccionarse diluyendo de forma apropiada
las células con DMEM, etc., centrifugando el resultado, suspendiendo
el precipitado en un medio de selección, como medio HAT, y
cultivando en éste las células. Entonces se seleccionan los
hibridomas productores de anticuerpos mediante inmunoensayo
enzimático utilizando el sobrenadante del cultivo, y el hibridoma
seleccionado se clona mediante el método de dilución limitada para
obtener el hibridoma productor de anticuerpos monoclonales
antimedulasina humana.
El anticuerpo monoclonal puede producirse
cultivando el hibridoma productor de anticuerpos obtenido de esta
manera en un medio de cultivo adecuado o en un animal, y recuperando
el anticuerpo monoclonal del cultivo. Con el fin de producir
grandes cantidades de anticuerpo monoclonal, se prefiere el método
en que los hibridomas se administran por vía intraperitoneal a un
animal de la misma especie como donante de las células de mieloma,
el anticuerpo monoclonal se administra en el líquido ascítico, y el
anticuerpo monoclonal se recupera del líquido
ascítico.
ascítico.
La separación del anticuerpo monoclonal del
cultivo o del líquido ascítico puede realizarse mediante
cromatografía con una columna de intercambiador aniónico o proteína
A, G, etc. o mediante fraccionamiento con sulfato de amonio que se
emplea habitualmente para la purificación de IgG.
Los anticuerpos monoclonales antimedulasina
humana obtenidos de esta manera existen en forma de cuatro tipos,
denominados 3F03, 3G03, 2E04 y 1G12, según el tipo de hibridoma
utilizado para formarlos. La clase de inmunoglobulina de cada uno
de estos anticuerpos monoclonales es IgG y la subclase es IgG_{1},
y cada anticuerpo reacciona específicamente con la medulasina
humana, que es el correspondiente antígeno. Por consiguiente, los
anticuerpos monoclonales antimedulasina humana descritos
anteriormente son útiles para el método para medir inmunológicamente
la medulasina humana de la presente invención.
Después, el método para diagnosticar la
esclerosis múltiple según la presente invención implica diagnosticar
la aparición y/o el alcance o el estado de la esclerosis múltiple
basándose en el tamaño o los cambios en el valor medido para el
contenido en medulasina humana en la muestra de sangre obtenida
mediante el método descrito anteriormente para medir
inmunológicamente la medulasina humana. De forma específica, puede
emplearse un método en que se calcula la cantidad de medulasina
humana en 10^{8} granulocitos a partir de la concentración medida
de medulasina humana en la muestra de sangre y el número medido de
granulocitos en la muestra de sangre utilizando la misma muestra de
sangre, y se considera la aparición de la esclerosis múltiple
comparando el tamaño de este valor con un valor de corte (valor
medio para un individuo normal \pm 2DE (desviación estándar)), o
se consideran los cambios en el alcance de la enfermedad a lo largo
del tiempo mediante la comparación de los cambios en el valor
medido a lo largo del tiempo.
De 112 pacientes que padecen esclerosis múltiple
que fueron diagnosticados mediante este método, 85 fueron positivos
con un valor de medulasina no menor que el valor de corte, dando un
alto porcentaje positivo del 75,8%. Por constraste, de 80 pacientes
que padecen diversas enfermedades nerviosas no inflamatorias, el
número de los que eran positivos con un valor de medulasina no
menor que el valor de corte era de 13, dando un bajo porcentaje
positivo de 16,3%. Por tanto, se observa que el método para
diagnosticar la esclerosis múltiple según el valor de medulasina
humana en la sangre es un método de diagnóstico con una fiabilidad
extremadamente alta. Además, el porcentaje de individuos normales
(en otras palabras, personas sanas) que arrojan un valor positivo
de medulasina fue 0% (véase la tabla 5 y la figura 3). También se
descubrió que el nivel del valor de medulasina para los pacientes
con esclerosis múltiple no presenta diferencias entre hombres y
mujeres (véase la figura 4) y no presente diferencias según la edad
(véase la figura 5).
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A continuación, la presente invención se
describirá en términos específicos mediante la ilustración de
ejemplos, junto con ejemplos de referencia. La invención no se
limita de ninguna manera a estos ejemplos. Los porcentajes
indicados en los ejemplos son porcentajes en peso.
