DK172581B1 - Fremgangsmåde til bestemmelse af et immunologisk påviseligt stof og en dertil egnet reaktionsbeholder - Google Patents

Description

i DK PR 172581 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af et immunologisk påviseligt stof efter princippet for heterogen immunbestemmelse under anvendelse af en fast fase, hvortil en af de immunologisk aktive reaktionskomponenter er bundet, en dertil egnet reaktionsbehofder samt anvendelse af en enhedsreaktionsbeholder.

5 Fra FR offentliggørelsesskrift nr. 2.601.455 kendes en fast, biologisk reaktionsbeholder til binding af et reagens via et biotin-avidin-kompleks, idet biotin er bundet til reagenset og avidin er bundet til den faste bærer. Der er ingen angivelse af, hvilken mængde avidin, der bindes til den faste fase.

Til bestemmelse af et specifikt bindingsdygtigt stof betjener man sig ofte af fremgangsmåder 10 efter immunbestemmelsesprincippet.. Herved bliver en af partnerne af et specifikt med hinan den bindingsdygtigt stofpar omsat med den for den specifikke receptor, som er markeret på i og for sig kendt måde. Konjugatet af disse to stoffer kan så endvidere omsættes med en receptor, der er specifik for konjugatet eller en af de to dele af konjugatet. Til denne immunologiske fremgangsmåde findes der mange variationer. Det er fordelagtigt, hvis en af recep-15 torerne foreligger bundet til en fast fase. Dette letter adskillelsen af bundne og ikke-bundne reaktionspartnere. Til bestemmelse af det specifikt bindingsdygtige stof bliver så målt mængden af på den faste fase bundet markeret reaktionspartner eller af i opløsning foreliggende markeret reaktionspartner og på i og for sig kendt måde sat i relation til mængden af den reaktionspartner, som skal bestemmes.

20 Som fast fase anvendes ved de immunologiske fremgangsmåder sædvanligvis små kunstofrør eller mikrotiterplader, på hvis indre overflade reaktionspartneren er fikseret, eller kugler, på hvis ydre overflade reaktionspartneren er fikseret.

Herved må bindingen af den specifikke reaktionspartner til den pågældende overflade ske således, at den ikke taber evnen til specifik binding af det for den specifikt bindingsdygtige 25 stof. Af denne grund sker bindingen af reaktionspartneren til den faste fase for det meste adsorptivt. Det er derfor allerede foreslået at bevirke fikseringen af reaktionspartneren til den faste fase via et koblingsmiddel, som formidler bindingen. Herved må der igen drages omsorg 2 DK PR 172581 B1 for, at bindingen af reaktionspartneren til bindingsmidlet ikke ødelægger det specifikt reagerende område af molekylet, eller at reaktionspartneren bindes således, at dens reaktionsdygtige sted er vendt bort fra den faste fase og mod bindingspartneren.

En ulempe ved alle disse kendte fremgangsmåder er, at der til hver specifik reaktion må stilles 5 en speciel fast fase til rådighed. Dette betyder, at der til hver enkelt prøve må fremstilles, lagres og så til bestemmelse anvendes en anden fast fase, hvilket er arbejdskrævende.

Det var derfor en opgave med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde og en reaktions-beholder, der er egnet til mange forskellige påvisningsmetoder I den kliniske rutinediagnostik bestemmes af en blodprøve i hvert enkelt tilfælde mange forskellige parametre såsom hormo-10 ner, tumormarkører, infektionsparametre, allergiparametre og fertilitetsparametre. Koncentrationen af den parameter, som skal bestemmes, omfatter et bredt område.Parametre, som forekommer i lav koncentration, som f.eks. TSH (thyroidstimulerende hormon) og prolactin, ligger i området l O'10-10'12 mol/liter, medens parametre, som forekommer i høj koncentration, såsom Tj og T4, ligger ved ca 10'T- 10'* mol/liter. Det ville være ønskeligt, om der til de 15 enkelte bestemmelser ikke hver gang skulle anvendes forskellige rør, men hvis dertil alle bestemmelser kunne anvendes en enhedsreaktionsbeholder.

