JPH04503109A - アビジン―ビオチン助力のイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アビジン−ビオチン　のイムノア・・セイ発明の背景 本発明は、スクリーニング及び診断目的のために体液、たとえば唾液、尿、涙、 血清又は血漿中の抗体の検出に関する。

特に、本発明は、そのような体液に少量存在する抗体又は少量のそのような体液 が利用でき、そしてさらに存在する抗体が特定の疾病状態の抗原特異性特徴を有 し、そして診断値である抗体の検出に関する。

哺乳類の体液、たとえば血清、血漿、唾液、涙、尿、ミルク、精液、滑液、等は 、疾病、たとえば細菌及びウィルス感染及び自己免疫起源の疾患の診断に有用で ある抗体を含むことができる。体液、たとえば唾液は、これらの診断的に価値あ る抗体の源として血清及び血漿よりも有意な利点を有する。

なぜならば、それらは設備及び血液サンプルの採取に付随する危険性を伴わない で得られるからである。しかしながら、しばしば抗体の濃度は、抗体についての 従来の試験を実用的にするのにはこれらの体液には低過ぎる。

特に唾液は、診断指示体としての問題を提供する。これらの問題は、唾液におけ る抗体の低濃度性及びすばやく行なわれ得る信頼できる診断試験のために十分な 唾液の収集の不便さ及び処理量から生じる。

発明の要約 １つの観点において、本発明は、多孔性マトリックスに共有結合される抗体−結 合タンパク質を供給しく前記マトリックスは透明なカラム内に配置され）；前記 抗体を含む試験流体と前記タンパク質−結合マトリックスとを接触し、そしてイ ンキュベートし、それによって、前記タンパク質が、前記抗体を固定するために 前記抗体と反応し、対象のビオチニル化された抗原と固定された抗体とを接触し 、そしてインキュベートし、それによって、前記ビオチニル化された抗原が、前 記ビオチニル化された抗原を固定するために前記固定された抗体と反応し；酵素 に共有結合される前記の溶液と固定されたビオチニル化抗原−固定化抗体−タン パク質結合マトリックス複合体とを接触し、そしてインキュベートし、それによ って、前記酵素ラベルされたアビジンが、前記酵素ラベルされたアビジンを固定 するために前記マトリックス複合体と反応し；前記固定された複合体と基質溶液 とを接触し、そしてインキュベートし、ここでアビジンに結合される前記酵素が 前記基質の反応を触媒し、そして検出可能な生成物を生成し；そして検出される べき前記抗体の存在に前記検出可能な反応生成物を相互関係せしめる段階を含ん で成る、体液中の抗体の検出のための方法である。

もう１つの観点において、本発明は、多孔性マトリックスに共存結合される抗体 −結合タンパク質を供給しく前記マトリックスは透明なカラム内に配置され）； 前記抗体を含む試験流体と対象の抗原の溶液とを接触し、そしてインキュベート シ（前記抗原はビオチニル化され）；前記組合された溶液とアビジンの溶液とを 接触し、そしてインキュベートしく前記アビジンは酵素に共有結合され）；抗体 −ビオチニル化された抗原−酵素ラベルされたアビジンの複合体が前記マトリッ クスにより固定されるように前記マトリックスと前記組合された溶液とを接触し 、そしてインキュベートし；前記固定された複合体と基質溶液とを接触し、そし てインキュベートし、ここでアビジンに結合される前記酵素が前記基質の反応を 触媒し、そして検出可能な生成物を生成し；そして検出されるべき前記抗体の存 在に前記検出可能な反応生成物を相互関係せしめる段階を含んで成る、体液中の 抗体の検出のための方法である。

