JPS62169054A - 固相免疫測定法 - Google Patents
固相免疫測定法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
、産業上の利用分野
本発明は、反応溶液、洗浄液等の分注・排出操作を容易
にした固相免疫測定法に関する。
にした固相免疫測定法に関する。
従来の技術
免疫学的測定法は、それぞれの抗原物質に、対応する抗
体が選択的に反応するという抗原抗体反応の特異性を応
用した測定法であり、検出感度も高く、様々な物質の同
定、定量に用いられてきた。
体が選択的に反応するという抗原抗体反応の特異性を応
用した測定法であり、検出感度も高く、様々な物質の同
定、定量に用いられてきた。
また、各種診断に応用される免疫学的診断法としても広
く用いられている。
く用いられている。
この様な現状において、免疫学的測定を、正確かつ簡単
に行うべく、種々の改良、開発が行われている。例えば
、この方法で最も手間がかかり、かつ困難なのは、抗原
抗体反応物を未反応物と分離する操作であり、この問題
を解決するために、抗原または抗体を不溶性の物質また
は反応容器の壁面に付着させ、抗原抗体反応物の分離お
よび洗浄をより容易とする固相免疫測定法が開発されて
いる。
に行うべく、種々の改良、開発が行われている。例えば
、この方法で最も手間がかかり、かつ困難なのは、抗原
抗体反応物を未反応物と分離する操作であり、この問題
を解決するために、抗原または抗体を不溶性の物質また
は反応容器の壁面に付着させ、抗原抗体反応物の分離お
よび洗浄をより容易とする固相免疫測定法が開発されて
いる。
この方法は、応用範囲がきわめて広く、例えば、抗原抗
体反応物を検出するだめの標識物質により、放射性同位
元素免疫測定法(RIA法)、あるいは酵素免疫測定法
(ELISA法、EIA法)等に分類できる。また、測
定操作において、抗原抗体反応物質を標識する手順によ
り、間接法、二抗体サンドイツチ法、競合法等に分類で
きる。
体反応物を検出するだめの標識物質により、放射性同位
元素免疫測定法(RIA法)、あるいは酵素免疫測定法
(ELISA法、EIA法)等に分類できる。また、測
定操作において、抗原抗体反応物質を標識する手順によ
り、間接法、二抗体サンドイツチ法、競合法等に分類で
きる。
固相免疫測定法においては、間接法、二抗体サンドイツ
チ法、競合法等と上記二種類の標識方法のいずれかとを
組合せることにより、種々の固相免疫測定を行うことが
できるが、感度、特異性、迅速性、正確性においてすぐ
れ、かつ自動化可能なものが好ましい。固相放射性同位
元素免疫測定法は、上記特性のほとんどを満たすが、放
射性同位元素の汚染に注意が必要である。
チ法、競合法等と上記二種類の標識方法のいずれかとを
組合せることにより、種々の固相免疫測定を行うことが
できるが、感度、特異性、迅速性、正確性においてすぐ
れ、かつ自動化可能なものが好ましい。固相放射性同位
元素免疫測定法は、上記特性のほとんどを満たすが、放
射性同位元素の汚染に注意が必要である。
固相酵素免疫測定法は、特異的な抗原抗体反応と鋭敏な
酵素反応を組み合わせることにより、極く微量の抗原も
しくは抗体を検出定予できるばかりでなく、放射性同位
元素による汚染の心配がないため(酵素免疫測定法:医
学書院列、1976年)、広く免疫学の研究分野のみな
らず、医学の臨床診断の分野においても、その有用性は
近年ますます高まっている。
酵素反応を組み合わせることにより、極く微量の抗原も
しくは抗体を検出定予できるばかりでなく、放射性同位
元素による汚染の心配がないため(酵素免疫測定法:医
学書院列、1976年)、広く免疫学の研究分野のみな
らず、医学の臨床診断の分野においても、その有用性は
近年ますます高まっている。
従来の固相酵素免疫測定法では96穴マイクロタイタ−
トレイを用いる方法が一般的であり、そのための専用の
光度計も開発されている。固相酵素免疫測定法の内、最
も良く利用されている96穴マイクロクイタートレイを
用いた間接法について、その÷既略を説明すると、まず
96穴マイクロタイタートレイの各穴(ウェル)の底部
内壁に抗原(あるいは抗体)Aをコーディングし、さら
に、該内壁Aによって被覆されなかった部分を別の蛋白
質でブロッキングすることにより完全に該底部内壁を被
覆し、次いで各穴にその抗原(あるいは抗体)Aに特異
的に反応する濃度の不明な抗体(あるいは抗原)Bの溶
液、さらにその抗体くあるいは抗原)Bに特異的に反応
する酵素標識抗体溶液を順次入れ替えて反応させる。未
反応の抗原あるいは抗体は溶液を入れ替える度に緩衝液
で良く洗い流す。最後に酵素と反応して発色する基質を
含む溶液を各穴に加えて一定時間反応させた後、強酸等
