JPS5942397A - モノクロ−ナルＩｇＭ抗体及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体、例えばＩｇＧモノクローナル抗体
は一般的に知られている。モノクローナルＩｇＭ抗体は
、例えば特別の血清学的標識の決定において有用である
。例えば、ウィルス感染症（例、単純ヘルペスウィルス
）の診断において、特定のＩｇＭ免疫グロブリンの抗体
の存在は患者が最近急性或いは原発性感染症を経験した
ことを示すのに対し、ＩｇＧクラスの抗体は回復期成い
は再発感染症における血液中に特性的に観察されるもの
である。この様に、ＩｇＭ抗体を検出する方法は望まし
いものである。

本発明は、広＜ＩｇＭモノクローナル抗体、より詳しく
はＩｇＭモノクローナルウィルス抗体、それらの製法及
びこれらのモノクローナルＩｇＭ抗体ヲ用いた診断技術
に向けられたものであるが、本発明は特に単純ヘルペス
ウィルス類に対するモノクローナル抗体に向けられたも
のである。

（１１） ヒトに感染症を引き起こす単純ヘルペスウィルス類（Ｈ
８Ｖ　）は、主として口の病気、角膜炎及び脳炎を起こ
す単純ヘルペスウィルスタイプ１（Ｈ８ＶＩ）及び主と
して性器の病気及び新生児に生命をおびやかす病気を引
き起こす単純ヘルペスウィルスタイプ２（）（ＳＶ２）
である。

性器の（Ｈ８Ｖ　）感染症は主としてＨ８Ｖ　２により
起こされる力瓢しかし、Ｈ８ＶＩも又性病を引き起こす
ことが可能なものである。ヘルペスは最も普通に性的に
伝染される病気の一つであると考えられている。

初期のＨ８Ｖ感染症はしばしば小さな水泡状びらんの形
態を取り、潰瘍にまで進む可能性のある中程度乃至激し
い痛みの伴う病巣により特徴付ゆられる。初期の感染は
又吐気、頭痛及び熱を伴うこともある。Ｈ８Ｖ感染症は
宿主内に潜在的に残り、しばしば再発感染症を引き起こ
す。感染した個人の５０％は再発の経験を有するのに対
し、他方５０ｑ６は有さない。現在においてＨ８Ｖ感染
症の如何なるものに対しても有効な治療はない。

（１２） 米国における性病のＨ８Ｖ感染症を有する個人の数は５
００万〜４０００万と推定されているが、２０００万が
最も通常に引用される数である。更に、毎年はぼ（ト）
万〜閣万がＨ８Ｖ　２に感染していると推定されている
。

Ｈ８Ｖ感染症は通常成人に対してはこれを無能にするよ
うなものではない。しかしながら、胎児及び新生幼児の
Ｈ８Ｖ感染症は高い死亡率及び後遺症を伴う激しい病気
である。

性病のＨ８Ｖ感染症は、病巣の外観、ＰＡＰ或いはツア
ンク（Ｔｚａｎｃｋ）スミア、直接或いは間接免疫蛍光
検定法或いは組織培養におけるウィルス感染性により示
される細胞形態により通常は診断されている。ヘルペス
病巣の大多数は病巣の外観のみに基づいて医者或いは検
査技師により診断されている。

生殖器の病巣がＨ８Ｖにより引き起こされたものである
かどうかを決定することは困難である。女性におけるヘ
ルペス感染症を診断するのは特性的な水泡がしばしば壊
れ、その他の型の性病の病巣の多くと同様な外観を呈す
る潰瘍状の病巣になるので特に困難である。

性病ヘルペスを診断するために、ツアンク（Ｔｚａｎｃ
ｋ）スミアがしばしば使用されている。しかしながら、
多数の偽の陰性者が得られる可能性がある。両方の組織
学的調剤（ツアンク或いはＰＡ、Ｐスミア）は訓練され
た病理学者により解釈されなければならない。しかしな
がら、その場合においても、内部の陰性結果が２０％の
確率で存在する。

直接或いは間接免疫蛍光法は、感染細胞におけるＨ８Ｖ
抗原の存在を検出するものである。Ｈ８Ｖ抗原を検出す
る能力は主として試料の品質に応じて異る。従って、こ
の試験は陰性の結果が得られる場合には常に読み取り及
び解釈することが困難であり、確認のために組繊細胞培
養が試料で接種されるべきである。

現在において、Ｈ８■感染症を診断する唯一の確実な方
法は試料を組繊細胞培養において生育することによるも
のである。その場合には、特異的抗体による抗原の中和
、或いはフルオレセインイソチオシアネートで標識化さ
れた特異性抗体を使用する’Ｈ８Ｖウィルス抗原の表示
などによる免疫学的方法による確実な同定が達成される
。これが、試験のコスト及び時間が考慮されない場合に
はＨ８Ｖ同定のおそらく壷も普通の方法である。

従って、特異性が高く、極めて感度がよく、迅速に行わ
れることが出来（現在の２〜１０日間よりはるかに速＜
）、且つ合理的コストで利用可能な性病のＨ３Ｖ感染症
の同定のための選択的な診断試験法を有することは極め
て望ましいことである。

その様な試験は妊娠女性のスクリーニング及びモニター
リング、再発感染症を有する）（ＳＶ感染人口の診断、
新症例の診断及びヘルペス様感染症を有する個人のスク
リーニングにおいて極めて有用であろう。

各種読み出し様式を用いる免疫検定法が従来技術におい
て説明されている。読み出しの容易性及びオペレーター
に必要とされる熟練度の水準を含む多くの理由により蛍
光或いは放射性標識或いはラベルも又しばしば使用され
るが、酵素免疫検定（１５） 法がしばしば選ばれる方法である。

トリ“スマン等［：　Ｄｒｅｅｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ。

１２　：　１１５〜１１９　（１９７９）］はＨ８Ｖ　
１及びＨ８Ｖ　２　ノ両者に対して型特異性抗体を測定
するＨ８Ｖのための同相ラジオイムノアッセイを記載し
ている。

ホリンガー等ＣＨａｌｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１０７　：　Ｎ１９９　（１９７９）１はへノぞチチス
Ｂ表面抗原を検出するための固相ラジオイム／アッセイ
を記載している。

ヘベイ等［Ｔ（ｅｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許４，
２２８，２３７号明細書〕は、リガンド（例、抗原）を
検出するために酵素標識されたアビジン及びビオチン標
識された試薬（例、抗体）を用いる不溶性相酵素免疫検
定法を記載している。

ノソリス（Ｐａｒｉｔｈ、米国特許４　、２９８　、６
８５号）はビオチン−アビジン系を用いてアビ、ジンを
固定することによりビオチン標識された競争的反応生成
物を析出する不溶性相を形成することにより抗原を検出
する診断系を記載している。

ゲスＰン等［Ｇｕｅｓｄｏｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｈ
ｉｓｔｏｅｈｅｍ、　＆（１６） Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　２７　：　１１３１　（１７９
７）１は、免疫検定法においてビオチン標識抗体の使用
後にアビジン標識酵素を使用することを記載している。

この文献は又同様にビオチン標識抗体とビオチン標識酵
素間の結合剤としてのアビジンの使用を記載している。

バイエル等ＣＢａｙｅｒ　ａｔ　ａｔ、、　１９７８年
１】月ＴＩＢＳｐｐ、　Ｎ２５７−Ｎ２５２及びＢａｙ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ１９
７６年１０月Ｖｏｗ、６８、ＮＱ２〕は微生物学におけ
るアビジン−ビオチン複合体を論じている。

リング等［Ｗａｎｄｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｉｎ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍ
ｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｖｃｅ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　Ｖｏｌ
、７８、ｐｐ。

１２１４−１２１８　（１９８１）及び米国特許４，２
７１，１４５号明細書〕は、へ／ＲチチスＢウィルスの
免疫診断における高親和性ＩｇＭモノクローナル抗体の
使用を記載している。

カプロスキー等［Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｔ、、
米国特許４．１９６，２６５号明細書〕はウィルス抗体
の製造法にむけられたものである。

ヨーロツ・に特許用ＩＦ、ｍ　Ｏ，０４４，４４１号明
細書は薬品用のモノクローナル抗体に向けられたもので
ある。

ランス等（Ｗａｎｄｓ　ｅｔ　ａｔ、、米国特許４，２
７１，１４５号明細書〕はへパチチスウイルス用モノク
ローナル抗体に向けられたものである。

ウィズダムＣ，Ｗｉｓｄｏｍ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ
、、　Ｖｏｌ、　２２、ｐｐ。

１２４３−１２５５　（１９７６）’）　　及びヨルケ
ン（Ｙｏｌｋｅｎ。

Ｒａｖ、１．ｎｆｅｃｔ、Ｐｉｓｅａｇｅｓ、　４　：
　３５〜６８、（１９８２））は総説記事において酵素
免疫検定法を論じている。

シュールス（５ｅｈｕｕｒｓ　）及び共同研究者によっ
て多くの酵素免疫検定法が米国特許３，６５４，０９０
号、同３．７９１．９３２号、同３．８５０．７５２号
、同３，８３９，１５３号、同３，８７９，２６２号、
同４，０１６，０４３号及び再発行特許２９　、１６９
号各明細書に開示されている。

Ｈ８Ｖ　１及びＨ８Ｖ　２を特性化するための多価抗血
清の使用は２種のウィルスの血清タイプ間に広範な血清
学的交差反応を示した。１つのＨ８Ｖタイプに対して産
生された超免疫血清は程度は少ないにせよ異形のタイプ
を一般的に中和する。高感度ラジオイム／アッセイ及び
実験的に産生された単一特異性抗血清を用いてタイプ−
共通性及びタイプ−特異性Ｈ８Ｖ抗原決定基の両者が示
された。モノクローナル抗体を製造する方法の必然によ
り、単一抗原部位として存在する特異性決定基が特徴付
けられ、抗原の決定を容易にする。Ｈ８Ｖ−暗号組み込
み蛋白質に対するある種のモノクローナル抗体について
記載され、タイプ−共通性及びタイプ−特異性Ｈ８Ｖ−
抗原決定基が検出されている。しかしながら、本発明の
以前に、１Ｆ（ＳＶに対するモノクローナルＩｇＭ抗体
は知られていなかったものと思われる。

本発明は、モノクローナルＩｇＭ抗体、好ましくはウィ
ルス抗体（例、ＩｇＭウィルス／抗原タイプ−共通性及
びタイシー特異性Ｈ８Ｖ抗体）の製法及びモノクローナ
ルＩｇＭ抗原特異性抗体及び読み出し可能に標識化され
た、好ましくはピオチン−アビジンに基づいた検出計を
用いる改良された免疫検定技術による生物学的流体中の
抗原或いは抗−抗原ＩｇＭ免疫グロブリンの検出法に関
する。

本発明の１つの側面に従えば、抗原（例、単純ヘルペス
ウィルス抗原）に対する高度に特異性のＩｇＭモノクロ
ーナル抗体を構成し、分泌するハイブリｒ−マ細胞系統
が確立される。第１段階として、動物のりンノで球が特
別の免疫化経路及び計画に従って予め選ばれた（例、Ｈ
８Ｖ）抗原に対するモノクローナル抗体を産生ずるリン
）１１球を発育させる。これらのリンパ球を回収し、同
一の動物種から得られたミニシーマ（骨髄腫）細胞と融
合させ、体細胞ハイブリツｒを形成する。この細胞ノ蔦
イブリッドを次いで組織培養液中において或いは同系の
動物において抗原に対する抗体を連続的に産生ずるため
に不特定期間増殖される。

本発明の方法において、動物リンパ球は精製された抗原
（例、Ｈ８Ｖ　１或いはＨ８Ｖ２）により１ｎｖｉｖｏ
において刺戟（免疫化）される。精製抗原の投与の経路
及び計画は色々変えて行うことができる。現在好ましい
投与様式は抗原を好ましくはアジュバント例えば完全７
０インドア・ツユバント中において２回に分けて腹腔内
に投与することよりなるものである。融合２．３日以内
にマウスは同様に投与されるブースターを注射される。

ミエローマ細胞との融合はそれらがチミジンキナー−１
２（ＴＫ）のような酵素を欠くことによりヒポキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ　）或いはヒポ
キサンチンーグアニンホスホリぎシルトランス７エ２−
ゼ（ＨＧＰＲＴ　）に感受性を有するミニ算−マ細胞を
用いて行われる。これによりＨＡＴ培地中において生育
を伴うハイブリッドの選択が可能になる。細胞融合のた
めに利用されるミエローマ細胞系統はコーラ−等［Ｋｏ
ｈｌｓｒ　ａｔ　ａｔ、。