Ejemplo de referencia
1
Se mezclaron 400 mililitros de sangre procedente
de un individuo normal y disolución de dextrano al 6% (peso
molecular: 200.000-300.000) en disolución salina
fisiológica a una proporción de sangre:disolución de dextrano
acuosa 2:1, y la mezcla resultante se agitó ligeramente con una
varilla de vidrio, y después se dejó en reposo a
4-8ºC durante aproximadamente 1 hora. Los
eritrocitos precipitados se retiraron y el sobrenadante obtenido se
centrifugó a 15.000 rpm, seguido de la recuperación del precipitado
para obtener los leucocitos. A los leucocitos obtenidos se les
añadió un tampón de extracción que contenía ácido
etilendiaminotetraacético de sodio (EDTA) 1 mM y ácido
p-cloromercuribenzoico (PCMB) 1 mM en tampón fosfato
de potasio (PKB) 1 M a pH 7,0, y la mezcla resultante se incubó con
agitación a 37ºC durante 20 minutos. El resultado se sometió a
ultrasonicación durante 15 segundos para romper completamente las
células y el resultado se incubó a 37ºC durante 20 minutos, seguido
de una centrifugación a 4ºC a 12.000 rpm durante 10 minutos. El
sobrenadante se recuperó y se dializó contra agua destilada. El
residuo precipitado se sometió varias veces a las operaciones
descritas anteriormente para realizar la extracción. El fluido
extraído obtenido se aplicó a una columna de gel de
CM-Sepharose equilibrada con PKB 50 mM (pH 6,0) y
la columna se lavó con el mismo tampón. Las sustancias adsorbidas
entonces se eluyeron con PKB 1 M (pH 6,0) y la disolución eluida se
dializó contra agua destilada durante la noche para eliminar la
sal, seguido de la concentración del resultado con una membrana de
colodión, para obtener 1,5 mg de medulasina humana purificada.
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Ejemplo de referencia
2
La medulasina humana extraída y purificada a
partir de granulocitos humanso en el ejemplo de referencia 1 se
emulsionó con adyuvante completo de Freund y el resultado se
administró por vía subcutánea a ratones BALB/C de 7 semanas a una
dosis de 50 \mug/ratón. Después de 4 semanas, los ratones se
sometieron a otra inmunización mediante el mismo método que la
primera inmunización. Siete días después de la administración
adicional se confirmaron unos mayores niveles sanguíneos de
anticuerpos. Otros 7 días después, el antígeno se administró por
vía intraperitoneal a una dosis de 50 \mug/ratón en la
inmunización final. Por otra parte, células de mieloma de ratón
P3-X63-Ag8-U1 (P3U1)
se transfirieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)
suplementado con suero de ternera fetal al 20%. Tres días después
de la inmunización final, se recogieron células de bazo fusionadas
de los ratones y, junto con células P3U1, utilizando
polietilenglicol 4000, se colocaron en los pocillos de una
microplaca de 96 pocillos. Después de la operación de fusión
celular, el medio se cambió a DMEM suplementado con hipoxantina 100
\muM, aminopterina 0,4 \muM y timidina 16 \muM (medio HAT), y
se obtuvieron hibridomas entre las células de bazo y las células de
mieloma mediante cultivo selectivo durante 2 a 3 semanas.
Las valoraciones de los anticuerpos en los
fluidos de cultivo de los hibridomas se determinaron mediante ELISA
(ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados), realizando con ello la
selección. Concretamente, la medulasina humana se adsorbe sobre las
paredes de una microplaca para ELISA, y los pocillos se bloquearon
con una disolución de albúmina de suero bovina (BSA) al 2% en
disolución salina tamponada con fosfato (PBS) 10 mM (pH 7,4). Se
añadieron 50 microlitros del fluido de cultivo del hibridoma a cada
pocillo y el resultado se dejó en reposo durante 1 hora. Después de
retirar el cultivo de hibridoma y de lavar los pocillos se añadieron
100 \mul de una disolución 2 \mug/ml de anticuerpo
IgG-Fc antirratón de cabra marcado con peroxidasa en
PBS a cada pocillo, y la mezcla resultante se dejó reaccionar a
37ºC durante 1 hora. Después de retirar la disolución de anticuerpo
marcado con enzima y de lavar los pocillos se añadieron 200 \mul
de una disolución de tampón citrato fostato 0,1 M (pH 4,6) que
contenía ABTS al 0,05% y peróxido de hidrógeno al 0,0034% para
generar color, seleccionando con ello los hibridomas productores de
anticuerpos antimedulasina humana.
