JPS6367661B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗原および抗体から形成される免疫複
合体の液体中における免疫学的定量法に関する。 免疫複合体は抗原―抗体複合体であり、それは
試験管内のみならず生体内においても多くの疾患
の際に形成され、そして体液中に現われる。免疫
複合体の抗原が生産される部位は種々のものに起
因している。これはしばしば微生物、ウイルス、
バクテリア、寄生虫、原生動物により形成され、
そして高等動物の血液循環系中に現われる。それ
はさらにまた動物の組織または悪性細胞からの生
成物である可能性もあり、それは抗原として抗体
形成のための原因となる。１種の抗原から誘導さ
れる抗体はその特定の抗原に関して特異的であ
る。生体の抗体形成は免疫複合体と称される抗原
―抗体複合体を形成することになる。免疫複合体
は生体内で補体因子と結合することができる。免
疫複合体は通常細網内皮系を通して迅速に生体か
ら除去される。一定の条件下においては免疫複合
体は体内に残存し、慢性の免疫複合体疾患を引き
起こす。残存している免疫複合体は一般的には抗
原の免疫学的結合位置のすべてが抗体で飽和され
ているのではないような方法で結合されている。
体液中の免疫複合体の確認は免疫複合体疾患と総
称される疾患の診断に対して重要な知見を与え
る。さらにこの種の疾患においては免疫複合体の
確認ばかりでなく、そこに含有されている抗原の
区別もまた極めて重要である。従つて免疫複合体
の存在を証明すると同時に抗原を区別することが
できる方法が望まれていた。このためには現在ま
で二段階の測定法、すなわち最初に免疫複合体を
確認し、その後抗原を同定する方法が可能であつ
た。 今や免疫複合体の確認および抗原の同定が単一
の操作で行なわれることが見出された。免疫複合
体の抗原に対して指向された特定の反応体Ａ（通
常は抗体）は担体と結合せしめられる。この被覆
された担体物質は液体検体と接触せしめられる。
その後このようにして処理された担体は、免疫複
合体中に存在する抗体に対して指向され、そして
場合により標識化された反応体Ｂ（抗体、補体）
の溶液と接触せしめられ、そしてつぎに結合して
いるかまたは液体中に溶解している反応体Ｂの部
分が好ましくは標識剤を測定することにより定量
される。 反応体Ｂはたとえば抗Fc抗体、抗免疫グロブ
リン凝集体抗体、リウマチ因子および補体因子で
ある。 標識化された反応体Ｂの場合にはそれぞれの定
量された標識剤の量がそれぞれの結合された免疫
複合体の量を示す。標識剤としてはたとえば放射
性原子、酵素、補酵素または螢光性の基が用いら
れる。両方の方法は抗原の特異性が抗原に特異的
な抗体を使用することにより確認されるという点
で共通している。たとえばHBsAgを含有する免
疫複合体を確認するためには抗HBsAg抗体が必
要であり、また破傷風トキソイドを含有する免疫
複合体を確認するためには抗破傷風トキソイド抗
体が必要である。 標識化された反応体を使用するための別法とし
ては、担体に結合された免疫複合体それ自体が指
示反応により確認される。このことはたとえば補
体結合の定量または担体の凝集により行なわれ
る。 従つて本発明の対象は、 ａ） 免疫複合体の抗原の抗原決定基に対して特
異的でありそして担体に結合された反応体Ａ
を、免疫複合体との反応に対して充分な量で、
免疫複合体を含有する液体とともにインキユベ
ートし、 ｂ） そのようにして処理された担体を、液体の
分離後、免疫複合体の抗体の抗原決定基に対し
て特異的でありそして場合により標識化された
反応体Ｂを免疫複合体との反応に対して充分な
量で含む溶液とともにインキユベートし、そし
て ｃ） その後結合されているか、または結合され
ていない反応体Ｂを測定することにより液体中
の免疫複合体を定量する ということを特徴とする、液体中の免疫複合体に
対する免疫学的定量法である。 従つて抗原と反応する反応体Ａは同様に担体と
結合することができる。同様に反応体Ｂは免疫複
合体の抗体に対して特異的であることができる。 さらに本発明の対象は、免疫複合体の抗原また
は抗体に対して特異的であり且つ担体に結合され
た反応体を含有することを特徴とする、抗原に特
異的な免疫複合体を定量するための診断剤であ
る。 免疫複合体中に存在する抗原に対して特異的な
反応体Ａは固体状担体に結合されている。抗原に
対して特異的な反応体は抗体または抗原と結合す
る抗体の断片（フラグメント）である。 担体としてはたとえば無機物（たとえばガラ
ス）または有機物（たとえばビニル化合物たとえ
ばオレフイン、ビニルアセテート、ビニルクロリ
ド、ビニリデンクロリド、テトラフルオロエチレ
ン、スチレン、アクリル酸またはメタアクリル酸
のホモポリマーまたはコポリマー、さらにホルム
アルデヒドおよび環状アセタールのポリマー、な
らびに縮重合体たとえばポリエステル、ポリカー
