FI95417B - Menetelmä ja reagenssi vasta-aineiden määrittämiseksi - Google Patents

Description

95417

Menetelmä ja reagenssi vasta-aineiden määrittämiseksi

Keksintö koskee menetelmää vasta-aineiden määrittämiseksi 5 inkuboimalla ainakin kolmea nestefaasiin liuotettua reseptoria R1# R2 ja R3, joista Rj pystyy sitoutumaan määritettävän vasta-aineen kanssa, R2 välittää sidoksen kiinteään faasiin ja R3 kantaa merkkiä, eristämällä muodostuva kompleksi liuoksesta kiinnittämällä kiinteään faasiin ja mittaamalla merkki 10 yhdessä faaseista kuten myös tähän soveltuvaa reagenssia.

Vasta-aineet ovat proteiinimolekyylejä, joita B-lymfosyytit ja plasmasolut tuottavat sopivan antigeenin kanssa tapahtuvan kontaktin jälkeen, ja jotka ovat spesifisiä niiden muo-15 dostumisen aiheuttavaa antigeeniä vastaan. Keho muodostaa vasta-aineita toisaalta vastauksena keholle vieraiden molekyylien kuten vieraan valkuaisen, bakteerien tai virusten tunkeutumiselle ja toisaalta autoimmunosairauden esiintyessä myös kehon omia soluja vastaan. Spesifisten vasta-aineiden 2p osoitus suo tämän vuoksi mahdollisuuden diagnosoida sairau-den kulun tai autoimmunosairauden esiintymisen.

Vasta-aineet voidaan osoittaa herkästi immunokoeperiaatteel-la. Tähän tunnetaan lukuisa joukko muunnelmia, jolloin niin 25 kompetitiiviset, immunoradiometriset ja immunoentsymaattiset kuten myös kerroslevymääritykset ovat tunnettuja. Luettelo erilaisista muunnelmista on annettu esimerkiksi A.H.W.M. Schuurs'in ja B.K. van Weemen'in artikkelissa lehdessä Dt.

Ges. f. Klin. Chemie e,V.-tiedonantoja (Mitteilungen) 1/79.

30 Kaikissa muunnelmissa on tällöin kompetitiivistä muunnelmaa lukuunottamatta määritettävien vasta-aineiden kanssa spesi-’ fisesti reagoivan aineen sitouduttava kiinteään faasiin.

Tämä saattaa olla joko määritettävän vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoiva antigeeni tai hapteeni tai myös mää-35 ritettävää antigeeniä vastaan suunnattu vasta-aine, kuten esimerkiksi lajispesifinen vasta-aine. Tämän kuvaillun menetelmän haittana on, että jokaista koetta varten on asetettava käyttöön spesifinen kiinteä faasi.

2 95417

Edelleen edellä mainitussa kirjallisuuslähteessä kuvaillaan koemenetelmä, jossa kiinteään faasiin on sidottu vasta-ainetta, joka on suuntautunut vasta-aineluokkaa vastaan, joka on peräisin määritettävästä vasta-aineesta. Määritettävän 5 vasta-aineen sisältävää koeliuosta inkuboidaan tämän kiinteän faasin läsnäollessa sille spesifisen antigeenin kuten myös samoin antigeenin kanssa sitoutumaan pystyvän merkityn vasta-aineen kanssa. Tällöin määritettävä vasta-aine ja lisätty merkitty vasta-aine kilpailevat sitoutumisesta anti-10 geenille. Kiinteään faasiin sitoutunut vasta-aine immobili-soi homogeenisessa faasissa edeltä muodostuneet vielä vapaita vasta-ainevalensseja sisältävät immunokompleksit ja osoittaa ne. Koska kiinteään faasiin sitoutumisen kinetiikka on merkittävästi hitaampi kuin immunokompleksin muodostumi-15 sen kinetiikka nestefaasissa, ei kiinteään faasiin sitoutuminen tapahdu kompetitiivisella periaatteella vaan titraus-reaktiona. Tämä menetelmä ei kuitenkaan ole tarpeeksi herkkä osoittamaan vasta-aineita, joita on koenesteessä vain vähäinen määrä. Tämän menetelmän suorittamiseen välttämätön spe-20 sifisten vasta-aineiden määrä on hyvin suuri.