Ｔｈｒ、　Ｊ、Ｉｒｒｒｎｕｎｏｌ、、　Ｖｏｌ、　６
、Ｔｌ１）、　２９２−２９５（１９７６））により鱈
己載されるＢＡＬＢ／ｃマウスＭＯＰＣ２１ミエローマ
より得られる。このミエローマ細胞系統はＰ　３−　Ｎ
Ｓ　−１／Ａｇ　４−１と呼ばれる。その様な細胞はか
μｇ／ｍ１　の８−アザグアニンに耐性を有し、ヒダキ
サンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）を含有
する培地中において死亡する。このミエローマ細胞はグ
ルコース、グルタミン及びウシ胎児血清及び任意にペニ
シリン及びストレプトマイシンを補給することのできる
適当な細胞生育培地中において生育される。その他のマ
ウス系統も又融合に利用することができる。融合はリン
ノぞ球の懸濁液を生育培地中においてミエローマ細胞に
添加し、遠心分離してペレットを形成することにより行
われる。これらの細胞は、次いで融合剤例えばポリエチ
レングリコールを含有する生育培地中においてインキュ
ベートされる。融合を行う適当な技術は例えばコーラ−
等［Ｋｏｈｌｒｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｆｏｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　Ｖｏｌ、　６、ｐ
ｐ、　５１１−５１６（１９７６）〕或いはゲッター等
（Ｇｅｆｔ５ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃ
ｅ１ｌＧｅｎｓｔ、、　Ｖａｔ、　３．２３１−２３６
　（１９７７））において説明されている。及びケネッ
ト〔ゝＷａｎ）１６ｔｔ　Ｍｏｎｏｅｌｏ−ｎａｌ　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’　）Ｖｙｂｒｉｄｏｍａｓ　［生
物学的分析における新らたな次元Ｊ　（Ａ　ｎｅｗ　ｄ
ｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎａ
ｌｙｓｉｓ　’）　Ｋｓｎｎａｔ　ａｔ　ａｔ、、　ａ
ｄｓ、、　Ｐｌｅｎｕｍ、　Ｎ、Ｙ、、　ｐｎ。

３６５−３７５　（１９８０））　　に説明されている
。

所定の（例、ウィルスの）抗原にむけられた抗体を合成
し分泌するノ・イブリＰ−マを培養して比較的安定な遺
伝構成を有する連続的に増殖する細胞系統を確立する。

この細胞系統のクローニングを行い、各系統からの個々
の細胞の子孫を与える。

この細胞系統或いはクローンは細胞培養液或いはｉｎ　
ｖｌｖｏ　　においてそれらが所定の抗原に対して抗体
を合成及び分泌し続ける同系の宿主中において無限に増
殖される。抗体を次いで組織培養細胞或いは組織適合性
宿主動物の腹水或いは血清から通常の沈澱、イオン交換
、脂肪或いは親、相性クロマトグラフィーなどにより回
収する。この様に、本発明の好ましいモノクローナル抗
体の製造方法は宿主動物に特定の抗原（例、単純ヘルペ
スウィルス抗原）の複数の抗原で接種により免疫化を行
い、最終抗体刺戟ブースター接種を免疫化後少なくとも
３週間後且つ宿主動物からのリン、ｅ球細胞除去前に与
え、抗体を産生ずるリン・ぞ球細胞を宿主動物から回収
し、該リン、ｅ球細胞をミエローマ細胞に融合すること
により細胞ハイブリッドを形成し、抗−所定抗原（例、
抗−単純ヘルペス）特異性ＩｇＭ抗体を産生ずるハイブ
リツＰ細胞を選択し、該ハイゾリツＰを培養し、所定の
抗原（例、単純ヘルペスウィルス１（対する１ｇＭタイ
プ−共通、タイプ１特異性或いはタイプ２特異性抗体）
を集めることよりなるものである。好ましくは、宿主動
物はマウスである。又、好ましい実施態様においてブー
スター接種は抗原を好ましくはアジュバント内において
腹腔内投与により行われるが、現在好ましいアジュバン
トは完全フロイントアジュノマントである。

本発明により得られるハイブリドーマはＩｇＭ抗体を産
生ずる能力を有する。１．Ｂ、１と称される細胞系統の
寄託はＡＴＣＣにおいて行われ、Ａ’ｌ’ＣＣ番号ＨＢ
　８１４８が与えられている。１８．Ｂ、２と称される
細胞系統の寄託はＡＴＣＣにおいて行われ、ＡＴＣＣ番
号ＨＢ　８１４９が与えられている。

ＡＴＣＣに寄託された細胞系統 特性化　　　　　　融合細胞 名称 Ｍ、１８６．１８．Ｂ、２　　　　　ＡＴＣＣＨＢ　８
１４８Ｍ、１８６．１．　Ｂ、Ｉ　　　　　ＡＴＣＣＨ
Ｅ　８１４９例１ 本例は本発明において有用なＨ８Ｖに対するモノクロー
ナル抗体が下記の如くして調製することができることを
例示するものである： 免疫化抗原の調製 アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞、倍数上皮ヒ
ト肺（ＭＢＣ−５）及びヒト上皮様ガン細胞（Ｔ（ｅＰ
　−２）を１０チのウシ胎児血清（Ｆｅ２）を補給され
たＤｕ　１ｂｅ　ｃｅｏの最小必須培地（ＤＭＥＭ　）
を用いて単層培養として増殖させた。以下に説明する如
く生成されたＭＳ−１ミエローマ細胞及びハイブリッド
細胞は２０％ＦＣ８を有するＤＭＥＭ中において生育さ
れた。Ｈ８ＶＩ（菌株ＫＯ８）及びＨ８Ｖ　２（菌株Ｍ
　１８６　）のウィルス原料の調製及び滴定を行うため
に用いられた方法は色々な文献に説明されている〔コー
トニー等（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ、　５２　：　４４７−４５５　（１９７３
））。

Ｈ８Ｖウィルス粒子は、前記の如くポリエチレングリコ
ール沈澱及び蔗糖勾配遠心分離により精製された〔Ｐリ
ースマン等、Ｖｉｒｏｌｏｇ）’　、　５０　：　５２
８−５３４　（１９７２））。ＶＰ１１９グリコプロテ
ィンはコートニー等［Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｖｉｒｏｌ、、　６２　：　５３９−５５１（１９
７４）：１　　に詳細に説明されている方法によりＨ８
Ｖ　２感染ＨｓＰ　−２細胞から精製された。

１、　　ミエローマ細胞系統の維持 試薬 １．８−アザグアニン或いは６チオグアニン耐性マウス
ミエローマ細胞。使用された細胞系統はＩＪ元ｋ　ＢＡ
ＬＢ／ｃ腫瘍、ＭＯＰＣ２１から得られたＰ、−Ｎ８−
１／Ａｇ４−１　　であった。この細胞系統はカッ・ｅ
ｔ鎖のみを分泌する。

２、　　Ｇｉｂｃｏ社製Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　の最小必須
培地（ＤＭＥＭ）４．５ｇ／ｉｔグルコース０．２Ｍグ
ルタミン富化。

３、　７．５　％　ＮａＨＣＯ３゜ ４、ウシ胎児血清（Ｆｅ２）。ミエローマ細胞に対して
非毒性であるロットを選ばなければならな（１゜ ５、Ｓｉｇｍａ社製ピルビン酸ナトリウム。

６、Ｓｉｇｍａ社製８アザグアニン（８−ＡＧ　）。

７　　Ｓｉｇｍａ社製６チオグアニン（６−ＴＧ　）。

（乙ｌ　） ８．７５ａＲ２，１５Ｑｃｍ２細胞培養フラスコ。

９、血球針及びＯ，’２　％　Ｔｒｙｐａｎ　Ｂｌｕｅ
溶液の調製： 全ての溶液は無菌的に調製されなければならず、無菌性
の試験を行わなければならない。

４００　ｍ　ＤＭＥＭ　　　５　〃Ｉ＆　／ＭＨ２０２
７Ｗ　Ａｎｔｉ　Ｈ２ＯｐＨ７，２ ６０ｍＡＦＣ８ １００Ｘ　６−　ＴＧ　２５０１ｔｔｒ／ｍｌ　Ｈ２Ｏ
を結晶が溶解するまで０、　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨでｐＨを
調製する。

注：ヒＩキサンチン−グアニンホスホリゾジルトランス
フェラーゼ（）（ＧＰＲＴ　）陽性細胞が徐々に蓄積す
るためにミエローマ細胞は時々（３×１年）８−　ＡＧ
及び／又は６−　ＴＧで処理されるべきである。単に８
−ＡＧ或いは６−　ＴＧ浴溶液生育培地に（２８） 添加し、これらの代謝前の存在下において細胞を生育す
る。これらの細胞はこれらの薬品の残存レベルの存在の
可能性があるために処理後５〜６継代の間融台に使用さ
れるべきでない。

操作方法： ミエローマ細胞は対数増殖を確実にするために２〜３Ｘ
１０５及びＩＸｌ、０６細胞／ｒｒｔｅの間に維持され
なければならない。通常細胞は、隔日毎に１＝３の分裂
を行うが、上記範囲に密度を維持するために細胞数の勘
定は毎週行わなければならない。

これらの細胞は３７℃、９５係湿度及び５〜７％ＣＯ２
を必要とする。

参考文献： クルーシズ（ＫｒｕｆＩｅｓ）、Ｐ、Ｆ’、、パターソ
ン（Ｐａｔｔｅｒ−ｓｏｎ）、Ｍ、に、、　「細胞培養
方法及び応用Ｊ　（Ｔｌ　５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　）
　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎ、Ｙ、、　１９７７、　ｐ、４７５−４７９　）。

■、動物の免疫化 試薬： １、　　Ｄｉｆｃｏ社製完全フロインドア・シュパント
（ＣＦＡ）。

２、精製抗原。

３．無菌０．９係塩水。

４、　　Ｈａｍｉｌｔｏｎ社製加ゲージ針を有する２　
−５ｃｃルアーロック（ｌｕｅｒ−１ｏｋ）ガラス注射
器。

５．１０〜１５週令メスＢＡＬＢ／ｃ　？ウス。

操作方法： １、抗原を無菌塩水で０．５　ｍ９−１．ＯｍＩ？／　
ｍＡに希釈する。

２、等容の抗原及びＣＦＡをガラス注射器内で混合する
ことにより抗原−アシュパントエマル、クヨンを調製す
る。

３、マウス当す０．１酩のエマルジョン（２５〜５０μ
ｇ）を腹腔内（ＩＰ）経路により注射する。

４．３週間後に工程２を繰り返す。

５、細胞融合２−３日前に、マウスに０．１ｍｇのＣＦ
Ａ中の１ｏｋｇの抗原をＩＰ注射する。

注二血液試料は第２回のブースト後に取り出して特異性
抗体の試験を行うことができる。

参考文献： ベンナー（Ｂｅｎｎｅｒ）、　Ｒ，、Ｆ、メイツ（Ｍｅ
ｉｍｌ等　「骨髄における抗体形成（Ａｎｔｉｂｏｄｙ
　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗ）
Ｊ　［１：　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ２ｙ、　２７　：　７４
７　（１９７４）　’）。

■、細胞融合 試薬： １、抗原感作されたＢＡＬＢ／ｅマウス。

２、　　Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ社製ポリエチレングリコー
ル１０００３、　　　ＤＭＥＭ ４、　７，５％ＮａＨＣＯ３ ５、Ｓｉｇｍａ社製ピルビン酸ナトリウム６、　　Ｓｉ
ｇｍａ社製オグザロアセテート。晶７、Ｓｉｇｍａ社製
インシュリン ８、Ｓｉｇｍａ社製トランスフェリン ９、Ｓｉｇｍａ社製グルタチオン １０、　　ＢｉｏＲａｄ社製２−メルカプトエタノール
１１、ヒ？キサンチン、アミノゾテリン、チミジン（Ｈ
ＡＴ） １２、　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ　Ｉｎ
ｃ０社製Ｈｅｐｅｇ１３、　　ｐｔｓｈｅｒ社＆’（ジ
メチルスルホキシｒ）１４、Ｃｏ５ｔａｒ社製９６穴集
合皿 １５、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ （３１） １６．１個の無菌にんにくプレス １７、ウシ胎児血清（Ｆｅ２　） Ｈ２Ｏ中　　　　　Ｈ２Ｏ 無菌フィルター （３２） 無菌フィルター　　無菌フィルター ）征Ｍ−ＤＭＳＯ４０チＰＥＧ ９ｍ／ＤＭＥＭ　　　　　１　ｇ　ＰＥＧ　１０００１
　ｍｌ　ＤＭＳＯ１，５ｍ１３　ＤＭＥＭ−ＤＭＳＯ 無菌フィルター 注：細胞融合後ハイブリドーマ培地に５ｍｇの１００Ｘ
　ＨＡＴを補給する。ＨＡＴ中において２週間後に培地
に２週間１００　Ｘ　ＨＴを補給して残存アミノプテリ
ンを希釈する。

