CN1018675B

CN1018675B - 测定可免疫检测物质的方法及适用于此的反应容器

Info

Publication number: CN1018675B
Application number: CN89103423A
Authority: CN
Inventors: 俄本·施密特; 埃伯哈德·毛若; 沃尔夫岗·路金格; 罗尔夫·迪格
Original assignee: Mannheim Bollinger AG
Current assignee: Mannheim Bollinger AG
Priority date: 1988-05-25
Filing date: 1989-05-25
Publication date: 1992-10-14
Also published as: DE58908167D1; HK1001899A1; JP2824516B2; CA1336759C; ES2019257T3; DK233589A; JPH0224559A; ES2019257A4; ATE109892T1; FI892540A; EP0344578A1; DK172581B1; FI892540A0; AU3511089A; DK233589D0; IE891439L; IE64286B1; CN1038168A; EP0344578B1; AU609301B2

Abstract

为了通过异源免疫检测法利用结合有免疫活性反应组分的固相测定可免疫检测的物质，利用一种反应容器作为固相，其内表面结合有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白，结合量为每毫升反应体积存在有0.1～2.5μg。

Description

本发明涉及一种免疫学检测方法，即通过使用结合有一种免疫活性反应组分的固相，根据异源免疫检测法测定可免疫检测的物质，还涉及适用于此的反应容器及标准反应容器的使用。

免疫检测法通常被用来测定能被特异结合的物质。在本方法中，使能够相互特异结合的结合对的一个成员与其通过已知方法标记的特异性受体反应。然后，进一步使这两种物质的结合物与一受体反应，此受体特异于结合物或其两个成员之一。可采用许多方式来进行这类免疫学检测。在这类方法中，最好是使受体之一与固相结合。这有助于使结合的和未结合的反应成员分离。在测定能被特异结合的物质时，根据已知方法测量与固相结合的标记的反应成员的量，或测定存在于溶液中的标记的反应成员的量，并计算待测的反应成员的量。

在免疫学方法中通常作为固相使用的有塑料试管或微量滴定板，其内表面结合有反应成员，或反应成分结合在其外表面的小球体。

在这些方法中，特异性反应成员与不同表面的结合必须以这样的方式进行，即它在结合后不丧失与能与其特异结合的物质进行特异性结合的能力。由于此原因，反应成员通常通过吸附作用结合于固相。因此，已有建议指出，反应成员与固相的结合应当通过介导结合作用的偶联剂进行。在此方法中，应当注意不要使反应成员与结合剂的结合破坏分子中进行特异性反应的区域，或者说应使反应成员以这样的方式结合，即使其反应位点背对固相并向着它的结合成员。

所有这些已知方法的缺陷是必须为每种特异反应提供专门的固相。这意味着对每个单独的测试来说，必须制备和贮存另一种固相，然后用来进行测定，这些步骤是很繁琐费时的。

因此，本发明的目的是提供一种方法和一种适用于许多不同的检测法的反应容器。在日常的临床诊断中，由一份血液样品测定许多不同的参数，例如激素、肿瘤标记等，并测定感染、过敏性或受孕等的参数。待测参数的浓度范围很广。低浓度参数如TSH和催乳激素的范围是10^-10-10^-12mol/l，而高浓度参数如T₃和T₄的浓度大约为10^-7-10^-8mol/l。就此而言，每次进行单项测定时最好不必使用不同的试管，而是能够在所有测定中使用一个标准的反应容器。

此目的是通过一种免疫学检测方法达到的，即通过使用结合有一种免疫活性反应组分的固相，根据异源免疫检测法测定可免疫检测的物质，其中使用一种反应容器作为固相，其内表面结合有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白，结合量为每毫升反应体积有0.1～2.5μg。所列数量是指在免疫反应过程中，可由结合成员（其形式为生物素化的蛋白质或半抗原）接近的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。

本发明的方法适用于所有的测定法，其中，受体可以是抗体或抗原，使它固定于固相上并与生物素结合。本发明与固相结合的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白能很好地粘附于所有的试管材料，而且这种结合对于洗涤剂是稳定的。在对许多免疫学方法进行评价时都需要建立标准曲线，在此过程中，与固相结合的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白产生很陡的标准曲线，而空白的读数很小，因此提高了精确度。另一优点是，每批之间所包裹的抗生蛋白链菌素量的差别对测量结果只有可以忽略的影响。本发明方法的特别突出的优点是，可以调节与固相结合的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的量，从而使它能够用于所有已知的以异源免疫检测法为基础的方法。进一步的优点是可用本发明的方法同时测定好几种物质，尤其是抗体，但也包括抗原。实例7将对此作更详细的说明。