Cada uno de los cultivos de los hibridomas
productores de anticuerpos antimedulasina humana se sometió a
clonación mediante el método de dilución limitante para obtener,
por último, 4 tipos de hibridomas monoclonales. Los hibridomas se
administraron por separado a ratones BALB/C por vía intraperitoneal,
habiendo recibido antes dichos ratones pristano, y los hibridomas
se cultivaron para obtener líquido ascítico que contenía el
anticuerpo monoclonal. Después, al líquido ascítico obtenido se le
añadió sulfato de amonio saturado al 50% para precipitar el
anticuerpo. El precipitado se separó y se disolvió en PBS. La
disolución resultante se dializó contra una disolución tampón de
Tris-ácido clorhídrico 50 mM (pH 7,8) que contenía NaCl 3 M. Después
se aplicó a una columna de proteína A-Sepharose
CL4B (disponible en el mercado en Pharmacia). El anticuerpo
adsorbido se eluyó con una disolución tampón de
glicina-HCl 0,1 M (pH 5,0) y la disolución eluida se
neutralizó, seguido de la purificación del anticuerpo contenido
para obtener 4 tipos de anticuerpo monoclonal, 3F03, 3G03, 2E04 y
1G12.
El antígeno que corresponde a los anticuerpos
monoclonales se inmovilizó mediante el método de la transferencia
Western.
En primer lugar, se sometió a la medulasina
procedente de granulocitos humanos a una electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida. La proteína se trasladó desde la
plancha de gel a una lámina de nitrocelulosa a lo largo de un
periodo de 2 horas con una pendiente de voltaje de 7 V/cm utilizando
una disolución que contenía
Tris(hidroximetil)aminometano 25 mM, glicina 192 mM y
metanol al 20% añadidos a un tampón de disolución electrolítica.
Después, cada carril de la lámina de nitrocelulosa se cortó y una de
las láminas se sometió a tinción de proteínas con Amideblack y la
otra lámina se sometió a un inmunoensayo enzimático como sigue.
Concretamente, después de bloquear la lámina con BSA al 2%/PBS, se
añadió el anticuerpo monoclonal antimedulasina humana de ratón como
anticuerpo primario, y después se añadió un anticuerpo específico de
IgG-Fc antirratón de cabra marcado con peroxidasa
como anticuerpo secundario, y el resultado se dejó reaccionar.
Después de lavar la lámina, se añadió una disolución de sustrato
que contenía 3,3'-diaminobenzidina al 0,04% y
peróxido de hidrógeno al 0,034% en PBS para generar color. Mediante
esto se confirmó que los cuatro anticuerpos monoclonales
antimedulasina humana de ratón reconocían a la medulasina derivada
de granulocitos humanos.
La medulasina humana inmovilizada sobre los
pocillos de una microplaca para ELISA se hizo reaccionar con un
primer anticuerpo biotinilado en presencia de un segundo anticuerpo
no marcado y después se hizo reaccionar con peroxidasa conjugada
con avidina, seguido de la adición de una disolución sustrato para
generar color, llevando a cabo con ello un ensayo de inhibición.
Con esto, no cambió la cantidad de anticuerpo biotinilado que
reacciona con ninguna combinación de anticuerpos monoclonales. Por
tanto, se confirmó que los 4 anticuerpos monoclonales reconocían
epitopos (sitios de antígeno) que son diferentes entre sí.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de lavar bien esferas de poliestireno
(diámetro de 6 mm), las esferas se sumergieron un día y una noche a
una temperatura de 4ºC en una disolución de PBS (pH 7,4) que
contenía 10 \mug/ml de anticuerpo monoclonal antimedulasina
humana de ratón (2E04). Entonces se lavaron con PBS y se sometieron
a un tratamiento de bloqueo dejándolas en una disolución acuosa de
BSA al 1% a una temperatura de 4ºC durante un día y una noche para
obtener esferas que tienen anticuerpos monoclonales inmovilizados
sobre ellas.
A una disolución 1,0 mg/ml de anticuerpo
monoclonal antimedulasina humana de ratón (2E04) en una disolución
de PBS se añadió 0,1 ml de una disolución 10 mg/ml de éster de
N-(ácido
m-maleimidabenzoico)-N-succinimida
(MBS) en dimetilformamida y se dejó que la mezcla reaccionase a una
temperatura de 25ºC durante 30 minutos. Después esta disolución de
mezcla de reacción se sometió a una columna cargada con Sephadex
G-25 y se realizó una cromatografía de permeación
en gel utilizando una disolución de tampón fosfato 0,1 M (pH 6,0)
para separar el anticuerpo monoclonal unido a maleimida del MBS sin
reaccionar.