聯佃Ｍ−ＨＥＰＥＳ １００ＭＤＭＥＭ １　ｍｌ　Ｔ（ｅｐｅｓ ｍ１ＦＣ８ 細胞融合操作： １、マウスの調製 免疫化されたマウスを麻酔にかゆ、目を取り出すことに
より採血する。血液をシリコーン被覆したチューブに集
め、抗体の試験を行う。回収することのできる全ての血
液を採集後、尻尾と頭をかたくつかみ、迅速に引張るこ
とにより頚椎を分離する。このマウスを２０％−？タジ
ン溶液に５分間浸漬する。

２、肺臓細胞の調製 肺臓を無菌的にツーＰ下において取り出し、肺臓を１０
扉シのＤＭＥＭ−Ｉ（ａｐｅｓ　　を含有するω龍ペト
リ皿内に置く。肺臓を洗浄し、それを無菌にんにくプレ
ス中に置（。プレスをおだやかにしぼり、個々の肺臓細
胞を１０　ｍｌの新鮮なり■Ｍ−）Ｔａｐｅｓ　を有す
る新らたなｆ５０　Ｕ１ｍ１ｍベト中にしぼり出す。こ
の工程を白色の肺臓カプセルかにんにくプレス内に残存
するまで継続する。この細胞を円錐形の遠心管に移し、
大きな組織片を沈澱させる。細胞をもう一つの管に移し
、１０００　ｒｐｍ　に置いて５分間遠心分離する。上
澄液を除去し、ペレットを２ｍｌのＤＭＥＭ−Ｈｅｐｅ
ｓ　中に再懸濁させる。この細胞懸濁液を５ｍｌのＦｉ
ｃｏｌｌ−取ｐａｑｕｅ　頂部からおだやかに添加する
。２００Ｏｒｐｍ　で５分間遠心分離を行い、赤血球を
リンパ球から分離する。Ｆｉ　ｃｏｌ　１−ＤＭＥＭ界
面に濃縮した細胞を注意深く取り出す。細胞を３回ＦＣ
８を有さないＤＭＥＭで洗浄する。肺臓当９１〜２×１
０　細胞数。

３、　ミエローマ細胞の調製 １〜２Ｘ１０７個の中間対数相のミエローマ細胞（トリ
パンブルー排除により９０％以上の生育可能性）を遠心
分離により濃縮する。Ｆｅ２を含まないＤＭＥＭで３回
洗浄する。洗浄ミエローマ細胞を洗浄肺臓細胞に添加す
る。

４、細胞融合操作 肺臓／ミエローマ細胞混合物を遠心分離する。

上澄液を除去し、ペレットをおだやかに叩く。

０．２ｍｌの４０チＰＥＧを添加する。よく混ぜるが、
しかし激しくピペットで移さない。ＰＥＧが添加される
と直ぐに融合の時間測定を開始する。ＰＥＧは全部で８
分間細胞と接触し続けるべきである。細胞を１５０Ｏｒ
ｐｍで正確に３分間回転させる。ＰＥＧを細胞上に８分
間の時間が完結するまで放置する。

ＰＥＧを適当な時に除去し、細胞ペレットを叩いて細胞
をほぐす。５０　ｍｌの血清を有しないＤＭＥＭを添加
し、１０００　ｒｐｍで遠心分離を行う。上澄液を除去
し、細胞ペレットをほぐし、５０ｍ１のＨＡＴを有する
ハイブリドーマ培地を添加する。％大集合皿中にウェル
当り０．１ｍ１分配する。細胞をインキュベーター中に
置く。

参考文献： ガルフレ等［Ｇａ１ｆｒｅ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　２２６：　５５０（１９７７）） ｙ、特異性抗体産生培養液の選択 試薬及び操作： 特異性マウス抗体の検出の仕様を参照。

注：細胞融合後ＨＡＴ培地は９６穴集合皿中に植え付け
られた細胞の殆んどを殺す。若し親ミエローマ細胞が融
合前に８７ザグアニンで適当に処理されるならば融合後
に生育する唯一の細胞はハイブリドーマである。ハイブ
リドーマはスクリーニングに適当な密度に到達するには
１０〜１４日必要とする。

融合とスクリーニング間において細胞生育の産生状態に
よ−る色変化に示されるように新たなＨＡＴ培地による
数回の培地変更が必要である。細胞がスクリーニングに
十分な状態になったら、各培養液から１００μｌを固相
ＲＩＡ或いはＥＬＩＳＡにより試験用に（５０μ！×２
）取り出す。特異性抗体を産生ずる培養液を同定後細胞
を拡張のために冴穴集合皿に移し、同時にクローニング
のためにアリコートを取り出す。培養が十分な細胞数（
ＩＸＩＯ’）に生育した後に、Ｕ大の集合皿からの細胞
を凍結する。

■、クローニング 試薬： １、　　Ｓｅａｋｅｍアガロース（ＦＭＣ製）、３６℃
においてゲル化、９０”Ｃにおいて融解。

２、　８＠ａＰ１ａｑｕｅアガロース（ＦＭＣ製）、５
℃においてゲル化。ω℃において融解。

３、　　Ｓｉｇｍａ製のミドマイシンＣ４，３Ｔ３細胞
（Ｂａ１ｂ／ｅ繊維芽球系統）５、　　Ｃｏ５ｔａｒ社
製のＵ集合皿 ６、　　）Ｔａｎｋｓの平衡塩水溶液（ＨＢＳＳ　）　
（Ｇｌｂｃｏ社）７、トリジシン−ＥＤＴＡ ８、ミリＩワフィルター（０，ｎミクロン）溶液の調ｉ
Ｒ： ０．８５ｇ　ＮａＣｌ　　　　　　　０．８５ｇ　Ｎａ
Ｃ１１０ＯＮｄＨ１０まで適量　　　１００　ｄＨ２０
まで適量３Ｔ３培地　　　　　　　　ミドマイシンＣ４
００ｍｌＤＭＥＭ　　　　　　　　１００　ｍｌ　３　
Ｔ　３培地６０ｍ１　Ｆｅ２　　　　　　　　　　２．
５ｍ？ミドマイシンＣ２５ｍ１７．５　％　ＮａＨＣＯ
３無菌フィルター操作方法： １、供給細胞層の調製 ３Ｔ３繊維芽球細胞が融合後生育培地をミドマイシンＣ
（２５μｇ／Ｔｉｅ　）を含有する培地で４時間置換す
る。ミドマイシンを除去し、細胞を３回２０ｍＥＩ（Ｂ
ＳＳで洗浄する。１０　ｍｌのトリゾシンーＥＤＴＡ溶
液を添加する。細胞を遠心分離し、４８ｍ１の３Ｔ３培
地中に再懸濁する。４個の集合皿のウェル毎に細胞懸濁
液を０．５ｍｌ添加する。生育可能な細胞を皿に２時間
付着させる。培地を除去し、ハイツリドーマ生育培地で
原液を４倍に薄めた０、６％のＳｅ　ａＫｅｍアガロー
ス培地（１２ｍｇ　２．４　’Ｉｔ　ＳｅａＫｅｍ　＋
　３６ｍ１培地）を添加する。細胞を３７℃で一晩イン
キユペートする。

２、柔軟寒天クローニング 供給細胞層を調製後、陽性のハイブリドーマ培養液を０
．４　％の５ｅａＰ１ａｑｕｅ　　アガ四−ス（８ｍｌ
の２、４　％　５ｅａＰ１ａｑｕｅ　＋４０１１培地）
で１００細胞／１に希釈し、０．５ｄの細胞懸濁液を供
給細胞層を有する冴大の集合皿に添加する。プレート毎
に２個のハイブリドーマ培養をクローニングする（培養
液当り６瞬ｔ）。

３、クローンの採取 りローニング後１０〜１２日後柔軟寒天層中に細胞の巨
視的り四−ンが見られる。個々のクローンを無菌の９イ
ンチパスツールピペットで取り出ス。

各クローンを９６穴の集合皿中の個々のウニ〃に移す。

細胞が７５％のウェルを充填した時点で、上澄液の特異
性抗体の試験を行う。陽性ウェルの拡張を行う。１×１
０７細胞数／痕アリコートにて細胞を凍結する。

参考文献： コフイーノ（Ｃｏｆｆｉｎｏ）、　Ｐ、、　Ａウマル（
Ｂａｕｍａｌ）　、　Ｒｏ。

等「マウスミエローマ細胞のクローニング及び変成種の
検出（ＣＩｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｏｕｓｅ　欣ｅｌｏｍ
ａ　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖ
ａｒｉａｎｔｓ　）　Ｊ　〔Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉａｌ
、７９　：４２９−４４０　’１゜ヤマモト（Ｙａｍａ
ｍｏｔｏ）　、　Ｎ、、ヒヌマ（）Ｔｉｎｕｍａ）、Ｙ
、［柔軟寒天中Ｅｐｇｔｉｏｎ−Ｒａｒｒウィルスによ
るヒト白血球のクローン形質転換（ＣｌｏｎａｌＴｒａ
ｎａｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　＄ｍａｎ　Ｔ、ｅｕｋ
ｏｃｙｔｅｓ　ｈｖ　Ｅｐｉｔｅｉｎ−Ｂａｒｙ■％ｒ
ｕｓ　ｉｎ　５ｏｆｔ　Ａｇａｒ　）　Ｊ　「）ｎｔ、
Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　１７　：　（１９７６）１９１−１
９６　）。

’Ｉ１．ｉｎ　ｖｉｖｏ増殖 試薬： クローニングされたハイブリドーマ細胞系統１０　ｇ　
Ｒａ１ｂ　／　ｅメスマウスＰｒ１ｓｔａｉｎ　（原液
） 操作： マウス当り０．５ｍｌのＰｒ１ｓｔａｉｎを腹腔内に注
射して、１〜２週間後に０．５ｍｌの無菌の通常の塩水
中の１〜２Ｘ１０’ハイブリドーマ細胞を注射する。

２〜３週間後に腹水を取り出す。細胞を室温において１
０００　ｒｐｍで遠心分離する。上澄液を取り出し、抗
体を液から精製する。細胞ペレットを０．５ｍｌの無菌
の通常の塩水中に再懸濁し、これらの細胞をもう一つの
Ｐｒ１ｓｔａｉｎ処理されたマウスの腹腔内に注射する
。

■、細胞の凍結及び解凍 試薬： ウシ胎児血清（Ｆｅ２） ＭＳ　０ ＮＵＮＣ（５ｏｕｔｈｌａｎｄ　Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃｓ
　）製の凍結アンプルスタイロホームラック ＝７０℃獅ＶｅＯ 液体Ｎ２凍結器 凍結の操作： １、中間一対数生育基即ち９０ｑＩＯを越える生育率の
１×１０　個の細胞を遠心分離する。

２、細胞を１　ａｔの９０％ＦＣ８／１０％ＤＭＳ　Ｏ
中に再懸濁させる。

３、アンプルをスタイロホームラックに置き直ちに細胞
を一７０℃に置く。

４．２４時間後細胞を一７０℃から液体Ｎ２に移す。

解凍の操作： １、アンプルを直ちに液体Ｎ２から３７℃の水浴に移す
。１００　ｒｐｍで遠心分離を行う。細胞を１．０　ｍ
１３のハイブリｒ−マ生育培地中に再懸濁する。

抗体含有腹水は５チヘ／リンで４％に希釈され、４℃に
おいて０．２５Ｍの最終濃度にＭｎＣ１２で脱脂され次
いで１８チ（重量／容積）の硫酸す）　ＩＪウムで分画
された。ＩｇＭ抗体は次いでそれぞれ５ｅｐｈａｃｒｙ
ｌＳ　−３００及び５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００上
で順次グル沖過を行うことにより分離した。モノクロー
ナルＩｇＭの濃度は１％溶液について１４の消衰係数を
用いて０、Ｔ）、２８ｏにおいて求めた。