本発明のさらにもう１つの観点において、本発明は、多孔性マトリックスに共有 結合される抗体−結合タンパク質を供給しく前記マトリックスは透明なカラム内 に配置され）；前記抗原を含み、そして水性緩衝液中、前記抗原に対する少量の 抗体を含む試験流体の溶液を供給し；抗体及び抗原の複合体が前記マトリックス により固定されるように前記マトリックスと前記溶液とを接触し、そしてインキ ュベートし；プロティンＡに結合するＦｃ部分を欠くが、しかし前記抗原に結合 するその能力を保持するＦａｂフラグメントであるように変性されたモノクロー ナル抗体の溶液を供給しく前記抗体はビオチニル化されており）；抗体−抗原− Ｆａｂ抗体複合体が前記マトリックスにより固定されるように前記溶液と固定さ れた複合体とを接触し、そしてインキュベートし；酵素に共有結合されたアビジ ンの溶液を供給し；前記溶液と前記固定された抗体−抗原−Ｆａｂ抗体複合体と を接触し、そしてインキュベートし、それによって、前記酵素ラベルされたアビ ジンが、前記酵素ラベルされたアビジンを固定するために前記マトリックス複合 体と反応し；前記固定された複合体と基質溶液とを接触し、そしてインキュベー トし、それによって前記アビジンに結合される酵素が前記基質の反応を触媒し、 そして検出可能な反応生成物を生成し；そして検出されるべき前記抗体の存在に 前記検出可能な反応生成物を相互間係せしめる段階を含んで成る、試験生物学的 流体中の抗原の検出のための方法である。本発明はまた、透明な開口式カラム； それらの間に空間を確定するために前記カラム内に配置される一対の多孔性フリ ット；それらに抗体−結合タンパク質を共有結合されている多孔性マトリックス ；及び前記一対の多孔性フリット間に前記空間で配置される前記マトリックスを 含んで成る試験キットにも向ける。このキットはまた、適切な試薬、たとえばサ ンプル希釈用緩衝液、ビオチニル化された抗原溶液、抗−抗原抗体、ビオチニル 化されたＦａｂモノクローナル抗体、酵素結合のアビジン溶液、酵素基質及び対 照溶液を含んで成る。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明により利用される結合機構を図示し；そして 第２図は、本発明で使用される装置を図示する。

好ましい態様の記載 本発明の好ましい態様は、プロティンＡ、すなわち抗体分子に急速に結合するタ ンパク質を化学的に結合する多孔性マトリックスに流体を通すことによって体液 から抗体を急速に単離する方法を含んで成る。従うて、抗体は、それがマトリッ クスを通過するにつれて流体から急速に除かれ、そして抗体は抗原特異性のため の続く比色定量アッセイのためにマトリックスにおいて濃縮される。好ましくは 、多孔性マトリックスは、透明な材料から製造されたカラムに置かれる共有結合 されたプロティンＡを有する予定量のビーズ形アガロースゲルである。カラムは 、ゲルを通しての体液の急速な濾過を可能にしながら、アガロースゲルを保持す るために底で多孔性フリットを有する。カラムにおけるプロティンＡ含有ゲルの 量は、体液中の抗体の最適量を結合し、そして続く比色定量アッセイのために適 切な大きさの表面を供給するのに十分な量である。

プロティンＡは、細菌スタフィロコーカス　アウレウス（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ ｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　（Ｃｏ　ｗ　ａ　ｎ　株ｌ）の細胞壁から単離され るタンパク質である。プロティンＡ（また、タイプＩ　Ｆｃ受容体と呼ばれる） は、この細菌から単離されたタンパク質として市販されており、そして他の細菌 に発現される組換え体形としても利用できる。プロティンＡは、いくつかの通常 使用される化学反応のいづれかによりアガロースに共有結合され得る。これらの 技法のいくつかの例は次の通りである二アミノ基又はカルボキシル基が、ジアミ ノアルカン（アミノ基の導入）又はアミノカルボキシルアルカン（カルボキシル 基の導入）による臭化シアン方法によりアガロースマトリックス中に導入される 。この方法は、Ｍ、Ｗｉｌｃｈｅｃｋなど、“Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｃｏｓｐｏｕｎｄｓ　ｂ ｙ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　”　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｃａｌ　Ａ＋す１■ｊＬ工２３：３４７〜３８５．１ ９８６により説明される６次にこれらの誘導体化されたアガロースゲルは、通常 使用されるカルボジイミド化学物質の使用又はＯ−ブロモアセチル−Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドを有するアミノ誘導体化されたアガロース中に導入されるＮ −ヒドロキシスクシンイミドのような通常使用される脱離基の使用によりタンパ ク質上でカルボキシル基又はアミノ基に結合される。他の既知の技法は、アガロ ース又は他の多糖マトリックスにプロティンＡを共有結合するために使用され得 る。

急速且つ實欲に抗体を結合する他のタンパク質が利用でき、そしてプロティンＡ の代わりに本発明の出願に記載される目的のために使用され得る。これらのタン パク質は、グループＡストレプトコーカスから単離されたあるタンパク質（タイ プＩｆ　Ｆｃ受容体）、はとんどのヒトＣ及びＧストレブトコーカス株から単離 されたプロティンＧ（タイプｍ　Ｆｃ受容体）、ある株Ｇストレブトコーカス株 から単離されたタイプＩＶ　Ｆｃ受容体及びストレブトコーカス　ズーエビジミ カス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｏｅｐｉｄｉｍｉｃｕｓ）から単離さ れたタイプＶ。

