JPH0224559A - 免疫学的に検出可能な物質の測定法、反応容器及びイムノアツセイ原理による方法における種々のパラメーターの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は免疫学的に活性の反応成分の１つが結合してい
る固相を使用して不均質イムノアッセイの原理により免
疫学的に検出可能な物質を測定するための方法、このた
めに好適な反応容器並びにイムノアッセイ原理による方
法において種々のパラメーターを測定するための方法に
関する。

従来の技術 特異的に結合性の物質を測定するためにしばしばイムノ
アッセイ原理による方法を使用するこの際、相互に特異
的に結合性の物質対の成分の１つを、これに特異的な、
自体公知法で識標されているレセプターと反応させる。

これら両方の物質からの複合体と、この複合体に対し、
又はこの複合体の両方の部分の１部に対し特異的である
レセプターとを更に反応させることができる。この免疫
学的方法に関しては多くの変法がある。この場合、レセ
プターの１つが固相に結合して存在する場合が有利であ
る。このことは結合している反応成分と結合していない
反応成分との分離を容易にする。特異的に結合性の物質
の決定のためには固相に結合した凛識化反応成分の量又
は溶液中に存在する＃Ｉ誠化反応成分の量を測定し、決
定すべき反応成分の量に自体公知で関連させる。

固相としては、免疫学的方法において常用の、内側表面
に反応成分が固定されているプラスチック管又はマイク
ロ滴定プレート、又は外側表面に反応成分が固定されて
いる球を使用するこの際、それぞれの表面への特異的反
応成分の結合は、この特異的反応成分が、これに特異的
に結合性の物質への特異的結合性を失なわないようＩこ
行なわれなければならない。この理由から反応成分の固
相への結合は吸着的に行なわれる。従って、結合を仲介
する連結剤を介して固相に反応成分の固定を生ぜしめる
ことはすでに提案されている。この際、結合剤への反応
成分の結合が分子の特異的に反応する範囲を破壊しない
ように、もしくは反応成分の活性位が固相から離れて結
合成分に向いているように注意しなければならない。

これらすべての公知方法の欠点は、それぞれの特異反応
のために特別な固相を提供しなければならないというこ
とである。このことは、個々のテストのために他の固相
を製造し、貯蔵し、次いで測定のために使用しなければ
ならないということを意味し、費用がかかる。

発明が解決しようとする課題 従って、本発明の課題は多くの異なる検出法に好適であ
る方法及び反応容器を提供することである。病院での慣
用診断法においては、ホルモン、腫瘍マーカー、感染パ
ラメーター　アレルギーパラメーター及び受胎パラメー
ターのような多くの異なるパラメーターを１つの血液試
料から測定する。測定すべきパラメーターの濃度は広い
範囲を包含する。例えばＴＳＨ及びグロラクチンのよう
な低い濃度のパラメーターは１０−ＩＯ〜１０−”　ｍ
ｏ＋２／Ｑ　（７）範囲ｆ：：ｔす、一方Ｔ３及びＴ４
のような高濃度のパラメーターは約１０″″７〜Ｉ　Ｏ
−８ｍｏＱ／（ｌである。個々の測定のために毎回異な
る管を使用しなければならないのではなく、すべての測
定のために標準反応容器を使用することができるという
ことが望ましい。

課題を解決するための手段 この課題は免疫学的に活性な反応成分の１つが結合して
いる固相を使用して不均質イムノアッセイの原理により
免疫学的に検出可能な物質を測定するために、内側表面
にストレプトアビジン又はアビジンが反応容量１ｍαあ
たり０．１〜２．５μｇ存在するような量で結合してい
る反応容器を固相として使用することを特徴とする免疫
学的に検出可能な物質の測定法により解決する。この量
の記載はビオチニル化蛋白質又はハプテンの形で存在す
る、免疫反応の範囲での結合成分にとって近づきうる、
ストレプトアビジン又はアビジンに関する。