で反応を停止させ、発色の程度、即ち酵素標識抗体と結
合した濃度不明の抗体(あるいは抗原)Bの塁を吸光度
で測定定量する。
トレイを用いる方法が一般的であり、そのための専用の
光度計も開発されている。固相酵素免疫測定法の内、最
も良く利用されている96穴マイクロクイタートレイを
用いた間接法について、その÷既略を説明すると、まず
96穴マイクロタイタートレイの各穴(ウェル)の底部
内壁に抗原(あるいは抗体)Aをコーディングし、さら
に、該内壁Aによって被覆されなかった部分を別の蛋白
質でブロッキングすることにより完全に該底部内壁を被
覆し、次いで各穴にその抗原(あるいは抗体)Aに特異
的に反応する濃度の不明な抗体(あるいは抗原)Bの溶
液、さらにその抗体くあるいは抗原)Bに特異的に反応
する酵素標識抗体溶液を順次入れ替えて反応させる。未
反応の抗原あるいは抗体は溶液を入れ替える度に緩衝液
で良く洗い流す。最後に酵素と反応して発色する基質を
含む溶液を各穴に加えて一定時間反応させた後、強酸等
で反応を停止させ、発色の程度、即ち酵素標識抗体と結
合した濃度不明の抗体(あるいは抗原)Bの塁を吸光度
で測定定量する。
上記の間接状以外にも、酵素標識抗体を反応させる前に
、濃度不明の抗体(あるいは抗原)已に特異的に反応す
る抗体Cを反応させてから、その特異抗体Cに反応する
酵素標識抗体を最後に反応させる2抗体サンドイッチ法
や、コーティングした抗原(あるいは抗体)Aに濃度不
明な抗体(あるいは抗原)Bを反応させ、さらに抗体(
あるいは抗原)Bと同様にAに反応する酵素標識抗体(
あるいは抗原)を反応させる競合法等がある。
、濃度不明の抗体(あるいは抗原)已に特異的に反応す
る抗体Cを反応させてから、その特異抗体Cに反応する
酵素標識抗体を最後に反応させる2抗体サンドイッチ法
や、コーティングした抗原(あるいは抗体)Aに濃度不
明な抗体(あるいは抗原)Bを反応させ、さらに抗体(
あるいは抗原)Bと同様にAに反応する酵素標識抗体(
あるいは抗原)を反応させる競合法等がある。
また、固相さしてはプラスチック製の9G穴マイクロタ
イクートレイの他に、2〜5 mm径の粒状体を容器の
中に入れて用いることもある。
イクートレイの他に、2〜5 mm径の粒状体を容器の
中に入れて用いることもある。
また、他の標識物質、例えば放射性同位元素を用い、放
射性同位元素標識抗体と抗原抗体反応物とを結合せしめ
、放射性同位元素の放射線量で定性・定量することも、
もちろん可能である。
射性同位元素標識抗体と抗原抗体反応物とを結合せしめ
、放射性同位元素の放射線量で定性・定量することも、
もちろん可能である。
いずれの方法も、固相となる穴内壁にコーティングした
抗原(あるいは抗体)に順次特異的に抗体や抗原を反応
させて行き、未反応のものは洗い流すことにより抗原抗
体反応を起したもののみを検出することを特徴とする。
抗原(あるいは抗体)に順次特異的に抗体や抗原を反応
させて行き、未反応のものは洗い流すことにより抗原抗
体反応を起したもののみを検出することを特徴とする。
これら従来の固相免疫測定法は、抗原溶液、抗体溶液あ
るいは基質溶液を容器に分注・排出する操作と、溶液を
入れ換える際に未反応の抗原あるいは抗体を緩衝液で洗
い流す洗浄操作との繰り返しで単調なものであるが、以
下の様な不具合があった。
るいは基質溶液を容器に分注・排出する操作と、溶液を
入れ換える際に未反応の抗原あるいは抗体を緩衝液で洗
い流す洗浄操作との繰り返しで単調なものであるが、以
下の様な不具合があった。
発明が解決しようとする問題点
即ち、分注操作はマイクロピペットもしくはマイクロデ
ィスペンサーを多数回操作し、しかもそれらの操作は反
応時間を揃えるため短時間のうちに手早く行う必要があ
り、疲労の大きいものであった。
ィスペンサーを多数回操作し、しかもそれらの操作は反
応時間を揃えるため短時間のうちに手早く行う必要があ
り、疲労の大きいものであった。
また、洗浄操作に就いては、96穴マイクロタイタート
レイを用いる場合は、洗浄液が隣接する穴に入らない様
に注意して洗浄液の注入・排出を繰り返す必要があり、
しかも反応相である底面を傷つけない様に気を付けて操
作しなければならず大変であった。
レイを用いる場合は、洗浄液が隣接する穴に入らない様
に注意して洗浄液の注入・排出を繰り返す必要があり、
しかも反応相である底面を傷つけない様に気を付けて操
作しなければならず大変であった。
そのため、自動的に各穴への洗浄液の注入及び各穴から
の洗浄液の排出を行う装置も幾つか開発されてはいるが
、底面を傷つける恐れがあるため排出用のチューブを穴
の底まで着けられず、液穴の底あるいは隅に廃液が残り
、分析の精度を悪くするという欠点があった。