ＶＩ　Ｆｃ受容体を包含する。これらのタンパク質のそれぞれは、種々の鴫乳類 種からの種々のサブクラスの免疫グロブリンに結合するその強さにおいて他のも の以上の一定の利点を有する。

多のタイプの多孔性マトリックスも、それらがタンパク質の低い非特異的結合及 び官能基、たとえばヒドロキシル基又はプロティンＡ又は抗体を結合する他のタ ンパク質の共有結合を可能にする独特の化学物質を有する場合、本発明の目的の ために適切である。そのようなマトリックスの例は、商標“Ｅｕｐｅｒｇｉｔ　 Ｃ″としてＲ’ｈｓ　Ｐｈａｒｍａから入手できるメタクリルアミド、グリシジ ルメタクリレートビーズポリマーである。

上記のように多孔性マトリックスへの抗体の結合の後、過剰量の体液が、適切な 水性緩衝波により洗浄することによってマトリックスから除かれる０次に、結合 された抗体を有するマトリックスが、その結合された抗体の抗原特異性について アッセイするために支持体として使用される。

いくつかの方法が、単離された抗体の抗原特異性のアッセイのために利用できる 。これらは、対象の抗原に共有結合される酵素、たとえばホースラディシュペル オキシダーゼ又はアルカリボスフ１ターゼの使用を包含する。この技法は、Ｔ、 Ｋｉｔａｇａｗａ　など＋ｌ　”Ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｉｍｓ＋ｕｎ ｏａｓｓａｙ　ｏｆ　１ｎｓｕ１ｉｎ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｃｏｕｐ ｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ、　”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈ堕ｎ紅ｈ ７９　：　２３３〜２３６．１９７６に例示される。これらの酵素は、抗原の存 在を示す色の反応を展開するために使用される。利用できるもう１つの方法は、 Ｇ、　Ｒ，Ｄｒｅｅｓ■ａｎなど、、アメリカ特許第４，５３５，０５７号；　 Ｄ、　Ａ、　Ｆｕｃｃｉｌｌｏ、“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａ ｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ、”Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　３　：　４９４〜５０１．　１９８５ 　；及びＭ、　Ｗｉｌｃｈｅｃｋなど＊ｊ　”Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　 ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｓ　ａ　ｔｏｕｌ　ｉｎ　ａ ＋ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ＋　”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａｌ　ｓｉｓ＋　２６　：１〜４５におけるように抗原へ のビオチンの共有結合である。ビオチン（また、ビタミンＨとしても知られる） は、次の化学構造を有する：それはタンパク質アミジンによりひじょうに高い結 合活性（Ｋｄ　１０〜１５Ｍ）で結合される。４個のビオチン分子がアビジン分 子当たりに結合される。酵素、たとえばホースファインユペルオキシターゼ又は アルカリホスファターゼがアビジン分子に化学的に結合される場合、アビジン− ビオチン相互反応は、対象の抗原とその抗原の存在を示す色の反応を展開するた めに使用される酵素との間に分子橋を構成することができる０個々のアビジン分 子は４個のビオチン結合部位を有するので、抗体分子当たりの酵素分子の数は、 過剰のビオチニル化された抗原の存在において高められ、そしてそのアッセイの 感度は高められる。

抗原とビオチン分子との間の化学結合は、利用できる多くの種々の化学反応配列 により形成され得る。これらの反応は典型的には、抗原のタンパク質構造におい てアミノ基を誘導体化するためにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル又はヨード脱 離基を利用する。典型的な試薬は下記に示される：炭水化物抗原は、ビオチンヒ ドラジドと、過ヨウ素酸塩との反応の後、多糖構造で生成されるアルデヒド基と の反応によりビオチニル化され得る。これらの及び他の利用できる化学反応の間 での最良のビオチニル化システムの選択は、試験される抗原の特定の性質に依存 する。

本発明は、酵素検出システムにより抗原を結合するためにビオチン−アビジン反 応の使用のユニークな適用を示す。このユニークな使用は、抗原が、このシステ ムを図示する第１図に示されるように、プロティンＡにより固定された特異的抗 体を含む多孔性マトリックスにそれを通すにつれて固定される事実にある。

過剰のビオチニル化された抗原の存在下で、多くのアビジン−酵素接合物がプロ ティンＡにより固定されるあらゆる抗体のためにゲルに結合され得る。これは、 その技法にその高い感度を付与する。

アビジンに結合される酵素は、抗原の検出に使用される比色測定アッセイを確定 し、そしてこれは結局、生物学的流体における一定のタイプの抗体の存在につい ての試験である。