本発明による方法は固相に固定されるべき、例えば抗体
又は抗原であってよいレセプター、がビオチンと結合し
ているすべての測定法に使用可能である。本発明による
固相固定ストレプトアビジンもしくはアビジンはすべて
の管材料に非常に良好な接着性を示し、この結合は界面
活性剤に対しても安定である。多くの免疫学的方法にお
ける評価のために必要である較正曲線の製造において、
本発明による固相結合ストレプトアビジンもしくはアビ
ジンは僅かな空位において急こう配の較正曲線を提供し
、このことは正確さの上昇に導び〈。もう１つの利点は
被覆したストレプトアビジン量のチャージ変動が測定結
果に無視可能な程度の影響を与えるにすぎないというこ
とである。本発明による方法の特別な利点は、結合した
ストレプトアビジンもしくはアビジンの量が、この固相
を不均質イムノアッセイの原理によるすべての公知法に
使用することができるように調節されるという点にある
。更に、本発明による方法を用いて、同時に多くの物質
、特に抗体、並びに抗原を測定することもできるという
利点がある。これらは例７により、より詳細に説明され
る。

特に有利な実施態様によれば、固相として使用した反応
容器は同時に標識の測光法のためのキュベツトとしても
使用される。このことは、全反応の実施のために唯１つ
の容器だけが必要であるので特に有利である。この場合
、反応容器は二つの相互に向きあった光透過性の動域を
有するように構成されている。この際、上域全体がスト
レプトアビジン又はアビジンで被覆されていてよい。

本発明により、内側表面にストレプトアビジン又はアビ
ジンが結合している反応容器を固相として使用する。こ
の際、ストレプトアビジン又はアビジンの結合は専門家
に公知の方法により行なわれる（例えば、ヨーロッパ特
許第１２２２０９号明細書）。ストレプトアビジン又は
アビジンは固相に直接結合しているか、又はスペーサー
又は結合を仲介する物質を介して結合している。

本発明方法の有利な実施形においては、ストレプトアビ
ジン又はアビジンが約５０００００を越える分子量の可
溶性蛋白質に結合し、次いでこの結合体が疎水性の固相
に吸着している。このことは例えば、特許出願ｐ３６４
０４１２．８に記載されている、疎水化された蛋白質を
使用するのが有利である。

疎水化は例えば加熱、酸、変性剤及び／′又はカオトロ
ープイオン（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ　！ｏｎｅｎ）での処
理により、及び／又は疎水性化合物との化学的結合によ
り行なわれる。これらの薬剤での処理は分子量の上昇に
も導びく。分子量の上昇は二価又は多価官能性蛋白質試
薬での架橋によっても達せられる。

酸としては、例えば酢酸、ズロビオン酸、乳酸又は塩酸
を使用する。通常の濃度は１０９〜１６時間の作用時間
において、１〜ｌｏｏｍｍｏｆｆ／Ｑである。

好適なカオトロープイオンは例えばチオシアネート、ヨ
ーシト、フルオリド、プロミド、ベルクロレート及びス
ルフェートである。好適な変性試薬は例えばグアニジン
塩酸塩又は尿素テある。通常ｓ　　ｌ　Ｏｍ　ｒｍｏＱ
／Ｑ　〜６　ｍｏ（１／Ｑの濃度を使用する。

疎水性化合物での誘導体化のためには有利に可溶性脂肪
酸、低分子又は高分子の形のリポイド並びに合成ポリマ
ー、例えばポリプロピレングリコール又はポリスチロー
ルの可溶性コポリマーを使用する、誘導体化は専門家に
常用の方法により行なわれる。

二官能性又は多官能性化合物を介しての架橋は自体公知
の蛋白質結合試薬を用いて実施される。これは同−又は
異なっていてよい少なくとも二つの官能基を有する化合
物であっで、これらの官能基を介して蛋白質の官能基と
反応することのできる化合物である。末端にサクシンイ
ミド基、マレイミド基及び／又はアルデヒド基を有する
アルキル鎖からなる化合物を使用するのが有利である。