Denne opgave løses med en fremgangsmåde til bestemmelse af et immunologisk påviseligt stof efter den heterogene immunbestemmelses princip under anvendelse af en fast fase, hvortil en af de immunologisk aktive reaktionskomponenter er bundet, som er ejendommelig ved, at 20 man som fast fase anvender en reaktionsbeholder, på hvis indre overflade der er bundet strep-tavidin eller avidin i en sådan mængde, at der pr. ml reaktionsrumfang findes 0,1 - 2,5 pg.

Denne mængdeangivelse refererer til streptavidin eller avidin, som er tilgængeligt for bindingspartneren inden for rammerne af den immunologiske reaktion, der foreligger i form af et biotinyleret protein eller hapten.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er anvendelig til alle bestemmelsesmetoder, ved hvilke receptoren, der f.eks. kan være et antistof eller et antigen, som skal immobiliseres på den faste fase, er konjugeret med biotin. Det ifø lge opfindelsen på fast fase fikserede streptavidin eller 3 DK PR 172581 B1 avidin udviser en god hæftning til alle rør- og glasmaterialer, og bindingen forbliver stabil over for detergenter. Ved fremstilling af justeringskurver, som er nødvendige til bedømmelse ved mange immunologiske fremgangsmåder, giver det ifølge opfindelsen på fast fase bundne streptavidin eller avidin stejle justeringskurver ved ringe tomværdier, hvilket fører til en 5 forøgelse af nøjagtigheden. En yderligere fordel er, at chargesvingninger i den overtrukne streptavidinmængde kun havde uanselig indflydelse på måleresultaterne. Den særlige fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ligger i, at den bundne mængde streptavidin eller avidin indstilles således, at den faste fase kan finde anvendelse til alle kendte fremgangsmåder efter den heterogene immunbestemmelses princip. Desuden består en fordel i, at man ved 10 fremgangsmåden ifølge opfindelsen samtidig kanbestemme flere stoffer, isærantistoffer, men også antigener. Dette belyses nærmere med eksempel 7.

I en særligt foretrukken udførelsesform bliver den som fast fase anvendte reaktionsbeholder samtidig anvendt som kuvette til fotometrisk bestemmelse af markeringen. Dette er særlig fordelagtigt, da der kun kræves en enkelt beholder til udførelse af den samlede reaktion.

15 Reaktionsbeholderen er i dette tilfælde udformet således, at den har to over for hinanden liggende optisk gennemtrængelige vægområder. Derved kan det samlede vægområde overtrækkes med streptavidin eller avidin.

Ifølge opfindelsen anvendes som fast fase en reaktionsbeholder, på hvis indre overflade der er bundet streptavidin eller avidin. Bindingen af streptavidinet eller avidinet sker på de for 20 fagmanden velkendte måder (f.eks. EP-A 0.122.209). Streptavidinet eller avidinet kan enten bindes direkte til den faste fase eller bindes via et mellemstykke eller gennem stoffer, som formidler bindingen.

I en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen kobles streptavidin eller avidin til et opløseligt protein med en molekylvægt over ca. 500 000, og dette konjugat 25 adsorberes så på en hydrofob fast fase, som beskrevet f.eks. i patentansøgning DE-A 36.40 412. Fortrinsvis anvendes et protein, som er hydrofobiseret.

4 DK PR 172581 B1

Hydrofobiseringen kan f eks ske ved anvendelse af varme, behandling med syrer, denaturerende midler og/eller kaotrope ioner og/eller ved kemisk kobling med en hydrofob forbindelse.

Behandlingen med disse midler fører også til en forhøjelse af molekylvægten. Forhøjelsen af molekylvægten kan også opnås ved tværbinding med et bifiinktionelt eller polyfunktionelt 5 protein reagens.