の洗浄液の排出を行う装置も幾つか開発されてはいるが
、底面を傷つける恐れがあるため排出用のチューブを穴
の底まで着けられず、液穴の底あるいは隅に廃液が残り
、分析の精度を悪くするという欠点があった。
固相として粒状体を用いる場合も、同様に粒状体表面を
傷つけない様に、洗浄液の注入・排出を行わなければな
らず、この反応溶液および洗浄液の注入排出操作は手間
のかかるものだった。
傷つけない様に、洗浄液の注入・排出を行わなければな
らず、この反応溶液および洗浄液の注入排出操作は手間
のかかるものだった。
問題を解決するための手段
本発明はこれらの従来の固相免疫測定法の問題点を解決
すると同時に、更に従来の固相免疫測定法にない長所を
有する、反応固相として作用する毛管部を有する細管を
用いることを特徴とする固相免疫測定法を提供するもの
である。
すると同時に、更に従来の固相免疫測定法にない長所を
有する、反応固相として作用する毛管部を有する細管を
用いることを特徴とする固相免疫測定法を提供するもの
である。
即ち、本発明による固相免疫測定法は、反応容器および
固相として、内径2mm以下の毛管部を有する透明な細
管内壁を用い、該内壁面に抗原または抗体を付着せしめ
、さらに被験溶液中の抗体または抗原と反応させること
を特徴とする。
固相として、内径2mm以下の毛管部を有する透明な細
管内壁を用い、該内壁面に抗原または抗体を付着せしめ
、さらに被験溶液中の抗体または抗原と反応させること
を特徴とする。
本発明の固相免疫測定法に用いられる細管は、毛管力に
より所定量の溶液を該細管内部に保持できる様な毛管部
を有するものであればよく、例えば、全体にわたって一
定の内径を持つ毛管であってもよい。また、添付第1図
に示す様に、細管全体を毛管1とし、該毛管1の下端に
該毛管1の内径よりも小さな孔径を有する透水性の隔壁
2を備えることで、より多くの溶液3を毛管1内部に保
持することも可能である。
より所定量の溶液を該細管内部に保持できる様な毛管部
を有するものであればよく、例えば、全体にわたって一
定の内径を持つ毛管であってもよい。また、添付第1図
に示す様に、細管全体を毛管1とし、該毛管1の下端に
該毛管1の内径よりも小さな孔径を有する透水性の隔壁
2を備えることで、より多くの溶液3を毛管1内部に保
持することも可能である。
本発明において、透水性とは、毛管1に該隔壁2を取り
付けた場合、毛管1の内部を陽圧あるいは陽圧とするこ
とにより容易に溶水を流通させ得る特性と理解されるべ
きである。該隔壁2は、例えば膜状、海綿状あるいは網
目状のいずれであっても良い。
付けた場合、毛管1の内部を陽圧あるいは陽圧とするこ
とにより容易に溶水を流通させ得る特性と理解されるべ
きである。該隔壁2は、例えば膜状、海綿状あるいは網
目状のいずれであっても良い。
更に、添付第2図に示す様に、毛管1の下端を、他の部
分上り小さな内径の開口部4を有する形状とすることに
よっても、毛管1内部に保持される溶液3の量を増加さ
せることができる。
分上り小さな内径の開口部4を有する形状とすることに
よっても、毛管1内部に保持される溶液3の量を増加さ
せることができる。
また、添付第3図に示す様に、上記細管5の固相として
用いる部分の上端部および下端部の少なくとも1方、好
ましくは両方を毛管部6とし、この2ケ所の毛管部6の
毛管力により、中央部の細管部7に一層多くの溶液3を
保持する形状とすることができる。
用いる部分の上端部および下端部の少なくとも1方、好
ましくは両方を毛管部6とし、この2ケ所の毛管部6の
毛管力により、中央部の細管部7に一層多くの溶液3を
保持する形状とすることができる。
また、上記細管の材質としては、抗原あるいは抗体、即
ち蛋白質を付着しやすい材質であることが好ましく、例
えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリ塩化ビニルおよびポリカーボネート等のポリマーあ
るいは、ガラス等を例示できる。
ち蛋白質を付着しやすい材質であることが好ましく、例
えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリ塩化ビニルおよびポリカーボネート等のポリマーあ
るいは、ガラス等を例示できる。
更に、一定量の溶液を吸上げるために、上記細管に液1
測定用の目盛を付けることが好ましい。
測定用の目盛を付けることが好ましい。
上記の様な細管を用いた、本発明の固相免疫測定法は、
標識物質として、酵素または放射性同位体等を用いた、
間接法、二抗体サンドイツチ法、または競合法等を、有
利に適用することが可能である。
標識物質として、酵素または放射性同位体等を用いた、
間接法、二抗体サンドイツチ法、または競合法等を、有