固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　）を使用してＨ８
Ｖに対する抗体のハイブリドーマのスクリーニングを行
い、モノクローナル抗体により検出される抗原決定基の
特性付けを行った。簡単に述べると、ＭＢＣ−５細胞中
で生育されたＨ８Ｖ　１　、Ｈ８Ｖ　２及び生育された
ＣＭ′ｖ１或いは精製されたＨ８Ｖ　１及びＨ８Ｖ　２
ウィルス粒子の感染された細胞溶菌液を平底マイクロタ
イシープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　、　　パージニア
州アレクサンドリア）のウェルに４℃において８時間被
覆した。未吸収ウィルスは除去し、ウェル上の非特異性
部位をＰ、　Ｂ、　Ｓ、中の１％ゲラチン溶液で遮断し
た。ハイブリ）Ｉ−マ上澄液或いは精製ＩｇＭモノクロ
ーナル抗体の希釈液の関μｌを添加し、５℃において１
時間インキュベートさせた。非結合抗体の除去後マイク
ロタイプ−プレートを３回Ｐ、Ｂ、Ｓ、で洗浄し、１チ
ゼラチン中のほぼ５０．０００　ｃｐｍの　ニー標識さ
れたヤギ抗−マウス免疫グロブリン（ＣＡＭ　）　（Ｃ
ａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓペンシルバニア
州、コクランビル）のＩｇＧ画分を添加した。５℃にお
いて１時間後に過剰の放射能を取り除きプレートを３回
ＰＢＳで洗浄した。ウェルな切り出し自動ガンマカウン
ター中でカウントを行った。谷Ｈ８Ｖの調剤を前融合マ
ウス抗−Ｈ８Ｖ２血清を用いて滴定して最適抗原濃度を
決定した。

又、固相ＲＩＡを用いてＨ鎖及びＬ鎖アイソタイプにつ
いてモノクローナル抗体の分類を行った。

この検定においては、２００ｎｇ　の精製モノクローナ
ル抗体を含有する５０μｌを平底マイクロタイタープレ
ートのウェル上に４℃において８時間被覆した。同様に
ウェルを１％ゼラチンで遮断し、異ったウサギ抗−Ｈ鎖
及びＬ鎖特異性抗血清（Ｌｌｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉ
ｅｓ社、メリーランド州、ケンシングトン）の希釈液を
添加した。

５℃において１時間インキュベーション後、フレートを
３回洗浄し、５０，０００　ｃｐｍの１２５■−標識ヤ
ギ抗−ウサギープロプリン（ＧＡＲＧＧ　）　（ＡＭＦ
社テキサス州、セギン）を添加した。ＧＡＲＧＧは予め
マウスグロブリンで吸着され、異好性抗体を除去した。

５℃において１時間インキュベーション後過剰の放射能
を除去し、ウェルを前記の如くカウントした。

ウィルスの中和 ＩｇＭモノクローナル抗体のウィルスの感染性を中和す
る能力をプラーク減少試験により求めた。

簡単に述べると、Ｈ８Ｖ　１及びＩ（ＳＶ　２をＶｅ　
ｒｏ細胞中において生育し、Ｑ、１ｍＡのウィルス当り
５０〜２００シラー久を与えるように滴定した。３００
μｇ　の精製モノクローナル抗体を含有する３００μｌ
　を３００／１１！　　のウィルス懸濁液と混合し、４
℃において１時間インキュＲ−トした。ウィルス抗体懸
濁液２００μｌをＶｅｒ□細胞単層上に接種し、３７°
Ｃにおいて２時間インキュベートした。３日後のメチル
セルロースを含有する培地の添加、固定及び染色及びプ
ラークのカウントは前記の如（行われた（　Ｓｈｏｗａ
ｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｒｙ
＋ｕｎ、、　３４　：　６８４−６９２）。

免疫蛍光法（ＩＦ） ＩＰの操作は上記ショウワルター（Ｓｈｏｗａｌ　ｔｅ
ｒ）等の方法によるものである。Ｖｅｒｏ細胞にＩＳＶ
　１及びＩＳＶ　２を感染させた。２０μｇの精製Ｉｇ
Ｍモノクローナル抗体をアセトン−固定細胞に添加し、
間接免疫蛍光をフルオレセインインチオシアネート結合
ＧＡＭ　（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
）を用いて得た。感染細胞表面は同様に検査したがしか
し細胞の固定は行わなかった。

等電点電気泳動分析゛ ＩｇＭモノクローナル抗体の等電点電気泳動（ＩＥＦ）
は前記の如く５チポリアクリルアミドゲル中において行
った（　０’Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈ
ｅｍ、。

２５０　：　４００７−４（１２１）。抗体の等電点（
Ｐ、）は陽極から移動した距離に基づき標準曲線（ＩＥ
Ｆ検量キット、Ｐｈａ加ａｃｉａ　）から求めた。

ヨウ素化 ＧＡＲＧＧ及びＧＡＭのＩｇＧ画分５０μｇをＴｈｚｙ
ｍａ−ｂｅａｄｓ　（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｖｉｅｓ＋、カリフォルニア州、リッチモンド）を用い
てＮａ　　Ｉ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、）で標
識化した。遊離Ｎａ１２５ＩをＰＤ−１０カラム（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　）上において１２５Ｉ標識化蛋白質か
ら分離した。】０チドリクロロ酢酸に沈澱された１２５
工標識チは９５チより犬であった。

結　　　　　果 １、　　ＲＩＡによるモノクローナルのＨ８Ｖ特異性Ｈ
８Ｖ　１、ＩＳＶ　２及び偽感染ＭＢＣ−５細胞溶菌液
に対する６つのモノクローナル抗体の結合分析が第５図
に示される。モノクローナル抗体２．Ａ、２（第５ｃ図
）、７Ｂ（第５Ｅ図）及び）（Ｓ、２．Ａ、　（第５Ｆ
図）はＩＳＶ　１及びＩＳＶ　２の両者に共有されるり
（４７） イブ−共通性抗原基を認識した。それらの各々の結合曲
線の傾斜は余り異らないので、これらの抗体は明らかに
Ｈ８ＶＩ及びＩＳＶ　２上に存在する同様な決定基を検
出した様である。これらの３個の抗体の偽細胞溶菌液に
結合する能力のないことは抗原決定基がＭＢＣ−５宿主
細胞物質中に見出されたものである可能性をしめ出した
ものである。抗体１２、Ａ、３　（第５Ｂ図）も又Ｈ８
Ｖタイプー共通性抗原決定基を検出した。しかしながら
、結合は又偽細胞溶菌液に対しても示されたので、この
モノクローナル抗体はＭＢＣ由来宿主物質或いはウィル
ス及び宿主細胞に溶融される決定基のいずれかを認識す
るものである。抗体１Ｂ、Ｂ、２はＩＳＶ　１よりもＩ
ＳＶ２に対するより効率の良い結合を示した（第５Ａ図
）。これに関して、５μｇの濃度において１２．８００
　ｃｐｍ及び４０００　ｃｐｍが）ＩＳＶ　２及びＩＳ
Ｖ　１抗原に対して各々結合した。１８．Ｂ、２は偽細
胞溶菌液とは結合しないＩＳＶ　１及びＩＳＶ　２上の
タイプ−共通性抗原を検出するが、それはより優先的に
Ｉ（ＳＶ２と反応するようである。

（４８） 抗体１．Ｂ、１は明らかにＩＳＶ　２タイプ−特異性抗
原決定基を認識した（第１Ｄ図）。これは、１．Ｂ。

１のＩＳＶ　１或いは偽感染細胞溶菌液に結合能力がな
いことにより示される。これに対し、相当程度の結合能
力がＩＳＶ２に示される。更に興味深いことに、抗体１
．Ｂ、１．２．Ａ、２．１８．Ｂ　、２及びＨ８，２Ａ
はＲＩＡにおいて代表的数の腸内ウィルスの精製ＣＭＶ
に結合しなかったのに対し、７．Ｂ、２はより少ない反
応性を示し、１２．Ａ　、　３は偽感染細胞に見られた
のと同様にＣＭＶを結合した（データ示さず）。

２、中和 モノクローナル抗体のＨ８Ｖ感染性を中和する能力はプ
ラーク減少に基づいており表１に示されている。３００
μｇ或いはＩμｇの濃度においてはＩｇＭ抗体１８．Ｂ
、２．１２．Ａ、３及び７．　Ｂ、　２はＩＳＶ　１或
いはＩＳＶ　２の感染性をあまり中和することがなかっ
た。

抗体２．Ａ、２及び１．Ｂ、１０両者は部分的にＩ（Ｓ
Ｖを中和する能力を有する。２．Ａ、２のタイプ−共通
特異性を更に証明するように、ＩＳＶ１及びＩＳＶ　２
プラークの減少率が各々４２％及び５０係であった。

２、Ａ、　２の濃度が３００μｇから（資）μｇに減少
すると、２つのタイプのウィルスについてプラーク減少
率の低下が見られた。抗体１．Ｂ、１のタイプ−特異的
性質はＩＳＶ　２感染性の部分的中和（６０％）により
更に示された。ＩＳＶ　１感染Ｖｅｒｏ細胞には１．Ｂ
、１によるプラーク数の減少は見られなかった。

モノクローナル抗体の２つはウィルスの感染性を中和す
る効率が悪く、部分的プラーク減少に多量の抗体（３０
０μｇ）を必要としたので、異った組合わせの抗体を試
験して、Ｈ８ｖ２感染性を中和するのに及ぼすそれらの
組合せ効果を試験した。

中和試験において完全に感染性を除去することのできな
かった抗体はウィルス感染性を防止するに必要な抗原決
定基の一部のみと反応することができるものと思われる
。数個のモノクローナル抗体の添加は中和活性に関して
増強或いは相乗的効果を発生する可能性がある。しかし
ながら、モノクローナル抗体の各種組合わ？　（ＨｏＳ
、２．Ａ、を除く）は個々の抗体単独と比べてＩＳＶ　
２感染性を中和する点において効率のよいものではなか
った（データ示さず）。

）（ＳＶ感染性を完全に除去した唯一のモノクローナル
はＩ（Ｓ、２．Ａであった。Ｉμｇの濃度後にＨ８゜２
、Ａは１（８Ｖ　１及びＩＳＶ　２　ＰＦＵを１００％
減少した。

５００　／ｊｇ　の濃度はＩＳＶ　２感染性中のｐｐＵ
ｌに５０％減少させた。ＩＳＶ　２　ＰＦＵを５０チ減
少させたＨ８．２．Ａの濃度は決定されなかったが、Ｈ
８，２，Ａにより認識された抗原決定基のタイシー共通
性の性質がこの中和試験から示唆された。

３、　　Ｉｇアイソタイプ及びＰｌの特性性はウサギ抗
−Ｈ鎖及びＬ鎖特異性抗血清と共に、固相ＲＩＡを用い
て全ての６個のモノクローナル抗体はカッパＬ鎖を有す
るＩｇＭＨ鎖クラヌクラスであることが判明した（表２
）。更にＩｇ　クラス特異性を証明するように全ての抗
体が８ａｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００の空隙容積中に検
出されたこと及び５Ｄ８−ポリアクリルアミｒゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）による減少がほぼ７０，０００ダルト
ンの分子量を有するＨ鎖を精製したことである。抗体１
２．Ａ、３により２つのＬ鎖が５ＤＳ−ＰＡＧＥにより
検出されたことは興味深い。これらのＬ鎖の１つはＭＳ
−１起源のものと思われるのに対し、他方はおそら（、
肺臓細胞親からのものと思われる。

精製ＩｇＭモノクローナル抗体の５係？リアクリロアミ
）＋１ゲル上ＩＥＦ分析は狭い範囲のＰ□　を示した（
表２）。この範囲は、Ｈ８，２，Ａ及び１．Ｂ、１に対
してそれぞれ７．７〜８．２５である。このデータは抗
−Ｈ８Ｖ活性も検定された蔗糖内における調製ＩＥＦに
より求められたＰ、とよく対応する。これに関して、抗
体２．　Ａ、　２．１．Ｂ、１及び１８．Ｂ　、　２に
対して調製ＩＥＦにより求められたＰｌ　はそれぞれ８
．０．８．１及び８．３であり、これらはＩＥＦ分析よ
り得られた値と同様である。

４、免疫蛍光法 アセトン固定）（ＳＶ　１及びＩＳＶ　２感染Ｖｅｒｏ
ａ胞を用いたモノクローナル抗体の間接免疫蛍光を測定
した。ＲＩＡ及び中和試験により予想された如く、抗体
２．Ａ、２及び１．Ｂ、１は各々タイプ−共通性及びタ
イプ−特異性Ｈ８Ｖ決定基を認識した。抗体１．Ｂ１は
Ｈ８Ｖ２感染細胞について免疫蛍光の核パターンを示し
たのに対し、Ｈ８Ｖ１感染細胞では全く蛍光が検出され
なかった。抗体２．Ａ、２によっては、ＩＳＶ　２及び
Ｈ８ｖ１の両者に感染された細胞について、核免疫蛍光
が示された。抗体２．Ａ、２及び１．Ｂ１により発生さ
れた蛍光の強さはポリクローナルマウス抗−）［ＳＶ　
２抗血清により発生されたものと同様であった。