ボネートまたはポリアミド、または網目状炭化水
素および網目状蛋白質）から成る無定形の粒子、
球体、小板、箔片または試薬容器、さらに特殊な
生物学的担体たとえば細胞（たとえば赤血球）が
適当である。 結合は接着的にかまたは共有的に行なうことが
できる。接着的に被覆するために担体は反応体と
接触せしめられる。たとえば反応体は1μｇ〜１
ｇ／好ましくは10μｇ/mlの濃度で水性溶液好ま
しくは緩衝液〔たとえば燐酸塩で緩衝化された等
張性の食塩溶液（PBS）、PH7.2〕に溶解され、１
分間ないし５日間好ましくは24時間担体とともに
放置される。過剰の試薬は有利には適当に洗浄剤
を含有する緩衝液〔たとえばポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート（ツイーン20）を0.1
％含有するPH7.2のPBS〕を用いて洗浄すること
により除去される。 それぞれの反応体の共有結合形成は種々の担体
を用いて文献既知の方法により行なわれる〔たと
えばOrth氏ら「Angw.Chemie」第84巻第319頁
（1972年）、Silman氏ら「Annu.Rev.Biochem.」
第35巻第873頁（1966年）、Becht氏ら「J.
Immunology」第101巻第18頁（1968年）、
Weetall氏「Immobilized Enzymes、Antigens、
Antibodies and Peptides」（Marcel Dekker社
発行）第32頁（1975年）参照〕。 今や免疫複合体の定量はつぎのようにして行な
われる。 それぞれの反応体Ａで被覆された担体は免疫複
合体を含有する液体好ましくは血清試料とともに
１分間ないし48時間好ましくは10時間インキユベ
ートされ、そして適当には過剰の血清成分を除去
するために緩衝液で洗浄される。 つぎにそのようにして処理された担体は、免疫
複合体に結合された抗体に対して特異的であり好
ましくは標識化された反応体Ｂの溶液とともに１
分間ないし48時間好ましくは１時間インキユベー
トされる。抗体に対して特異的である反応体Ｂ
は、天然のままであるかまたは変性した抗体の抗
原決定基に対して指向された微生物性蛋白質Ａ、
補体、抗体または抗体断片でありうる。 免疫複合体が生体内で補体因子と結合している
場合には、補体因子に対して指向された抗体また
は抗体断片はまた抗体に特異的な反応体として使
用することができる。 抗原に対して特異的である反応体は抗原に特異
的な抗体または抗体断片である。特異性を有する
抗体製剤は特定の免疫化された動物の血清から
か、または人の血清から単離される〔たとえば紅
斑性狼瘡の患者の血清から抗デスオキシリボヌク
レイン酸抗体が、肝炎が治癒した患者の血清から
抗肝炎Ｂ抗体が、そしてリウマチ様関節炎（変形
関節炎）の患者の血清からリウマチ因子が単離さ
れる〕〔HumphreyおよびWhite両氏
「Immunologie」（Thieme社（1972年）発行）、
Gell、CoombsおよびLachmann氏「Clinical
Aspects of Immunology」（Blackwell社（1975
年）発行）参照〕。試験において使用される反応
体の最適希釈度は担体といかなる非特異的な結合
を起してはならない。すなわち免疫複合体が担体
に結合されていないときは担体との結合のないこ
とが証明できるようなものでなければならない。
これらの最適希釈度はそれぞれの反応体ごとに前
試験により個別的に決められるべきである。慣用
される希釈度はたとえば１：10〜１：400である。
また上記のように免疫複合体なしに血清を用いて
行なわれる試験は対照として役立つ。 反応体に対する標識剤としてはすでに記載した
ようにたとえば放射性物質および螢光物質または
酵素が好ましい。 担体に対する標識剤の定量は当業者によく知ら
れている方法で行なうことができる。 本発明をさらに良く理解せしめるために以下に
実施例をあげて説明する。 実施例 １ 担体に結合された破傷風トキソイド抗原に対し
て特異的な反応体Ａの使用 抗原として破傷風トキソイドを有する免疫複合
体は人の破傷風抗体を破傷風トキソイドと混合す
ることにより製造される。 吸着的に抗体で被覆された担体の製造 容量400μのポリスチレンの細管に家兎から
得られた抗破傷風免疫グロブリンの1.1×10^-3％
溶液（蛋白質の重量／燐酸塩で緩衝化された食塩
溶液の容量）100μを入れ、そして４℃で保持
する。24時間後にその溶液を吸引過する。この
細管をそれぞれ400μの洗浄液〔ツイーン20を
0.1％（ｇ/v）を含有する燐酸塩で緩衝化された
PH7.2の食塩溶液〕で３回洗浄する。 １ インキユベーシヨン 上記の抗破傷風トキソイドで被覆された細管
に上記のようにして製造された免疫複合体を含
有する溶液0.1mlを充填し、牛血清アルブミン
５％を含有する燐酸塩で緩衝化された食塩溶液
