JP2684244B2 - 被分析成分を測定する方法及び患者血清中の抗−ｔｓｈ受容体自己抗体の測定へのその使用 - Google Patents

被分析成分を測定する方法及び患者血清中の抗−ｔｓｈ受容体自己抗体の測定へのその使用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、流体試料のある量中の被分析成分（analyt
e）を測定するための方法、及び患者血清中の抗−TSH受
容体自己抗体の測定の為にそれを使用することに関す
る。
本発明に関して述べる意味に於いては、「被分析成
分」とは、自然の状態である流体である生物試料中の、
または適当な予備処理によって流体形に変換された生物
試料中の、その存在及び／または量が測定されるべきも
のである生物活性物質を主として意味している。従っ
て、本発明の意味に於いては、被分析成分は、主として
ハプテン性または抗原性を有している物質、例えばホル
モン類、ペプチドホルモン類、生理活性ペプチド類及び
蛋白質類であり、後者はまたイムノグロブリン性質を有
している蛋白質、即ち抗体または自己抗体を含む。生物
試料は主として血液試料またはその他の流体血液分画
物、特に、例えば血清試料または血漿試料であるが、試
料は原則として他の生物流体、例えば唾液または尿また
は溶解された組織抽出物でもあり得る。しかしながら本
発明は、天然の起源の生物活性物質の測定には限定され
ず、生物流体中の薬剤及びそれらの代謝物の測定も含
み、そして本発明に従う比較的高価な方法の使用が、そ
のような被分析成分の測定に対し有用であるならば、そ
して本発明に従う方法を実施するためにそのような場合
に必要とされる結合パートナー類及び反応体類が見いだ
されるならば、任意の他の物質の測定へも使用できる。
しかしながら本発明は、生物活性物質の測定に特に重要
であり、特に生物体液中の蛋白性の物質、従ってそれ自
体知られている別の方法に於いて測定するのが困難であ
るそのような被分析成分の測定において特に重要であ
る。本発明に従う測定方法が、ある種類の被分析成分ま
たはある被分析成分に関して主として記載されている場
合は、これは本発明の方法をそのような被分析成分に制
限することを意味するものと解釈されてはいけない。
単純な無機または有機性の化学物質に対し、広範囲な
化学的及び／または物理的な測定方法が利用できるが、
生物活性被分析成分、特にある種の生理機能を有してい
る天然の生物分子に於いては、一般に、いわゆるイムノ
ディアグノスティック法（免疫診断法）によって測定さ
れなければならない。なぜならば、それらの性質及び／
またはそれらが存在する量の為に、他の測定方法は使用
できないか、または例えば臨床的な実施には高価すぎる
からである。
そのような免疫学的な測定法は、原理的には知られて
いると考えられる。既知の方法は、反応の種類、測定さ
れるべき物質または使用されるべき検出法に依存して、
種々の形式に当てはめることができる。従って、方法の
幾つかはいわゆる競争的測定と命名でき、これは古典的
なラジオイムノアッセイ（RIA）を含んでおり、そして
これは標識、測定されるべき分子の種類、及び均質相中
での測定かまたは不均質相中での測定かに依存して、更
に種々のサブタイプに振り分けられる。競争的な方法に
よる抗原及び抗体の測定の為の基本的な方法に関して
は、例えばUS−B1−3654090のカラム３の上部を参照す
ることができる。この方法では、既知の量のコンペティ
ター（競争者）及び必要量未満の特定のバインダーが調
査されるべき試料に加えられ、一般には成分、即ちコン
ペティターまたはバインダーの一方が標識された形態
で、そして他方が固定された形態で存在し、そして所望
量の被分析成分が固相に結合した標識の量から測定され
る。従ってこの方法では、バインダーまたはコンペティ
ターの成分の少なくとも１つが固定できるもの、そして
他方が標識できるものであることが必要であり、直接の
標識の代わりに、後で行う間接的な標識の可能性でも充
分である。
いわゆるサンドウィッチ測定法として知られている別
の原理は、例えば異なる抗体などのバインダーに対する
二つの異なる結合場所を有している被分析成分に適して
いる。試料中に存在する被分析成分の合計量は、まず第
一の固定された抗体の過剰によって結合され、そしてこ
の量は第二の標識された抗体で、後で、または同時に標
識される。この原理の間接的な変形が、例えばEP−A1−
0105714またはEP−A1−147848中で実現されているよう
に、更に別の固定された、または標識された抗体が、測
定されるべき被分析成分を含有しているサンドウィッチ
を、固定または標識のいずれかをするために使用され
る。これらの方法すべてに於いて、測定されるべき被分
析成分は、最後にはそれ自体固定されかつ標識された、
検定の結果得られた免疫複合体中に存在しそして測定さ
れる。