より通常使用される酵素のうち２種は、アルカリホスファターゼ及びホースラデ ィシュペルオキシダーゼである。これらの酵素は、タンパク質のための通常使用 される化学的経路を用いてアビジン分子に化学的に結合され得；タンパク質共有 結合は、グルタルアルデヒドの使用又は他のホモニ官能価及びヘテロニ官能価の 試薬、たとえばジスクシンイミジルスベレート及びスクシンイミジル−Ｎ−（４ −カルボキシ−シクロヘキシルメチル）−マレイミドの使用を包含する（Ｓ、　 Ｙｏｓｈ　ｉ　ｔａ　ｔｅなど、、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｃ ｏｓｅ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　鹿ｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ　ａｎｄ　 ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕ ｃｃｉｎｉｍｉｃｌｅ　ｅｓｔｅｒ　ｏｆ　Ｎ−（４−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｃｙｃ ｌｏｈｅｘｙｌｓｅｔｈｙｌ）−ｍａｌｅｉａ＋ｉｄｅ、　”　Ｅｕｒ、　Ｊ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０１　：　３９５〜３９９　）　、これらの化学は、ス クシンイミジルエステルとタンパク質のアミノ基との反応性及びマレイミド成分 とタンパク質の遊離ｓＨ基との反応性を利用する。

ホースラディシュペルオキシダーゼが検出酵素として使用される場合、典型的な 基質は、ジアミノベンジジン、４−クロロ−１−ナフトール又は３．３’、５． ５’−テトラメチルベンジジン（７）である、これらの材料のいづれがが過酸化 水素と混合され、そして酵素に暴露される場合、暗色のポリマー材料が形成され る。この着色された生成物は不変であり、すなわち不溶性であり、そして固体支 持体上で沈殿する。

この着色された沈殿物の生成は酵素の存在を示し、そして本発明の場合、抗原に 対して特異的な抗体の存在が調べられる。

高く着色された沈殿物を生成する他の材料は、アルカリホスファターゼ、たとえ ば４−クロロ−２−メチルアニリン及び３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸４′− クロロ−２′−メチルアニリドホスフェートの混合物又は５−ブロモ−４−クロ ロ−３−インドールイル−ホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウムの混合 物の存在を示すために使用され得る。

本発明において、不溶性マトリックスに結合されるプロティンＡによる抗体の捕 獲が、１５分以下の合計アッセイ時間（分）で生じる。カラム技法の使用は、本 発明に速度及び便利さを付与し、そして多量の流体からの抗体の濃縮を可能に次 のことは、本発明の基本である考え及び技法の典型的且つ実質的な使用であるニ ブロチインＡが、（製造者又は商業的供給者、たとえばＢｉｏ　Ｒａｄ　Ｃｏｒ ｐ、　Ｐｒｏｄｕｃｔ　１５３６１５４のいづれかにより）示された技法により 結合されているビーズ（７５〜３００ミクロンの直径）から成る架橋されたアガ ロースを、リン酸緩衝波（ＰＢＳ）により洗浄し、そして０．７５％ゼラチン、 ０．３％Ｔｗｅｅｎ２０界面活性剤を含むＰＢＳ中、２５％の懸濁液として４° Ｃで１２時間インキュベートする。これは、アガロースへのタンパク質の非特異 的結合を減じる。アガロース−プロティンＡビーズを、ＰＢＳにより再び洗浄す る。第２図に示されるように、６鴎１の体積及び底で多孔性（７０μｍの孔サイ ズ）のポリエチレンディスク　、（フリット）１２を有する洗浄されたポリスチ レンヵラムエ０　（Ｂａｗｌ、Ｄ、Ｘ　１０２＋ｎｍ）を使用する（たとえばＰ ｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、製品２９９２０）、キＪｒｙブ１４は、カ ラムを通しての液体の流れを制御するためにカラムの底の先端上で使用される。

本発明の基本必要条件を満たす他の寸法のカラムも使用できる。調製されたアガ ロース−プロティンＡビーズ１６の２００ＪＩｌを、移動のための適切なＰＢＣ を含むカラムの底でのフリット上に置く。第２フリツト１８を、沈降されたアガ ロースビーズの上部に置き、２つの多孔性フリットの間にサンドイツチされたア ガロースビーズの４−一の厚さのディスクをもたらす、ここに記載されるカラム は、（１）適切な量のアガロース−プロティンＡビーズを含み、（２）ビーズの 容易な観察を可能にし、（３）体液中の溶質及びビーズに結合されるプロティン Ａとの間で適切な接触面を伴ってビーズを通しての試験されるべき体液の流れを 可能にし、（４）体液中の抗体の比色測定試験を行なうために使用される試薬の 連続的な添加及び洗浄を可能にするであろう装置の不可欠な必要条件を満たす。