で１：４に希釈し、21℃で10時間放置する。そ
の後この溶液を吸引過し、そして担体の被覆
の場合と同様に洗浄する。 ２ インキユベーシヨン つぎに上記の細管にNakaneおよびKawaoe
両氏の方法〔「J.Histochem.Cytochem.」第22
巻第1084頁（1972年）参照〕により得られたペ
ルオキシダーゼで標識化された家兎の抗人ガン
マグロブリンを、牛血清アルブミン５％を含有
する燐酸塩で緩衝化された食塩溶液で１：50に
希釈した液0.1mlを入れ、つぎに１時間（21℃）
後に被覆の場合と同様にして再び洗浄する。 ３ 標識化の測定 新たに調製したくえん酸塩―燐酸塩緩衝液
（0.1Mくえん酸５ml＋0.2M燐酸水素＝ナトリ
ウム５ml）中0.1％のＯ―フエニレンジアミン
塩酸塩溶液0.1mlに１％（v/v）過酸化水素溶液
0.1mlを加え、それを細管にピペツトで測り入
れる。暗所で30〜60分間反応させたのちに2N
硫酸溶液0.1mlを用いてその反応を止め、そし
てベツクマン社製の光度計を用いて490nmにお
ける吸光度を測定する。

【表】 粋な破傷風免疫血清
免疫複合体はその組成（抗原／抗体の割合）
により認知可能であるが、抗原が少過剰である
場合に特に良い結果が得られる。 実施例 ２ 抗原であるHBsAgに対して特異的な担体に結
合された反応体Ａの使用 HBsAg含有免疫複合体を有する患者の血清お
よび60種の正常な血清が試験される。 吸着的に抗体で被覆された担体の製造 容量400μのポリスチレン細管に家兎から得
られた抗肝炎免疫グロブリンの1.1×10^-3％溶液
（蛋白質の重量／燐酸塩で緩衝化された食塩溶液
の容量）100μを入れる。24時間（４℃）後に
その溶液を吸引過し、ツイーン20を0.1％（ｇ/
ｖ）含有し且つ燐酸塩で緩衝化されたPH7.2の食塩
溶液各400μで３回洗浄する。 １ インキユベーシヨン 家兎の抗肝炎超免疫グロブリンで被覆された
細管に、牛血清アルブミンを５％含有し且つ燐
酸塩で緩衝化された食塩溶液で１：４に希釈さ
れた免疫複合体を含有する溶液0.1mlを入れ、
21℃で10時間放置する。 その後この溶液を吸引過し、そして担体の
被覆の場合と同様にして洗浄する。 ２ インキユベーシヨン 上記の細管にNakaneおよびKawaoe両氏の
方法〔「J.Histochem.Cytochem.」第22巻第
1084頁（1974年）参照〕により得られたペルオ
キシダーゼで標識化された家兎の抗人ガンマグ
ロブリンを、牛血清アルブミンを５％含有し且
つ燐酸塩で緩衝化された食塩溶液で１：50に希
釈した液0.1mlを加え、そしてつぎに１時間
（21℃）後に担体の被覆の場合と同様にして再
び洗浄する。 ３ 実施例１の場合と同様の標識化の定量 結果はつぎの表に示される。

【表】 肝炎患者の血清において明らかに抗原に特異
的な免疫複合体を証明することができる。 実施例 ３ 活性アジド基を有するポリメチレンメタアクリ
レート箔の使用 箔片の被覆 M.Lynnの方法〔H.H.Weetall氏編
「Immobilized Enzymes、Antigens、
Antibodies and Peptides」（Marcel Dekker社
（1975年）発行）第32頁参照〕により製造された
ポリメチレンメタアクリレートからの活性アジド
基を有する同じ大きさの箔片はPH7.2のPBS中馬
の抗破傷風トキソイド免疫グロブリンの0.1％溶
液とともにインキユベートされ、そして過剰の抗
体を除去するためにPH7.2のPBSで３回洗浄され
る。 １ インキユベーシヨン 馬の抗トキソイドで被覆された箔片は免疫複
合体（実施例１の場合と同様に抗原として破傷
風トキソイドを有する免疫複合体）を含有する
試料とともにPBS―５％アルブミンで１：４
に希釈され、10時間インキユベートされる。そ
の後箔片は実施例１と同様の洗浄液で３回洗浄
される。 ２ インキユベーシヨン つぎに上記の箔片をペルオキシダーゼで標識
化された家兎の抗人ガンマグロブリンとともに
PBS（燐酸塩で緩衝化された食塩溶液）―BSA
（牛血清アルブミン）（実施例１参照）で１：50
に希釈し、１時間（21℃）インキユベーシヨン
し、洗浄液（上記参照）で３回洗浄し、そして
実施例１の場合と同様にして箔片の標識化を測
定する。結果は次表のとおりである。

【表】 おける吸
光度
実施例１と同様にして製造された免疫複合体
を含有する試料において、免疫複合体を含有し
ない血清および破傷風トキソイドに対して明ら
かに抗原特異的な免疫複合体を確認することが
できる。 実施例 ４ Ｆ（ab）₂断片の共有結合に対して活性アジド基
を有するポリメチルメタアクリレート箔の使用 箔片の被覆 同じ大きさのポリメチルメタアクリレート箔片
（実施例３参照）をPH7.2のPBS中馬の抗破傷風ト
キソイドＦ（ab）₂製剤の0.1％溶液〔A.Visonoff氏
らの方法により製造される、「Arch.Biochem.