それらの種々の具体例中で、上記の基本的な方法は生
物流体中の殆どの生物活性被分析成分の測定の為に使用
できる。
しかしながら、即ち入手の可能性、達成可能な純度、
安定性、固定可能性、及び測定方法中で互いに反応され
る反応体の結合性を含めた種々の理由の為に、既知の原
理は直接適用出来ないか、又はそれらの適用にいくつも
の重大な欠点が伴う多くの場合が存在し、これらの場合
は一見すると古典的な測定方法のより複雑な変更をする
ことが、単純な基本的な方法よりも、より有利に見え
る。そのようなより複雑な測定方法の例は、出願人のド
イツ特許4,120,412中に記載されており、ここでは述べ
られた特許に詳細に記載されている理由の為に、ヒト甲
状腺パーオキシダーゼ（hTPO）に対する自己抗体の測定
が、測定方法の試薬セットに属している成分からのサン
ドウィッチの合成の撹乱が、試料中に存在する被分析成
分、即ち、hTPOに対する自己抗体によって測定されると
いう方法で実施される。この方法では、測定されるべき
被分析成分の存在は、標識が固相へ結合することが減少
することとして現れる。述べられた方法の実質的な利点
は、抗hTPO自己抗体に対する競争者（コンペティター）
として役立つ抗原hTPOの、以前には必須とみなされてい
た高い精製を無しで済ませることができるということで
ある。
特に測定方法の反応体の一つが受容体（レセプター）
である場合には、幾らか異なった種類の問題が生じ得
る。ペプチドまたは蛋白質性の生物分子が受容体に結合
することは、一般に非常に複雑であり、受容体と生物分
子の間の結合の形成は、生物分子の構造変化、または受
容体の構造変化、例えば標識の結果、または固定化の結
果に対し慣用の抗原／抗体結合ペアーの場合よりもより
ずっと感受性である。上記の基本的な原理の一つに従
う、既知の免疫学的な測定方法が可能かどうかについ
て、このことは、そのような方法の設計に関する非常に
僅かな自由度しか存在しないということを生じる。従っ
て、抗−TSH受容体自己抗体の測定の場合に於いては、
今日まで固定された受容体（及び標識されたbTSH）、ま
たは固定されたコンペティター類（及び標識された受容
体）を用いることが可能ではなかった。
今述べたことは、本発明に従う典型的な測定方法を実
施するために好ましい場合でもある、TSH受容体に対す
る自己抗体の測定の場合に、更に詳細に説明される。
TSHは、甲状腺の機能に関して鍵となる役割を果た
す、脳下垂体ホルモンである。その放出は、視床下部中
に形成されたホルモンTRHによって刺激され、最も重要
な甲状腺ホルモンのチロキシン（T4）の生成と放出を制
御する。フィードバックに基づいて、血清のチロキシン
含量はTSHの放出を制御する。甲状腺細胞によるチロキ
シンの形成は、脳下垂体によって放出されたTSHが甲状
腺細胞膜のTSH受容体と結合する手順により、TSHによっ
て刺激される。
ある種の病理学的な症状に於いては、このTSH受容体
に対する種々の種類の自己抗体も形成され得る。これら
の自己抗体の種類に依存して、チロキシンの生成及び放
出の何れかの抑制が、TSH分子が遮へいされる為にTSH受
容体に於いて起こり得るか、または逆に、この甲状腺ホ
ルモンは、抗−TSH受容体自己抗体がTSHの作用を真似て
甲状腺ホルモンの合成と放出を刺激することによって制
御されない方法で放出され得るかの何れかである。甲状
腺ホルモン過剰は、後者の場合に、なかでもグレーブス
病型（バセドウ氏病型）の甲状腺機能亢進症として現れ
る。
従って、抗−TSH受容体自己抗体の検出は、臨床的な
実施に於いて非常に重要であり、生物学的流体中のその
ような自己抗体の測定を可能とする。幾つかの既知のラ
ジオ受容体検定が既に存在している。
そのようなTSH受容体検定は、測定されるべき自己抗
体の為の特異的な結合試薬として、抗被分析成分自己抗
体の代わりに、TSH受容体類の調製物が使用されるこ
と、そしてコンペティターとして使用されるTSH調製物
は、放射性標識系であることを除いては、競争的なラジ
オイムノアッセイと同様に機能する。更に、以下に述べ
る受容体/TSH相互作用の特異な性質の為に、TSH受容体
調製物の、放射性標識化TSH調製物や試料との反応が、
液層で実施され、受容体と結合パートナーから形成され
る反応生成物が、例えばポリエチレングリコールの添加
によって沈殿され、そして上澄み液の除去後にペレット
化された沈殿物中の放射能が測定できるように、試験は
実施されなければならない。
ヒトの血清中の抗−TSH受容体自己抗体の、既知の測
定の基本原理と詳細は、多くの出版物中に記載されてお
り、それらの中には、種々の試薬製造業者の製品情報に
加えて、L.C.ハリソン及びP.J.リードマンのClin.Bioch
em.,23巻,43〜48ページ,1990年、バーナード・リース・
スミスら,ENdocrine Reviews,9巻,No.1,106〜121ペー