蛋白質を自体公知法で二官能性又は多官能性化合で架橋
し、この際可溶性蛋白質と二官能性又は多官能性化合物
とが反応する。

疎水化及び／又は架橋のために分子量１ｏｏｏ。

〜７０００００を有する蛋白質を使用するのが打利であ
る。特に有利であるのは、牛血清アルブミンリパーゼ又
は免疫−γ−グロブリンが打利である。

次いで、蛋白質に自体公知法でストレプトアビジン又は
アビジンを結合させる。好適な結合法は例えばＪ、イシ
カワ、Ｉｍｍｕｎｏｓｓａｙ％ＩＴ　４　巻１９８３年
、第２０９〜３２７頁に記載されている。

次いで、ストレプトアビジン又はアビジンと蛋白質とか
らなる得られた複合体は固相として働ら〈プラスチック
表面に吸着される。蛋白質とストレプトアビジン又はア
ビジンとからなる複合体を疎水性固相に吸着させる前に
、両相を物理的又は化学的に処理することも可能である
こうして、例えばプラスチック表面を予め膨潤させるか
、又は自体公知法で活性化する。固相への吸着結合は強
いか、又は弱い相互作用、疎水性力、ダイポール／ダイ
ポール相互作用又はイオン／ダイポール相互作用を介し
て行なわれる。

疎水性固相としては疎水性可溶性蛋白質の表面張力より
小さい表面張力を有する担体材料、すなわち蛋白質より
疎水性である担体材料からなる反応容器が特に好適であ
る。表面張力４０エルグ／　ｃｙｉ２を有する担体材料
を使用するのが有利である。特に好適であるのはポリス
チレンポリメタクリレート、テフロン、ポリアミドスチ
レン及びアクリロニトリルからなるコポリマー　ガラス
及びセルロース製品である。

本発明により製造した固相材料は多くの異なるパラメー
ターを測定するために使用される。

この際、測定すべきパラメーターと結合性の物質をビオ
チンと結合させ、これを再び固相に固定したストレプト
アビジンもしくはアビジンと結合させる。このようにし
て、イムノアッセイ法に基づき形成された特異的複合体
を固定し、次いで測定する。従って、本発明により、ビ
オチン化された特異的に結合性の物質を結合するために
、反応容量１　ｒａＱあたりＯ９１〜２．５μｇを自由
に使えるような量でストレプトアビジンもしくはアビジ
ンを固相に結合する。

反応容量としては、この際試料容量及び試薬容量からな
る合計をあられす。

ビオチニル化、特異的結合性物質との結合のために試験
容量１ｍｌあたりストレプトアビジンもしくはアビジン
ｌ〜２ｔｔｇが存在するように固相材料を被覆するのが
有利である。ビオチニル化特異的結合性物質の量は本発
明方法の際に有利にＩ　Ｏ−”　〜ｌ　Ｏ−’　ｒａｏ
Ｑ／反応容量の範囲にあるのが有利である。

本発明の他の課題は、相互に相対する光透過性聖域を有
し、更に、少なくとも部分的に、液体取り込みのために
予定された内壁の範囲でストレプトアビジン又はアビジ
ンで被覆された壁を有する反応容器であり、この際液体
取り込みのために決められた容器の内容と、被覆のスト
レプトアビジン含量もしくはアビジン含量とを相互に調
節して、反応容量１＋ｍαあたりストレプトアビジン又
はアビジン０．１〜２．５μｇが存在するように決める
。

この反応容器は本発明方法を実施するために特に好適で
ある。光透過性の、相互に相対している聖域を有し、更
にストレプトアビジンもしくはアビジンでの被覆を示す
ので、反応の実施のために、かつ測光法のために同時に
使用することができる。反応容量］ｍρあたりストレプ
トアビジン０．１〜２．５μｇで被覆することによりこ
の反応容器を不均質イムノアッセイの原理による種々の
パラメーターの測定のために使用することができる。

反応容器は固相を形成する。反応容器は通常使用される
材料、例えばプラスチック、ガラス等からなる。光透過
性上域は同様に公知材料からなる、特に有利であるのは
ポリスチロール、ポリスチロールの共重合体、ポリカー
ボネートポリアクリレート及びポリメタクリレートであ
る。