Som syrer anvendes f.eks. eddikesyre, propionsyre, mælkesyre eller saltsyre. Sædvanlige koncentrationer er I - 10O mmol/liter ved ind virkningstider på 10 minutter til 16 timer.

Egnede kaotrope ioner er f.eks. thiocyanater, jodider, fluorider, bromider, perchlorater og sulfater Egnede denaturerende midler er f.eks. guanidin hydrochlorid ellerurinstof. Sædvan-10 ligvis anvendes her koncentrater på 10 mmol/liter - 6 mol/iiter.

Til derivatisering med hydrofobe forbindelser anvendes fortrinsvis opløselige fedtsyrer, lipoider i lavmolekylær eller højmolekylær form samt syntetiske polymerersåsom polypropy-lenglycol eller opløselige copolymerer af polystyrol. Derivatiseringen sker på måder, der er velkendt for fagmanden.

15 Tværbindingen via bifunktionelle eller polyfunktionelle forbindelser udføres med i og for sig kendte proteinbindingsreagenser. Dette er forbindelser, der bærer mindst to funktionelle grupper, der kan være ens eller forskellige, og som via disse funktionelle grupper kan reagere med funktionelle grupper i proteiner. Fortrinsvis anvendes forbindelser, der består af en alkylkæde, i hvis ender der befinder sig succinimid-, maleimid- og/eller aldehydgrupper.

20 Proteinet tværb indes på i og for sig kendt måde med den bifunktionelle eller polyfunktionelle forbindelse, idet det opløselige protein og den bi- eller polyfunktionelle forbindelse omsættes.

Fortrinsvis anvendes til hydrofobiseringen og/eller tværbindingen proteiner med en molekylvægt på 10.000 - 700.000. Særligt foretrækkes okseserumalbumin, lipase eller immun-y-globu-lin.

5 DK PR 172581 B1

Til proteinet kobles så på i og for sig kendt måde streptavidinet eller avidinet. Egnede koblingsmetoder er f.eks. beskrevet i Ishikawa, J.Immunoassay 4 (1983), 209 - 327.

Det fremkomnekonjugat af streptavidin elleravidin ogprotein adsorberes så adsorptivt på den kunststofoverflade, der tjener som fast fase. Før konjugatet af protein og streptavidin eller 5 avidin adsorberes på den hydrofobe faste fase, er det også muligt at forbehandle den faste fase fysisk eller kemisk. Således kan f.eks. en kunststofoverflade kvældes forud eller aktiveres på andre i og for sig kendte måder. Den adsorptive binding til den faste fase sker via stærke og svage vekselvirkninger, hydrofobe kræfter, dipol-dipol- eller ion-dipol-reaktioner.

Særligt egnet som hydrofob fast fase er reaktionsbeholdere afbærermaterialer med en overfla-10 despænding, der er mindre end overfladespændingen af det hydrofobe opløselige protein, dvs.

mere hydrofobe end protein. Fortrinsvis anvendes bærermaterialer med en overfladespænding på 40 erg/cm2. Særligt egnet er polystyrol, polymethacrylat, teflon, polyamid, copolymerer af styrol og acryInitril, glas- og celluloseprodukter.

Det ifølge opfindelsen fremstillede fastfasemateriale anvendes til bestemmelse af mange 15 forskel lige parametre. Herved bliver et af de stoffer, som er bindingsdygtige med den parame ter, der skal bestemmes, konjugeret med biotin, som igen binder til det på den faste fase fikserede streptavidin eller avidin. På denne måde kan de pågrund af immunbestemmelsesmetoden dannede specifikke komplekser immobiliseres og derefter bestemmes. Ifølge opfindelsen bindes derfor til den faste fase så meget streptavidin eller avidin, at der pr. ml reaktions-20 rumfang haves 0,1 - 2,5 pg til bindingen af det biotinylerede, specifikt bindingsdygtige stof.