ジ,1989年、及びバーナード・リース・スミス及びレジ
ナルド・ホール,Methods in Enzymology,74巻,405〜420
ページ,1981年が特に挙げられる。抗−TSH受容体自己抗
体の測定の為に記載された全ての受容体検定は、上記の
基本方法を実現している。更に詳細が知りたければ、出
願人の非先行技術出版のドイツ特許出願P 42 37 430.8
の内容を参照出来る。抗−TSH受容体自己抗体の測定の
為に意図された受容体検定、及び上記以外の基本原理に
伴う操作は、今日まで開示されてはいない。
この理由は、受容体／自己抗体又は受容体／標識化TS
H調製物の相互作用の性質である。これは例えば固定形
でTSH受容体を使用することをこれまで不可能とし、そ
して慣用の液体／固体分離の後に固相に於いて測定され
るべき放射能を測定することをこれまで不可能としてき
た。そして更に、受容体調製物を標識化すること、そし
て被分析成分に対するコンペティターとしての固定され
たTSH調製物とのその反応が今日まで可能ではないとさ
れてきた。更に、放射能を有するもの以外の標識でTSH
調製物を標識することは、今日まで実際可能ではなかっ
た。従って、例えば放射能標識は、酵素標識又は蛍光性
の標識で置き換えることができない、何故ならば、これ
らが共に沈殿してしまうか、又は受容体／結合パートナ
ー複合体の必要とされる沈殿中で不活性化されるかのい
ずれかであるからである。更に、既知のTSH調製物の受
容体結合能力は、標識として嵩ばる有機ラジカルを付加
しようと試みると、余りにも大きく制御不可能に損なわ
れる。
抗TSH受容体自己抗体の測定の為の以前の受容体検定
は、従って沈殿型の放射性受容体検定とならざるを得な
かった。但しそのような検定は、ユーザー並びに製造業
者に多くの欠点を有している。即ち： 1.排他的に放射能を使用する方法は、製造業者、使用者
及び環境に対し既知の安全に対する負担をかけること。
2.沈殿物をペレット化する為の結合／分離に必要とされ
る遠心分離は、実質的により時間がかかり、免疫診断で
現在非常に広く使用されている他の方法、例えば、被覆
された試験管及びミクロ滴定プレート技術よりも、取扱
いが不便であること。
3.トレーサーとして放射性標識化TSHを生産すること
は、高価で技術的に困難である。まず、天然の供給源か
ら得られる、一般的にはウシのものであるTSHは、費用
のかかる多段階の手順によって精製されなければなら
ず、このことは特異的な受容体結合活性の減少を生じ
る。必要とされるその後の酸化的な放射性ヨウ素化は、
更に結合活性を減少させる。
4.沈殿の効率及びトレーサーの非特異的なペレット化
も、とりわけ、試料の組成に依存している。しかしなが
ら、試料の組成は異なる患者の血清により変化し、従っ
て実際の測定値はこの試験設計で誤認を生じ得る。
既知の方法の利点の中には、血清試料中に存在する内
因性のヒトTSHが、一般的に使用されるウシのTSHのブタ
のTSH受容体への結合に干渉しないということがある。
ウシのTSHのブタTSH受容体への親和性は、異なる生物起
源のTSH/TSH受容体の全ての調べられた組合わせの中で
最も大きいので、新しく設計された試験に於いてもま
た、これらの利点を利用することが望ましい。
本発明の目的は、液体試料のある容量中の被分析成分
の新規な測定方法を提供することであり、特に測定され
るべき被分析成分に対するコンペティターの性質、及び
その標識方法に関して、被分析成分の性質及び関連する
バインダーの性質に対して、その試験がより大きな独立
性を有し、そして特に沈殿段階なしにできる受容体検定
を可能とすること、そして、殆ど任意の標識で機能でき
る種類の受容体検定法型である、方法を提供することで
ある。
本発明の特定の目的は、そのような新規な原理に従っ
て機能する抗−TSH受容体自己抗体の測定方法を提供す
ることであり、既知の方法の上記欠点がないが、同時に
その利点を保有している抗−TSH受容体自己抗体の測定
方法を提供することである。
これらの目的は、特許請求の範囲第１項に従う測定方
法によって達成され、そして特許請求の範囲第15項に従
うこの方法の具体例に従って達成される。
これらの方法の有利な具体例が、その下のサブクレー
ムに記載されている。
項−TSH受容体自己抗体の測定の為の基本的な方法と
その特定の設計の更に好ましい具体例と特徴は、次の記
載から明らかである。
この方法の基本的な原理を説明し、図解するために、
図１が参照できる。
本発明に従う方法は、測定されるべき被分析成分
（Ａ）の存在と量が、間接的に測定される手順によって
基本的な目的を達成する。その間接的な測定は、固定さ
れたコンペティター（Ｋ）の濃度の測定として実際の濃
度測定を実施することによって行われる。その固定され
たコンペティター（Ｋ）は、バインダー（Ｂ）に結合さ
れておらず、直接標識されているか、または追加の抗体