ＲＩＡにおける抗体７．Ｂ、　２により検出されたタイ
プ−共通性抗原決定基を再確認するものが）ＩＳＶ　２
及びＩＳＶ　１感染細胞において精製した免疫蛍光の細
胞質・す−ンで基っだ。アセトン固定細胞を用いて抗体
１８．Ｂ、２及び１２．Ａ、３では免疫蛍光染色が検出
されなかったのに対し、Ｈ８，２，ＡはＩＳＶ　２感染
細胞についてのみ、弱い細胞質染色を生成した。

ＲＩＡにおいてＩＳＶに対して最も効率的な結合を示し
た抗体１８，８．２がウィルス感染性の中和或いはウィ
ルス感染細胞の染色を行わなかったことは矛盾であった
。抗体１８．Ｂ　、　２がウィルス感染細胞の表面染色
を示すか否かを決定するために、未固定Ｈ８Ｖ感染細胞
について間接ＩＦを行った。ＩＳＶ　１及びＨ８Ｖ　２
感染細胞の両者について表面染色はあったが、偽感染細
胞については何等の染色も見られなかった。

（５５） （５６） モノクローナルＩｇＭ抗−Ｈ８Ｖ抗体のＩｎ及びビオｆ
ｆ−ン標識化 ＴｇＭ抗体は次の方法によりビオチンで標識化された：
　１０ｍｑ　／ｒｒＩ１９度の１ｍｌ容のＩｇＭを０．
１モル濃度の重炭酸ナトリウムに対して４°Ｃにおいて
一晩透析を行った。ジメチルホルムアミド１００μｌ　
当’）３．４７％’のビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスク
シニミ）’　（ＢＮＨ８）　（Ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
　）を１４１　ｆｆした。２８５ｔｔｌｌのＢＮＨ８溶
液を１　ｒｎｌ容のＩｇＭ　（１（１＋ＩＬｑ／　ｍｅ
　）に添加１−１時々混合しながら１時間室温において
インキュベートした。得られた溶液を次いで再び４℃に
おいて２４時間数回変えたリン酸Ｖ衝塩水（ｐＨ７，２
）　（ＰＢＳ　）に対して透析を行′）だ。透析後抗体
溶液を等容の２重蒸留グリセロールと混合し、−２０℃
に貯蔵した。

モノクローナルＩｇＭ抗−Ｈ８Ｖ２抗体の調製及びビオ
チン標識化 精製Ｈ８Ｖ’２ウィルス粒子で免疫化したマウスからの
肺臓細胞を前記の如＜、ＭＳ−１ミエローマ細胞と融合
させた。抗体のスクリーニングを行うために、ＩＳＶ１
及びＩＳＶ２の両者を使用した。抗−Ｆ（ＳＶ　２に対
して陽性の細胞のみを腹水腫瘍を発生するために使用し
た。得られたモノクローナルＩｇＭ抗体を単離し前記の
如く標識化した。

モノクローナルＩｇＭ抗−Ｈ８Ｖ　１抗体の調製及びビ
オチン標識化 これらの抗体の調製に用いられた方法はＩＳＶ　２抗体
に用いられた上記の方法と抗−ＩＳＶ　１に陽性の細胞
のみが腹水腫瘍を発生するために用いた他は同一である
。抗体の精製及びビオチン標識化は上記と同様にして行
われる。

免疫検定法 本発明の好ましい方法は、所定の抗原例えば単純ヘルペ
スウィルス（Ｈ８ＶＩ及びＩＳＶ２）の表示及び決定に
関するものである。第１図を参照すると、不溶性マ）　
ＩＪソックス所定の抗原例えば単純ヘルペスウィルスに
対するポリクローナル抗体（非−マウス種において調製
）（即ちＩＳＶ　１並びに）ＩＳＶ　２と交差反応性を
有する抗体）で被覆されている。生物学的試料液体、そ
の決定が求められ（５９） でいる所定の抗原例えばＨ８Ｖ抗原含量が抗体被覆マト
リックスとインキュベートされ、所定の抗原例えばＨ８
Ｖ抗原が若し存在するならばそれを免疫捕獲する（第１
Ａ図）。

未捕獲試料から分離された得られたマトリックスを存在
する測定可能な数の抗原を結合するに十分な一定勘のビ
オチン標識化モノクローナルＩｇＭ抗体（例、抗−Ｈ８
Ｖ抗体、好ましくはマウス由来；Ｈ８Ｖ　１及びＩＳＶ
　２の両者に交差反応可能或いは一方のタイプのみと特
異的に反応性を有する）とインキュは一卜する（第１Ｂ
図）。得られたマトリックスを未捕獲モノクローナル抗
体から分離し、そのマトリックスを次いで所定量の標識
化アビジン、好ましくは存在する測定可能な数の標識化
モノクローナル抗体を結合するに十分な酵素標識アビジ
ンとインキュベートさせる（第１Ｃ図）。得られたマト
リックスを末捕獲アビジンから分離し、標識を検出し及
び／又は好ましくは定量し、それにより試料中のＨ８Ｖ
抗原の存在を間接的に決定する。標識が酵素である場合
には、マ）　＋Ｊラックス（６０） 酵素反応性の基質とインキュベートされ、基質における
変化例えば色変化或いは蛍光発生を検出する。

上記方法においてＩＳＶを表示及び決定するために使用
される場合において、モノクローナル抗体がＩＳＶ　１
及びＩＳＶ　２に交差反応性を有する場合にはその試験
は一般的Ｉ（ＳＶスクリーニング試験として使用するこ
とができ、引続いて必要に応じて他の適当な手段例えば
２つのＨ８Ｖタイプの一方に特異的なモノクローナルＩ
ｇＭ抗体を用いて操作を繰返すことにより存在するＨ８
Ｖタイプを決定することができる。

本発明の一実施態様において、第１図の基本操作は追加
された増幅工程を使用することにより修正される。この
実施態様において基本操作は液体試料のインキュベーシ
ョンを通じて行われる。この試料を次いで十分量の分離
されたモノクローナルＩｇＭ抗体（ビオチンに結合され
ていない）とインキュベートさせる（第２Ｂ図）。この
マトリックスヲ次いで測定可能な数のモノクローナル抗
体を結合するに十分な所定量のそのモノクローナル抗体
に対するビオチン標識化抗体或いは該モノクローナル抗
体と反応するその様な抗体のビオチン標識化反応性断片
（例、ビオチン標識化Ｆａｂ’　）、例えばヤギ抗−マ
ウスＩｇＭ免疫グロブリンとインキュベートさせる（第
２Ｃ図）。得られた分離マトリックスを次いで基本操作
（第１図）と同様にして酵素−アビジン結合体とインキ
ュ（−トさせる（第２Ｇ図）。この操作は、基本操作に
対して相当により大きな感度をもたらす。

更に、本発明のもう一つの実施態様（第３図）において
は、上記の如く形成された試料接触されたマトリックス
をビオチニル化モノクローナルＩｇＭ抗体とインキュベ
ートさせる。得られた分離マトリックスを次いで天然ア
ビジンとインキュベートさせ、更に分離後にビオチニル
化酵素と反応させ、各試薬は十分に測定可能な址で用い
られ、抗原（例、Ｈ８Ｖ）の存在の検出可能性を増幅す
る。

もう一つのウィルス（例、Ｈ８■）感染症の代替的な検
定法は所定の抗原に対するＩｇＭ抗体の検出を生物学的
試料中に検出することを含むものである。この方法（第
４図）においては、不溶性マトリックス生物学的試料液
体中において決定されるべきＩｇＭ免疫グロブリンのｍ
ｕ−鎖に特異的なポリクローナル抗体で被覆する。この
被覆マトリックスを次いで生物学的液体試料とインキュ
ベートさせて存在する免疫グロブリンを免疫捕獲する（
第４Ａ図）。このマトリックスを分離し、次いで存在す
るウィルスに特異性を有する測定可能な捕獲ＩｇＭ分子
を結合するに十分な一定量のビオチン標識化ウィルスと
インキュベートさせる。試料が抗−所定ウィルス活性を
有するＩｇＭを含有する場合には特異的結合が生ずる。

このマトリックスを分離し、次いでアビジン−酵素結合
体或いはその他の上記の如く標識化アビジンとインキュ
ベートされ、それは次いで結合されているならばビオチ
ニル化ウィルスに結合する。

酵素標識を付したアビジン或いはビオチンの代りにアビ
ジン或いはビオチン結合体は例えｖ、（１２５Ｘなどの
放射線同位元素標識を用いて公知の技術で標識化するこ
とができる。更に別法は、アビジンの蛍光性標識例えば
クルオレセイン、ローダミン、フルオレスカミン及び８
アメレノ−１−ナフタレン硫酸、などであり、これらも
又文献に記載される一般的技術により行うことができる
。

免疫検定法における酵素標識の使用は、酵素をアビジン
或いはビオチンに結合する技術と同様に一般的に知られ
ている。技術上知られている酵素及び基質を本発明にお
いで使用することができる。

使用される酵素は、好ましくは比色法或いは分光分析的
に決定可能なものがよい。有用な酵素としては、一般的
にカタラーゼ、パーオキシダーゼ、Ｒ−ターゲルコイン
ダーゼ、ベーターＤ−グルコシダーゼ、ベーターＤ−ガ
ラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ
、ガラクトースオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファタ
ーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、ウレアー
ゼ及びオキシクロレンデンターゼなどが含まれる。

現在好ましい酵素はアルカリ性ホスファターゼ及びワサ
ビダイコンノぞ−オキシダーゼである。

もう一つの特に有用な酵素系は蛍光発生基質と共に使用
されるペーターガラクシトーぜであり、読み出しが蛍光
計を用いて行われる。この系において選ばれる基質は４
−メチルーウンペレフェリルーベーターＤ−ガラクトピ
ラノシドである。

不発明の好ましい実施態様はビオチン−アビジン系の使
用を含んでなるものであるが、一つの代替的実施態様に
おいてはビオチン−アビジン系を省略することが出来、
読み出し可能な標識（酵素、放射性原子など）が直接に
ＩｇＭモノクローナル所定抗原抗体或いは所定の抗原Ｉ
ｇＭ抗体に特異性の抗体或いは抗体反応性断片に直接付
着することができる。

不溶性の反応性抗体を有するマトリックスは、文献上公
知の任意の手段により形成することができる。即ち、抗
体を例えばセルロース化合物、アガロース、架橋デキス
トジン、？リスチレンなどの不溶性担体に架橋、物理吸
着或いは化学結合などにより不溶性とすることができる
。

例２ 本発明の基本的方法（第１図に図示）は非−マウスＩｇ
Ｇ抗−Ｈ８Ｖを含む不溶性マトリックスを形成し、それ
を次いで被分析試料と接触することにより、存在する抗
−Ｈ８Ｖ抗原をマトリックスに固定することよりなるも
のである。このマトリックスを次いで非結合試料から分
離し、予め選択された量のＨ８Ｖに対するビオチニル化
モノクローナル抗体と接触させ、このモノクローナル抗
体をマトリックス上に存在するＨ８Ｖ抗原に固定する。

マトリックスな単離後、マトリックスを次いで予め選択
された量のアビジン連結酵素と接触させて、次いで予め
マトリックスに固定した任意のモノクローナル抗体に酵
素を固定する。このマトリックスを再び分離し、マトリ
ックスに固定された酵素の存在及び／又は量を決定し、
それにより分析される試料中に存在するＨ８Ｖ抗原の存
在の検出及び／又はその定量を行う。

るＩｇＧの調製 抗−Ｈ８Ｖ抗体に陽性のウサギ血清を】８チ及び１２％
（重量／容量）の硫酸す）　ＩＪウムを逐次添加するこ
とにより分画した。得られた免疫グロブリンをＴ）ＥＡ
Ｅ−セルロース或いは５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００
（Ｐｈａｒｍａｃｌａ　）カラム内で分画し、それによ
りＩｇＧを他の免疫グロブリンから単離する。ウサギＩ
ｇＧの濃度はＯｏＤ、２８ｏにおける１９！Ｉ溶液の消
衰係数１５．０を用いて決定した。