Som reaktionsrumfang betegnes herved summen af prøverumfang og prøvereagensrumfang.

Fortrinsvis bliver det faste fasemateriale overtrukket således, at der haves 1 - 2 pg streptavidin eller avidin til bindingen medbiotinyleret, specifikt bindingsdygtigt stof pr. ml prøverumfang.

Mængden af det biotinylerede, specifikt bindingsdygtige stof ligger ved fremgangsmåden 25 ifølge opfindelsen fortrinsvis i området fra 10'16 til 10-1 mol pr. reaktionsrumfang.

6 DK PR 172581 B1

Opfindelsen angår endvidere en reaktionsbeholder med over for hinanden liggende,optisk gennem trængelige vægområder og i øvrigt, i det mindste delvis, inden for området af den til væskeoptagelse beregnede indervæg, med streptavidin eller avidin overtrukne vægge, idet det til væskeoptagelse bestemte indre rum i beholderen og streptavidin- eller avidinindholdet i 5 overtrækket er afpasset ti I hinanden således, at der pr. ml reaktionsrumfang findes 0,1 -2,5 pg streptavidin eller avidin.

Denne reaktionsbeholder er særligt egnet til udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Da den har optisk gennemtrængelige, over for hinanden liggende vægområder og desuden har et overtræk med streptavidin eller avidin, kan den samtidig anvendes til udførelse af reaktio-10 nen og til fotometrisk bestemmelse. I kraft af overtrækket med 0,1 - 2,5 pg streptavidin eller avidin pr. ml reaktionsrumfang kan denne reaktionsbeholder anvendes til bestemmelse af de mest forskelligartede parametre efter den heterogene immunbestemmelses princip.

Reaktionsbeholderen udgør den faste fase. Den består af de sædvanligt anvendte materialer såsom kunststoffer, glas etc. De optisk gennemtrængelige vægområder består af ligeledes 15 kendte materialer. Særligt foretrækkes herpolystyrol, copolymerer afpolystyrol, polycarbona-ter, polyacrylater og polymethacrylater.

Overtrækningen med streptavidin eller avidin kan ske enten direkte eller via etbærermateriale eller et mellemstykke. Egnet er f.eks. bindingen af streptavidin eller avidin til et opløseligt protein med en molekylvægt over 500.000, som så adsorberes på indervæggen af reaktionsbe-20 holderen.

Opfindelsen angår også anvendelse af en enhedsreaktionsbeholder, der består af en beholder, på hvis indre overflade der er bundet streptavidin eller avidin i en sådan mængde, at der til bestemmelsesreaktionen pr. ml reaktionsrumfang haves 0,1 -2,5 pg streptavidin eller avidin til bestemmelse af forskellige parametre ved fremgangsmåder efter immunbestemmelsens 25 princip.

7 DK PR 172581 B1

Ifølge opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde og en reaktionsbeholder, med hvilken streptavidin eller avidin med god hæftning og varigt Fikseres på den indre overflade af en reaktionsbeholder som fast fase. Hæflningen er så god, at selv ikke en tilsætning af detergenter fører til en udløsning af stoffet. Reaktionsbeholderen ifølge opfindelsen er universelt 5 anvendelig og egner sig til udførelse af bestemmelsesmetoder for mange parametre og letter derved udførelsen af rutinebestemmelser.

Opfindelsen belyses i det følgende med tegninger og eksempler. På tegningen viser figur l en skare justeringskurver til en TSH-bestemmelse under anvendelse af immobiliseret streptavidin i forskellige mængder og biotinyleret anti-TSH-antistof, 10 figur 2 en justeringskurve for en prolactinprøve, figur 3 en justeringskurve for en CEA-prøve, figur 4 en justeringskurve for en T4 -prøve, og figur 5 en skare justeringskurver for en anti-HB.-b es tem melse under anvendelse af immobiliseret streptavidin i forskellige mængder.