Mientras, se añadió una disolución de etanol que
tenía una concentración de 10 mg/ml de
N-succinidimil-3-(2-piridiltio)propionato
(SPDP) a una disolución de PBS que contenía 1,0 mg/ml de peróxidasa
de rábano como enzima peroxidasa y se hizo reaccionar a una
temperatura de 25ºC durante 30 minutos. Después la disolución de
mezcla de reacción se aplicó a una columna Sephadex
G-25 y se sometió a una permeación en gel con una
disolución de tampón acetato 10 mM (pH 4,5). Las fracciones que
contenían HRP unida a disulfuro de piridilo se recogieron y se
concentraron en aproximadamente 10 veces con enfriamiento con hielo
en una bolsa de colodión. A esto se le añadió 1 ml de disolución
salina fisiológica en tampón acetato 0,1 M (pH 4,5) que contenía
ditiotreitol 0,1 M, seguido de una agitación durante 30 minutos a
una temperatura de 25ºC para reducir los grupos disulfuro de
piridilo introducidos en la molécula de HRP. Esta disolución de
mezcla de reacción entonces se sometió a una cromatografía de
permeación en gel utilizando una columna cargada con Sephadex
G-25 y se obtuvo una fracción que contenía
HRP
tiolada.
tiolada.
Después, el anticuerpo monoclonal unido a
maleimida y la HRP tiolada se mezclaron y la mezcla se concentró
hasta una concentración de proteína de 4 mg/ml en una bolsa de
colodión con enfriamiento con hielo. Después de dejar el resultado
en reposo a 4ºC durante un día se sometió a una cromatografía de
permeación en gel utilizando una columna cargada con Ultrogel AcA44
(fabricado por SEPRACOR) y se obtuvo un anticuerpo monoclonal
marcado con enzima peroxidasa.
Se mezcló una esfera sobre la cual se hubo
inmovilizado el anticuerpo monoclonal antimedulasina humana de
ratón (3F03), 50 \mul de una disolución de PBS que contiene BSA al
2% y que también contiene medulasina humana purificada (material de
referencia patrón) a una concentración de 0, 1, 10, 100 ó 200 ng/ml,
y 350 \mul de una disolución de PBS que contiene BSA al 2%, y la
mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos.
A continuación, después de que la disolución
dentro del tubo de ensayo se hubo retirado mediante aspiración, la
esfera se lavó con disolución salina fisiológica y después el tubo
de ensayo se rellenó con 400 \mul de una disolución de PBS que
contenía BSA al 2% y que contenía anticuerpo monoclonal
antimedulasina humana de ratón marcado con HRP (2E04) a una
concentración de 0,2 \mug/ml, seguido de una incubación a una
temperatura de 37ºC durante 30 minutos. La disolución en el tubo de
ensayo se retiró mediante aspiración, seguido de un lavado con
disolución salina fisiológica. Entonces se añadieron 400 \mul de
una disolución de tampón ácido fosfórico 0,1 M (pH 4,6) que
contenía peróxido de hidrógeno al 0,0034% y ABTS al 0,05% a cada
tubo de ensayo, seguido de una incubación a 37ºC durante 30
minutos. Se añadió 1 ml de una disolución de ácido oxálico acuoso
0,1 N a cada tubo de ensayo como terminador de la reacción para
detener la reacción enzimática. Después se midió la absorbancia a
una longitud de onda de 420 nm para la disolución resultante
utilizando un espectrofotómetro. Mediante la representación gráfica
de la absorbancia medida con respecto a la concentración del
material de referencia patrón se obtuvo una curva de calibración
con una buena dependencia de la concentración, como se muestra en
la
figura 1.
figura 1.