Siten keksinnön tehtävä on antaa käyttöön menetelmä, jolla vasta-aineet ovat osoitettavissa helposti yksinkertaisella menetelmällä, jolloin vasta-ainetarve pienenee.

25 : . Tämä tehtävä ratkaistaan menetelmällä vasta-aineiden määrittämiseksi immunomääritysperiaatteella inkuboimalla vähintään kolmea nestefaasiin liuotettua reseptoria Rt, R2 ja R3, joista Rj on määritettävän vasta-aineen kanssa spesifisesti sitoutu-30 va reseptori, R2 välittää sitoutumisen kiinteälle faasille ja R3 kantaa merkin, erottamalla muodostuva kompleksi ja mittaamalla merkki yhdessä faaseista, menetelmälle ollessa tunnusomaista, että reseptorina R2 käytetään reseptorin R, kanssa spesifisesti sitoutuvan vasta-aineen tai sen osan ja spesi-35 fisesti sitoutuvan aineen S, konjugaattia, ja R3:na käytetään Rj:n kanssa spesifisesti sitoutuvan vasta-aineen tai sen osan ja merkin konjugaattia, jolloin muodostuvan kompleksin immo- 3 95417 bilisoituminen kiinteälle faasille tapahtuu S,:n kanssa spesifisesti sitoutuvalla komponentilla.

Keksinnön mukaisella menetelmällä onnistuu yllättävästi pa-5 rantaa herkkyyttä merkittävästi. Sitäpaitsi sen suorittamiseen tarvitaan olennaisesti vähäisempi määrä vasta-ainetta.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä määritettävän vasta-aineen sisältävä näyte inkuboidaan kolmen nestefaasissa liuotettuna 10 olevan reseptorin kanssa. Reseptori Rj on tällöin määritettävän vasta-aineen kanssa spesifisesti sitoutuva reseptori ja saattaa olla joko antigeeni tai anti-idiotyyppinen vasta-aine. Reseptori R2 on reseptorin Ri kanssa spesifisesti sitoutuva ja välittää sitoutumisen kiinteään faasiin, minkä 15 vuoksi se derivatisoidaan vastaavasti. Reseptori R3 on samoin R,:een spesifisesti sitoutuva ja siinä on sitä paitsi merkki. Koeliuoksessa kilpailevat nyt reseptorit R2 ja reseptori R3 yhdessä määritettävän vasta-aineen kanssa sitoutumisesta reseptorille R^ Mitä enemmän koeliuoksessa on vasta-ainetta, 20 sitä enemmän myös sitoutuu vasta-ainetta R^lle ja sitä vähemmän on käytettävissä sitoutumiskohtia reseptoreita R2 ja R3 varten. Riippuen antigeenin epitooppien lukumäärästä muodostuu R,:n kompleksi R2:n, R3:n ja/tai määritettävän vasta-aineen kanssa. Vain kompleksit, jotka sisältävät vähintään 2b yhden reseptorin R2, voivat sitoutua kiinteään faasiin ja : vain kompleksit, joihin on sitoutunut ainakin yksi reseptori R3, tulevat osoitusreaktioon. Reseptorista Rj, reseptorista R2 kuten myös mahdollisesti reseptorista R3 ja/tai määritettävästä antigeenistä muodostuvat kompleksit sitoutuvat tällöin 30 reseptoriin R2 sitoutuneella spesifisesti sitoutuvalla aineella S, kiinteään faasiin. Tällöin sitoutuminen voi tapahtua joko suoraan kiinteään faasiin kiinnittyneillä S,reen sitoutuvilla komponenteilla tai sitoutumisen kiinteään faasiin välittävillä komponenteilla. Kiinteän faasin erotuksen 35 jälkeen nestemäisestä faasista merkki voidaan määrittää jom-masta kummasta faasista, jolloin voidaan osoittaa sitä enemmän sitoutunutta merkkiä, mitä vähäisempi määritettävän vasta-aineen osuus koeliuoksessa on.

4 95417

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty reseptori R, on määritettävän vasta-aineen kanssa spesifisesti sitoutuva antigeeni, jolla on ainakin kaksi vasta-aineen kanssa sitoutumaan pystyvää epitooppia.