（ラベル）で標識されることができて、特に固定された
サンドウィッチの形成によって標識できるものである。
その固定されたコンペティター（Ｋ）の量は、被分析成
分（Ａ）の含有量の増加が、結合されたコンペティター
（Ｋ）の、または結合された標識（ラベル）の量の増加
につながる方法で測定されるべき試料中の被分析成分
（Ａ）の量と、相関しているものである。
本発明に従う方法に於いては、バインダー、例えば受
容体及びコンペティターを含んでいる複合体中に標識が
存在する必要がなく、標識化はバインダー／被分析成分
またはコンペティターを含んでいる複合体と独立に実施
できるので、ある種の標識を適用可能である必要がある
といったどんな制限も、本発明に従う方法では避けるこ
とができる。
バインダーに直接結合していないコンペティターの測
定を通じて、被分析成分を間接的に測定するために、試
料試薬バインダー及びコンペティターの純度及び他の結
合性に関する要求は減少できる。この試験が機能するた
めには、主として要求される全ては次の事である。
・バインダー、例えば受容体に対するコンペティターの
結合の程度は、測定される被分析成分の存在によって充
分に明らかに影響を受けること。この要件は一般にバイ
ンダーが特異的なバインダー、例えば受容体である時の
みに満たされる。及び、 ・コンペティターの結合されなかった成分は、バインダ
ーに結合したコンペティターの成分の同時的な固定及び
／または標識化は起こらず、そしてバインダーへのコン
ペティターの結合がコンペティターの結合されなかった
量の固定化によって有意義には損なわれないようなやり
方で固定されることができる。
言い換えれば、バインダー（TSH受容体）に対するコ
ンペティター（例えば、抗−TSH受容体自己抗体の測定
に於いては、ウシTSHのもの）は、固相に対するコンペ
ティターの結合と比較して充分に良好にされていなけれ
ばならないこと、即ち、バインダーと受容体の相互作用
によって形成される複合体は、熱力学的及び／または動
力学的に充分に安定であって、従って、使用された共通
の培養時間内に、そのコンペティターの選択的な固定に
使用される物質の存在下で、述べられた複合体から既に
結合されたコンペティターを解放することが、有意義に
存在しないことが必要である。このことは、試験化合物
の濃度の正しい選択及び／または種々の反応の為のよろ
めき及び培養の期間及び／またはバインダーに結合され
ないコンペティターの固定及び標識化の為の、充分低い
会合動力学（反応速度）を有している抗体の選択、また
はそのような会合反応速度（動力学）につながる条件下
での作業によって達成できる。
更に、固相に結合された標識が、実際には、バインダ
ーに結合されないコンペティターのラベルのみであるこ
とが確保されなければならない。言い換えれば、ａ）そ
のコンペティターの固定の為の固相上に固定された抗体
へ、コンペティターのその後の標識化の為に使用された
抗体又は抗体断片が結合することを防ぐこと、ｂ）更
に、バインダーとコンペティターの複合体が固相に結合
することを、又はそれらが結合されるべき時は標識され
ることを防止することが必要である。最後に述べた要件
は、コンペティターの固定及び標識化に使用される二つ
の抗体の少なくとも一方が、コンペティターのバインダ
ーへの優先的な結合（ブタのTSH受容体に対するbTSHの
結合）によって封じられているコンペティター（bTSH）
のエピトープに結合する時に達成される。
勿論、コンペティターとバインダーは、バインダーの
結合位置について、コンペティターの被分析成分との効
果的な競争が存在するような量で、試験成分として使用
されなければならない。しかしながら、コンペティター
と被分析成分が同じ結合位置について直接競争すること
は必要ではなく、コンペティターの結合が、被分析成分
のバインダーへの結合によって明らかに減少されること
で充分である。このことは、流体層中に結合されないコ
ンペティターのより高い割合を生じ、この割合は、流体
反応混合物中の被分析成分の濃度を反映し、従って、そ
の後で固相への結合及び標識化によって測定できる。
抗体濃度と、バインダーに結合されてはいないが固相
上に固定され、標識化されているコンペティターの間の
比例の為に、本発明に従う方法は、流体試料中の被分析
成分の濃度の定量的な測定を可能とし、そして勿論、そ
のような試験では普通であるように、測定された値は検
量物質を使用して作られた検量曲線と比較される。
しかしながら、試料中に期待される被分析成分濃度に
於いて、バインダーからのコンペティターの完全な置き
換えがありそうであり、そして、生じる多かれ少なかれ
一定の、固定コンペティターの信号が、被分析成分の存
在に対する信号を表すように、比較的少量のバインダー
とコンペティターを使用することによって、この方法は
単純な定性的な陽性／陰性試験として実施することもで
きる。