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Muestras de sangre congelada recogida de un
individuo normal (una persona sana) y de un paciente que padece
esclerosis múltiple se descongelaron a temperatura ambiente y se
añadieron 10 \mul de cada muestra a 2 ml de agua destilada
(presión osmótica = 0 mOsm/kg\cdotH_{2}O) y se mezcló de manera
adecuada utilizando un mezclador Vortex para obtener disoluciones
de muestra. Entonces se añadieron 10 \mul de éstas a tubos de
ensayo y se diluyó mediante la adición de 390 \mul de una
disolución de PBS (pH 7,4) que contenía BSA al 2%. Después, se
añadieron esferas con anticuerpo monoclonal antimedulasina humana de
ratón inmovilizado sobre ellas (3F03), una a cada uno de estos
tubos de ensayo, y se incubó a una temperatura de 37ºC durante 30
minutos. Después de la eliminación de las disoluciones en los tubos
de ensayo mediante aspiración se lavaron con disolución salina
fisiológica. Los tubos de ensayo entonces se rellenaron con 400
\mul de una disolución de PBS que contenía BSA al 2% y que
contenía anticuerpo monoclonal antimedulasina humana de ratón
marcado con HRP (2E04) a una concentración de 0,2 \mug/ml,
seguido de una incubación a una temperatura de 37ºC durante 30
minutos. Después se realizó un lavado, la reacción enzimática y se
terminó la reacción exactamente mediante las mismas operaciones que
en la preparación de las curvas de calibración descritas
anteriormente. Entonces se midió la absorbancia a una longitud de
onda de 420 nm utilizando un espectrofotómetro, y se determinó la
concentración de medulasina humana a partir de la curva de
calibración. Las operaciones de medición, comenzando desde el
tratamiento de dilución de la muestra, se repitieron para cada uno 5
veces para estudiar la reproducibilidad de las mediciones. Como
resultado, se confirmó que la concentración de medulasina humana
medida en las muestras de sangre mostró una reproducibilidad
extremadamente buena, como se muestra en la tabla 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
1
Muestras de sangre que se habían tomado,
respectivamente, de un individuo normal y de un paciente que padece
esclerosis múltiple y que se habían congelado para su conservación
se descongelaron devolviéndolas a temperatura ambiente. Se tomaron
10 \mul y se añadieron a 2 ml de una disolución de PBS (pH 7,4)
(presión osmótica = 290 mOsm/kg\cdotH_{2}O) y se mezclaron de
manera uniforme para obtener disoluciones de muestra. Entonces se
añadieron 10 \mul de éstas a tubos de ensayo y se diluyó mediante
la adición de 390 \mul de PBS (pH 7,4) que contenía BSA al 2%.
Después, se añadieron esferas con anticuerpo monoclonal
antimedulasina humana de ratón inmovilizado sobre ellas (3F03), una
a cada uno de estos tubos de ensayo, y se incubó a una temperatura
de 37ºC durante 30 minutos. Después de la eliminación de las
disoluciones en los tubos de ensayo mediante aspiración se lavaron
con disolución salina fisiológica. Los tubos de ensayo entonces se
rellenaron con 400 \mul de una disolución de PBS que contenía BSA
al 2% y que contenía anticuerpo monoclonal antimedulasina humana de
ratón marcado con HRP (2E04) a una concentración de 0,2 \mug/ml,
seguido de una incubación a una temperatura de 37ºC durante 30
minutos. Después se realizó un lavado, la reacción enzimática y se
terminó la reacción exactamente mediante las mismas operaciones que
en la preparación de las curvas de calibración descritas
anteriormente. Entonces se midió el grado de absorbancia a una
longitud de onda de 420 nm utilizando un espectrofotómetro, y se
determinó la concentración de medulasina humana a partir de la curva
de calibración. Las operaciones de medición, comenzando desde el
tratamiento de dilución de la muestra, se repitieron para cada uno
5 veces para estudiar la reproducibilidad de las mediciones. Como
resultado, se confirmó que la concentración de medulasina humana
medida en las muestras de sangre produjo unos datos cuya
reproducibilidad no siempre puede describirse como buena, como se
muestra en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras de sangre que se habían tomado,
respectivamente, de un individuo normal y de un paciente que padece
esclerosis múltiple y que se habían congelado para su conservación
se descongelaron devolviéndolas a temperatura ambiente. Se tomaron
10 \mul y se añadieron a 2 ml de agua destilada que contenía
bromuro de dodeciltrimetilamonio al 0,01% y se mezclaron de manera
adecuada utilizando un mezclador Voltex para obtener disoluciones de
muestra. Entonces se añadieron 10 \mul de éstas a tubos de ensayo
y se diluyó mediante la adición de 40 \mul de una disolución de