利に適用することが可能である。
本発明の固相酵素免疫測定法の操作手順を、最も良く使
われる前記の間接法を例に説明する。
われる前記の間接法を例に説明する。
透明で表面に蛋白質を封着する材質から成る細管を必要
数量用意し、コーティングする抗原(あるいは抗体)A
溶液を一定滑、即ち、例えばそれぞれの細管の内径が同
一ならば細管の同じ高さまで、また、細管の外面に液量
を示す目盛が付いていればこの目盛まで、該細管の下端
より吸い上げる。その後、そのままの状態、あるいは該
細管を寝かせて、一定時間静置し、抗原(あるいは抗体
)Aを細管内壁に付着させる。
数量用意し、コーティングする抗原(あるいは抗体)A
溶液を一定滑、即ち、例えばそれぞれの細管の内径が同
一ならば細管の同じ高さまで、また、細管の外面に液量
を示す目盛が付いていればこの目盛まで、該細管の下端
より吸い上げる。その後、そのままの状態、あるいは該
細管を寝かせて、一定時間静置し、抗原(あるいは抗体
)Aを細管内壁に付着させる。
上記操作により、細管内壁に抗原(あるいは抗体)Aを
付着させた後、細管の下端を洗浄液に浸し、細管の上端
よりアスピレータ−等で吸引することにより洗浄液を細
管中に流し、細管内部を洗浄する。−足車の洗浄液を流
して細管内壁を洗浄した後、細管の下端を洗浄液から取
り出し細管の内部に残った洗浄液を抜き取る。
付着させた後、細管の下端を洗浄液に浸し、細管の上端
よりアスピレータ−等で吸引することにより洗浄液を細
管中に流し、細管内部を洗浄する。−足車の洗浄液を流
して細管内壁を洗浄した後、細管の下端を洗浄液から取
り出し細管の内部に残った洗浄液を抜き取る。
この洗浄液の排出操作は、毛管を束ねて底に吸水性の紙
等を詰めた遠沈管に詰めて低速の遠心分離により脱水す
るか、毛管の上端から陽圧を加えるか下端から陽圧を加
えて毛管の下端より洗浄液を抜き取るか、もしくは洗浄
液を流すのと同じように毛管の上端から残液も吸い取る
ことによって行うことができる。
等を詰めた遠沈管に詰めて低速の遠心分離により脱水す
るか、毛管の上端から陽圧を加えるか下端から陽圧を加
えて毛管の下端より洗浄液を抜き取るか、もしくは洗浄
液を流すのと同じように毛管の上端から残液も吸い取る
ことによって行うことができる。
上記の洗浄操作が終了後、ブロッキング溶液を、抗原(
あるいは抗体)Aがコーティングされた反応固相部分よ
り上の位置まで、細管下端より吸い上げ、一定時間静置
する。上記と同様に、細管内部の洗浄を行った後、コー
ティングした抗原(あるいは抗体)Aに特異的に反応す
る抗体くあるいは抗原)Bを含む被験溶液を、抗原(あ
るいは抗体)八をコーティングした位置まで、細管の下
端より吸い上げる。細管の上部に細管のナンバーを表す
数字もしくはバーコード等が付いていると、試料のナン
バーとの照合が容易であるばかりでなく、自動化を行う
場合には機械にナンバーを認識させることができるので
、便利である。
あるいは抗体)Aがコーティングされた反応固相部分よ
り上の位置まで、細管下端より吸い上げ、一定時間静置
する。上記と同様に、細管内部の洗浄を行った後、コー
ティングした抗原(あるいは抗体)Aに特異的に反応す
る抗体くあるいは抗原)Bを含む被験溶液を、抗原(あ
るいは抗体)八をコーティングした位置まで、細管の下
端より吸い上げる。細管の上部に細管のナンバーを表す
数字もしくはバーコード等が付いていると、試料のナン
バーとの照合が容易であるばかりでなく、自動化を行う
場合には機械にナンバーを認識させることができるので
、便利である。
抗原(あるいは抗体)Aと抗体くあるいは抗原)Bを細
管内壁面で一定時間反応させた後、上記と同じ方法で細
管内部の洗浄を行う。
管内壁面で一定時間反応させた後、上記と同じ方法で細
管内部の洗浄を行う。
次に、抗体(あるいは抗原)已に特異的に反応する酵素
標識抗体Cの溶液を、抗原(あるいは抗体)Aをコーテ
ィングした位置まで、細管の下端より吸い上げる。一定
時間反応させた後、同様にして細管内部の洗浄を行う。
標識抗体Cの溶液を、抗原(あるいは抗体)Aをコーテ
ィングした位置まで、細管の下端より吸い上げる。一定
時間反応させた後、同様にして細管内部の洗浄を行う。
最後に標識酵素に反応して発色する基質溶液を一定量、
抗原(あるいは抗体)Aをコーティングした反応固相部
分より上の位置まで、細管下端より吸い上げる。
抗原(あるいは抗体)Aをコーティングした反応固相部
分より上の位置まで、細管下端より吸い上げる。
必要であれは遮光して、一定時間反応させた後、基質液
の発色の程度を測定する。強酸溶液等を一定量細管中に
吸い上げて、反応を停止させてから、基質液の吸光度測
定を行っても良い。
の発色の程度を測定する。強酸溶液等を一定量細管中に