測定方法の成分に関する上記の種々の要件は、実際上
に実現できることは、抗−TSH受容体自己抗体の測定法
としてこの方法を実施する、次の特定の具体例によって
示される。
述べられた特定の方法の記載に関連して、図面が参照
されるが、その図面は以下のものを示している。
図１は、本発明に従う基本法の図解であって、抗−TS
H受容体自己抗体の測定の例についての必要な試験成分
と共に記載されている。
図２は、別のTSH抗体で被覆されそして試験管の壁の
形態である、固相への標識化TSH抗体の結合を示し、そ
の結合は加えられたbTSHの濃度に依存している。
図３は、ブタTSH受容体と共に予備培養した場合の図
２に従う系に於ける測定された信号中の減少を示してい
る。
図４は、抗−TSH受容体自己抗体を有する患者血清の
添加により、図３に従う測定信号の受容体に関連する減
少の除去を示しており、固定され標識化されたbTSHの増
加量が、自己抗体の増加量と対応している事を示す。
図５は、本発明の方法による、グレーブス病にかかっ
た患者の血清群及び健康な志願者の血清群の測定の結果
を示しており、 図６は、本発明に従う方法によって得られる測定値
の、実際に試験された抗−TSH受容体自己抗体の測定に
ついての伝統的な試験の測定値との相関を示している。
抗−TSH受容体自己抗体が本発明に従う測定法によっ
て実際に測定できるかどうかの問いを調べるために、次
の物質と方法を使用して、種々の試験を実施した。
材料と方法 1.試験管 コンペティターとして使用されるbTSHを固定するため
の固相の調製については、ポリスチレン・スター試験管
（NUNC）を、300μｌの0.1M NaHCO3,pH8.0当たり、1.0
μｇのモノクローナルの市販の抗−TSH抗体（フィンラ
ンドのメディックス（Medix）社からの抗体No.5405）で
被覆した（15時間、室温）。その後、飽和と凍結乾燥
を、それ自体は知られた方法で実施し、0.5％ウシ血清
アルブミン（BSA）/3％カリオン/0.005％ NaN3で行っ
た。
製造業者に従って、この特別の抗−TSH抗体はbTSHに
対し特異的、またはhTSHのベータ・サブ・ユニットに対
し特異的であり、そして５×109l/mol hTSHの親和性定
数を有している。これはイン ビトロで製造され、0.1
％NaN3の含有量を有する0.15mol/l NaCl中のアフィニテ
ィー精製Igフラクションとして市販されている（蛋白質
濃度0.02mg/ml）。
2.コンペティターとして使用されたウシTSH調製物 市販の「スィトロパル（Thytropar）」の名前を有す
るローラー ファーマスーティカルズ（Rorer Pharmace
uticals）からのTSH調製物を測定当たり100μＵの量で
使用した。
3.バインダーとして使用されるブタTSH受容体 製造は文献に記載されているブタ甲状腺膜の粗洗剤抽
出物であるブタTSH受容体が使用された（例えば、バー
ナード・リース・スミス及びホール,Meth.Enzym.74,405
〜420ページ,1981年、または出願人のドイツ特許出願P
42 37 430.8を参照）。ブタTSH受容体は、慣用の知られ
ている測定法のものよりも４倍高い濃度で使用した。
4.固定されたbTSHコンペティターを標識するための標識
された抗体 試験管を被覆するために使用された抗体（オランダ，
アムステルダム,CLB社からのモノクローナル抗−bTSH抗
体 920831−52）からの異なるエピトープ中に、bTSHを
結合することが知られている市販のモノクローナル・マ
ウス抗bTSH抗体を、1:1のモル比で、既知の方法でアク
リジニウムエステルで標識化した。抗体に結合しないア
クリジニウムエステル標識は、ゲル濾過で除去した。試
験を実施するために、得られたトレーサーを、200μｌ
の10mMトリスtris/HCl pH7.5/0.1％ BSA/0.4mg/mlマ
ウス lgG/0.4mg/mlウシlgG当たり、200,000RLU（相対
光学単位 /Relative Light Units）の濃度に調節した。
この述べられた抗体の使用は、最初に述べたものの使
用と同じ位非臨界的であるとみなされる。試験動物の免
疫化（例えばbTSHによる）及びその後の慣用的な選択に
よってそれ自体は知られた方法で得ることが出来る、他
の可能なモノクローナル抗体の対の適合性は以下の試験
１及び２に記載される方法によって単純に試験できる。
次の試験は上の材料を使用して実施された。
試験１ 予備試験に於いて、固相に結合されたbTSHサンドイッ
チが、試験管を被覆するため及びトレーサーを調製する
ために使用されたモノクローナル抗体を使用して製造で
きるかどうかが決定された。この目的には、種々の量の
ウシTSHを上記の様に造られたトレーサー200,000RLUと
共に、300μｌのPBS（ホスフェート緩衝化食塩溶液）の
容量中で、上記の様にして造った試験管中で、300rpmで