PBS (pH 7,4) que contenía BSA al 2%. Después, se añadió una esfera
con anticuerpo monoclonal antimedulasina humana de ratón
inmovilizado sobre ella (3F03) y 350 \mul de una disolución de PBS
que contenía BSA al 2% y que contenía anticuerpo antimedulasina
humana de ratón marcado con HRP (2E04) a una concentración de 0,2
\mug/ml a cada tubo de ensayo, seguido de una incubación a una
temperatura de 37ºC durante 30 minutos. Después se realizó un
lavado, la reacción enzimática y se terminó la reacción exactamente
mediante las mismas operaciones que en la preparación de las curvas
de calibración descritas anteriormente. Entonces se midió la
absorbancia a una longitud de onda de 420 nm utilizando un
espectrofotómetro, y se determinó la concentración de medulasina
humana a partir de la curva de calibración. Las operaciones de
medición, comenzando desde el tratamiento de dilución de la
muestra, se repitieron para cada uno 5 veces para estudiar la
reproducibilidad de las mediciones. Como resultado, se confirmó que
la concentración de medulasina humana medida en las muestras de
sangre mostró una reproducibilidad extremadamente buena, como se
muestra en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
2
Muestras de sangre que se habían tomado,
respectivamente, de un individuo normal y de un paciente que padece
esclerosis múltiple y que se habían congelado para su conservación
se descongelaron devolviéndolas a temperatura ambiente. Se tomaron
10 \mul y se añadieron a 2 ml de una disolución de PBS (pH 7,4) y
se mezclaron de manera uniforme para obtener una disolución de
muestra. Entonces se añadieron 10 \mul de ésta a tubos de ensayo
y se diluyó mediante la adición de 40 \mul de una disolución de
PBS (pH 7,4) que contenía BSA al 2%. Después, se añadió una esfera
con anticuerpo monoclonal antimedulasina humana de ratón
inmovilizado sobre ella (3F03) y 350 \mul de una disolución de
PBS que contenía BSA al 2% y que contenía anticuerpo monoclonal
antimedulasina humana de ratón marcado con HRP (2E04) a una
concentración de 0,2 \mug/ml a cada tubo de ensayo, seguido de
una incubación a una temperatura de 37ºC durante 30 minutos. Después
se realizó un lavado, la reacción enzimática y se terminó la
reacción exactamente mediante las mismas operaciones que en la
preparación de las curvas de calibración descritas anteriormente.
Entonces se midió la absorbancia a una longitud de onda de 420 nm
utilizando un espectrofotómetro, y se determinaron las
concentraciones de medulasina humana a partir de la curva de
calibración. Las operaciones de medición, comenzando desde el
tratamiento de dilución de la muestra, se repitieron para cada uno
5 veces para estudiar la reproducibilidad de las mediciones. Como
resultado, se confirmó que la concentración de medulasina humana
medida en las muestras de sangre produjo unos datos cuya
reproducibilidad no puede describirse como buena, como se muestra en
la
tabla 4.
tabla 4.
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Muestras de sangre que se habían tomado,
respectivamente, de un individuo normal, de un paciente que padece
esclerosis múltiple, y de un paciente que padece una enfermedad
nerviosa no inflamatoria y que se habían congelado para su
conservación se descongelaron devolviéndolas a temperatura ambiente.
Se tomaron 10 \mul y se añadieron a 2 ml de agua destilada
(presión osmótica = 0 mmol/l\cdotH_{2}O [0
mOsm/kg\cdotH_{2}O]) y se mezclaron de manera adecuada
utilizando un mezclador Voltex para obtener disoluciones de muestra.
Entonces se añadieron 10 \mul de éstas a tubos de ensayo y se
diluyó mediante la adición de 390 \mul de una disolución de PBS
(pH 7,4) que contenía BSA al 2%. Después, se añadió una esfera con
anticuerpo monoclonal antimedulasina humana de ratón inmovilizado
sobre ella (3F03) a cada tubo de ensayo, seguido de una incubación a
una temperatura de 37ºC durante 30 minutos. Después de la
eliminación de las disoluciones en los tubos de ensayo mediante
aspiración se lavaron con disolución salina fisiológica. Los tubos
de ensayo entonces se rellenaron con 400 \mul de una disolución
de PBS que contenía BSA al 2% y que contenía anticuerpo monoclonal
antimedulasina humana de ratón marcado con HRP (2E04) a una
concentración de 0,2 \mug/ml, seguido de una incubación a una
temperatura de 37ºC durante 30 minutos. Después se realizó un
lavado, la reacción enzimática y se terminó la reacción exactamente
mediante las mismas operaciones que en la preparación de las curvas
de calibración descritas anteriormente. Entonces se midió la
absorbancia a una longitud de onda de 420 nm utilizando un
espectrofotómetro, y se determinaron las concentraciones de
medulasina humana a partir de la curva de calibración.