Biophys.」第89巻第230頁（1960年）参照〕とと
もに21℃で24時間インキユベートし、そして過剰
の反応体を除去するために洗浄液（実施例１参
照）で３回洗浄する。 １ インキユベーシヨン 上記の被覆された箔片を免疫複合体を含有す
る試料とともにPH7.2のPBSおよびBSA（５％）
で１：４に希釈して10時間インキユベートし、
そしてつぎに洗浄液で３回洗浄する。 ２ インキユベーシヨン つぎに上記の箔片をペルオキシダーゼで標識
化された（実施例１参照）家兎の抗人IgGに加
えてPH7.2のPBSおよびBSA（５％）で１：50
に希釈し、２時間インキユベートし、つぎに洗
浄液（実施例１参照）で３回洗浄する。 箔片の標識化はそのようにして製造された箔
片を基質溶液（Ｏ―フエニレンジアミン塩酸塩
溶液、実施例１参照）0.5ml中で30〜60分間イ
ンキユベートし、そしてつぎにその溶液の
490nmにおける吸光度を測定することにより定
量される。結果は次のとおりである。

【表】 おける吸
光度
免疫複合体を含まない対照試験とは対照的に
免疫複合体を有する試料は明らかに高い吸光度
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ａ） 免疫複合体の抗原の抗原決定基に対し
   て特異的でありそして担体に結合された反応体
   Ａを、免疫複合体との反応に対して充分な量
   で、免疫複合体を含有する液体とともにインキ
   ユベートし、 ｂ） そのようにして処理された担体を、液体の
   分離後、免疫複合体の抗体の抗原決定基に対し
   て特異的でありそして場合により標識化された
   反応体Ｂを免疫複合体との反応に対して充分な
   量で含む溶液とともにインキユベートし、そし
   て ｃ） その後結合されているか、または結合され
   ていない反応体Ｂを測定することにより液体中
   の免疫複合体を定量する ことを特徴とする、液体中の免疫複合体の免疫学
   的定量法。 ２ 担体が生物学的粒子または有機または無機の
   成形体であることを特徴とする前記第１項記載の
   方法。 ３ 反応体の結合が共有結合によるかまたは吸着
   により行なわれることを特徴とする前記第１項記
   載の方法。 ４ 抗原と反応する反応体Ａが担体に結合されて
   おり、そして抗体と反応する反応体Ｂが標識化剤
   を有することを特徴とする前記第１乃至３項のい
   ずれかの項に記載の方法。 ５ 抗原または抗体と反応する反応体が抗体また
   は抗体断片であることを特徴とする前記第１乃至
   ４項のいずれかの項に記載の方法。 ６ 抗体と反応する反応体がスタフイロコツカ
   ス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の蛋
   白質Ａであることを特徴とする前記第１乃至４項
   のいずれかの項に記載の方法。 ７ 抗体と反応する反応体が補体因子であること
   を特徴とする前記第１乃至４項のいずれかの項に
   記載の方法。 ８ 抗体と反応する反応体が補体に対して指向さ
   れた抗体または抗体断片であることを特徴とする
   前記第７項記載の方法。 ９ 抗体と反応する反応体が免疫グロブリンの
   Fc分画に対するか、または免疫グロブリン凝集
   体に対する抗体またはリウマチ因子であることを
   特徴とする前記第１乃至５項のいずれかの項に記
   載の方法。 １０ 標識剤が放射性物質、酵素、補酵素または
   蛍光物質であることを特徴とする前記第１項記載
   の方法。 １１ 担体に結合され且つ免疫複合体の抗原に対
   して特異的である反応体を含有することを特徴と
   する、免疫複合体を抗原に特異的に定量するため
   の診断剤。