吸い上げて、反応を停止させてから、基質液の吸光度測
定を行っても良い。
基質液の吸光度測定は、従来の96穴マイクロタイター
トレイ用のアナライザーを用いる場合は、細管の上端よ
り陽圧を加え、下方に受けた96穴マイクロタイタート
レイの穴の中に基質液を移し換えて、アナライザーで測
定する。細管をセットできる様に特別に改良を加えた分
光光度計を用いれば、細管中の溶液の発色を直接測定す
ることが可能である。
トレイ用のアナライザーを用いる場合は、細管の上端よ
り陽圧を加え、下方に受けた96穴マイクロタイタート
レイの穴の中に基質液を移し換えて、アナライザーで測
定する。細管をセットできる様に特別に改良を加えた分
光光度計を用いれば、細管中の溶液の発色を直接測定す
ることが可能である。
上記間接法で、放射性同位元素により標識した場合、上
記と同様の反応操作を行い、最終的に基質溶液の変りに
、アルカリ性溶液等を細管下端より吸入し、蛋白質を分
解した後、管上端より陽圧を加え、排出する操作を複数
回くり返し、回収された排出液の放射線量を測定するこ
とにより、抗原抗体反応物の量を測定できる。
記と同様の反応操作を行い、最終的に基質溶液の変りに
、アルカリ性溶液等を細管下端より吸入し、蛋白質を分
解した後、管上端より陽圧を加え、排出する操作を複数
回くり返し、回収された排出液の放射線量を測定するこ
とにより、抗原抗体反応物の量を測定できる。
2抗体サンドイッチ法、競合法等も、用いる試薬や操作
回数が異なるだけで、各操作の内容は間接法で説明した
のと同じであるので、本発明の固相免疫測定法を用いて
のそれらの操作手順についての説明は省略する。
回数が異なるだけで、各操作の内容は間接法で説明した
のと同じであるので、本発明の固相免疫測定法を用いて
のそれらの操作手順についての説明は省略する。
作用
本発明の固相免疫測定法は、内径が2mm以下の毛管部
を有し、表面に蛋白質、即ち抗原や抗体を付着する透明
な材質から成る細管を反応容器とし、該細管の内壁を反
応固相として用いる、新規な固相免疫測定法であり、毛
管部を有する細管を用いることにより、以下に示すよう
な特性を有する。
を有し、表面に蛋白質、即ち抗原や抗体を付着する透明
な材質から成る細管を反応容器とし、該細管の内壁を反
応固相として用いる、新規な固相免疫測定法であり、毛
管部を有する細管を用いることにより、以下に示すよう
な特性を有する。
即ち、本発明の固相免疫測定法に反応容器および固相と
して用いられる、毛管部を有する細管は、該毛管部の毛
管力により、細管内部にかなりの量の溶液を保持するこ
とかできる。さらに、全体にわたって同一内径を有する
毛管とする、全体を毛管とし該毛管の下端に膜状、海綿
状あるいは網目状の隔壁を備える、全体を毛管とし該毛
管の下端を他の部分の内径より小さな内径を有する様に
すぼめる、あるいは溶液を保持する部分の上端部および
下端部の少なくとも1方を毛管部とする等により、適宜
その保持溶液量を変化させ得る。
して用いられる、毛管部を有する細管は、該毛管部の毛
管力により、細管内部にかなりの量の溶液を保持するこ
とかできる。さらに、全体にわたって同一内径を有する
毛管とする、全体を毛管とし該毛管の下端に膜状、海綿
状あるいは網目状の隔壁を備える、全体を毛管とし該毛
管の下端を他の部分の内径より小さな内径を有する様に
すぼめる、あるいは溶液を保持する部分の上端部および
下端部の少なくとも1方を毛管部とする等により、適宜
その保持溶液量を変化させ得る。
しかも、上記管の全体を内径の小さな毛管とした場合、
少量の抗原(あるいは抗体)溶液でも正確に定量でき、
さらに十分な面積の固相上で反応を行わせることが可能
となった。
少量の抗原(あるいは抗体)溶液でも正確に定量でき、
さらに十分な面積の固相上で反応を行わせることが可能
となった。
また、本発明の固相免疫測定法では、従来の方法では手
間のかかった分注操作が、毛管そのものがマイクロピペ
ットとしての機能を持つため、簡単に行える。また、同
様に手間がかかり時間のかかった洗浄操作も、毛管中に
洗浄液を流す方法により、反応固相を傷つけることなく
短時間で簡単に行える。さらに、反応溶液の世を毛管が
自然に吸い上げる世として適当な溶液濃度に調整する、
多数の毛管をまとめてアスピレータにセットして一度に
洗浄操作を行う等の工夫により自動化が容易に行えると
言った長所がある。
間のかかった分注操作が、毛管そのものがマイクロピペ
ットとしての機能を持つため、簡単に行える。また、同
様に手間がかかり時間のかかった洗浄操作も、毛管中に
洗浄液を流す方法により、反応固相を傷つけることなく
短時間で簡単に行える。さらに、反応溶液の世を毛管が
自然に吸い上げる世として適当な溶液濃度に調整する、