酵素に共有的に結合したアビジンの調製５ｍ９のアルカ
リ性ホスファターゼ（Ｓｉｇ＋ｎａ　％Ｐ５５２１　）
を遠心分離し、ペレットを０．９ｍｌのＰＢＳに再懸濁
した。懸濁液をＰＢＳに対して一晩透析を行い、容量を
ＰＢＳで１．３１まで上昇させた。このアルカリ性ホス
ファターゼを６５μｌの２５チグルタルアルデヒド（１
，２５チグルタルアルデヒドの最終濃度）を用いて活性
化した。この溶液を１８時間室温において回転させ、次
いで炭酸−重炭酸緩衝液（ｐｕ　９．６　）に対して２
４〜４８時間透析した。アビジン（Ｖｅｃｔｏｎ　Ｌｏ
ｂｏｒａｔｏｒｉｓｓ　ｒ１＆１Ａ２０００　）を１＝
１０モル比で添加し、混合物を４℃において２４〜４８
時（６７） 間インキュベートした。得られた結合体を０．０５モル
濃度のトリス０．１５モル濃度塩水ｐＨ８＋ナトリウム
アジＰに対して透析を行った。結合生成物を次いでトリ
ス塩水アジド＋２チウシ血清アルブミン（ＢＡＡ　）と
１：１で希釈し、−２０’Ｃに貯蔵した。

アビジンアルカリ性ホスファターゼ及びビオチニル化モ
ノクローナルＩｇＭ抗−Ｈ８Ｖの最適希釈率はチェッカ
ー盤滴定を用いてビオチニル化モノクローナルＩｇＭ抗
−Ｈ８Ｖ及びアビジンアルカリ性ホスファターゼの希釈
率を一定量のＨ８Ｖ　２抗原に対して増加させることに
より決定した。

試験は以下のようにして行った： ％穴ポリスチレンマイクロタイタープレートの平底ウェ
ルを０．３Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐ）（９，５）
中の２００　ｎｇウサギＩｇＧ抗−Ｈ８Ｖ　（５０μｌ
ｌ　／ウェル）で被覆し、４℃において一晩インキユベ
ートした。これらのウェルは０．５％ゼラチン−ＰＢＳ
　（２００ｐｌｏウェル）で後被覆し、２２”Ｃで領分
（６８） 間インキュベートした。ウェルを一度０．０１１ｒゼラ
チン−ＰＢＳ　（２００μｌ／ウエル）で洗浄した。被
試験試料を２つのウェルの各々に添加しく　５０ｍ１　
／ウェル）、４５℃（水浴）において２時間インキュベ
ートした。ウェルを次いで３回０．０１　’％ゼラチン
ーＰＢＳ　（２００μｌ／ウエル）で洗浄した。０．１
％ゼラチン−ＰＢＳ中で１＝２５に希釈したアビジン−
アルカリ性ホスファターゼ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　。

Ｂｕｒｌｉｎｇａｆｎｅ　、　ＣＡ　）を次いでウェル
に添加しく５０ａｌ／ウエル）、２２”Ｃにおいて加分
間インキュベートした。このウェルを゛０．０１％ゼラ
チンーＰＢＳ（２００μｌ／ウエル）で３回洗浄した。

ウェルを１０％ジェタノールアミン、０．５　ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２　　中の０．１％ｐ−ニトロンエニルホスフエ
ートよりなる基質中でインキュベートしく２００μ！／
ウエル）、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

結果は下記の通りであった： 臨床標本は、小庖を乾燥した綿棒でこすり取って病巣か
ら集め、殺菌した１ドラ二のバイアル中に分取した２−
の子牛肉せんじ汁（ＶＩＢ）中に入れた。各試料は試験
まで一７０℃に冷凍して貯蔵した。各試料を解凍し、Ｖ
ｅｒｏ細胞を予め入れた試験管当り０．２ｍｌの試料を
接種することによりウィルス感染性の試験を行った。細
胞変性効果（ＣＰＥ）は毎日４日間に亘り顕微鏡で読ん
だ。典型的Ｈ８ＶＣＰＥを示す細胞シートは感染性が陽
性と記録された。試料の感染性が試験された同日にそれ
らは上記ピオチン／アビジン酵素結合免疫吸着剤検定（
ＢＡ−ＥＬＩＳＡ　）　　により試験を行った（第１図
）。

これまでに唇、首、腟、のど、ペニス及び乳房に伴う病
巣から４２１の試料が集められた。その結果は次のよう
に記録された： １６％（’６９／４２１　）は抗原及び感染性の両者に
対して陽性であった；３）１％（１５９／　４２１　）
は両試験に陰性であった；２９％（１２２／４２１　）
はＢＡ−ＥＬＩＳＡによる試験では抗原陽性であったが
、感染性ウィルスは含有しなかった；及び１７％（７１
／４２１）はＢＡ　−ＥＬＩＳＡにより陰性であったが
、組織培養では感染性であった。更に加の試料は余りに
汚染されているので組織培養による試験は行うことがで
きず、その内の９はＢＡ−ＥＬＩＳＡ陽性であり、Ｊｌ
はＢＡ−ＥＬＩＳＡ陰性であった。

一つの試験に対して陽性であるが、第二の試験において
は陰性である試料について得られた結果の正当性をウサ
ギの目をＨ８Ｖで感染した対照モデル研究により行った
。二つのＨ８Ｖ　１単離物が選ばれ、１２匹のウサギが
各々のウィルス単離物で感染された。涙腺試料を３日目
、４日目及び２４日目に集め、ＢＡ−ＥＬＩＳＡにより
Ｈ８Ｖ抗原について試験を行い、組織培養により感染性
を試験した。３日目には単離物１を接種した８／１２ウ
サギ及び単離物２で接種した９／１２のウサギが抗原に
対して陽性であった。３日目に全ての々匹のウサギから
集めた涙分泌物は感染性Ｈ８Ｖを含有した。４日目まで
に抗原及び感染性ウィルスの両者が１００％のウサギに
おいて検出された。冴日日には、感染性ウィルスはこれ
らのウサギのいずれにも検出されなかった。しかしなが
ら、ＢＡ−ＥＬＩＳＡにより感染した場合にはＭ日日に
集めた試料の１００％が抗原陽性であった。

（７１） 要約すると、少量の感染性ウィルスはＥＬＩＳＡによっ
て検出されるには余りに少ない抗原を含有する培養によ
り検出することができると結論することができる。しか
しながら、病巣から集められた２倍多い試料においては
、活性ウィルス感染がＨ８Ｖ抗原の表現により検出する
ことができるが、しかし、感染性ウィルスは殆んど或い
は全く存在しない。

例３ ウサギＩｇＧ抗−Ｈ８Ｖは例１で用いられたものと同一
である。本例で用いられたモノクローナル抗体はビオチ
ン標識がない他は例１で説明したものと同一である。

ヤギ抗−マウスＩｇＭ血清を５ｓｐｈａｒｏｓｅ　結合
ウサギＩｇＧカラムを通し、血清からウサギＩｇＧに結
合する任意の免疫グロブリンを吸収する。この血清を１
８％及び１５％（重量／容量）の逐次硫酸す）　ＩＪウ
ム沈澱により分画した。得られた免疫グロツサ（７２） ンを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００上でりｏマドグラ
フにかけ、ＩｇＧをその他の免疫グロブリンから分離し
た。得られたＩｇＧを１ｍｌ容のＩｇＧを１０７Ｑ　／
ｒｎＥの濃度において０．１モル濃度重炭酸ナトリウム
に対して４℃で一晩透析することによりビオチンで標識
化した。

１００μｌ　のジメチルホルムアミド当り、３．４ｍ９
のビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＣａｔＢ
ｉｏｃｈｅｍ　）　　の溶液を調製した。５７μノの訃
ＪＨ８溶液をＩＭ容の工ｇＧ（１０ｍ９／ｒＩＬｌ）に
添加シ、混合シナがら室温で１時間インキュベートした
。得られた溶液を４℃において冴時間数回変更したＰＢ
Ｓに対して透析を行った。透析後、等容の二重蒸留グリ
セロールを添加し、混合物を−２０”Ｃで貯蔵した。

ＩｇＭイムノグロブリンに対するビオチニル化Ｆａｂ’
の調製 Ｆａｂ’断片はＩｇＧ調製のためにヤギ抗−マウスＩｇ
Ｍ抗血清から調製される。ヤイ抗−マウスＩｇＭ抗体は
前記の如く酢酸緩衝液中でｐＨ３，９において２％ペプ
シンを用いて４時間消化される［　Ｃａｂｒａｌ　、　
Ｇ、Ａ、、　Ｇｙｏｒｋｅｙ、　Ｆ、　、　Ｇｙｏｒｋ
ｅｙ、　Ｐ、、　Ｍｅｌｎｉｃｋ。

Ｊ、Ｌ、及びＤｒｅｅｓｒｍｎ、　Ｇ、Ｒ，、、Ｅｘｐ
ｔｌ　、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｐａｔｈｌ　、　。

２９　：　１５６−１６９　（１９７８）］。反応液を
４時間消化後に０゜Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨを添加して、中和
し、蛋白質を５％Ｎａ２ＳＯ４を添加することにより析
出し、１８％の最終濃度にする。得られたＦ（ａｂ’）
２断片をｐＨ７，０において０．００７　Ｍジチオスレ
イトールにより３７℃で２時間還元する。次いで乾燥ヨ
ードアセタミドを０．０１５　Ｍの最終濃度まで添加し
、蛋白質溶液を３７℃において更に２時間インキュベー
トする。

混合物を次いで５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−１００中にお
けるゲル濾過により分画し、５０，０００ダルトンの分
子量を有する蛋白質を含有する画分をＰＭＩＯフィルタ
ーを用いたＡ＋ｎｊ　ｃｏｎ　（ｐ過により５　Ｉｎ？
　／　ｍｌまで濃縮する。

これらの断片はビオチンにより上記と同様の方法により
標識化する。

本例においては、例２の酵素アビジン結合生成物が使用
された。

試験操作 第２図に例示される方法に従い、非−マウス■ｇＱ抗−
Ｈ８Ｖよりなる不溶性マトリックスが形成される。この
マトリックスは次いで被試験試料と接触され、存在する
任意のＨ８Ｖ抗原をマトリックスに固定する。このマト
リックスを次いで上澄液から分離し、次いで決定有効量
のＨ８Ｖに対するモノクローナル抗体と接触させる。マ
トリックスを再び上澄液から分離し、このマトリックス
を次いでＩｇＭモノクローナル抗体に対する過剰のビオ
チン標識化ＩｇＧ抗体と接触させ、それをマトリックス
上に存在するモノクローナル抗体に固定する。

このマ）　ＩＪラックス次いで上澄液から分離し、マト
リックスを次いで標識を付されたアビジンと接触させ、
アビジンをマトリックスに予め固定されたビオチンに固
定する。固定アビジン上の標識を次いで定量的或いは定
性的に測定してマ）　ＩＪラックス固定したＨ８Ｖ抗原
の存在及び／又は量を決定する。

上記一般的方法と一貫して次の仕様が開発された： ９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートの平底ウ
ェルを２００ナノグラム（ウェル当り関μｌ）（’７５
　） の炭酸−重炭酸緩衝液（ｐｌ（９，５）中に希釈された
ウサギＩｇＧ抗−Ｈ８Ｖで被覆され、４℃で一晩インキ
ユヘートされた。このウェルは０．５％ゼラチン−ＰＢ
Ｓ（２００μｌ／ウエル）で後被覆され、２２℃で加分
間インキュベートされた。これらのウェルは一度０．０
１　チゼラチンーＰＢＳ　（２００μｌ／ウエル）で洗
浄した。被試験試料は二重のウェル（ウェル当り刃μｌ
）に添加し、４５℃（水浴）において２時間インキュベ
ートした。これらのウェルを、０１チゼラチンーＰＢＳ
で３回洗浄した。、１％ゼラチン−ＰＢＳ中に希釈した
上記千ツクローナル抗体をウェルに添加し、３７℃（水
浴）において１時間インキュベートした。これらのウェ
ルを次いでｏ、ｏｉ　％ゼラチンーＰＢＳで３回洗浄し
た。次いで０．１％ゼラチン−ＰＢＳ中に１：２５で希
釈したアビジンアルカリ性ホスファターゼ（Ｖｅｃｔｏ
ｒ　Ｉ、ａｂｏｒａ７ｔｏｒｌｅａ　）をウェルに添加
し、室温で加分間インキユベートした。これらのウェル
を次いで３回、０１チゼラチン−ＰＢＳで洗浄した。ウ
ェル当り２００μｌの基質（例１と同様）をウェルに添
加し、（７６） ４０５　ｎｍの吸光度を測定した。