15 DeieksemplemeanvendtemonoklonaleantistoffermodTSHstammerfrahybridomacellelin-jer, som er deponeret i den europæiske samling af dyrecellekulturer, Porton Down, GB, under betegnelserne ECACC 87.122201 og ECACC 87.122202.

EKSEMPEL 1.

20 Der blev undersøgt fastfasehæftningen af konjugatet ifølge opfindelsen og hydrofobt protein og streptavidin: 8 DK PR 172581 B1

Termisk aggregeret RSA, i det følgende betegnet termo-RSA, blev fremstillet på følgende måde: I g RSA blev opløst i 100ml 50 mmol kaliumphosphatopløsning ved en pH-værdi på 7,0, opvarmet ti) 70® C og holdt i 4 timer under let omrøring ved denne temperatur. Opløsningen blev afkølet, filtreret og indstillet til en koncentration på 50 mg/ml. Derefter blev der 5 dialyseret over for et 30 gange så stort rumfang redestilleret vand.

Fremstilling af et konjugat af streptavidin med termo-RSA: Streptavidin, udvundet af Strepto-myces avidinii, blev omsat med maleimido-hexanoyl-N-hydroxysuccinimid, og man fik på denne måde et streptavidin, der bærer maleimidogrupper. Termo-RSA blev omsat med S-acetylmercaptoravsyreanhydrid, og derefter blev de beskyttede SH-grupper frigjort ved 10 tilsætning af hydroxylamin. Streptavidinet indeholdende maleimidogrupper blev så blandet med det SH-gruppeholdige termo-RSA under dannelse af det ønskede konjugat.

Kunststofglas af polystyrol blev så ladet med konjugatet af streptavidin-termo-RS A. Ladningen af glasset skete med 1,5 ml af en streptavidin-termo-RSA-opløsning, idet det molære forhold mellem de to komponenter var 1,8:1 (10pg/ml), i 40 mmol natriumphosphatstødpude, 15 pH 7,4, ved 20°C i 18 - 24 timer.

Efter udsugning af glasset blev der efterladet i 30 minutter ved 20®C med 1,8 ml af en opløsning af 2% saccharose, 0,9% natriumchlorid og 0,3% RSA. Efter tørring (24 timer ved 20 °C og 40% relativ fugtighed) var glassene parat til anvendelse og holdbare.

EKSEMPEL 2.

20 ---------------- TSH-prøve i et enkelt trin.

Der blev fremstillet biotinylerede monoklonale anti-TSH-antistoffer. Til dette formål blev anti-TSH-antistoffet, ECACC 87.122201, omsat på sædvanlig måde med biotin, idet koblingen skete over aminogruppeme. Antistof og biotin blev anvendt i forholdet 1:16.400 ng af det 25 således fremkomne biotinylerede antistof blev opløst i 1 ml stødpude (40 mmol natriumphosp- 9 DK PR 172581 B1 hat, 0,5% Pluronic F68, 0,2 mol natriumtartrat pr. liter samt 0,01% phenol) og derefter inkuberet sammen med 200/μ1 prøve eller en standardopløsning, der indeholdt en kendt mængde TSH, og 75 mU af et med peroxidase konjugeret anti-TSH-antistof (ECACC 87.122202) i et ifølge eksempel 1 overtrukket glas i 2 timer. Derefter blev der vasket tre gange med postevand 5 og derpå tilsat 1 ml ABTS-substratopløsning.

Efter en time blev ekstinktionen målt ved 405 nm. Resultaterne er vist på figur 1. Det viser sig, at et tilfredsstillende resultat fås med immobiliseret streptavidin i en mængde på over 0,1 pg/ml prøverumfang.

Der blev konstateret behovet for streptavidin til binding af det i prøven anvendte biotinylerede 10 antistof. Til dette formål blev først bestemt mængden af frit tilgængeligt biotin efter metoden ifølge Bayer, Edward A., Meir-Wilchek, Analytical Biochemistry 154 (1986), 367 - 370.