多数の毛管をまとめてアスピレータにセットして一度に
洗浄操作を行う等の工夫により自動化が容易に行えると
言った長所がある。
実施例
細管状の容積100μ!のガラス製マイクロピペット(
内径的1.3mm)の下端にスポンジを1〜2m1Tl
の厚さに詰め、下端から30μβ及び50μ!の位置に
目盛を付は第1図に示す如き形状の固相用毛管を使用し
た。
内径的1.3mm)の下端にスポンジを1〜2m1Tl
の厚さに詰め、下端から30μβ及び50μ!の位置に
目盛を付は第1図に示す如き形状の固相用毛管を使用し
た。
ウサギ抗マウス免疫グロブリンを、0.(11M燐酸緩
衝食塩水(P B S ; 0.(11M Na2HP
○、−Na82P○4.0、15 M NaCl ;
p H7,2)により5t−tg/mflに希釈し、
該溶液を、上記マイクロピペットの下端より、30μβ
の目盛まで吸い上げた後、該マイクロピペットを、温度
37度で1時間、静置した。
衝食塩水(P B S ; 0.(11M Na2HP
○、−Na82P○4.0、15 M NaCl ;
p H7,2)により5t−tg/mflに希釈し、
該溶液を、上記マイクロピペットの下端より、30μβ
の目盛まで吸い上げた後、該マイクロピペットを、温度
37度で1時間、静置した。
次に、該マイクロピペットの上端にアスピレータに接続
した吸引チューブを取り付け、更に下端を洗浄液(0,
05%Tween 20.0.OLM PBS)に浸
漬し、該洗浄液をマイクロピペットの下端より連続して
吸い上げ洗浄した。約1mnの洗浄液を流した後、下端
を洗浄液より引き上げ、更に吸引を続は該マイクロピペ
ット内の洗浄液をアスピレータで全て吸い取った。
した吸引チューブを取り付け、更に下端を洗浄液(0,
05%Tween 20.0.OLM PBS)に浸
漬し、該洗浄液をマイクロピペットの下端より連続して
吸い上げ洗浄した。約1mnの洗浄液を流した後、下端
を洗浄液より引き上げ、更に吸引を続は該マイクロピペ
ット内の洗浄液をアスピレータで全て吸い取った。
ブロッキング溶液として、1%牛血清アルブミン(BS
A)および0,1%NaN:+を含む0.OIMPBS
を用い、該PBSを該マイクロピペットの下端より、5
0μβの目盛まで吸い上げた後、マイクロピペットを温
度37℃で30分間静置し、ブロッキングを行い、更に
、上記と同様にして、マイクロピペットの内部を洗浄し
た。
A)および0,1%NaN:+を含む0.OIMPBS
を用い、該PBSを該マイクロピペットの下端より、5
0μβの目盛まで吸い上げた後、マイクロピペットを温
度37℃で30分間静置し、ブロッキングを行い、更に
、上記と同様にして、マイクロピペットの内部を洗浄し
た。
次に、硫安塩析法及びプロティンAアフィニティカラム
で精製したマウス免疫グロブリン(I gG)を1%B
SA−0,(11’M PBSで4倍段階希釈した溶
液を各々、上記マイクロピペットの下端より、30μβ
の目盛まで吸い上げ、該マイクロピペットを、温度4℃
で1時間、静置し、抗原抗体反応を起し、再度上記と同
様にして、該マイクロピペットの内部を洗浄した。
で精製したマウス免疫グロブリン(I gG)を1%B
SA−0,(11’M PBSで4倍段階希釈した溶
液を各々、上記マイクロピペットの下端より、30μβ
の目盛まで吸い上げ、該マイクロピペットを、温度4℃
で1時間、静置し、抗原抗体反応を起し、再度上記と同
様にして、該マイクロピペットの内部を洗浄した。
次に、ペルオキシダーゼ(HRP ) 4M識ウつキ゛
抗マウス免疫グロブリン(ダコバッツ(DAK13PA
TTS)社)を1% B S A−0,OLM P B
Sで500倍に希釈した溶液を、上記マイクロピペッ
トの下端より、30μ!の目盛まで吸い上げた後、該マ
イクロピペットを、温度4℃で1時間静置し、更に上記
と同様にして、マイクロピペットの内部を洗浄した。
抗マウス免疫グロブリン(ダコバッツ(DAK13PA
TTS)社)を1% B S A−0,OLM P B
Sで500倍に希釈した溶液を、上記マイクロピペッ
トの下端より、30μ!の目盛まで吸い上げた後、該マ
イクロピペットを、温度4℃で1時間静置し、更に上記
と同様にして、マイクロピペットの内部を洗浄した。
更に、基質溶液(4mg O−フェニレンジアミン、
4μβ 30%過酸化水素水/10m1 クエン酸−燐
酸緩衝液)を、マイクロピペットの下端より、50μβ
の目盛まで吸い上げ、室温で30分間、暗所に静置した
。
4μβ 30%過酸化水素水/10m1 クエン酸−燐
酸緩衝液)を、マイクロピペットの下端より、50μβ
の目盛まで吸い上げ、室温で30分間、暗所に静置した
。
次に、96穴マイクロタイタートレイの各穴に2規定硫
酸溶液を50μβずつ分注し、その上に上記マイクロピ