二つの試薬、タイプ−共通性抗−Ｈ８Ｖモノクローナル
抗体及びビオチニル化ヤギ抗マウス−ＩｇＭ試薬の最適
希釈度をチェッカー盤滴定試験において各々の希釈率を
公知のＨ８Ｖ陽性対照例に対して増大させて試験した。

試験設計（第２図）に対して最適感度はモノクローナル
抗体が２００ナノグラム／ｒｎｌの希釈率で添加され、
引続き１　：　４００の希釈率のＣオチン標識化ヤギ抗
−マウスＩｇＭ試薬と反応させた時に認められた。

ＢＡ−ＥＬＩＳＡの挑′戦的な応用がウィルス脳炎を有
する患者から得られるを髄液中に分泌されるＨ８Ｖ抗原
の可能性のある検出において呈示される。

唯一の知られている利用可能な診断方法は脳の生検組織
における蛍光抗体染色技術によるＨ８Ｖ抗原の検出であ
る。小さな予備的研究において、我々はＨ８Ｖ脳生検陽
性患者からのを髄液中においてＢＡ−ＥＬＩＳＡ技術に
よりＨ８Ｖ抗原を検出した。第２図に示される技術は、
この研究において使用されたものである。

例４ 第３図に例示される操作はＩｇＧ抗−ＩＳＶよりなるマ
トリックスを形成し、そのマトリックスを試料と接触さ
せて、試料中に存在するＩＳＶをマトリックスに固定し
、マトリックスを上澄液から分離し、得られたマトリッ
クスを決定有効量のビオチン標識化モノクローナル抗体
と接触させ、上澄液を分離し、マトリックスを決定有効
量の天然アビジンと接触させ、上澄液を分離し、次いで
マトリックスを標識されたビオチンと接触され、ビオチ
ン上の標識を読み取り、試料中のＨ８Ｖ抗原の量を定性
的或いは定量的に決定する方法に関する。

本例において使用されたウサギＩｇＧ抗−Ｈ８Ｖ抗体は
例２で調製されたものと同一である。本例において使用
されたビオチニル化モノクローナル抗体は例１で調製さ
れたものと同一である。天然アビジンはＶｅｃｔｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（製品番号Ａ２０００）よ
り得られた。ビオチニル化アルカリ性ホスファーゼはＶ
ｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（製品番号Ｂ
−２００５）より得られた。

上記一般的方法の一例は次の如くである＝９６穴のポリ
スチレンマイクロタイタープレートの平底ウェルを２０
０ナノグラム（ウェル当り５゜μｌ）の炭酸−重炭酸緩
衝液（ｐＨ９，５）中に希釈されたウサギＩｇＧ抗−）
（ＳＶで被覆し、４℃において一晩インキユペートさせ
る。ウェルな０．５％ゼラチン−ＰＢＳ　（ウェル当り
２００ｍ）で後被覆し、２’２　’Ｇにおいて３０分間
インキュベートさせる。これらのウェルを一度０．０１
　％ゼラチンーＰＢＳ　（ウェル当り２００μｌ）で一
度洗浄する。被試験試料を添加（ウェル当り５０μｌ）
シ、２時間４５℃（水浴）においてインキュベートする
。これらのウェルを、０１％ゼラチン−ＰＢＳで３回洗
浄し、０．１％ゼラチン−ＰＢＳ中に希釈したビオチニ
ル化モノクローナル抗体をウェルに添加し、１時間３７
℃（水浴）においてインキュベートする。これらのウェ
ルを次いで０．０１　％ゼラチンーＰＢＳで洗浄し、０
．１％ゼラチン−ＰＢＳ中で希釈されたアビジンをウェ
ルに添加し、２２”Ｃにおいて四分間インキュベートす
る。ウェルを０．５％ゼラチン−ＰＢＳで３回洗浄し、
（７９） 次いで０．１％ゼラチン−ＰＢＳ中で希釈されたビオチ
ニル化アルカリ性ホスファターゼをウェルに添加し、ｎ
℃においてか分間インキュベートする。

これらのウェルを０．０１　％ゼラチンーＰＢＳで３回
洗浄する。ウェルに基質を添加（ウェル当り２００μｌ
）　Ｌ、、４０５　ｎｍにおける吸光度を測定する。

例５ 第４図において、明らかに別の本発明の実施態様はヒ）
１ｇＭ免疫グロブリンに対する抗体を含んでなるマトリ
ックスを形成し、得られたマトリックスなＩＳＶと反応
性を有する１ｇＭ免疫グロブリンを含有すると疑われた
試料と接触させることよりなるものである。このマトリ
ックスは、上澄液から分離され次いで、ピオチン標識化
Ｈ８Ｖ抗原と接触され、後者は所定の有効量にて用いら
れる。マトリックスを再び上澄液から分離し、読み取り
可能に標識化されたアビジンと接触され、マトリックス
中に存在するビオチンを結合する。マトリックスを再び
上澄液及びマ）　ＩＪラックス中存在する標識から分離
し、読み取りを行って試料中に求め（８０） られる）ＩＳＶと反応した１ｇＭ免疫グロブリンの存在
を定量的又は定性的に決定する。

上記一般的説明の方法において、５０μノの親和性精製
ＩｇＧ１剤中の２００　ｎＨのヒトＩｇＭのｍｕ−Ｈ鎖
に対して特異的なりギ抗体２００　ｎｇを炭酸−重炭酸
緩衝液（ｐＨ９，５）中においてポリスチレン９６穴マ
イクロタイタープレートの表面上に４℃で８時間吸着さ
せる。１０％ＦＣ８を用いて遮断後ＰＢＳ１０．１％ゼ
ラチン（５０μｌ容）中の１　：　２００希釈の患者の
血清を添加し、３７℃（水浴中）において１時間インキ
ュベートさせる。過剰の抗体はＴｗｅｅｎ　２０−　Ｐ
ＢＳ　　を用いて３回洗浄して除去した。

前記仕様と同様にしてビオチニル化した等数のＩＳＶ　
１及びＩＳＶ　２の粒子の１：２５希釈液を添加し、３
７℃（水浴）において２時間インキュベートした。

ＴＷｅｅｎ　２０−　ＰＢＳで３回洗浄後、１：２５希
釈率のアビジンアルカリ性ホスファターゼを添加し、室
温において加分間インキュベートした。ウェルに’Ｉｍ
ｅｅｎ　２０−　ＰＢＳで３回洗浄した。基質を添加し
、吸光ｉを４０５　ｎｍで測定した。試験の効率を示す
ために、試料血清を上記方法に決定されるべき試料とし
て導入した。結呆は下記の通りである：臨床的に正常な
ヒト血清　　　　０．１８　（０，０４）＊臨床的Ｉｇ
Ｍ抗−Ｈ８ＶＩ　　　　　　０９６６　　（０，０７）
臨床的ＩｇＧ抗−Ｈ８Ｖ２　　　　　０．２１　　（０
，０５）臨床的ＩｇＭ抗−１（ＳＶ２　　　　　０．４
５　（０，０３）本標準偏差 本発明のもう一つの側面は上記検定を行うために有用な
診断・ぞツクである。例えば＝所定の抗原（例、Ｈ８ｖ
）の表示及び決定のための診断ツクツクにおいて、 （ａ）　　パック内にも存在するモノクローナル抗体を
産生ずるために使用された宿主とは区別された宿主に由
来する抗−所定の抗原（例、抗−単純ヘルペスウィルス
）ＩｇＧで被覆された一定量のマトリックス、 （ｂ）　　所定の抗原（例、Ｈ８Ｖ）に対して特異的な
対応をする所定量のモノクローナ＃　Ｉ　ｇＭ　抗体、
（ｃ）　　対応する所定量のアビジン結合酵素、及び（
ｄ）　　該酵素の酵素活性を決定するための基質、を含
んでなることを特徴とする診断、ｅツク。

所定の抗原（例、Ｈ８Ｖ）の表示及び決定のための診断
・ぞツクにおいて、 （ａ）　　パック内にも存在するモノクローナル抗体を
産生ずるために使用された宿主とは区別された宿主に由
来する抗−所定の抗原（例、抗−単純ヘルペスウィルス
’）　ＩｇＧで被覆された一定量のマトリックス、 （ｂ）　　所定の抗原（例、Ｈ８Ｖ　）に対して特異的
な対応する所定量のモノクローナルＩｇＭ抗体、（ｃ）
　　対応する所定量の（１）該モノクローナル抗体を産
生ずるために使用された宿主とは区別された宿主に由来
する該モノクローナル抗体に対する抗体、或いは（１１
）該モノクローナル抗体に反応性を有する（１）のＦ’
ａｂ’断片、 （ｄ）　　対応する所定量のアビジン結合酵素、及び（
８３） （、）　　該酵素の酵素活性を決定するための基質、を
含んでなることを特徴とする診断・ぞツク。

所定の抗原（例、Ｈ８Ｖ）の表示及び決定のための診断
、ｅツクにおいて、 （、）　　パック内にも存在するモノクローナル抗体を
産生ずるために使用された宿主は区別された宿主に由来
する抗−所定の抗原（例、抗−単純ヘルペスウィルス）
　ＩｇＧで被覆された所定量のマトリックス、 （ｂ）　　対応する所定量の所定の抗原（例、Ｈ８Ｖ　
）に対して特異性のビオチニル化モノクローナルＩｇＭ
抗体、 ｆｃ）　　対応する所定量のアビジン、（ｄ）　　対応
する所定量のアビジン結合酵素、及び（ｅ）該酵素の酵
素活性を測定するための基質、を含んでなることを特徴
とする診断・ξツク。

所定の抗原（例、Ｈ８ｖ）の表示及び決定のための診断
パックにおいて、 （＆）所定量の抗−ヒ）ＩｇＭ重鎖特異性抗体で被覆さ
れたマトリックス、 （８４） （ｂ）　　対応する所定量のビオチニル化抗原（例、単
純ヘルペスウィルス）、 （ｃ）　　対応する所定量のアビジン結合酵素、（ｄ）
　　該酵素の酵素活性を決定するための基質を含んでな
ることを特徴とする診断パック。