振盪しながら培養した。結合したもの／遊離のものの分
離を次にそれ自体は知られている方法で実施し、固相の
発光を測定した。試験管に対する発光バンドをベルトル
ド社からのLP952Tルミノメーターで測定した。
図２は、トレーサーの増加量がbTSHの増加量で固定さ
れること、即ち、サンドイッチが二つの選択された抗体
を使用して造られ得ることを示している。
試験２ 試験１に従うサンドイッチ反応中の測定可能なウシTS
Hの量に対するTSH受容体調製物の存在の影響の試験 次の手順が使用された。
1. 異なる量の粗製ブタTSH受容体（TSH受容体試薬TRAK
−検定ヘニングベルリンからの50μｌ）をモノクローナ
ル抗−TSH抗体で被覆された試験管中にピペットで入れ
た。
2. 25μｌのウシTSH（スィトロパール（Thytropar），
ローラー（Rorer）社,PBS中100μＵ）を次にピペットで
入れた。
3. 200μｌの標識されたモノクローナル抗−TSH抗体
（発光標識化されているもの、PBS中200,000RLU）を次
にピペットによって加えた。
300rpmで振盪しながら、室温に於いて、培養を２時間
実施し、その後、結合物／遊離物分離、固相の洗浄、及
び固相に結合された発光の測定を図１のように実施し
た。
図３に示されるように、ブタTSH受容体調製物の存在
は、標識され固相上に固定されることの出来るbTSHの量
の減少につながり、このことは溶液中のbTSHの量が加え
られた受容体への結合の結果減少したことを示してい
る。
試験３ 定義された量の抗TSH受容体自己抗体を、試験２に従
う試験系に加えた。一つの自己抗体濃度単位は、350U/l
の抗体力価を有する血清に相当している。そのような血
清は抗体のない血清で希釈され、試験２に従う試薬系に
加えられた。
特定していえば、この形態で既知の試料による検量、
及び未知の試料の測定の両方の為に使用できる完全な試
験は、以下の様に実施された。
次のものがまず被覆されていない試験管にピペットで
入れられる。50μｌのブタTSH受容体50μｌの抗体含有
血清試料。
続いて室温で15分間培養される。25μｌのbTSH（100
μＵ）を次にピペットで加える。
室温で１時間培養後、100μｌの液体反応混合物モノ
クローナル抗−TSH抗体5404で被覆されている被覆試験
管に移し、そしてアクリジニウムエステルで標識された
200μｌの第二の抗−bTSH抗体をサンドウィッチを造る
ために加えた。
300rpmで振盪しながら、室温で３時間培養を実施し、
ヘニングベルリン社からの市販のルミテスト洗浄溶液を
使用して洗浄を実施した。試験管に結合された発光バン
ドを次に試験１のように、ベルトルド社からのLB952Tル
ミノメーターを使用して測定した。
図４は試験管の壁に結合した発光ラベルの濃度が加え
られた抗−TSH受容体自己抗体の量の関数として増加す
ることを示している。
試験４ 臨床的な有用性の測定の為には、グレーブス病（バセ
ドウ氏病）を有していると分類されているドナーの血清
が試験３の下に記載された培養プロトコルに従って本発
明に従う測定方法で測定された。更に、抗−TSH自己抗
体のない健康な甲状腺を有する人々からの血清を測定し
た。
図５は、本発明に従う方法によって健康な志願者とグ
レーブス病（バセドウ氏病）にかかった患者の間の明瞭
な区別が可能であることを示している。
本発明に従う方法による抗体含有血清の測定中で得ら
れた値は、更に実際に使用されている認められた比較方
法による測定の結果と比較された（ヘニングベルリン社
のTRAK検定）。
結果は図６に示されている。本発明に従う方法の結果
は、公知測定方法によって得られた結果と相関できるこ
とがわかる。自己抗体の無い陰性の血清（＜15U/l）
は、公知試験法に於けるような本発明に従う試験法に於
いて、低い測定値を与え、一方、自己抗体含有の陽性の
血清は一般に本発明に従う測定法に於いても高い測定値
を与える。図６に示された結果は、記載された実際的な
具体例中での新規な測定法の臨床的な有用性を文書化す
るものである。
上記の測定法に於いては、バインダー（ブタ甲状腺か
らの粗製ブタTSH受容体）が試料（患者血清）及びコン
ペティター（粗製ウシTSH）と共に試験管中で予備培養
される。
この液体反応混合物を次にバインダーに結合されてい
ないコンペティターの成分の選択的な結合の為に被膜
（モノクローナル抗−bTSH抗体でのコーティング）を有
している試験管に移され、同時に第二の標識された抗体
（発光標識モノクローナル抗−bTSH抗体）が試験管に加
えられる。この抗体はバインダーによって結合されたコ
ンペティター（受容体に結合されたbTSH）に結合せず、
又は試験管壁上の固定された第二の抗−bTSH抗体に結合
しないように選択される。
培養後、洗浄を実施し、試験管壁上の発光を測定す
る。このようにして検出されたbTSHの量は、患者試料中