Se calcularon los valores de medulasina humana
(\mug/10^{8} granulocitos) que muestran la cantidad de
medulasina en 10^{8} granulocitos a partir de la concentración de
medulasina humana y se midió el número de granulocitos utilizando
cada muestra de sangre, y se muestran en la figura 3.
La figura 3 muestra una comparación de los
valores de medulasina respectivos para individuos normales,
pacientes con esclerosis múltiple, y pacientes que padecen
enfermedades nerviosas no inflamatorias. Los siguientes resultados
se obtienen a partir de la figura.
- Pacientes con esclerosis múltiple: 355 \pm
117 (n = 112)
- Pacientes con enfermedad nerviosa no
inflamatoria: 233 \pm 66 (n = 80)
- Individuos normales: 213 \pm 34 (n = 25)
Estos resultados se compararon con un valor de
corte (281 \mug/10^{8} granulocitos) y se clasificaron como
positivos o negativos. Los valores de cada uno y los porcentajes
positivos se muestran en la tabla 5.
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A partir de los anteriores resultados, se
observa que el diagnóstico de la esclerosis múltiple según el valor
de la medulasina en la sangre es un método de diagnóstico de alta
fiabilidad. Además, los siguientes resultados se obtuvieron después
de clasificar los niveles de los valores de medulasina para
pacientes con esclerosis múltiple según fueran hombres o mujeres
(véase la figura 4) y según sus diferentes edades (véase la figura
5).
\vskip1.000000\baselineskip
- Pacientes con esclerosis múltiple:
- \cdot
- Mujeres: 351 \pm 107 (n = 78)
- \cdot
- Hombres: 367 \pm 143 (n = 34)
- Individuos normales: 214 \pm 34 (n = 24)
- Valor de corte: 281 (\mug/10^{8}
granulocitos)
\newpage
- Pacientes con esclerosis múltiple:
- \cdot
- 10-19: 421 \pm 154 (n = 9)
- \cdot
- 20-29: 329 \pm 94 (n = 26)
- \cdot
- 30-39: 357 \pm 104 (n = 30)
- \cdot
- 40-49: 330 \pm 157 (n = 17)
- \cdot
- 50 y mayores: 375 \pm 125 (n = 21)
- Individuos normales: 213 \pm 34 (n = 25)
- Valor de corte: 281 (\mug/10^{8}
granulocitos)
Estos resultados muestran que no se observa
diferencia entre hombres y mujeres y que no se observa diferencia
con la edad.
Con la invención, tal como se describió
anteriormente, es posible medir inmunológicamente el contenido en
medulasina humana en una muestra de sangre de forma precisa y con
una buena reproducibilidad. Ademas, puede realizarse el diagnóstico
de la aparición de la esclerosis múltiple, o del alcance o estado de
la enfermedad, mediante un diagnóstico de sangre para detectar
enfermedades inflamatorias crónicas, en particular la esclerosis
múltiple, utilizando el valor medido del contenido en medulasina
humana en la sangre.
Claims (12)
1. Un método para medir inmunológicamente el
contenido en medulasina humana en sangre, que se caracteriza
por las siguientes etapas (a) y (b):
(a) una etapa de romper los leucocitos en una
muestra de sangre, poniendo en contacto dicha muestra de sangre con
los siguientes líquidos acuosos (i) o (ii) o con una mezcla de los
líquidos acuosos (i) y (ii):
(i) un líquido acuoso, que contiene 0,05% mol o
más, o 0,005% mol o menos de un soluto, que tiene una presión
osmótica de 250 mmol/l\cdotH_{2}O (250 mOsm/kg\cdotH_{2}O) o
menor, o un líquido acuoso que tiene una presión osmótica de 310
mmol/l\cdotH_{2}O (310 mOsm/kg\cdotH_{2}O) o mayor;
(ii) un líquido acuoso, en el que dicho líquido
acuoso (ii) es una disolución acuosa de un tensioactivo; y
(b) determinar inmunológicamente el contenido en
medulasina humana en dicha muestra de sangre mediante un método que
comprende poner en contacto la muestra de sangre que contiene dicha
medulasina humana liberada de los leucocitos rotos en dicha etapa
(a) con un anticuerpo monoclonal antimedulasina humana inmovilizado
sobre un vehículo insoluble en presencia de un anticuerpo monoclonal
antimedulasina humana marcado para formar un complejo de
"sandwich", y capturar la medulasina humana sobre un complejo
inmunológico marcado mediante una reacción de
antígeno-anticuerpo, y después determinar la
cantidad de actividad del material marcador en dicho complejo.