【図面の簡単な説明】

第１図は、単純ヘルペスウィルス抗原を検出する本発明
の基本的増幅酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）の
概略図である。 第２図は、第２の増幅工程を含む基本試験の概略図であ
る。 第３図は、天然アビジンを用いてビオチニル化抗体及び
ビオチニル化酵素を架橋する修正法の概略図である。 第４図は、Ｈ８ｖ及びＩｇＭ抗体の検出試験のための概
略図である。 第５図は、それぞれ０１・、及び＾で示されるＩ（ＳＶ
　１、Ｈ８Ｖ　２及び未感染細胞溶菌液（例１）に対す
る活性についてＲＩＡの６個モノクローナル抗体調剤の
結合分析を示すグラフである。各点からの延長線は三つ
の値の範囲を示すものである。各図に示されたモノクロ
ーナル抗体は次の通りである；Ａ図１８．Ｂ、２　；　
８図１２．Ａ、３　；　Ｃ図２．Ａ、２　；Ｄ図ＩＢ、
１　；　８図７Ｂ、２及びＦ図Ｉ（Ｓ、２．Ａ。 出願人代理人　　　猪　股　　　　清 −く・ ☆・ ＦＩＧ、Ｉ Ａ　　　　　　　　　Ｂ　　　　　　　　　Ｃｆ五ｌ、
−）−１ｓＶ　坑利　１−１匪ｌ！−工ｋｆ’−’りづ
ｒり知４？ハ１食て−Ｉン辷１資−さ財−千す劉４・１
トソ７７又 じオケンオ苧＝Ａ’ｔ／フａ−グＩしＩ４Ｍ　　Ｆｆｂ
−Ｈ５Ｖゼしイ序こ４８？　＋　ζ％−ｉ’！：’：：
＃Ｌｒ−ブｉ−９７ＦＩＧ、２ Ａ　　　　　　８　　　　　　　　　ＣＤ☆　エ　七ノ
クロークＩし１戸−ｐＬｒ　　Ｈ５Ｖｊ’ｌ、４本）−
＝　　　１’７ＱＬｉＭｌｉＬＡり”ｏ７”１ンｔｔ用
ｂｃ−ｆ−＋４！ｊＬｉ１２３５− ＦＩＧ、３ ０　　＝　嚇＃、亀１１．′オナン ＦＩＧ、４ ね ＜　　　＝　　　ｃ？Ｌ）Ｍ　　Ｌ’Ａ　７”ｏ７’ｖ
ｙＬＪ’；☆　−）（ＳＶ　ｔ、ｇ−ＩＸ／１Ｌ）Ｉｖ
Ｉｌ　４％くっ、ニジ゛オナンオ片、を代’１−ＩＳυ
十五ノ雪。 １３岱素 り”ログ？１ン ＦＩＧ、５ １２３６− 第１頁の続き 優先権主張　＠１９８２年７月２６日■米国（ＵＳ）■
４０２０１５ ＠１９８３年６月１７日＠米国（ＵＳ）■５０３８８２ ０発　明　者　ロナルド・シー・ケネディーアメリカ合
衆国テキサス州ヒユ ーストン・カービー・ドライブ ・ナンバー７１４　７６００ ０発　明　者　リチャード・ディー・ヘンケルアメリカ
合衆国テキサス州ヒユ ーストン・コートランド・スト リート１８１５ Ｍ　　明　者　シンシア・イー・ケンドールアメリカ合
衆国ミズーリ州コロ ンビア・ジョージタウン・ドラ イブ４４１６ １２３７−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 仝 １、単純ヘルペウイルス抗原に対して特異的抗体活性を
   有するモノクローナルＩｇＭ抗体。 ２、マウスモノクローナルＩｇＭである特許請求の範囲
   第１項記載の抗体。 ３、単純ヘルペスタイプ１及びタイプ２の両者に対して
   特異的に反応性を有する特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の抗体。 ４、単純ヘルペスタイプ１に対しては特異的に反応性を
   有するが、単純ヘルペスタイプ２に対しては反応性を有
   さない特許請求の範囲第１項又は第２項記載の抗体。 ５、単純ヘルペスタイプ２に対して特異的に反応性を有
   するが、単純ヘルペスタイプ１に対しては反応性を有さ
   ない特許請求の範囲第１項又は第２項記載の抗体。 ６、細胞培養物ＡＴＣＣＨＢ　８１４８（本発明におけ
   る１、Ｂ、１　）に由来する単純ヘルペスウィルス抗原
   に対して特異的抗体活性を有するモノクローナルＩｇＭ
   抗体。 ７、細胞培養物ＡＴＣＣＴ（Ｂ　８１４９（本発明にお
   ける１８、Ｂ、２）に由来する単純ヘルペスウィルス抗
   原に対して特異的抗体活性を有するモノクローナルＩｇ
   Ｍ抗体。 ８、ビオチン標識を付された！許請求の範囲第１項〜第
   ７項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。 ９、成る選ばれた特定の抗原に対して特異的抗体活性を
   有するＩｇＭ抗体を形成する方法において、ａ、宿主動
   物を選ばれた抗原の複数の接種により免疫化し、 ｂ、免疫化後、少なくとも約３週間後且つ宿主動物から
   リンパ球細胞の除去前に最終抗体刺戟ブースター接種を
   与え、 Ｃ０宿主動物から抗体を産生ずるリンパ球細胞を回収し
   、 ｄ、該リンノｅ球細胞をミエローマ細胞に融合させるこ
   とにより細胞ハイブリッＰを形成し、及び Ｃ０この抗原特異性ＩｇＭ抗体産生ハイブリッｒ細胞を
   選択し、該ハイブリッｒを培養し、この抗原に対するＩ
   ｇＭ抗体を集めることを特徴とする方法。 １０、宿主動物がマウスである特許請求の範囲第９項記
   載の方法。 １１、ブースター接種がア、クユパント中において腹腔
   内に注射される抗原により行われる特許請求の範囲第９
   項記載の方法。 １２、アジュバントが完全フロインドアジュバントであ
   る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、抗原がウィルスである特許請求の範囲第９項又は
   第１１項記載の方法。 １４、特許請求の範囲第９項、１０項、１１項或いは第
   １２項の方法により製造されるＩｇＭモノクローナル抗
   体。 １５、単純ヘルペスウィルス抗原に対して特異的抗体活
   性を有するモノクローナルＩｇＭ抗体を形成する方法に
   おいて、 ａ、宿主動物を単純ヘルペスウィルス抗原の複数の接種
   により免疫化し、 ｂ、免疫化後、少なくとも約３週間後且つ宿主動物から
   リンＪｅ球細胞の除去前に最終抗体刺戟ブースター接種
   を与え、 Ｃ１宿主動物から抗体を産生ずるリンノｅ球細胞を回収
   し、 ｄ、該リン、ｅ球細胞をミエローマ細胞に融合させるこ
   とにより細胞ハイブリッドを形成し、及び ｅ、抗−単純ヘルぼス特異性ＩｇＭ抗体産生ハイブリッ
   ド細胞を選択し、該ハイブリッドを培養し、及び単純ヘ
   ルペスウィルスに対するＩｇＭタイプ共通性、タイプ１
   特異性、タイプ２特異性抗体を集めることを特徴とする
   方法。 １６、宿主動物がマウスである特許請求の範囲第１５項
   記載の方法。 （３） １７、ブースター接種がア、クユパント中において腹腔
   内に注射される抗原により行われる特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法。 １８、アジュバントが完全７０インドア・クユノζント
   である特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、　ａ、　　被検知ウィルス抗原に対するＩｇＧ抗
   体よりなる不溶性マトリックスを形成し、 ｂ、該マ）　＋７ツクスを生物学的流体と接触させ、被
   検知ウィルス抗原を免疫捕獲し、 Ｃ０得られたマトリックスを該ウィルス抗原に対するピ
   オチン標識モノクローナルＩｇＭ抗体と接触させ、 ｄ、得られたマトリックスを読み出し可能に標識化され
   たアビジンと接触させ、 ｅ、マトリックスにより免疫捕獲された標識化アビジン
   を読み出すことにより生物学的流体から免疫捕獲された
   ウィルス抗原の存在を決定及び／又は定量を行うことを
   特徴とする免疫学的検定法。 ２（１，単純ヘルペスウィルス抗原の表示及び決定の（
   ４） ための診断パックにおいて、 ａ、、ｅツク内にも存在するモノクローナル抗体を産生
   ずるために使用された宿主とは区別された宿主に由来す
   る抗−単純ヘルペスウィルスＩｇＧで被覆された一定量
   のマトリックス、ｂ、　　単純ヘルペスウィルスに対し
   て特異的な対応する所定量のモノクローナルＩｇＭ抗体
   、Ｃ１対応する一定着のアビジン結合酵素、及びｄ、該
   酸素の酵素活性を決定するための基質、を含んでなるこ
   とを特徴とする診断パック。 ２１、（ａ）がウサギ由来のＩｇＧであり、（ｂ）がマ
   ウス由来のモノクローナルＩｇＭである特許請求の範囲
   第加須記載の診断パック。 ２２、ａ、被検知ウィルス抗原に対するＩｇＧ抗体より
   なる不溶性マトリックスを形成し、 ｂ、該マトリックスを生物学的流体と接触させ、被検知
   ウィルス抗原を免疫捕獲し、 Ｃ０得られたマトリックスを該ウィルス抗原に対するモ
   ノクローナルＩｇＭ抗体と接触させ、ｄ、得られたマト
   リックスを該モノクローナル抗体に対するピオチン標識
   抗体と接触させ、・、得られたマトリックスを読み出し
   可能に標識化されたアビジンと接触させ、 ｆ、マトリックスにより免疫捕獲された標識化アビジン
   を読み出すことにより生物学的流体から免疫捕獲された
   ウィルス抗原の存在を決定及び／又は定量を行うことを
   特徴とする免疫学的検定法。 ｎ、単純ヘルペスウィルス抗原の表示及び決定のための
   診断ノソツクにおいて、 色、ノソツク内にも存在するモノクローナル抗体を産生
   ずるために使用された宿主とは区別された宿主に由来す
   る抗−単純ヘルペスウィルスＩｇＧで被覆された一定量
   のマトリックス、ｂ、単純ヘルペスウィルスに対して特
   異的な対応する所定量のモノクローナルＩｇＭ抗体、Ｃ
   ０対応する一定量の（１）該モノクローナル抗体を産生
   ずるために使用された宿主とは区別された宿主に由来す
   る該モノクローナル抗体に対すル抗体、或いは（Ｉｆ）
   該モノクローナル抗体に反応性を有する（１）のＦａｂ
   ’断片、 ｄ、対応する一定量のアビジン結合酵素、及びｅ、該酵
   素の酵素活性を決定するための基質、を含んでなること
   を特徴とする診断、ｅツク。 ２４、　（ａ）がウサギ由来ＩｇＧであり、（ｂ）がマ
   ウス由来モノクローナルＩｇＭである特許請求の範囲第
   ｎ項記載の診断・ぐツク。 ２５、ａ、被検知ウィルス抗原に対するＩｇＧ抗体より
   なる不溶性マトリックスを形成し、 ｂ、該マ）　ＩＪラックス生物学的流体と接触させ、被
   検知ウィルス抗原を免疫捕獲し、 Ｃ１得られたマトリックスを該ウィルス抗原に対するピ
   オチン標識モノクローナル抗体と接触させ、 ｄ、得られたマトリックスをアビジンと接触させ、 ｅ、得られたマトリックスを読み出し可能に標識化され
   たピオチンと接触させ、 ｆ、マトリックスにより免疫捕獲された標識ピオチンを
   見出すことにより生物学的流体から免（７） 疫捕獲されたウィルス抗原の存在を決定及び／又は定量
   化することを特徴とする免疫学的検定法。 鋲単純ヘルペスウィルス抗原の表示及び決定のための診
   断ノＲツクにおいて、 ａ、パック内にも存在するモノクロ−ナール抗体を産生
   ずるために使用された宿主とは区別された宿主に由来す
   る抗−単純ヘルペスウィルスＩｇＧで被覆された一定量
   のマトリックス、ｂ、対応する所定量の単純ヘルペスウ
   ィルスに対して特異性のビオチニル化モノクローナルＩ
   ｇＭ抗体、 Ｃ０対応する所定量のアビジン、 ｄ、対応する所定量のアビジン結合酵素、及びｅ、該酵
   素の酵素活性を測定するための基質、を含んでなること
   を特徴とする診断パック。 茨、（ａ）がウサギ由来ＩｇＧであり、（ｂ）がマウス
   由来モノクローナルＩｇＭである特許請求の範囲第ｎ項
   記載の診断ｉＲラック ２８、ａ、　　抗−ヒ）ＩｇＭ抗体を含んでなる不溶性
   マ（８） トリックスを形成し、 ｂ、該マトリックスを生物学的流体と接触させて、被検
   出ＩｇＭ免疫グロブリンを免疫捕獲し、Ｃ１該マトリツ
   クスを被検出ＩｇＭ免疫グロブリンと結合するウィルス
   であるピオチン標識ウィルス抗原と接触させ、 ｄ、得られたマトリックスを読み出し可能に標識化され
   たアビジンと接触させ、 Ｃ，マトリックスにより免疫捕獲された標識アビジンを
   読み出すことにより生物学的流体から免疫捕獲されたＩ
   ｇＭ免疫グロブリンの存在を決定し及び／又は定量する
   ことを特徴とする免疫学的検定法。 西、単純ヘルペスウィルス抗原の表示及び決定のための
   診断、Ｒツクにおいて、 ａ、所定量の抗−ヒ）ＩｇＭ抗体で被覆されたマトリッ
   クス、 ｂ、対応する所定量のビオチニル化単純ヘルペスウィル
   ス、 Ｃ０対応する所定量のアビジン結合酵素、ｄ、該酵素の
   酵素活性を決定するための基質を含んでなることを特徴
   とする診断／ｅラック３０、（ＬＬ）がヤギ抗−ヒ）Ｉ
   ｇＭ抗体である特許請求の範囲第四項記載の診断ノミツ
   ク。 ３１、読み出し可能な標識が反応性基質と接触された酵
   素である特許請求の範囲第１９項、第２２項、第５項又
   は第四項記載の検定法。 ３２、ウィルス抗原が単純ヘルペスウィルス抗原である
   特許請求の範囲第１９項、第四項、第５項又は第四項記
   載の検定法。 ３３、ウィルス抗原が単純ヘルペスウィルス抗原である
   特許請求の範囲第３１項記載の検定法。 ３４、　単純ヘルペスウィルスに対する抗体を有する単
   純ヘルペスウィルス検定のための改良された免疫学的検
   定法において、単純ヘルペスウィルスに対するモノクロ
   ーナルＩｇＭ抗体である抗体を含んでなることを特徴と
   する検定法。 ３５、ウィルスがＨ８Ｖ　１である特許請求の範囲第４
   項記載の改良された免疫学的検定法。 ３６、ウィルスがＨ８Ｖ　２である特許請求の範囲第３
   ４項記載の改良された免疫学的検定法。