ストレプトアビジン又はアビジンでの被覆は直接又は担
体材料又はスペーサーを介して行なわれる。好適である
のは例えば分子量が５ｏｏｏｏ。

を越える可溶性蛋白質へのストレプトアビジン又はアビ
ジンの結合であり、次いでこれは反応容器の内側表面に
吸着される。

本発明の課題は、測定反応のために反応容量ＩｒｘＱあ
たりストレプトアビジン又はアビジン０．１〜２．５μ
ｇが提供されるような量で、内側表面にストレプトアビ
ジン又はアビジンが結合している容器からなる標準反応
容器を使用して、イムノアッセイ原理による方法におけ
る種々のパラメーターを測定するための方法である本発
明方法により、ストレプトアビジン量又はアビジンが固
相としての反応容器の内側表面に良好な接着で、かつ持
続的に固定されている反応容器及び方法が提供される。

この接着は洗浄剤の添加によっても物質の溶解に導かな
い程良好である。本発明により提供される反応容器は一
般的に使用可能であり、非常に多くのパラメーターのた
めの測定法の実施のために好適であり、従って、慣用法
の実施を容易にする。

実施例 次に本発明を図面及び実施例につきより詳細に説明する
。

実施例中で使用したモノクローナルのＴＳＨに対スる抗
体はヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セ
ル・カルチャーズ（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１Ｌｕｒｅ
ｓ）　、ポルトン・ダウン（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ）
　、Ｇ　ＢにおいてＥＣＡＣＣ８７１２２２０１及びＥ
ＣＡＣＣ８７１２２２０２として寄託されたハイブリド
ーマ細胞系から由来する。

例　　１ 本発明による複合体の固相接着及び疎水性蛋白質及びス
トレプトアビジンを実験したニー熱−ＲＳ　Ａ　（Ｔｈ
ｅｒｔａｏ　−ＲＳ　Ａ　）として表わされる熱により
凝集したＲＳＡを次のように製造した：Ｒ５Ａ　　１ｇ
を５Ｑｍｎ＋ｏ１２燐酸カリウム塩溶液１００ｍｆｆ中
にｐＨ７，０で溶かし、７０°Ｃに加熱し、４時間軽い
撹拌下にこの温度に保持した。この溶液を冷却し、濾過
し、濃度５０ｍｇ／ｍαに調節する。引き続き、３０倍
容量の２回蒸留水に対して透析する。

一ストレプトアビジンと熱−ＲＳＡとの複合体の製造：
ストレプトマイセス・アビジニー（Ｓｔｒｅｐｔｏａ＋
ｙｅｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉ）から得られたストレプト
アビジンをマレイミド−ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシ
ーサクシンイミドと反応させ、こうしてマレイミド基を
有するストレプトアビジンが得られる。熱−ＲＳＡをＳ
−アセチルメルヵグトコハク酸無水物と反応させ、引き
続きこの保護したＳＨ基をヒドロキシアミンの添加によ
り遊離する。次いで、マレイミド基を有するストレプト
アビジンをＳＨ基を含有する熱ＲＳＡと混合すると所望
の複合体が形成される。

−ポリスチロールからなるプラスチック管をストレグト
アビジン／黙−ＲＳＡ−複合体で被覆した。この管の被
覆をストレプトアビジン／熱−ＲＳＡ−溶液１．５１で
行ない、この際両方の成分のモル比は１８時間から２４
時間の間２０℃で、４０　ｍｍｏｄ　＃１１１ナトリウ
ム塩緩衝液ｐＨ７，４中で１．８：１（ｔｏμｇ／肩Ｑ
）であったこの管を吸引した後、サッカロース２％、塩
化ナトリウム０．９％及びＲＳＡ０．３％の溶液１．８
ｍＱで２０°Ｃで３０分間、後被覆した。乾燥後（２０
℃及び相対湿度４０％で２４時間）この管は使用可能で
あり、安定であっｌ；。