5

Reseptorina R2 käytetään keksinnön mukaisesti konjugaattia, joka koostuu R,:n kanssa spesifisestä vasta-aineesta tai sen osasta ja spesifisesti sitoutuvasta aineesta Sj. R,:n kanssa spesifisesti sitoutuva osuus toimii lisätyn antigeenin sito-10 misessa. Reseptorin R2 spesifisesti sitoutuva aine St on tällöin edullisesti spesifisesti keskenään sitoutuvan parin partneri. Sellaiset parit ovat ammattimiesten tuntemia. Sopivia ovat esimerkiksi seuraavat parit: antigeeni-vasta-ai-ne, hapteeni-vasta-aine, biotiini-avidiini/streptavidiini, 15 proteiini-antiproteiini, proteiini A-immunoglobuliini, hemo globiini -haptoglobiini tai entsyymi-substraatti. Edullisesti Sj:nä käytetään hapteenia, esimerkiksi digoksiinia, p-nitro-fenolia, saponiinia, FITC:tä ja erityisesti biotiinia. Sjtn sitoutuminen Rjreen spesifisesti sitoutuvan osan kanssa ta-2p pahtuu sinänsä tunnetulla tavalla. Menetelmät ovat ammattimiehen tuntemat.

Kolmas käytetty reseptori on R^n kanssa spesifisesti sitoutuvan osan ja merkin konjugaatti. Merkkinä voidaan käyttää 25 entsyymiä, radioaktiivista ainetta, isotooppia, fluoresoivaa : tai kemiluminenssiainetta, joiden määritys voidaan suorittaa ammattimiehen tuntemin menetelmin. Konjugaattien valmistus tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla.

30 Reseptoreita R2 ja R3 varten käytetyt spesifisesti sitoutuvat osat ovat vasta-aineita tai niiden osia, jotka pystyvät si- toutumaan reseptorina Rj käytetyn antigeenin kanssa. Koska näiden spesifisesti sitoutuvien osien on kilpailtava määritettävän kanssa sitoutumisesta antigeeniin, on olennaista, 35 että tässä käytetään reseptoreita, jotka reagoivat antigeenin kanssa Selmalla tavalla kuin määritettävä vasta-aine, se on, joilla on samanlainen sitoutumiskapasiteetti. Tähän käytetään R2:11e ja R3:lle reseptoreina toisinaan polyklonaali- 5 95417 siä vasta-aineitä, jotka itse pystyvät sitoutumaan määritettävään vasta-aineeseen. Samoin on mahdollista käyttää mono-klonaalista vasta-ainetta, kun on varmistettu, että myös määritettävä vasta-aine tunnistaa tämän monoklonaalisen vas-5 ta-aineen tunteman antigeenissä olevan epitoopin.

Molempia reseptoreita R2 ja R3 on käytettävä sellaisessa suhteessa, että toisaalta saattaa sitoutua tarpeeksi reseptoreita R2 R,:lle suorittamaan muodostuneen kompleksin immobili-10 sointi ja toisaalta sitoutuu tarpeeksi reseptoreita R3, koska vain merkitsemistä seuraa määritys.

Antigeenistä, R2:sta, R3:sta ja/tai määritettävästä vasta-aineesta muodostuneen kompleksin immobilisointi kiinteään 15 faasiin tapahtuu spesifisesti sitoutuvalla aineella S,. Tähän on olemassa kaksi muunnelmaa. Edullisessa suoritusmuodossa kiinteään faasiin on sitoutunut S,:n kanssa spesifisesti sitoutuvia komponentteja. Tätä varten spesifisesti sitoutuvan parin S,:lie komplementaarinen partneri sidotaan kiinteään 20 faasiin sinänsä tunnetulla tavalla. Reseptoreiden R2, R3 ja määritettävän vasta-aineen kompetitiivinen reaktio R,:n kanssa ei häiriinny myöskään vaikka inkubointi tapahtuu kiinteän faasin läsnäollessa, koska reseptoreiden R,, R2 ja R3 reaktio tapahtuu homogeenisessä faasissa ja tapahtuu sen vuoksi 25 olennaisesti nopeammin kuin sitoutuminen heterogeeniselle ; faasille. Samoin on luonnollisesti mahdollista suorittaa ensin kömpieksinmuodostus ja lisätä sitten kiinteä faasi, jonka lisäyksen jälkeen seinämäsitoutuminen vasta voi tapahtua. Kiinteänä faasina ovat sopivia niin polymeerimateriaa-30 lit kuin myös selluloosapitoiset materiaalit tai lasi. Erityisen sopiviksi ovat osoittautuneet polystyreeni, polymet-akrylaatti, teflon, polyamidi, styreeni/akryylinitriiliko-polymeerit, lasi ja selluloosatuotteet. Kiinteä faasi voi esiintyä mielivaltaisessa muodossa, esimerkiksi pikkuputki-35 na, mikrotiitterilevyinä, kuulina, kalvona, jauheena, jyväsinä tai kuitumattona.