在一个尤其优选的具体方案中，用作固相的反应容器可同时用作对标记进行光度学测定的小杯。这一点是尤其有利的，因为进行所有的反应时只需使用一个容器。在这种情况下，所制造的反应容器在相互对立的两面应当具有光学透明的壁。所有的壁区域都可以用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白包裹。

根据本发明，用作固相的反应容器在其内表面上结合有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。通过现有技术的方法（EP122209）进行抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的结合。抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白可以直接结合在固相上，或也可以通过间隔物或介导结合作用的物质进行结合。

在本发明优选的具体方案中，使抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白与分子量高于大约500000的可溶性蛋白偶联，然后根据例如专利申请P3640412.8所述方法，使此结合物吸附于流水性固相上。优选使用已经使之具有疏水性的蛋白质。

可通过下述方式提高疏水性，即利用热处理、甲酸、变性剂和/或促溶离子处理和/或通过磺酰方法与疏水化合物偶联。用这些试剂处理还导致分子量的上升。通过下述方式也能使分子量上升即利用双或多功能蛋白剂进行交联。

可以作为酸使用的有例如乙酸、丙酸、乳酸或盐酸。通常的浓度是1-100mmol/l，反应时间为10分钟至16小时。

合适的促溶离子有例如硫氰酸盐、碘化物、氟化物、溴化物、高氯酸盐和硫酸盐。合适的变性剂有例如盐酸胍或脲。它们的浓度通常为10mmol/l至6mol/l。

对于用疏水化合物进行衍生来说，优选使用可溶性脂肪酸、低或高分子量的类脂以及合成聚合物如聚丙烯二醇或可溶性的聚苯乙烯共聚物。用本领域公知的方法进行衍生。

利用已知的蛋白结合剂通过双或多功能化合物进行交联。这些化合物至少具有两个功能基团，它们可以是相同的或不同的，这些化合物能通过这些功能基团与蛋白质的功能基团反应。优选使用由烷基链组成的化合物，在其末端具有琥珀酰亚胺、马来酰亚胺和/或醛基。

通过已知方法使蛋白质与双或多功能化合物交联，即使可溶性蛋白与双或多功能化合物反应。

为了提高疏水性和/或进行交联，优选使用分子量为10000-700000的蛋白质。尤其优选牛血清清蛋白、酯酶或免疫-γ-球蛋白。

然后利用已知方法使抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白与蛋白质交联。合适的偶联方法见于（例如）Ishikawa，J.Immunoassa y4：209-327，1983。

然后，由抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白和蛋白质得到的结合物吸附于用作固相的塑料表面。在使蛋白质和抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的结合物吸附于疏水固相之前，也可以对固相进行化学或物理预处理。例如，可预先使塑料表面溶胀或以另一种已知方法活化。与固相的吸附结合是通过强和弱相互作用、疏水力、偶极子-偶极子或离子-偶极子相互作用产生的。

由表面张力小于可溶性疏水蛋白的表面张力的支持材料（即比蛋白质具更强的疏水性）制成的反应容器特别适于用作疏水固相。优选使用表面张力为40erg/cm²的支持材料。特别合适的材料有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚四氟乙烯、聚酰胺、苯乙烯和丙烯腈的共聚物、玻璃和纤维素产品等。

本发明生产的固相材料被用于测定许多不同的参数。在此方法中，使一种能与待测参数结合的物质与生物素结合，再使其与分别结合在固相上的抗生蛋白链菌素和抗生物素蛋白结合。通过这种方式，能够固定由免疫检测法产生的特异复合物并进行测定。因此，根据本发明，分别与固相结合的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白，在每毫升反应体积中有0.1～2.5μg可用来与能进行特异结合的生物素化物质结合。

所述反应体积是指样品体积和试剂体积之和。

优选以这样的方式来包裹固相材料：使得可用来与能进行特异结合的生物素化物质结合的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白分别为1-2μg。能进行特异结合的生物素化物质量的范围在10^-16至10^-8mol/反应体积。