Gående ud fra 1 pg antistof, som blev biotinyleret i forholdet antistof til biotin 1:15 (Guesdon, I.L., J.Histochem.Cytochem. 27 (1979), 1131 - 1139), fås, at 1 - 2 mol biotin pr. mol antistof står til rådighed til binding, dvs. at der pr. pg antistof er 1,5 - 3 ng biotin frit tilgængeligt.

15 Etmed 10pg/mIstreptavidin-termo-RSA-konjugat ladet glas (eksempel 1) har en bindingskapacitet for biotin på 15 - 20 ng pr. ml prøverumfang, bestemt med radioaktivt Cu-biotin.

Til biotinylerede immun-y-globuliner er bindingskapaciteten af streptavidinglasset 1,7-2 pg/ml prøverumfang. Bestemmelsen blev udført med ln5-mærket γ-globulin (mærket efter metoden ifølge McConahey & Dixon (1966), Int.Arch.Allergy 29/185).

20 EKSEMPEL 3.

Prolactinprøve.

Prolactin bestemmes ved en sandwich-immunbestemmelse i ét trin. Til påvisningen anvendes et reagens med følgende sammensætning: DK PR 172581 B1 io 50 mU/ml af et konjugat af POD og et prolactinspecifikt monoklonalt antistof, 40 mmol/l phosphatstødpude, pH 7,0, 0,5% PluronicF65 (polyoxyethylenpolypropylen), 0,2 mol/l natriumtartrat, 5 0,01% phenol, 0,2% okseserumalbumin, 400 ng/ml af et biotinyleret monoklonalt antistof mod prolactin.

Til de to monoklonale antistoffer stilles kun de krav, at de erkender prolactin og er rettet mod forskellige epitoper af prolactin. I et med streptavidin-termo-RSA-konjugat overtrukket po-10 lystyrolglas, fremstillet ifølge eksempel 1, blev 1 ml af dette reagens og 50 μ 1 prøve inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev vasket tre gange med postevand. Til påvisningsreaktionen blev tilsat I ml ABTS®-substratop!øsning. Efter 30 minutter blev ekstinktionen målt fotometrisk ved 405 nm. Resultaterne fremgår af figur 2.

ABTS®: 2,2'-azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat(s)]-diammoniumsalt.

15 EKSEMPEL 4.

CEA-prøve.

I en prøveopløsning blev CEA bestemt ved en sandwich-immunbestemmelse i ét trin. Det anvendte reagens havde følgende sammensætning: 20 120 mU/ml af et konjugat af POD og et monoklonalt antistof, 40 mmol/l phosphatstødpude, pH 7,0, 0,5% PluronicF68, 0,2 mol/l natriumtartrat, 0,01% phenol, 11 DK PR 172581 B1 0,2% okseserumalbumin, 500 ng/ml af et biotinyleret monoklonalt antistof mod CEA.

Til de to monoklonale antistoffer mod CEA stilles kun de krav, at de skal erkende CEA og er rettet mod et andet epitop af CEA.

5 I et med streptavidin-termo-RS Aovertrukket polystyrolglas, fremstillet som i eksempel 1, blev 1 ml af reagenset og 100 μΐ prøve inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Derefter blev der vasket tre gange med postevand. Derpå blev der til påvisningsreaktionen tilsat 1 ml ABTS®-substratopløsning. Efter en time blev ekstinktionen målt ved 405 nm fotometrisk.

Resultaterne fremgår af figur 3.

10 EKSEMPEL 5.

T,-prøve.