の被分析成分の量と比例する。
しかし、記載された反応手順は成分の濃度、ピペット
で移す順序などに関して特定の変化をしうる。
抗TSH受容体自己抗体について最初に記載された測定
法と比較して、本発明に従う方法は次の利点を有してい
る。
1. 本発明に従う試験で使用するために、コンペティタ
ーとして使用されるウシTSHは精製される必要も、標識
される必要もなく、ウシTSHは粗製ホモジネートとして
のウシ脳下垂体から一段階で抽出したものが使用でき
る。これは特定の精製及び標識段階の結果活性が失われ
る危険性を減少し、かつ、最大の特異的受容体結合活性
が保証される。
2. 既知の方法とは対称的に、結合物／遊離物分離が遠
心分離ではなく単純な慣用の試験管洗浄によって実施さ
れる。これはより速くより経済的であり、より便利で、
使用者にとってかなりの取扱の利点をあたえる。
既知の試験に存在する放射能標識を使用しなくてはな
らないという制約が本発明の方法では存在しない。コン
ペティターは直接標識される必要がないので、コンペテ
ィターの受容体結合活性が損なわれること考慮する必要
がない。トレーサーとしての抗体を標識することは、コ
ンペティターとしてのbTSHを標識することよりも問題が
ずっと少ない。抗体の抗原との相互作用は、抗体の小部
分のみの参加で実施され、抗体の大部分（の場所）はそ
の免疫反応性に影響することなしに化学的に変化出来
る。一方、受容体結合はずっとより複雑で、標識の導入
によって生じ得る様な、外的な影響に対しずっと感受性
が大きい。
4. 本発明の方法では、遠心分離が実施されないので、
例えば、測定されるべき試料中の異なる蛋白質濃度に起
因する、そしてそれに関連してトレーサーの非特異的ペ
レット化に起因する、既知の方法では生じ得る測定誤差
が存在しない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コルンフェルト，シャウル ドイツ国 ベルリン ディー―14167 ダーレマー ヴェグ 133 (56)参考文献 特開 平８−54393（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−501103（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−507388（ＪＰ，Ａ)

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ） 被分析成分（Ａ）の為の予め決めら
    れた量のバインダー（Ｂ）、及び ｂ） コンペティター（Ｋ）のバインダー（Ｂ）に対す
    る結合の程度が、試料中の被分析成分（Ａ）の量と相関
    するような方法で該バインダー（Ｂ）によって同様に結
    合される、予め決められた量のコンペティター（Ｋ）、
    但し、該コンペティター（Ｋ）は、定量的及び／又は定
    性的な測定を可能とする標識で標識されているか又は標
    識されることが出来るものである、 を含んでいる、１以上の測定試薬が試料に加えられて液
    体反応混合物を形成する、流体試料のある容量中の被分
    析成分を測定する方法であって、 ｃ） 該液体反応混合物が、同時に又はその後に続い
    て、バインダー（Ｂ）に結合されていないコンペティタ
    ー（Ｋ）の量の選択的な固定の為の物質（Imm）が結合
    されている固相と反応させられ、但し、該物質（Imm）
    は、該被分析成分（Ａ）及びバインダー（Ｂ）に結合し
    たコンペティター（Ｋ）と有意に交差反応しないもので
    あり、 そして必要ならば、該液体反応混合物が、固定されたコ
    ンペティター（Ｋ）に対する標識された反応体（ラベ
    ル）と反応され、そして液体反応混合物から固相の定量
    的な分離の後に、固相に結合したコンペティター（Ｋ）
    の量がそれ自体は知られた方法で、該コンペティターに
    結合した標識の物理的及び／又は化学的な検出によって
    測定され、そして該コンペティター（Ｋ）の測定された
    量がもとの試料中の被分析成分（Ａ）の存在及び／又は
    量と相関されることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】固相を添加する前に、本質的に平衡に達す
    る迄試料流体とａ）及びｂ）に従う測定試薬を含んでい
    る液体反応混合物が、一緒に培養されることを特徴とす
    る請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】固相への結合の間又はその後に、コンペテ
    ィター（Ｋ）が固定されたコンペティター（Ｋ）に結合
    するが固相には結合しない標識された反応体（ラベル）