本发明进一步的具体方案是一种反应容器，在其相互对立的两面具有光学透明的壁，容器的壁上包裹有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，所述壁至少有部分是在将用来盛装液体的内壁区域之内，容器的内空间将用来盛装液体，所包裹的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的数量分别为每毫升反应体积存在有0.1～2.5μg抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。

此反应容器尤其适于用来进行本发明的方法。由于它在相互对立的两面具有光学透明的壁并包裹有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。因此它能同时用来进行反应和光度学测定。由于它分别包裹有每毫升反应体积0.1～2.5μg抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。因此，此反应容器能用来根据异源免疫检测法测定不同的参数。

反应容器构成了固相。它是由通常用于此目的的材料组成的。例如塑料、玻璃等。光学透明的壁区域也是由已知材料构成。在此情况下尤其优选聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯。

抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白可以直接或通过载体物质或间隔物进行包裹。例如一种合适的方式是，使抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白与分子量大于500000的可溶性蛋白结合，然后使其吸附在反应容器的内表面上。

使用标准反应容器利用免疫检测法来测定不同参数也是本发明的具体方案之一，它包括其内表面结合有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的容器，其结合量为在测定反应中每毫升反应体积有0.1～2.5μg抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。

本发明提供了一种方法和一个反应容器，其中，在用作固相的反应容器内表面以良好粘性永久性地结合有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。所述粘性非常之好，即使加入洗涤剂也不会使该物质脱落。本发明提供的反应容器能够广泛使用，并适于用来测定许多不同的参数，因此促进了日常测定工作的进行。

后面的附图和实例解释了本发明。在这些附图中：

图1是使用不同量的固定化抗生蛋白链菌素（SA）和生物素化的抗TSH抗体得到的用于TSH测定的一系列标准曲线：

图2是测定催乳激素的标准曲线;

图3是测定CEA的标准曲线和

图4是测定T₄的标准曲线。

图5是利用不同量的固定化抗生蛋白链菌素得到的测定抗HBs的一系列标准曲线。

产生实例中所用的针对TSH的单克隆抗体的杂交瘤细胞系寄存于欧洲动物细胞培养物收集中心（Po Hon Down，GB），寄存号为ECACC87122201和ECACC87122202。

实例1

研究了本发明的结合物以及疏水蛋白和抗生蛋白链菌素与固相的结合：

-如下述制备加热聚集的BSA（后面称为热BSA）：lgBSAH溶于100mlpH7.0的50mmol/l磷酸钾溶液中，加热至70℃，在此温度下保持4小时并加轻轻搅拌。使溶液冷却，过滤后将浓度调至50mg/ml。然后，在30倍体积的重蒸馏水中透析。

-抗生蛋白链菌素与热BSA聚合物的制备;从阿维迪链霉菌（Streptomyces avidinii）中分离抗生蛋白链菌素，并通过马来酰亚胺-己酰-N-羟基-琥珀酰亚胺转化为含有马来酰亚胺基的抗生蛋白链菌素。用S-乙酰基-巯基-琥珀酸酐转化热BSA，然后通过加入羟胺释放被保护的疏基。然后使含有马来酰亚胺基的抗生蛋白链菌素和含有疏基的热BSA混合，则得到所需要的结合物。

-然后用抗生蛋白链菌素-热BSA结合物包裹由聚苯乙烯制成的塑料试管。试管的包裹用1.5ml抗生蛋白链菌素-热BSA溶液于20℃进行18-24小时，其中，两种组分以1.8∶1的摩尔比例存在于40mmol/l的pH7.4的磷酸钠缓冲液中（10μg/ml）。

使试管抽气，然后再用1.8ml含有2%蔗糖、0.9%氯化钠和0.3%BSA的溶液于20℃包裹30分钟。在干燥以后（于20℃和40%相对湿度下24小时），试管可以备用并具有稳定的性能。

实例2

TSH的一步测定法

制备生物素化的单克隆抗TSH抗体。为了此目的，通过常规方法用生物素转化TSH抗体（ECACC87122201），即通过氨基进行偶联。所用抗体和生物素的比例为1∶16。使这样得到的400mg生物素化抗体溶于1ml缓冲液中（40mmol/l磷酸钠，0.5%Pluronic F68，0.2mol/l酒石酸钠及0.01%苯酚），然后在如实例1包裹的试管中保温2小时，其中加有200μl样品或分别含有已知量TSH和75mU与过氧化物酶结合的TSH抗体（ECACC87122202）的标准溶液。然后用来自水洗涤3次并加入1ml ABTS底物溶液。1小时ABTS底物溶液。1小时后在405nm处测定光吸收。结果示于图1中。结果表明，如果所用的固定化抗生蛋白链菌素的量多于0.1μg/ml测试体积，则能够得到满意的结果。