Der blev bestemt T4 ved en kompetitiv immunbestemmelse under anvendelse af biotinylerede anti-T4-antistoffer. Til dette formål blev der i et med streptavidin-termo-RSA-konjugat over-15 trukket polystyrolglas, fremstillet som i eksempel 1, inkuberet 500 μΐ af et reagens bestående af 100 mU/ml thyroxin-POD-konjugat (fremstillet ifølge EP 209.155), 120 mmol/l barbiturat, 18,2 mmol/l phosphatstødpude, pH 8,6, 20 0,04 vægt% ANS (8-anilino-l-naphthalen-sulfonsyre), 0,2 vægt% okseserumalbumin samt 20 μ 1 prøvei 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev der tilsat 500 μ] afet andet reagens bestående af 12 DK PR 172581 B1 1 pg/ml biotinyleret polyklonalt antistof mod T4, 120 mmol/1 phosphatstødpude, pH 8,6, 0,04 vægt% ANS (8-aniIino-l-naphthalen-sulfonsyre), 0,2 vægt% okseserumalbumin 5 og inkuberet vderligere i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask tregange med postevand blev der tilsat 1 ml ABTS®-substratop!øsning og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur.

Derefter blev ekstinktionen bestemt fotometrisk ved 405 nm. Resultaterne fremgår af figur 4.

EKSEMPEL 6.

10 -----------------

Anti-HBj-prøve HB,-antistoffer bestemmes ved en sandwich-immunbestemmelse i ét trin. Til påvisningen anvendes et reagens med følgende sammensætning: 60 mU/ml af et konjugat af POD og HB,-antigen, 15 40 mmol/1 phosphatstødpude, pH 7,0, 200 mmol/1 natriumtartrat, 0,5 vægt% Pluronic F68, 0,01 vægt% phenol, 0,2% okseserumalbumin, 20 0,1 vægt% okse-IgG, 150 ng/ml biotinyleret HB,Ag (fremstillet ifølge Immunol.Letters 8 (1984) 273).

Ietmedstreptavidin-termo-RSA-konjugatovertrukketpolystyroIglas ifølge eksempel 1 blev 1 ml af dette reagens og 200 μΐ prøve inkuberet i 4 timer ved stuetemperatur. Derefter blev der vasket tre gange med postevand. Til påvisningsreaktionen blev der tilsat 1 ml 25 ABTS-substratopløsning. Efter 60 minutter blev ekstinktionen målt fotometrisk ved 422 nm.

13 DK PR 172581 B1

Anti-HB,-prøven blev under anvendelse af glas udført med forskellige mængder immobiliseret streptavidin. Resultaterne fremgår af figur 5. Herved viser det s ig, at når streptavidin anvendes i mængder, der ligger over de ifølge opfindelsen anvendte mængder, bliver prøven tydeligt mere ufølsom.

5 EKSEMPEL 7.

Anti-HTV-prøve.

HIV-antistoffer bestemmes ved en sandwich-immunbestemmelse i to trin Til påvisningen anvendes reagenserne med følgende sammensætning: 10 Reagens 1: 10'7 mol/liter af et eller flere biotinylerede HIV-antigener, 40 mmol/l phosphatstødpude, pH 7,0, 0,9 vægt% kogsalt, 10 rumfangs% okseserum.

15 Som antigener blev anvendt følgende: Genteknologisk fremstillede HIVl-antigener svarende ti 1 HTVl-gp41 (gp41 -rek., Centocor®- p 121 )ogHIVl-p24 (p24-rek., Centocor ® -gp2), kemisk syntetiserede peptider af HIVl-gp41 (gp41-pep., Wang mil., PNAS 83, 6159 (1986)) og HlV2-gp32 (gp32-pep., J.W.Gnann m.fl., Science 237, 1346 (1987)). Disse antigener blev markeret med biotin, som beskrevet af Leary m.fl., PNAS 80, 4045 (1983).

20 Reagens 2: 20 mU/ml af et konjugat af fåreantistoffer mod human-immunglobulin og POD, 40 mmol/l phosphatstødpude, pH 7,0, I4 DK PR 172581 B1 0,05 vægt% "Tween"20, 0,2% okseserumalburain, 0,2% okse-IgG.