6 95417

Spesifisesti sitoutuvat komponentit voidaan sitoa kiinteään faasiin sisänsä tunnetulla tavalla. Sitominen voi tällöin tapahtua joko suoraan kiinteään faasiin tai välikkeellä tai sitojaproteiinilla. Menetelmät tähän ovat ammattimiehen tun-5 temat. Sopiva on esimerkiksi patenttihakemuksessa DE-A 36 40 412 kuvailtu menetelmä kiintofaasimatriisin valmistamiseksi.

Edelleen toisessa keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa suoritusmuodossa kiinteään faasiin sidotaan toinen spesifi-10 sesti sitoutuva aine S2. Tämä aine S2 on samoin kuin aine S, spesifisesti sitoutuvan parin partneri kuten yllä on määritelty. S, ja S2 ovat edullisesti identtiset. Immobilisointiin lisätään sitten komponenttia, jossa on ainakin yksi spesifinen sitoutumiskohta S,:lie ja S2:lle. Tämä komponentti voi 15 olla molekyyli, jossa on kaksi tai useampia sitoutumiskohtia S,:lie tai S2:lle, samoin se voi olla konjugaatti kahdesta erilaisesta molekyylistä, joissa on kulloinkin spesifinen sitoutumiskohta S]:lie tai S2:lle. Edelleen on mahdollista valita verkkomuotoinen komponentti, se on, S^n ja S2:n kanssa 20- sitoutuvien aineiden polymeerejä.

Erityisen edullisesti S,:nä ja S2:na käytetään toisinaan bio- tiinia. Tällöin immobilisointiin voidaan käyttää avidiinia tai streptavidiinia, joka saattaa olla monomeeri-, mutta 25 myös polymeerimuodossa.

«

Komponentin lisäyksellä liuokseen antigeenin ja R2:n, R3:n ja/tai määritettävän vasta-aineen konjugaatti kiinnittyy komponentin sitoutumisella Sjin kanssa ja komponentin sitou-30 tumisella S2:n kanssa kiinteään faasiin. Faasit voidaan sit-..ten erottaa helposti samalla kun neste poistetaan. Faasien .* erotuksen jälkeen merkki voidaan määrittää jommasta kummasta faasista tunnetulla tavalla, ja on sitten antigeenille spesifisen vasta-aineen määrän mitta.

Keksinnön mukainen menetelmä on yksinkertainen suorittaa, koska se voidaan suorittaa yhdessä tai korkeintaan kahdessa vaiheessa. Täten pysyy myös mahdollisuus tämän menetelmän 35 7 95417 siirtämiseksi analyysiautomaatille. Koska menetelmä tapahtuu kompetitiivisesti, voidaan, toisin kuin tunnetuilla ja useimmiten käytetyillä määritysmenetelmillä, jotka kaikki ovat muodostuneet kerroslevymenetelmiksi tai immunometrisik-5 si menetelmiksi, välttämättömän vasta-aineen määrää vähentää olennaisesti. Siitä huolimatta keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan erittäin hyviä tuloksia, jolloin herkkyyttä tunnettuihin menetelmiin verrattuna voitaisiin parantaa vielä edelleen.