对与用于试验中的生物素化抗体相结合所需的抗生蛋白链菌素进行测定。为了这一目的，根据Bayer，Edward A.，Meir-Wilchek的方法（Analytical Biochemistry 154：367-370，1986）测定游离的生物素。假设在1∶15的抗体与生物素的比例中有1μg抗体被生物素化（Gucsdon，I.L.，J.HistochcmCytochero.27：1131-1139，1979），则每摩尔抗体中有1-2摩尔生物素可用于结合，也就是说，每微克抗体有1.5-3ng生物素可以自由结合。

用放射活性的¹⁴C-生物素测定发现，用10μg抗生蛋白链菌素-热BSA结合物（实例1）包裹的试管，其对于生物素的结合容量为每毫升测试体积15-20ng。

抗生蛋白链菌素试管对于生物素化的γ免疫球蛋白的结合容量是1.7-2μg/ml测试体积。测定是用¹²⁵Ⅰ-标记的β-球蛋白进行（根据Mc Conahey和Dixon 1966，Int.Arch.Allergy 29/185的方法标记）。

实例3

催乳激素测定

通过一步夹层免疫检测法测定催乳激素。具有下列组成的试剂用于检测中：

-50mU/ml POD和针对催乳激素的单克隆抗体的聚合物，

-40mmol/l磷酸缓冲液，pH7.0，

0.5%PluronicF65（聚氧乙烯-聚氧丙烯）

0.2mol/l酒石酸钠

0.01%苯酚

0.2%牛血清清蛋白（BSA）

400ng/ml针对催乳激素的生物素化单克隆抗体。

两种单克隆抗体都只需能用来检测催乳激素就行，并且针对催乳激素的不同的抗原决定簇。在实例1得到的用抗生蛋白链菌素热BSA聚合物包裹的聚苯乙烯试管中，使1ml此试剂与50μl样品于室温下保温30分钟。然后用自来水洗涤3次。加入1mlABTS

底物溶液进行测定反应。30分钟后，在405nm处测定光吸收。结果示于图2中。

ABTS

2，2′-连氮基-二-[3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸酯]-二-铵盐

实例4

CEA测定

通过一步夹层免设检测法测定样品溶液中的CEA。所用试剂含有下列成分：

-120mU/mlPOD和针对CEA的单克隆抗体的结合物

-40mmol/l磷酸缓冲液，pH7.0

0.5%Pluronic F68

0.2mol/l酒石酸钠

0.01%苯酚

0.2%牛血清清蛋白

500ng/ml针对CEA的生物素化单克隆抗体。

对于两种针对CEA的单克隆抗体的唯一要求是它们能检测CEA，并且它们分别针对CEA的不同的抗原决定簇。

在实例1得到的用抗生蛋白链菌素-热BSA包裹的聚苯乙烯试管中，使1ml试剂和100μl样品于室温下保温2小时。然后用自来水洗涤3次。加入1mlABTS底物溶液进行测定反应。1小时后在405nm处测定光吸收。结果示于图3中。

实例5

T₄测定

利用生物素化的抗T₄抗体通过竞争性免疫检测法测定T₄。由下述组分配制用于此目的的试剂。

100mU/ml甲状腺素-POD结合物（根据EP209155制备）

120mmol/l巴比土酸盐

18.2mmol/l磷酸缓冲液，pH8.6

0.04%重量的ANS（8-苯胺基-1-萘磺酸）

0.2%重量的牛血清清蛋白，

在实例1得到的用抗生蛋白链菌素-热BSA结合物包裹的聚苯乙烯试管中，使500μl上述试剂和20ml样品于室温下保温10分钟。然后加入500μl由下述组成的第二试剂：