例　　２ ＴＳＨの１工程試験 ビオチニル化モノクローナル抗−Ｔ　Ｓ　ｉ（−抗体を
製造した。このためには抗−ＴＳＨ−抗体ＥＣＡＣＣ８
７１２２２０１を常法でビオチンと反応させ、この際ア
ミン基を介して結合を行なう。抗体及びビオチンをｌ：
１６の比で使用した。このように得られたビオチニル化
抗体４００　ｎｇを緩衝液１ｍｆｆ中に溶かしく燐酸ナ
トリウム４０ｍｍｏ（１，プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎ
ｉｃ）Ｆｅ２　０．５％、酒石酸ナトリウム０．２モル
／１２並びにフェノール０．０１％）、次いで試料もし
くは公知量のＴＳＨを含有する標準溶液２００μαと一
緒にし、ペルオキシダーゼと結合した抗−ＴＳＨ−抗体
（ＥＣＡＣＣ８７１２２２０２）７５ｍＵを例１により
被覆した管中で２時間恒温保持した。その後、水道水で
３回洗浄し、引き続きＡＢＴＳ−基質溶液１ｍ１２を添
加した。１時間後に、４０５ｎｍにおける吸光を測定し
た。結果は第１図から示される。固定したストレプトア
ビジンでの満足のゆく結果は試験容量ｌ　ｍＱあたり０
．１μｇをこえた量で得られることを示す。

テストに使用したビオチニル化抗体の結合のためのスト
レプトアビジンの必要量を調べた。

このためには、まずバイヤー（Ｂａｙａｒ）の方法、エ
ドワルド（Ｅｄｗａｒｄ）　Ａ　−、マイヤー・ヴイル
チェック（Ｍｅｉｒ−Ｗｉｌｃｈｅｋ）　、アナリュテ
ィカル・ビオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅ＋＋＋１−ｓｔｒｙ）　ｓ第１５４巻、１９
８６年、第３６７〜３７０頁、により遊離した近づきや
すいビオチンの量を調べた。抗体対ビオチン１：１５の
比でビオチニル化した（Ｇｕｅｓｄｏｎ、　　Ｉ　、　
Ｌ　、　、　Ｊ　。

Ｈｉｓｔｏｃｈｅｎ＋、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、第２７
巻、１９７９年、第１１３１〜１１３９頁）抗体１μｇ
から出発し、抗体１モルあたりビオチン１〜２モルが結
合に提供される、すなわち抗体１μｇあたリビオチン１
．５〜３μｇが自由に近づきやすい。

ストレグトアビジン／熱−Ｒ３Ａ複合体１０μｇ／ｌｓ
Ｑで被覆された管（例１）は試験容量１ｍＱあたり１５
〜２０ｎｇのビオチンに関する結合能を有し、これは放
射性Ｃｌ４−ビオチンで測定した。

ビオチニル化免疫−γ−グロブリンに関して、試験容量
１ｍｆｆあたりストレプトアビジン管の結合能は１．７
〜２μｇである。この測定を１１２５−８ｊ［識γ−グ
ロブリフ　（ＭｃＣｏｎａｈｅｙ　ａｎｄＤｉｘｏｎの
方法、１９６６年、Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　ＡＩｌｅ−
ｒｇｙ　２９／　１８５により標識）で実施した。

例　　３ プロラクチン試験 プロラクチンをＩ工程サンドウィッチ・イムノアッセイ
において測定する。検出のために、次の組成の試薬を使
用するニ ーＰＯＤとプロラクチン特異的モノクローナル抗体とか
らなる複合体　　　　５０ｍ　Ｕ　／　ｍＱ。

−燐酸塩緩衝液、ｐＨ７，０４０ｍ　ｍｏ（１／　Ｑプ
ルロニック　Ｆ６５（ポリオキシエチレンポリプロピレ
ン）０．５％ 酒石酸士トリウム　　　　　０．２ｍｏｆ２／１２フェ
ノール　　　　　　　　０．０１％牛血清アルブミン　
　　　　０．２％ プロラクチンに対するビオチニル化モノクローナル抗体
　　　　　　　　　４００　ｎ　ｇ／　ＷｒＱ　。