ペット内の基質溶液を、該マイクロピペット”下端より
全量滴下し、96穴マイクロタイクートレイ用アナライ
ザー(東洋測器e))で、各大穴の基質溶液の490
n mの吸光度(OD、、、)を測定した。
酸溶液を50μβずつ分注し、その上に上記マイクロピ
ペット内の基質溶液を、該マイクロピペット”下端より
全量滴下し、96穴マイクロタイクートレイ用アナライ
ザー(東洋測器e))で、各大穴の基質溶液の490
n mの吸光度(OD、、、)を測定した。
測定の結果を第4図に示す。第4図から明らかな様に、
本発明の固相酵素免疫測定法では、少量の抗原あるいは
抗体溶液を用いて、従来の固相酵素免疫測定法と同様の
精度の高い分析結果を得られることがわかった。
本発明の固相酵素免疫測定法では、少量の抗原あるいは
抗体溶液を用いて、従来の固相酵素免疫測定法と同様の
精度の高い分析結果を得られることがわかった。
発明の効果
以上述べてきた様な細管部を有する管を反応容器および
固相として用いることにより、本発明による固相免疫測
定法は、次に挙げる様な利点を有する。
固相として用いることにより、本発明による固相免疫測
定法は、次に挙げる様な利点を有する。
即ち、抗原あるいは抗体溶液の注入排出操作および、未
反応物質の洗浄操作等が、簡単かつ確実に短時間で行え
る。
反応物質の洗浄操作等が、簡単かつ確実に短時間で行え
る。
また、少量の抗原(あるいは抗体)溶液の測定も可能で
ある。
ある。
さらに96穴マイクロタイタートレイでは、検体数が9
6の倍数である場合を除いて、使われない無駄な穴がで
きるが、本発明にかかる固相免疫測定法では検体数が何
検体で行っても無駄がでない。
6の倍数である場合を除いて、使われない無駄な穴がで
きるが、本発明にかかる固相免疫測定法では検体数が何
検体で行っても無駄がでない。
また、多量の検体数でも場所を取らずに手早く操作でき
る。
る。
以上の特性により、本発明の固相免疫測定法は全操作を
自動化することが可能である。
自動化することが可能である。
添付第1図は本発明の固相免疫測定法で用いる細管の好
ましい一態様を示す縦断面図を表し、添付第2図は本発
明の固相免疫測定でもちいる細管の好ましい別の態様を
示す縦断面図を表し、添付第3図は本発明の固相免疫測
定でもちいる細管の好ましい更に別の態様を示す縦断面
図を表し、 また第4図は実施例の結果を示したものである。 (主な参照番号) 1・・毛管、 2・・隔壁、 3・・溶液、 4・・毛管下端の開コ部、5・・細管
、 6・・毛管部、 7・・細管部
ましい一態様を示す縦断面図を表し、添付第2図は本発
明の固相免疫測定でもちいる細管の好ましい別の態様を
示す縦断面図を表し、添付第3図は本発明の固相免疫測
定でもちいる細管の好ましい更に別の態様を示す縦断面
図を表し、 また第4図は実施例の結果を示したものである。 (主な参照番号) 1・・毛管、 2・・隔壁、 3・・溶液、 4・・毛管下端の開コ部、5・・細管
、 6・・毛管部、 7・・細管部
Claims (17)
- (1)内径2mm以下の透明な毛管部を有する細管の内
壁面に、抗原または抗体を付着せしめ、該内壁面に付着
された抗原または抗体と、被験溶液中の抗体または抗原
とを抗原抗体反応せしめることを特徴とする固相免疫測
定法。 - (2)上記細管の全体が、内径2mm以下の毛管であっ
て、下端に透水性の隔壁を備えることを特徴とする特許
請求の範囲第1項に記載の固相免疫測定法。 - (3)上記隔壁が、膜状であることを特徴とする特許請
求の範囲第2項に記載の固相免疫測定法。 - (4)上記隔壁が、海綿状であることを特徴とする特許
請求の範囲第2項に記載の固相免疫測定法。 - (5)、上記隔壁が、網目状であることを特徴とする特
許請求の範囲第2項に記載の固相免疫測定法。 - (6)上記細管の全体が内径2mm以下の毛管であって
、下端が該細管の他の部分より小さな内径の開口部を有
することを特徴とする特許請求の範囲第1項に記載の固
相免疫測定法。 - (7)上記細管の下端部と、上記抗原または上記抗体が
付着する内壁面上端部の少なくとも1方が内径2mm以
下の毛管であることを特徴とする特許請求の範囲第1項
に記載の固相免疫測定法。 - (8)上記細管が、ポリマーであることを特徴とする特
許請求の範囲第1項ないし第7項のいずれか1項に記載
の固相免疫測定法。 - (9)上記ポリマーが、ポリスチレン、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリ塩化ビニルおよびポリカーボネー
トから選択されることを特徴とする特許請求の範囲第8
項に記載の固相免疫測定法。 - (10)上記細管が、ガラスであることを特徴とする特