1μg/ml针对T的生物素化的单克隆抗体，

120mmol/l磷酸缓冲液，pH8.6，

0.04%重量的ANS（8-苯氨基-1-萘磺酸），

0.2%重量的牛血清清蛋白，

并于室温下进一步保温30分钟。用自来水洗涤3次，然后加入1mlABTS底物溶液于室温下保温30分钟。然后在405nm处测定光吸收。结果于图4中。

实例6

抗-HBs测定

通过一步夹层免疫检测法测定HBs抗体。测定中使用具有下述组成的试剂：

60mU/mlPOD和HBs抗原的结合物

40mmol/l磷酸缓冲液，pH7.0

200mmol/l酒石酸钠

0.5%重量的PluronicF68

0.01%重量的苯酚

0.2%牛血清清蛋白

0.1%重量的牛IgG

150ng/ml生物素化的HBs Ag（根据Immunol.Letters 8：273，1984制备）。

使1ml此试剂和200μl样品在用抗生蛋白链菌素-热BSA结合物包裹的聚苯乙烯试管中于室温下保温4小时。用自来水洗涤3次，然后加入1mlABTS底物溶液进行测定反应。60分钟后在422nm处测定光吸收。

利用不同量的固定化抗生蛋白链菌素在试管中进行抗-HBs测定。结果示于图5中。从中可以看出，如果抗生蛋白链菌素的使用量高于本发明所推荐的，则此测定的灵敏度显著降低。

实例7

抗-HIV测定

通过一步夹层免疫检测法测定HIV抗体。测定中使用具有下述组成的试剂。

试剂1：

一种或多种生物素化的HIV抗原各10^-7mol/l

40mmol/l磷酸缓冲液，pH7.0

0.9%重量的氯化钠

10%体积的牛血清

使用下列作为抗原：通过遗传工程生产的相应于HIV-gp41（gp41-rek.，Centocor-p121）和HIV-p24（p24-rek.，Centocor-pg2）的HIV1抗原，由HIV1-gp41（gp41-pep，Wang等人，PNAS83;6159，1986）和HIV2-gp32（gp32-pep，Gnann，J.W.等人，Science237：1346，1987）化学合成的肽。这些抗原根据Leary等人所述（PNAS80：4045，1983）用生物素进行标记。

试剂2：

20mU/ml针对人免疫球蛋白的羊抗体和POD的结合物

40mmol/l磷酸缓冲液，pH7.0

0.05%重量的Tween20

0.2%牛血清清蛋白

0.2%牛IgG

在用抗生蛋白链菌素-热BSA结合物包裹的聚苯乙烯试管中，使1ml试剂和10μl人血清或血浆于室温保温1小时。然后用自来水洗涤试管3次，并于室温下与1ml试剂2保温/小时。试管再用自来水洗涤3次，加入1mlABTS底物溶液进行测定反应。60分钟后在422nm处测定光吸收。用单个的HIV抗原和抗原结合物进行抗-HIV 测定。结果证实，在用抗生蛋白链菌素-热BSA结合物包裹的聚苯乙烯试管中进行的测定法，不仅适于测定单个抗原特异性的抗体，还适于用来测定好几种抗体或抗体群落（筛选试验：表1），而不管这些抗体是否针对同样的病毒，或是针对好几种病毒或针对感兴趣的抗原。

Claims

1、利用免疫活性反应成分之一与一固相结合的异源免疫检测法测定可免疫检测物质的方法，其中能够与所要测定的参数结合的物质与生物素相连，将含有所需参数的溶液与该结合物一起保温以形成复合物，并通过将该溶液加至反应容器中而固定所形成的复合物，并通过将该溶液加至反应容器中而固定所形成的复合物，该容器的内表面则以每毫升反应容积0.1-2.5μg的量结合了抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白，然后分离掉液相并按已知方法进行测定。

2、权利要求1的方法，其中使用一种小杯作为反应容器，杯壁的内表面包裹有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。

3、前述权利要求之一的方法，其中的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白与分子量大于500000的可溶性蛋白偶联，然后使抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白和蛋白质的结合物吸附于疏水固相上。

4、前述权利要求之一的方法，其中能同时测定好几种物质尤其是好几种抗体。

5、在对立两面具有光学透明壁的反应容器，其壁上包裹有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，所述壁至少有部分是在将用来盛装液体的内壁区域之内，其中容器的内空间将用来盛装液体。所包裹的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的数量分别为每毫升反应体积存在有0.1～2.5μg抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。

6、权利要求5的反应容器，其中的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白是通过分子量大于500000的可溶性蛋白与固相结合。

7、权利要求5或6的反应容器，其中的反应容器是一种小杯。

8、标准反应容器的用途，用它通过免疫检测法测定不同参数，它包括其内表面结合有抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白的容器，其结合量为在测定反应中每毫升反应体积有0.1～2.5μg抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白。