10

Edelleen yksi tämän keksinnön suoritusmuoto on reagenssi vasta-aineiden määritykseen, jossa reseptorit R,, R2 ja R3 kuten myös kiinteä faasi on erotettu toisistaan fysikaalisesti, jolloin R! on määritettävän vasta-aineen kanssa spesi- 15 fisesti sitoutuva antigeeni, R2 on R,:n kanssa spesifisesti sitoutuvan osan ja spesifisesti sitoutuvan aineen S! konju-gaatti ja R3 on R,:n kanssa spesifisesti sitoutuvan osan ja merkin konjugaatti.

20, Keksinnön mukaisena reagenssina käytetään edullisesti kiinteää faasia, jolle on sitoutunut S^n kanssa spesifisesti sitoutuva komponentti. Erityisen edullisesti immobilisointi tapahtuu spesifisesti sitovalla parilla biotiini-avidiini/-streptavidiini.

25 .Samoin on edullista käyttää kiinteää faasia, jolle on sitoutunut toinen spesifisesti sitoutuva aine S2, jolloin reagenssi tällöin sisältää lisäksi komponentin, jossa on kulloinkin ainakin yksi spesifinen sitoutumiskohta Sjrlle ja S2:lle.

30 Edullisesti kiinteään faasiin sidotaan sama spesifisesti si-toutuva aine, joka on sidottu reseptoriin R2. Myös tässä suo-.·’ ritusmuodossa käytetään erityisen edullisesti spesifisesti sitovaa paria biotiini ja avidiini/streptavidiini.

35 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Keksintöä valaistaan seuraavilla kuvilla ja esimerkeillä.

β 95417

Kuvassa 1 on keksinnön mukaisen menetelmän kalibrointikäyrä HBcAg:n vastaisten vasta-aineiden määritykselle.

Kuvassa 2 on tekniikan tason menetelmän kalibrointikäyrä 5 HBcAg:n vastaisten vasta-aineiden määritykselle.

Esimerkeissä mainittu HBcAg:n vastainen monoklonaalinen vasta-aine on talletettu European Collection of Animal Cell Cultures:iin seuraavalla talletusnumerolla: ECACC 88022507.

10

Esimerkki 1

Valmistettiin reseptorit 1¾ ja R3 HBcAg:n vastaisten vasta-aineiden määritykseen.

15 a) HBcAg:n (Hepatitis B-Core-antigeeni) vastaisen mono- klonaalisen vasta-aineen ja biotiinin konjugaatin valmistus.

Liuotettiin 6 mg/ml D-biotiini-e-aminokapronihappo-N-hydrok-sisukkinimidiesteriä dimetyylisulfoksidiin. Seuraavaksi in-20 kuboitiin 10 mg/ml vasta-ainetta 30 mmol/1 kaliumfosfaatti-puskurissa, pH 7,5, 15-kertaisessa moolisessa biotinylointi-reagenssiylimäärässä 1 tunti 25°C:ssa. Seuraavaksi dialysoi-tiin 2 mmol/1 kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,5 vastaan.

25 b) HBcAg:n vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen (ECACC _ 88022507) ja peroksidaasin konjugaatti

Piparjuuriperoksidaasi hapetettiin Nakanen kuvailemalla menetelmällä (Wilson, M.B., Nakane, P.K. "Immunofluorescence 30 and Related Staining Techniques" W. Knapp, Holuber ja G.

Wick, julkaisija Elsevier/North-Holland Biomedical Press .•Amsterdam New York 1978, s. 215 - 224). Sitten liitettiin 10 mg vasta-ainetta ja 12 mg hapetettua peroksidaasia toisiinsa kokonaistilavuudessa 4,6 ml pH-arvossa 9,4 ja 25°C:ssa. Ver-35 kottuminen pysäytettiin tunnin kuluttua 0°C:ssa lisäämällä 20 nmol/1 trietanoliamiinia ja 1,5 mmol/1 natriumborohydri-diä 30 minuutin inkuboinnilla pH-arvossa 8,9. Lopuksi konjugaatti jaettiin vielä jakeiksi geelisuodatuksella Superose 9 95417 6:ssa, preparatiivista laatua, 50 mmol/1 kaliumfosfaattipus-kurissa, pH 7,5 ja 150 mmol/1 NaCl:ssä.