両方のモノクローナル抗体に関しては、これがプロラク
チンを認識し、プロラクチンの種々のエピトープに向い
ているということだけが要求されている。ストレプトア
ビジン／熱−Ｒ５Ａ複合体で被覆された、例１により得
られたようなポリスチロール管中で、該試薬ｌ＋ｌｌａ
及び試料５０μαを室温で３０分間恒温保持した。引き
続き、水道水で３回洗浄した。検出反応のため■ にはＡＢＴＳ　　−基質溶液ｌｌｌｌＩ２を添加した。

３０分後、４０５ｎｍにおける吸光を測光法により測定
した。結果は第２図から示される。

■ ＡＢＴＳ　　とは２．２′−アジノージ−［３−エチル
ベンズチアゾリンスルホネート］　−’；アンモニウム
塩である。

例　　４ ＣＥＡ−試験 試料溶液中でＣＥＡを１工程サンドウイツチ・イムノア
ッセイにより測定した。使用した試薬は次の組成を有し
た： ＰＯＤとＣＥＡに対するモノクローナル抗体からの複合
体　　　　　　　１２０ｍ　Ｕ　／　ｍＱ。

−燐酸塩緩衝液ｐＨ：　７．０　　４０ｍ　ｍｏα／Ｑ
プルロニック　Ｆ１ａ　　　　０．５％酒石酸ナトリウ
ム　　　　０．２ｍｏＱ／（２フエノール　　　　　　
　０．０１％ 牛血清アルブミン　　　　０．２％ ＣＥＡに対するビオチニル化モノクローナル抗体　　　
　　　　　　　　５００ｎｇ／　ｗｔＱ　。

ＣＥＡに対する両方のモノクローナル抗体に関しては、
これがＣＥＡを認識しなければならず、それぞれＣＥＡ
の他のエピトープに対して向いているということだけが
要求される。

例１により得られたような、ストレプトアビジン／熱Ｒ
ＳＡ被覆ポリスチロール管中に試薬１ｍＱ及び試料１０
０μａを２時間室温で恒温保持した。引き続き、水道水
で３回洗浄した。次１ｍｆ２を添加した。１時間後、４
０５ｎｍにおける吸光を測光法により測定した。結果を
第３図に示す。

例　　５ Ｔ４−試験 Ｔ４をビオチニル化抗−Ｔ４−抗体を使用して競合イム
ノアッセイにより測定した。このためには例１により得
られたようなストレプトアビジン／熱−Ｒ３Ａ複合体で
被覆されたポリスチロール管中で、次の組成： チロキシシン／ＰＯＤ複合体（ヨーロッパ特許第２０９
１５５号明細書により製造）１００ｍ　Ｕ　、／　ｒａ
Ｑ パルピッレート　　　　　　１２０ｍ　ｍｏＱ／　Ｑ。

燐酸塩緩衝液、ｐＨ８，６１８，２ｍ　ｍｏ１２／　（
１゜ＡＮＳ　（８−アニリノ−１−す７タリンースルホ
ン酸）　　　　　　　　　　０．０４重量％、牛血清ア
ルブミン　　　　０．２重１１％、からなる試薬５００
μＱ１並びに試料２０μαを室温で１０分間恒温保持し
た。引き統さ、次の組成： Ｔ４に対するビオチニル化ポリクローナル抗体　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ｌμｇ／ｍＱｓ燐酸
塩緩衝液、ｐＨ８，６１２０ｍ　ｍｏＱ／　Ｑ。

ＡＮＳ　（８−アニリノ−１−ナフタリン−スルホン酸
）　　　　　　　　　　０．０４重量％、牛血清アルブ
ミン　　　　０．２重量％、からなる第２の試薬５００
μαを添加し、更に３０分間室温で恒温保持する。水道
水で３回流■ 浄した後、ＡＢＴＳ　　−基質溶液１　ｍ（ｌを添加し
、室温で３０分間恒温保持する。引き続き、４０５ｎｍ
における吸光を測定法で測定した。結果を第４図に示し
た。