    で標識されることを特徴とする請求項１又は２に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】標識された反応体（ラベル）が、更に別の
    液体試薬の形態で使用されることを特徴とする請求項３
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】コンペティター（Ｋ）又は標識された反応
    体（ラベル）が、放射性同位元素、酵素、酵素反応の基
    質、蛍光標識、又は化学発光標識で直接標識されること
    を特徴とする請求項１〜４のいずれか一に記載の方法。
  6. 【請求項６】被分析成分（Ａ）が、抗原性又はハプテン
    性を有している生物活性物質であることを特徴とする請
    求項１〜５のいずれか一に記載の方法。
  7. 【請求項７】被分析成分（Ａ）が、抗体又は自己抗体で
    あることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】コンペティター（Ｋ）が抗原性又はハプテ
    ン性を有する生物活性物質であることを特徴とする請求
    項１〜７のいずれか一に記載の方法。
  9. 【請求項９】バインダー（Ｂ）が、コンペティター
    （Ｋ）又は被分析成分（Ａ）に対する生物的な受容体で
    あって、その受容体が生物物質から得られるか又は遺伝
    子工学によって製造されることを特徴とする請求項１〜
    ８のいずれか一に記載の方法。
  10. 【請求項１０】試料中に存在する被分析成分（Ａ）の合
    計量の測定方法として実施されることを特徴とする請求
    項１〜９のいずれか一に記載の方法。
  11. 【請求項１１】バインダー（Ｂ）に結合されていないコ
    ンペティター（Ｋ）の選択的な固定の為の物質（Imm）
    が、コンペティター（Ｋ）に対するモノクローナル抗体
    であることを特徴とする請求項１〜10のいずれか一に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】固定されたコンペティター（Ｋ）を標識
    するための標識された反応体（ラベル）が、コンペティ
    ター（Ｋ）に対するモノクローナル抗体であるか、又は
    コンペティター（Ｋ）に対する結合が固相上にコンペテ
    ィター（Ｋ）を固定することによって損なわれず、この
    固定に干渉しない抗体断片であることを特徴とする請求
    項１〜11のいずれか一に記載の方法。
  13. 【請求項１３】コンペティター（Ｋ）を固定する為の物
    質（Imm）及び標識された反応体（ラベル）が、ａ）コ
    ンペティター（Ｋ）のバインダーに結合された成分の固
    定及び／又は標識化が妨げられるように、及び／又は
    ｂ）バインダー（Ｂ）への結合からコンペティター
    （Ｋ）の結合された成分が放出されることを導かないよ
    うに、選択されることを特徴とする、請求項１〜12のい
    ずれか一に記載の方法。
  14. 【請求項１４】使用された固相が被覆された試験管の壁
    であることを特徴とする請求項１〜13のいずれか一に記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】患者血清中の抗−TSH受容体自己抗体
    （Ａ）の測定法として実施され、その実施が バインダー（Ｂ）として、標準化されたTSH受容体調製
    物又は測定方法の実施と関連して検量することが出来る
    TSH受容体調製物、 コンペティター（Ｋ）として、標準化されたTSH調製物
    又は測定方法の実施と関連して検量することが出来るTS
    H調製物、 該固相上の選択的な固定の為の物質（Imm）として、第
    一のモノクローナル抗−TSH抗体、及び 標識された反応体（ラベル）として、固定の為に使用し
    た第一の抗体とは固定されたコンペティター（Ｋ）の異
    なる領域にTSHを結合させてTSHサンドイッチを形成し、
    そして非放射性標識の形態の標識を有している、更に別
    のモノクローナル抗−TSH抗体又は標識されたそのよう
    な抗体の断片、 を使用することによって行うことを特徴とする、請求項
    １〜14のいずれか一に記載の方法。
  16. 【請求項１６】バインダー（Ｂ）として、TSH受容体が
    ブタTSH調製物の形で使用され、コンペティター（Ｋ）
    がウシTSH調製物の形で使用されることを特徴とする請
    求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】ブタTSH受容体調製物がブタ甲状腺膜の
    洗剤抽出物の形態で使用されることを特徴とする請求項
    16に記載の方法。
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