2. El método para medir inmunológicamente el
contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1,
en el que dicho líquido acuoso (i) es un tampón y/o agua destilada
que pueden incluir un disolvente orgánico soluble en agua.
3. El método para medir inmunológicamente el
contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1,
en el que dicho líquido acuoso (i) es una disolución acuosa que
contiene una sustancia soluble en agua seleccionada del grupo que
consiste en sustancias formadas por sales de ácidos inorgánicos,
sales de ácidos orgánicos, azúcares, alcoholes de azúcares,
aminoácidos y proteínas.
4. El método para medir inmunológicamente el
contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1,
en el que la cantidad de dicho líquido acuoso (i) utilizada es de 50
a 100000 veces la de la muestra de sangre en términos de unidades
de volumen.
5. El método para medir inmunológicamente el
contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1,
en el que dicho líquido acuoso (ii) es una disolución acuosa de al
menos un tipo de tensioactivo seleccionado del grupo que consiste
en sales de ácido graso superior, sulfonatos de alquilarilo,
sulfonatos de alquilo, sales de éster de sulfato de alquilo, sales
de alquilpiridinio, sales de alquiltrimetilamonio, polioxietilén
alquilfenil éteres, polioxietilén alquil éteres, ésteres de ácido
graso de polioxietilensorbitán, y alquilbetaínas.
6. El método para medir inmunológicamente el
contenido en medulasina humana en sangre según la reivindicación 1,
en el que la cantidad de dicho líquido acuoso (ii) utilizada es de
50 a 100000 veces la de la muestra de sangre en términos de
unidades de volumen.
7. Un método para diagnosticar la esclerosis
múltiple, que se caracteriza porque incluye las siguientes
etapas (a), (b) y (c):
(a) una etapa de romper los leucocitos en una
muestra de sangre, poniendo en contacto dicha muestra de sangre con
los siguientes líquidos acuosos (i) o (ii) o con una mezcla de los
líquidos acuosos (i) y (ii):
(i) un líquido acuoso, que contiene 0,05% mol o
más, o 0,005% mol o menos de un soluto, que tiene una presión
osmótica de 250 mmol/l\cdotH_{2}O (250 mOsm/kg\cdotH_{2}O) o
menor, o un líquido acuoso que tiene una presión osmótica de 310
mmol/l\cdotH_{2}O (310 mOsm/kg\cdotH_{2}O) o mayor;
(ii) un líquido acuoso, en el que dicho líquido
acuoso (ii) es una disolución acuosa de un tensioactivo; y
(b) determinar inmunológicamente la cantidad de
medulasina humana liberada hacia dicha muestra de sangre desde los
leucocitos rotos en dicha etapa (a) utilizando un anticuerpo
antimedulasina humana; y
(c) observar el tamaño y/o los cambios en el
contenido en medulasina humana en la sangre obtenida en dicha etapa
(b).
8. El método para diagnosticar la esclerosis
múltiple según la reivindicación 7, en el que al menos uno de
dichos anticuerpos antimedulasina humana es un anticuerpo monoclonal
antimedulasina humana.
9. El método para diagnosticar la esclerosis
múltiple según la reivindicación 7, en el que dicho líquido acuoso
(i) es una disolución tampón y/o agua destilada que puede incluir un
disolvente orgánico soluble en agua.
10. El método para diagnosticar la esclerosis
múltiple según la reivindicación 7, en el que la cantidad de dicho
líquido acuoso (i) utilizada es de 50 a 100000 veces la de la
muestra de sangre en términos de unidades de volumen.
11. El método para diagnosticar la esclerosis
múltiple según la reivindicación 7, en el que la cantidad de dicho
líquido acuoso (ii) utilizada es de 50 a 100000 veces la de la
muestra de sangre en términos de unidades de volumen.
12. El método para diagnosticar la esclerosis
múltiple según la reivindicación 7, en el que dicha etapa (b) para
determinar inmunológicamente el contenido en medulasina humana en
dicha muestra de sangre comprende poner en contacto la muestra de
sangre que contiene dicha medulasina humana liberada desde los
leucocitos rotos en dicha etapa (a) con un anticuerpo
antimedulasina humana inmovilizado sobre un vehículo insoluble en
presencia de un anticuerpo antimedulasina humana marcado para
formar un complejo de "sandwich" mediante una reacción de
antígeno-anticuerpo, y después determinar la
cantidad de marcador en dicho complejo.
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