許請求の範囲第1項ないし第7項のいずれか1項に記載
の固相免疫測定法。 - (11)上記細管が、液量測定用の目盛を付けられてい
ることを特徴とする特許請求の範囲第1項ないし第10
項のいずれか1項に記載の固相免疫測定法。 - (12)さらに、標識付きの抗体と反応せしめることを
特徴とする特許請求の範囲第1項ないし第11項のいず
れか1項に記載の固相免疫測定法。 - (13)上記標識が、酵素であることを特徴とする特許
請求の範囲第12項に記載の固相免疫測定法。 - (14)上記標識が、放射性同位元素であることを特徴
とする特許請求の範囲第12項に記載の固相免疫測定法
。 - (15)上記固相免疫測定法が、間接法によって行なわ
れることを特徴とする特許請求の範囲第12項ないし第
14項のいずれか1項に記載の固相免疫測定法。 - (16)上記固相免疫測定法が、二抗体サンドイッチ法
によって行われることを特徴とする特許請求の範囲第1
2項ないし第14項のいずれか1項に記載の固相免疫測
定法。 - (17)上記固相免疫測定法が、競合法によって行われ
ることを特徴とする特許請求の範囲第12項ないし第1
4項のいずれか1項に記載の固相免疫測定法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1178986A JPS62169054A (ja) | 1986-01-22 | 1986-01-22 | 固相免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1178986A JPS62169054A (ja) | 1986-01-22 | 1986-01-22 | 固相免疫測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62169054A true JPS62169054A (ja) | 1987-07-25 |
Family
ID=11787688
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1178986A Pending JPS62169054A (ja) | 1986-01-22 | 1986-01-22 | 固相免疫測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62169054A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0224559A (ja) * | 1988-05-25 | 1990-01-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | 免疫学的に検出可能な物質の測定法、反応容器及びイムノアツセイ原理による方法における種々のパラメーターの測定法 |
US7709271B2 (en) | 2001-11-07 | 2010-05-04 | Prolight Diagnostics Ab | Method and device for immunoassay |
JP2012132868A (ja) * | 2010-12-24 | 2012-07-12 | Power Supply Kk | 免疫反応測定キット、免疫反応測定装置および免疫反応測定方法 |
-
1986
- 1986-01-22 JP JP1178986A patent/JPS62169054A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0224559A (ja) * | 1988-05-25 | 1990-01-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | 免疫学的に検出可能な物質の測定法、反応容器及びイムノアツセイ原理による方法における種々のパラメーターの測定法 |
US7709271B2 (en) | 2001-11-07 | 2010-05-04 | Prolight Diagnostics Ab | Method and device for immunoassay |
US9475046B2 (en) | 2001-11-07 | 2016-10-25 | Prolight Diagnostics Ab | Method and device for immunoassay |
JP2012132868A (ja) * | 2010-12-24 | 2012-07-12 | Power Supply Kk | 免疫反応測定キット、免疫反応測定装置および免疫反応測定方法 |
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