上記のようにカラム中にアガロース−プロティンＡビーズを置いた後、試験され るべき体液的ト１を、０．２５μのトリス（ヒドロキシメチルアミンメタンＬ０ ．３７％のゼラチン、０．３０％のＴｗｅｅｎ２０ＳＯ，０１５ｕのＮａＣ１及 び０．０１μのリン酸ナトリウムを含む水性緩衝液２ｍｌにより希釈する。この 緩衝液を“希釈緩衝液”と呼び、そして約８．０のｐＨを有する。希釈された体 液を上部フリットの上部のカラムに置き、そして底のキャップを除くことによっ てカラムを通しての排水を可能にする（この段階のためには３〜５分）０次に、 そのカラムを３■１の部分の希釈緩衝液により２度洗浄する（洗浄当たり３分） 、ビオチニル化された抗原（製造者により調製された）１０μｇを、希釈緩衝液 ２ｍｌに添加し、そしてカラムを通して排水する（２分）、追加の感度が、体液 と共に抗原を５分間、予備インキュベートし、そして次にカラムを通して排水す ることによって得られる。

この後、２Ｘ３１１１の希釈緩衝液により洗浄する（それぞれ３分）、、２０μ ｇのアビジン−ペルオキシダーゼ接合体（製造者又は商業的な供給者、たとえば Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、製品３１５１）を、２ｍｌの希釈緩衝液 に溶解し、そしてカラムを通して排水する（２分）、再びカラムを３ｍｌの希釈 緩衝液により２度洗浄する（それぞれ３分）、これらの洗浄の後、２ｓ＋１の基 質溶液をカラムに通す、その基質溶液は、ｏ、ｏｏ。

０４％のＨ□０□を含む、ＰＢＳ中、０．５ａ＋ｇ／ｍｌの３．３−ジアミノベ ンジジンであり得る（２分）、この点でのゲルの暗色化なる程度が、試験抗原に 対して特異的な生物学的流体における抗体の存在を示す、水による追加の洗浄は 、試験カラムのキャップ及び安定した色の進行を伴っての冷蔵庫温度での７日間 の貯蔵を可能にする。

対照は、体液の既知の正及び負のサンプル又は正及び負の抗体の適切な溶液によ り同時に実施されるカラムから成る。

色の比較のための他の又は追加の対照は、プロティンＡを含まないアガロース（ 負）又はそれに結合されるビオチンを有するアガロースである。カルボン酸を含 むビオチンは、アガロースにプロティンＡを結合するために使用される同じ化学 反応によりアガロースに結合され得る。これらの色−比較一対照は、アガロース −プロティンＡによりカラム中のアガロースの追加のアリコートを単純に交換す ることによってその試験と同じカラムで実施され得；個々のアガロースのアリコ ートは、ポリエチレンフリットにより他から分離される。

例■ 体液１ｍ＋１をアッセイするために例Ｉに記載される方法は約２７分かかる。こ の時間は、次の変法により有意に減じられ得る＝１−１の体液を２ｍ＋１の希釈 緩衝液により組合す、１０μｇのビオチン−抗原複合体を添加した後、室温で２ 分間インキュベートする。２０μｇのアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を添加 し、そしてその混合物をすぐに、カラムに通す（３分）、この後、３■ｌの希釈 緩衝液により２度洗浄しく６分）、そして２ｍｌのジアミノベンジジン−ＨｚＯ ｚ基質溶液により色を展開する（２分）。この変法を伴っての合計のアッセイ時 間は、約１３分であり、そしてその感度は前記の感度に等しいか、又はそれ以上 である。

例■ 例■の簡略されたカラム方法を用いて、ヒト免疫欠損ウィルス−１（ＨＩＶ−１ ）タンパク質に対する血清抗体を有することが確証されている後天性免疫欠損（ ＡＩＤＳ）患者の唾液及び血清（陽性サンプル）を試験したｅ　ｌＯｕｇのビオ チニル化されたＨＩＶウィルス溶解物をカラム当たりに使用した。６ＩＩｌの陽 性血清又は１５０μｌの陽性唾液を用いる場合、はぼ最大の暗カッ色がジアミノ ベンジジン基質を用いてアガロースビーズ上に得られた。感染されていない人か らの対照の血清及び唾液は、同じ方法により実質的に無色のアガロースビーズを 付与した。同じ結果が、組換え遺伝子（市販の製品、エンベロープペプチドＰ　 １２１　、　Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、　Ｉｎｃ、）の発現により生成されるＨＩＶタ ンパク質を抗原として用いて得られた。類領する結果がまた、ウィルスＨＴＬＶ −１のウィルス溶解物及び感染された患者からの血清を用いて得られた。