I et med streptavidin-termo-RSA-konjugat overtrukket polystyrolrør ifølge eksempel 1 blev 5 I ml af reagenset 1 og 10 μ 1 humanserum eller-plasma inkuberet i en time ved stuetemperatur. Derefter blev der vasket tre gange med postevand og l ml reagens 2 inkuberet i en time ved stuetemperatur. Igen blev dervasket tre gange med postevand, og til påvisningsreaktionen blev der tilsat 1 ml ABTS-substratopløsning. Efter 60 minutter blev ekstinktionen målt fotometrisk ved 422 nm.

10 Anti-HTV-prøven blev udført under anvendelse af enkelte HIV-antigener og antigenkombina-tioner Derved viste det sig, at prøvningen i polystyrolglas overtrukket med Streptavidin-termoRS A-konjugat er egnet både til bestemmelse af enkelte antigenspecifikke antis toffer og til samtidig bestemmelse af flere antistoffer ellerantistofpopulationer(screening-stest, tabel 1), ligegyldigt om disse er rettet mod den samme virus eller flere vira eller interes-15 serende antigener.

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af et immunologisk påviseligt stof efter princippet for 20 heterogen immunbestemmelse under anvendelse af en fast fase, hvortil en af de immunologisk aktive reaktionskomponenter er bundet, kendetegnet ved, at man som fast fase anvender en reaktionsbeholder, på hvis indre overflade der er bundet streptavidin eller avidin i en sådan mængde, at der pr. ml reaktionsrumfang haves 0,1 - 2,5 pg.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man som reaktionsbeholder 25 anvender en kuvette, hvis vægge på den indre overflade er overtrukket med streptavidin eller avidin. 16 DK PR 172581 B1

3. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, kendetegnet ved, at man kobler streptavidin eller avidin til et opløseligt protein med en molekylvægt over ca. 500.000 og derpå adsorberer konjugatet af streptavidin eller avidin og protein på en hydrofob fast fase.

4. Fremgangsmåde ifølge de foregående krav, kendetegnet ved, at man samtidig 5 bestemmer flere stoffer, især flere antistoffer.

5. Reaktionsbeholder til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1 - 4 med over for hinanden liggende,optisk gennemtrængelige vaegområder og iøvrigt, mindst delvis, i området afdentilvæskeoptagelse beregnede indervæg, med streptavidin eller avidin overtrukne vægge, idet det til væskeoptagelse bestemte indre rum i beholderen og streptavidin-eller avidinindhol- 10 det i overtrækket er afpasset efter hinanden således, at der pr. ml reaktionsrumfang findes 0,1 - 2,5 pg streptavidin eller avidin.

5 Anti- Anti- Anti- Anti- Anti- Anti- HlV-antigener Neg. HIVI HIVI HIVI HIV II HIVI HIVII HIV-antigenmængde gp41-rek. 52 I250 812 521 102 223 75 10 p24-rek. 43 786 1515 212 491 1531 263 gp41-pep. 71 831 301 295 63 52 59 gp32-pep. 38 41 50 62 1819 45 810 gp41-, p24-rek. 45 1402 1818 618 550 1550 266 gp41 p24-rek- + 15 gp 32-pep. 55 1380 1753 599 1723 1529 878 Patentkrav.

6. Reaktionsbeholder ifølge krav 5, kendeteqnet ved, at streptavidinet eller avidinet er bundet via et opløeligt protein med en molekylvægt over 500.000 til den faste fase.

7. Reaktionsbeholder ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at reaktionsbeholderen er 15 en kuvette.

8. Anvendelse af en enhedsreaktionsbeholder, der består af enbeholder, påhvis indre overflade der er bundet streptavidin eller avidin i en sådan mængde, at der til bestemmelsesreaktionen pr. ml reaktionsrumfang stårO, 1 - 2,5 pg streptavidin eller avidin til rådighed, til bestemmelse af forskellige parametre ved fremgangsmåder efter immunbestemmelsens princip. 20