Esimerkki 2 5 Määritettiin ihmisseerumin hepatiitti B-Core-antigeenin vastaisen vasta-aineen pitoisuus. Tähän käytettiin seuraavia reagenssejä:

Reagenssi 1: 10 100 ng/ml rekombinantti-HBcAg (valmistettu patenttihakemuk sen EP-A 0013828 mukaisesti)

Reagenssi 2: 50 ng/ml biotinyloitua monoklonaalista vasta-ainetta HBcAg:-15 tä (ECACC 88022507) vastaan, valmistettu esimerkin la) mukaisesti ja monoklonaalisen HBcAg:n vastaisen vasta-aineen ja peroksidaasin konjugaattia (valmistettu esimerkin Ib) mukaisesti, POD-aktiivisuus 25 mU/ml) 40 mmol/1 natriumfos-faattipuskurissa, pH 7,4 0,5 % polyeetteriglykoli (Pluronic 20, F-68) 0,2 % naudanseerumialbumiini 0,1 % naudan IgG 0,2 « mol/1 natriumtartraattia.

Streptavidiini-lämpö-naudanseerumialbumiininilla päällystetyssä polystyreeniputkessa, joka oli valmistettu patenttiha-25 kemuksessa DE-A 36 40 412 kuvaillulla tavalla, pipetoitiin i 200 μΐ näytettä ja hieman peräjälkeen tai samanaikaisesti 500 μΐ kumpaakin reagenssia 1 ja reagenssia 2. Tunnin inku-boinnin jälkeen huoneenlämpötilassa pestiin kolmesti vesijohtovedellä ja putkeen pipetoitiin 1 ml ABTSiää (2,2'-atsi-30 dodi-[3-etyyli-bentstiatsoliinisulfonihappo(6)]-diammonium-suolaa) (1,9 mmol/1) substraattireaktiota varten ja inkuboi-*tiin edelleen tunti huoneenlämpötilassa. Ekstinktio mitattiin 405 nm:llä 5 mm kerrospaksuuden kyvetissä ja muunnettiin 1 cm:n kyvetille.

Kuvassa 1 on kalibrointikäyrä, joka saatiin positiivisen seerumin laimennuksella negatiiviseen. Mittausarvot on kerätty taulukkoon 1.

35 95417 10

Taulukko 1 esimerkki 2 esimerkki 3 laimennettu HBc ekst.^j m ekst.^ 5 -----------------------------------------------.......

1 : 2000 0,048 0,040 1 : 4000 0,195 0,803 1 : 8000 0,792 1,856 1 : 16000 1,489 2,565 10 1 : 32000 2,070 2,767 neg. seerumi 2,570 2,845 osoitusreagenssi 1,050 1,225

Esimerkki 3 (vertailuesimerkki) 15 Vertauksen vuoksi suoritettiin HBcAg:n vastaisen vasta-aineen määritys tekniikan tasolla tunnetulla tavalla. Tähän käytettiin polystyreeniputkia, joihin lisättiin 1,5 ml liuosta, joka sisälsi 3 μg/ml HBcAg:n vastaista vasta-ainetta (ECACC 88022507) 40 mmol/1 fosfaattipuskurissa, pH 7,4, ja 20 annettiin seistä 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Putki täytettiin liuoksen poiston jälkeen 2 ml:11a puskuria, joka sisälsi 0,9 % NaCl, 0,3 % naudanseerumialbumiinia ja 2 % sakkaroosia, ja inkuboitiin puoli tuntia. Tämän liuoksen poiston jälkeen putkia inkuboitiin yön yli suuaukko alaspäin 25 21°C:ssa. Edelleen toimittiin esimerkissä 2 kuvaillulla ta- . valla, jolloin käytettiin streptavidiini-lämpö-RSA:lla päällystetyn polystyreeniputken sijasta HBcAg:n vastaisella mo-noklonaalisella vasta-aineella päällystettyä putkea ja rea-genssia 2, joka oli valmistettu ilman HBcAg:n vastaista vas-30 ta-ainetta.

Tulokset on esitetty taulukossa 1. Kuvassa 2 on kalibrointi-käyrä, joka saatiin positiivisen seerumin laimentamisella negatiivisella.