同様の態様において、本発明は、Ｂ型肝炎及び単純ヘルペスタイプ■及びタイプ ■のような物質による感染による患者の体液中の疾病特異的抗体の検出のために 有用であるはずである。

本発明の基本的な機能を満たすもう１つの構成は、使い捨てのプラスチックピペ ット先端にフリット−プロティンＡ−アガロース−フリットのサンドインチを取 り付けることである。フリットは先端の壁に対して堅くくさび止めにし、アガロ ースビーズを確保し、そしてビーズを通しての液体の流れを可能にする。標準の 手動ピペット単位に取り付けられる場合、その先端は、体液及び種々の試薬を抜 き取り、そしてアガロースビーズを通して流体を洗浄するために使用され得る。

例■ ＨＩＶ及び他の抗原に対して特異的な抗体を検出するその能力の他に、本発明は 、対象の抗原を直接検出するために変性され得る。ビオチニル化された抗原がこ の方法で排除される。試験されるべき生物学的流体が、カラムにおけるブロック 緩衝液に添加される。抗原に対するヒト抗体２μｇをまた、そのブロック緩衝液 におけるこの溶液に添加する。５〜１０分間のインキユベーションの後、Ｆａｂ フラグメント（プロティンＡに結合する分子のＦｃ部分を欠くが、しかし抗原を 結合するその能力は保持する）であるように変性されたマウスモノクローナル抗 体２μｇを添加する。（１）、　ＨｌＤｒｅｓｓｅｒ。

”　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ　ｉａ＋＠ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎ ｇ　ｃｅｌｌｓ、”　ｉｎ　Ｄ、ＬＨｅｉｒ版、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍ＊ｕｎｏｌｏｇｙ＋　３４版。

Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　０ ｘｆｏｒｄ　；及びＪ、　Ｊ。

Ｌａｎｇｏｎｅ＋　”　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ｏｆ　Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃ ｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｉｍｓｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ 　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｉａ ｎｄ　Ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ　”　Ａｄｒａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｌ５ｕｓｕ ｎｏｌｏ　＋　３２　：　１５７〜２５２）、この変性されたモノクローナル抗 体はまた、上記のようにビオチニル化される。そのモノクローナル抗体は、ヒト 抗体に結合されない、抗原のそれらの部分に結合する。さらに、５〜１０分間の インキユベーションの後、アビジン−酵素検出試薬を添加し、そして混合物をカ ラムを通して排水する。洗浄の後、色原体の検出を前記のようにして行なう、モ ノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントは単にカラムに結合し、そして従って色の 進行は、対象の抗原が存在する場合にのみ、見出されるであろう。抗原の直接的 な検出のための他のイムノア２セイに比べると、この技法は、抗体、たとえば生 物学的サンプルに内因的に存在する抗体の結合により抗原−抗体複合体として抗 原を捕獲する。また、多量の生物学的流体が小さな検出表面上で濃縮され得る。

例Ｖ この技法はまた、対象の抗原に対する内因性抗体を欠き、そしてその抗原に対し て特異的なヒト抗体の他の源が存在しない生物学的流体に適合され得る。これは 、たとえば植物病原体の抗原についてアッセイされるべき植物組織抽出物におけ る事例である。ここで、病原体の抗原に対して特異的な２種のモノクローナル抗 体が使用される。１つの抗体は、抗原を結合し、そして固定されたプロティンＡ へのその結合を媒介するために抽出物に添加される。２番目の抗体は、ビオチニ ル化されたＦａｂフラグメントに製造され、そして検出抗体として使用される。

この技法の特定の可能性ある用途は、ジャガイモのコリネバク−■ラム　セベド ニカム感染の検出のために存在する。

Ｃセペドニカム感染は、ジャガイモに細菌性環状腐敗を生成する。感染された植 物の幹及び塊茎は多くのこれらのグラム陽性細菌を含む。多くのモノクローナル 抗体が、生物のためのイムノアッセイに使用され得るＣ、セペドニカムの抗原に 対するマウスに生成された。疑わしい植物組織の抽出物を、細菌抗原の溶解性を 最大にするために界面活性剤を含む流体に標準の技法に従って調製する。不溶性 物質を、濾過及び遠心分離により除去する。この抽出物１〜５ｍＬを、上記カラ ムに添加する。そのカラムは、１ｍＬの希釈緩衝液及び主要細菌性抗原に対する モノクローナル抗体に１０μｇを含む、ビオチニル化され、そしてＦａｂフラグ メントとして存在する第２モノクローナル抗体１０μｇがまた存在する。このモ ノクローナル抗体は、同じ細菌性抗原上で第２エピトープに対して特異的である 。５分のインキュベーションの後、その混合物をカラムを通して排水する。その カラムを、上記のようにして希釈緩衝液により洗浄する。次に、酵素に結合され るアビジンをカラムに通し、次に例Ｉ及び■に記載されるようにして洗浄する。