例　　６ 抗ＨＢ５−試験 ＨＢｓ−抗体を１工程サンドウイツチイムノアツセイに
おいて測定した。検出のために次の組成を有する試薬を
使用する： ＰＯＤとＨＢｓ−抗原とからなる複合体６０ｍＵ／肩ａ 燐酸塩緩衝液、ｐＨ７、０４０ｍ　ｍｏ１２／　Ｑ酒石
酸ナトリウム　　　　　２００ｍ　ｍｏＱ／　Ｑプルロ
ニック　Ｆ１ａ　　　　　０．５重量％フェノール　　
　　　　　　０．０１重量％牛血清アルブミン　　　　
　０．２％ 牛−１ｇＧ　　　　　　　　　　Ｏ，１重量％ビオチニ
ル化ＨＢ５Ａ　ｇ　（Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ８、１９８４年、第２７３頁により製造）１５０ｎｇ
／　＋ｉｆｆ。

例１によるストレプトアビジン／熱−Ｒ５Ａ複合体で被
覆したポリスチロール管中で、該試薬１ｍ１２と試料２
００１１Ｑとを４時間室温で恒温保持した。引き続き、
水道水で３回洗浄した。

検出反応のためにはＡＢＴＳ−基質溶液１　ｍＱを添加
した。６０分後に、４２２ｎｍにおける吸光を測光法に
より測定した。

抗−ＨＢｓ−テストを、種々の量の固定ストレプトアビ
ジン量を有する管を使用して実施した。結果は第５図か
られかる。ストレブ］・アビジンを本発明により使用す
る量を越えて使用する場合、このテストの感度は明らか
にわるくなるということが、この際示される。

例　　７ 抗−）（Ｉ　Ｖ−試験 ＨＩＶ−抗体を２工程サンドイツチイｔ２ノアツセイで
測定する。検出のためには次の組成の試薬を使用する。

試薬１ １種以上のビオチニル化ＨＩＶ−抗原 各１０−７ｍｏｌ／　（１ 燐酸塩緩衝液、ｐＨ７，０４０ｍ　ｍｏＱ／　Ｑ食塩　
　　　　　　　　　　０．９重量％牛血清　　　　　　
　　　　ｌＯ容量％抗原としては次のものを使用した：
遺伝子工学により製造したＨＩＶＩ−抗ＵＫ　；　ＨＩ
　Ｖ　ｌ　−ｇｐ４１に相応するもの（ｇｐ４１−ｒｅ
ｋ、−Ｃｅｎ−ｔｏｃｏｒＴ’　−ｐ　ｌ　２１　）及
びＨＩＶＩ−ｐ２４に相応するもの（ｐ２４−ｒｅｋ、
、Ｃｅｎ　ｔｏｃｏｒ　”　−ｐｇ２）、化学合成ペプ
チド、　ＨＩ　Ｖ　ｌ−ｇｐ４１カらのもの（ｇｐ４１
−　ｐｅｐ、　Ｗａｎｇ等、ＰＮＡＳ。

第８３巻、第６１５９頁、１９８６年）及びＨＩＶ２−
ｇｐ３２からのもの（ｇｐ３２−ｐｅｐ、　Ｇｎ−ａｎ
ｎ、　Ｊ　、　Ｗ　、等、５ｃｉｅｎｃｅ１第２３７巻
、第１３４６頁、１９８７年）。これらの抗原はレアリ
イ（Ｌｅａｒｙ）等（ＰＮＡＳ、第８０巻、第４０４５
頁、１９８３年）によると同様にしてビオチンで標識化
された。