Esimerkki 4

Hepatiitti B-Core-antigeenin määrittämiseksi seerumista suoritettiin kompetitiivinen koe. Tätä varten pipetoitiin 35 11 95417 s t reptavidi ini-lämpö-naudanseerumialbumi ini1la päällystet-tyyn polystryreeniputkeen (valmistettu kuten esimerkissä 2) 500 μΐ reagenssia, joka sisälsi: 5 50 ng/ ml biotinyloitua HBcAgin vastaista monoklonaalista vasta-ainetta (ECACC 88022507), joka valmistettiin esimerkin la) mukaisesti (reseptori R2) , 100 ng/ml rekombinantti-HBcAg:tä, joka valmistettiin patent-10 tihakemuksessa EP-A 0013828 kuvaillun ohjeen mukaisesti (reseptori R2) , ja 200 μΐ näytettä 15 inkuboituna liuoksessa, joka sisälsi 40 mmol/1 natriumfos-faattipuskuria, pH 7,4, 0,5 % polyeetteriglykolia (Pluronic F-68), 0,2 % naudanseerumialbumiinia, 0,1 % naudan IgG, 0,2 mol/1 natriumtartraattia. Tunnin inkuboinnin jälkeen huoneenlämpötilassa edellä kuvailtuun puskuriliuokseen lisät- 20. tiin 500 μΐ toista reagenssia, joka sisälsi monoklonaalisen HBcAgm vastaisen vasta-aineen ja peroksidaasin konjugaatin, joka saatiin esimerkin Ib) mukaisesti (reseptori R3) , jonka peroksidaasiaktiivisuus oli 25 mU/ml, ja inkuboitiin edelleen tunti huoneenlämpötilassa. Tuloksekkaan inkuboinnin 25 jälkeen pestiin kolmesti vesijohtovedellä ja pipetoitiin . lisäksi 1 ml ABTS (1,9 mmol/1) ja inkuboitiin tunti huoneenlämpötilassa. Ekstinktio mitattiin 405 nm:llä 5 nutun kerrospaksuuden kyvetillä ja muunnettiin 1 cm:n kyvetille.

30 Mittaustulokset on esitetty taulukossa 2.

i < * Esimerkki 5

Hepatiitti-B-Core-antigeenin määrittämiseksi kompetitiivi-sella periaatteella pipetoitiin streptavidiini-lämpö-naudan-35 seerumialbumiinilla päällystettyyn polystyreeniputkeen, joka oli valmistettu patenttihakemuksessa DE-A 3640412 kuvaillulla tavalla, pipetoitiin 200 μΐ näytettä ja 500 μΐ reagenssia 1, joka käsitti 100 ng/ml rekombinantti-HBcAg:tä (valmistet- 12 95417 tu EP 0013828:n mukaisesti) 40 mmol/l:ssa natriumfosfaatti-puskuria, pH 7,4, 0,5 % polyeetteriglykolia (Pluronic F 68), 0,2 % naudanseerumialbumiinia, 0,1 % naudan IgG ja 0,2 mol/1 natriumtartraattia. Tunnin inkuboinnin jälkeen lisättiin 500 5 μΐ reagenssia 2, joka käsitti 50 ng/ml HBcAg:n vastaista biotinyloitua monoklonaalista vasta-ainetta, (joka oli valmistettu esimerkin la) mukaisesti) , ja 10 25 mU/ml HBcAg:n vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen ja peroksidaasin konjugaattia (valmistettu esimerkissä Ib) kuvaillulla tavalla) 15 edellä reagenssin l kohdalla ilmoitetun tapaisessa puskuri-liuoksessa, ja inkuboitiin edelleen 1 tunti huoneenlämpötilassa.

Edelleen toimittiin esimerkissä 3 kuvaillulla tavalla.

20

Saadut mittaustulokset on kerätty taulukkoon 2.