酵素のための適切な色素原性基質を添加し、そして色の展開を、元の組織におけ る細菌の存在を評価する補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年７月飴日

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．抗体を含む体液中の抗体を検出するための方法であって； ａ．多孔性マトリックスに共有結合される抗体−結合タンパク質を供給し（前記 マトリックスは透明なカラム内に配置され）； ｂ．前記抗体と前記段階（ａ）のタンパク質−結合マトリックスとを接触し、そ してインキュベートし、それによって、前記タンパク質が、前記抗体を固定する ために前記抗体と反応し； ｃ．ピオチニル化されている対象の抗原の溶液を供給し；ｄ．前記段階（ｃ）の ピオチニル化された抗原と段階（ｂ）の固定された抗体とを接触し、そしてイン キュベートし、それによって、前記ピオチニル化された抗原が、前記ピオチニル 化された抗原を固定するために前記固定された抗体と反応し；ｅ．酵素に共有結 合されるアピジンの溶液を供給し；ｆ．前記段階（ｅ）の溶液と段階（ｄ）の固 定されたピオチニル化抗原−固定された抗体−タンパク質結合マトリックス複合 体とを接触し、そしてインキュベートし、それによって、前記酵素ラベルされた アピジンが、前記酵素ラベルされたアピジンを固定するために前記マトリックス 複合体と反応し；ｇ．前記段階（ｆ）の固定された複合体と基質溶液とを接触し 、そしてインキュベートし、ここでアピジンに結合される前記酵素が前記基質の 反応を触媒し、そして検出可能な生成物を生成し；そして ｈ．検出されるべき前記抗体φ存在に前記検出可能な反応生成物を相互関係せし める段階を含んで成る方法。
2. ２．前記体液が唾液である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記マトリックスが、タンパク質の低い非特異的結合及び抗体を結合するタ ンパク質の結合を可能にする官能基又は他の化学的性質を有するいづれかの多孔 性材料である請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記マトリックスがアガロースである請求の範囲第３項記載の方法ル
5. ５．着色−比較対照が、ポリエチレンディスクによりお互いから分離されたアガ ロースの追加のアリコートを用いて同じカラムにおいて作動される請求の範囲第 ４項記載の方法。
6. ６．前記タンパク質がプロテインＡである請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記タンパク質が、他の源、たとえばタイプＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ及びＶ ＩＦｃ受容体の群から選択されたものに由来する請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記試験流体が前記タンパク質結合マトリックスと接触され、そしてインキ ュベートされた後、前記マトリックスが洗浄される請求の範囲第１項記載の方法 。
9. ９．前記ピオチニル化された抗原が前記固定された抗体と接触され、そしてイン キュベートされた後、前記マトリックスが洗浄される請求の範囲第１項記載の方 法。
10. １０．前記酵素結合アピジンが前記固定された抗原複合体と接触され、そしてイ ンキュベートされた後、前記マトリックスが洗浄される請求の範囲第１項記載の 方法。
11. １１．前記カラムが開口式である請求の範囲第１項記載の方法。
12. １２．前記カラムがポリスチレンである請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．前記マトリックスが多孔性ポリエチレンディスクにより支持されている請 求の範囲第１項記載の方法。
14. １４．前記試験体液が、適用の前、水性緩衝液により希釈される請求の範囲第１ 項記載の方法。