試薬２ 人−免疫グロブリンに対する羊抗体とＦ’　ＯＤとから
の複合体　　　　　　　２０ｍ　Ｕ　／　ｔｘＱ燐酸塩
緩衝液、ｐＨ７，０４０ｍｍｏρ／Ｑツウィーン２０　
　　　　　　０．０５重量％牛血清アルブミン　　　　
　０．２％ 牛−１ｇＧ　　　　　　　　　Ｏ，２％ストレプトアビ
ジン／熱Ｒ３Ａ複合体で被覆した、例１によるポリスチ
ロール管中に、試薬１　１＋α及び人血清又は人血漿ｌ
Ｏμαを室温で１時間恒温保持した。引き続き３回水道
水で洗浄し、試薬２１＊Ｑと１時間室温で恒は保持する
。再び３回水道水で洗浄し、検出反応のためにＡＢＴＳ
−基質溶液１ＩＩＩ２を添加する。６０分後、４２２ｎ
ｍで吸光を測光法で測定した。

抗−ＨＩＶ−試験を個々のＨＩＶ−抗原及び抗原組合わ
せを用いて実施した。この際、ストレプトアビジン／熱
Ｒ５Ａ複合体で被覆したポリスチロール管中での試験実
施は個々の抗原特異的抗体の測定のためにも、多くの抗
体又は抗体混合物の同時的測定のためにも好適であるこ
とが示されている（スクリーニングテスト・；第１表）
、これらが同じビールス又は多くのビールスもしくは興
味のある抗原に向いているかとうかは重要ではない。

４　Ｉ！７面の筒車な説明 第１図は異なる量の固定ストレプトアビジンとビオチニ
ル化抗−ＴＳＨ−抗体とを使用しｌ；Ｔ、ＳＨ−測定に
関する較正曲線を示す図であり、第２図はグロラクチン
試験に関する較正曲線を示す図であり、第３図はＣＥＡ
−試験に関する較正曲線を示す図であり、第４図はＴ４
−試験に関する較正曲線であり、第５図は種々の画の固
定ストレプトアビジンを使用した抗−Ｈｌ３Ｓ−測定に
関する較正曲線である。

ＦＩＧ、１ ０．４１　Ｐ９　ｂＡ７面 ＦＩＧ　、　３ ｎｇ／ｒｎｌ　ＣＥＡ ＦＩＧ、２ μＵ／ｍｌ プロラクチ／ Ｆ［Ｇ、４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫学的に活性な反応成分の１つが結合している固
   相を使用して不均質にイムノアッセイの原理により免疫
   学的に検出可能な物質を測定するために、内側表面にス
   トレプトアビジン又はアビジンが反応容量１ｍｌあたり
   ０．１〜２．５μｇ存在するような量で結合している反
   応容器を固相として使用することを特徴とする免疫学的
   に検出可能な物質の測定法。 ２、反応容器として、壁の内側表面がストレプトアビジ
   ン又はアビジンで被覆されているキュベットを使用する
   請求項１記載の方法。 ３、ストレプトアビジン又はアビジンを分子量約５００
   ０００を越える可溶性蛋白質に結合させ、次いでこのス
   トレプトアビジン又はアビジン及び蛋白質からなる複合
   体を疎水性固相に吸着させる請求項１又は２記載の方法
   。 ４、同時に複数の物質、特に複数の抗体を測定する請求
   項１から３までのいずれか１項記載の方法。 ５、相互に相対している光透過性の壁域を有し、更に液
   体を取り込む内壁の範囲に少なくとも部分的にストレプ
   トアビジン又はアビジンで被覆された壁を有し、この際
   容器の液体を取り込む内室と被覆のストレプトアビジン
   含量もしくはアビジン含量とが、反応容量１ｍｌあたり
   ストレプトアビジン又はアビジン０．１〜２．５μｇが
   存在するように相互に調節して決められていることを特
   徴とする反応容器。 ６、ストレプトアビジン又はアビジンが分子量５０００
   ００を越える可溶性蛋白質を介して固相に結合している
   請求項５記載の反応容器。 ７、反応容器がキュベットである請求項５又は６記載の
   反応容器。 ８、反応容量１ｍｌあたりストレプトアビジン又はアビ
   ジン０．１〜２．５μｇが測定反応に提供されるような
   量で内壁にストレプトアビジン又はアビジンが結合して
   いる容器からなる標準反応容器を用いることを特徴とす
   るイムノアッセイの原理による方法における種々のパラ
   メーターを測定するための方法。