Taulukko 2

Anti-HBc-positiivisen esimerkki 4 esimerkki 5 25 seerumin laimennos ekst. 405 nm ekst. 405 nm 1 : 2000 0,075 0,016 1 : 4000 0,163 0,046 1 : 8000 0,357 0,229 30 1 : 16000 0,637 0,563 1 : 32000 0,907 0,814 ; neg. seerumi 1,165 1,206 osoitusreagenssi 0,491 0,493

II

Claims (10)

13 95417

1. Menetelmä vasta-aineiden määrittämiseksi immunomääri-tysperiaatteella inkuboimalla vähintään kolmea nestefaasiin liuotettua reseptoria R,, R2 ja R3/ joista Rj on määritettävän 5 vasta-aineen kanssa spesifisesti sitoutuva antigeeni, R2 välittää sitoutumisen kiinteään faasiin ja R3 kantaa merkin, erottamalla muodostuva kompleksi ja mittaamalla merkki yhdessä faaseista, tunnettu siitä, että R,:llä on ainakin kaksi vasta-aineen kanssa sitoutumaan kykenevää ep.itooppia ja R2:n 10 ja R3:n spesifisesti sitoutuvat osat ovat vasta-aineita tai niiden osia ja että reseptorina R2 käytetään reseptorin R, kanssa spesifisesti sitoutuvan vasta-aineen tai sen osan ja spesifisesti sitoutuvan aineen S, konjugaattia, ja R3:na käytetään Rj:n kanssa spesifisesti sitoutuvan vasta-aineen tai 15 sen osan ja merkin konjugaattia, jolloin muodostuvan kompleksin immobilisoituminen tapahtuu S^n kanssa spesifisesti sitoutuvan komponentin sitoutumisella kiinteään faasiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii-20, tä, että määritettävä vasta-aine sekoitetaan samanaikaisesti kaikkien kolmen reseptorin kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritettävä vasta-aine inkuboidaan ensin resepto- 25 rin R, ja mahdollisesti R2:n tai R3:n kanssa ja sitten lisä-* tään reseptorien R2 ja R3 tai vain R3:n tai R2:n liuos.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kiinteää faasia, jolle on kiin- 30 nittynyt spesifisesti S^n kanssa sitoutuvia komponentteja. 1 Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kiinteää faasia, jolle on kiinnittynyt toinen spesifisesti kiinnittyvä aine S2, ja että 35 koeliuoksen inkuboinnin jälkeen reaktioon osallistuneiden reseptoreiden kanssa lisätään kompleksin immobilisointiin komponentti, jolla on kummallekin S,:lie ja S2:lle vähintään yksi spesifinen sitoutumiskohta. 95417 ________ . τ 14

6. Jonkin edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R2:na ja R3:na käytetään reseptoreita, jotka itse pystyvät sitoutumaan määritettävään vasta-aineeseen. 5

7. Jonkin edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R2:na ja R3:na käytetään poly-klonaalista vasta-ainetta, jotka pystyvät sitoutumaan R,:n kanssa. 10

8. Jonkin edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että spesifisesti sitovana parina käytetään jonkin pareista antigeeni-vasta-aine, hapteeni-vasta-aine, proteiini-antiproteiini, proteiini A-immunoglo- 15 buliini, hemoglobiini-haptoglobiini, entsyymi-substraatti tai avidiini/streptavidiini-biotiini S,-komponenttia.

9. Reagenssi vasta-aineiden määrittämiseksi jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukaisella immunomääritysperiaat- 20 teella, tunnettu siitä, että se sisältää kolme reseptoria R,, R2 ja R3 kuten myös kiinteän faasin toisistaan erillään, jolloin R, on määritettävän vasta-aineen kanssa spesifisesti sitoutuva antigeeni, jolla on ainakin kaksi vasta-aineen kanssa sitoutumaan kykenevää epitooppia, R2 on Rj:n kanssa 25 spesifisesti sitoutuvan vasta-aineen tai sen osan ja spe-sifisesti sitoutuvan aineen S, konjugaatti ja R3 on Rjin kanssa spesifisesti sitoutuvan vasta-aineen tai sen osan ja merkin konjugaatti.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää kiinteän faasin, jolle on kiinnittynyt toinen spesifisesti sitoutuva aine S2, ja että reagenssi sisältää edelleen komponentin, jolla on kummallekin Sjille ja S2:lle vähintään yksi spesifinen sitoutumiskohta. 15 95417