15. １５．抗体を含む体液中の抗体を検出するための方法であって； ａ．多孔性マトリックスに共有結合される抗体−結合タンパク質を供給し（前記 マトリックスは透明なカラム内に配置され）； ｂ．前記抗体を含む試験流体と対象の抗原の溶液とを接触し、そしてインキュベ ートし（前記抗原はピオチニル化され）；ｃ．前記段階（ｃ）の組合された溶液 とアピジンの溶液とを接触し、そしてインキュベートし（前記アピジンは酵素に 共有結合され）； ｄ．抗体−ピオチニル化された抗原−酵素ラベルされたアピジンの複合体が前記 マトリックスにより固定されるように前記段階（ａ）のマトリックスと前記段階 （ｃ）の組合された溶液とを接触し、そしてインキュベートし；ｅ．前記階段（ ｄ）の固定された複合体と基質溶液とを接触し、そしてインキュベートし、ここ でアピジンに結合される前記酵素が前記基質の反応を触媒し、そして検出可能な 生成物を生成し；そして ｆ．検出されるべき前記抗体の存在に前記検出可能な反応生成物を相互関係せし める段階を含んで成る方法。
16. １６．前記段階（ｃ）の組合された溶液が前記段階（ａ）のマトリックスと接触 され、そしてインキュベートされた後、前記マトリックスが洗浄される請求の範 囲第１５項記載の方法。
17. １７．前記対象の抗原がＨＩＶ−１である請求の範囲第１又は１５項記載の方法 。
18. １８．前記アッセイがピペットの先端で行なわれる請求の範囲第１又は１５項記 載の方法。
19. １９．抗原を含む試験用生物学的流体中の抗原を検出するための方法であって； ａ．多孔性マトリックスに共有結合される抗体−結合タンパク質を供給し（前記 マトリックスは透明なカラム内に配置され）； ｂ．前記抗原を含み、そして水性緩衝液中、前記抗原に対する少量の抗体を含む 試験流体の溶液を供給し；ｃ．抗体及び抗原の複合体が前記マトリックスにより 固定されるように前記段階（ａ）のマトリックスと前記段階（ｂ）の溶液とを接 触し、そしてインキュベートし；ｄ．プロテインＡに結合するＦｃ部分を欠くが 、しかし前記抗原に結合するその能力を保持するＦａｂフラグメントであるよう に変性されたモノクローナル抗体の溶液を供給し（前記抗体はピオチニル化され ており）；８．抗体−抗原−Ｆａｂ抗体複合体が前記マトリックスにより固定さ れるように段階（ｄ）の溶液と段階（ｃ）の固定された複合体とを接触し、そし てインキュベートし；ｆ．酵素に共有結合されたアピジンの溶液を供給し；ｇ． 前記段階（ｆ）の溶液と段階（ｅ）の固定された抗体−抗原−Ｆａｂ抗体複合体 とを接触し、そしてインキュベートし、それによって、前記酵素ラベルされたア ピジンが、前記酵素ラベルされたアピジンを固定するために前記マトリックス複 合体と反応し； ｈ．前記段階（ｇ）の固定された複合体と基質溶液とを接触し、そしてインキュ ベートし、それによって前記アピジンに結合される酵素が前記基質の反応を触媒 し、そして検出可能な反応生成物を生成し；そして ｉ．検出されるべき前記抗体の存在に前記検出可能な反応生成物を相互関係せし める段階を含んで成る方法。
20. ２０．前記酵素結合のアピジンが前記段階（ｅ）の固定された複合体と接触され 、そしてインキュベートされた後、前記マトリックスが洗浄される請求の範囲第 １９項記載の方法。
21. ２１．前記段階（ｈ）の抗−抗原抗体及び段階（ｄ）の抗−抗原抗体が前記抗原 の種々のエピトープに対して特異的である請求の範囲第１９項記載の方法。
22. ２２．前記生物学的試験流体が前記抗原に対する内因性抗体を欠く請求の範囲第 １９項記載の方法。
23. ２３．前記生物学的試験流体が植物病原体の抗原を含む植物抽出物である請求の 範囲第２２項記載の方法。
24. ２４．前記抗原が細菌である請求の範囲第２３項記載の方法。
25. ２５．前記細菌がユリネパクテリウムセペドニカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｉｕｍｓｅｄｏｎｉｃｕｍ）である請求の範囲第２４項記載の方法。
26. ２６．診断試験のためにズ唾液中の抗体を検出するためのキットであって； （ａ）透明な開口式カラム； （ｂ）それらの間に空間を確定するために前記カラム内に配置される一対の多孔 性フリット； （ｃ）それらに抗体−結合タンパク質を共有結合されている多孔性マトリックス ；及び （ｄ）前記一対の多孔性フリット間に前記空間で配置される前記マトリックスを 含んで成るキット。
27. ２７．前記マトリックスがアガロースピーズを含んで成る請求の範囲第２３項記 載のキット。
28. ２８．前記カラムの一端で除去できる先端をさらに含んで成る請求の範囲第２３ 項記載のキット。
29. ２９．試薬、すなわちサンプル希釈用緩衝液、ピオチニル化された抗原溶液、酵 素結合のアピジン溶液、酵素基質及び対照溶液をさらに含んで成る請求の範囲第 ２３項記載のキット。
30. ３０．試薬、すなわちポリクローナル又はモノクローナル抗−抗原抗体及びピオ チニル化されたＦａｂモノクローナル抗体をさらに含んで成る請求の範囲第２６ 項記載のキット。